Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao trong quá trình lên men chượp mắm cát hải

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
CHƢỢP MẮM CÁT HẢI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội – Năm 2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
CHƢỢP MẮM CÁT HẢI

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã số:

15BCNTP-06

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. Bùi Thị Thu Hiền

2. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh

Hà Nội – Năm 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng.
Tôi xin cam đoan, các thông tin đƣợc trích dẫn trong luận văn này đã đƣợc ghi
rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2017
Ngƣời viết báo cáo

Nguyễn Thị Ngân Hà

I


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của gia đình, các thầy cô giáo và bạn bè, đồng
nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Thị Thu Hiền, Trƣởng phòng
Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản và PGS.TS. Khuất
Hữu Thanh, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học
Bách Khoa Hà Nội đã truyền cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tận
tình hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau
thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề
tài.

Tôi xin dành những dòng cuối để cảm ơn bố mẹ, chồng con và những ngƣời
thân trong gia đình đã dành thời gian cho tôi, thay tôi làm mọi công việc gia đình và
luôn động viên tôi yên tâm học tập, công tác. Tôi cũng dành sự trân trọng với bạn
bè, đồng nghiệp đã luôn ở bên tôi trong những lúc khó khăn để vƣơn lên trong học
tập, công tác và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận
văn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2017
Ngƣời viết báo cáo

Nguyễn Thị Ngân Hà

II


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT .............................. VI
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................VII
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. VIII
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1

KHÁI QUÁT VỀ NƢỚC MẮM ....................................................................3

1.1.1

Khái niệm ................................................................................................3

1.1.2

Các loại nƣớc mắm .................................................................................3

1.1.3

Đặc điểm chung của nƣớc mắm..............................................................4

1.2. NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT NƢỚC MẮM ...................................................9
1.2.1

Cá ............................................................................................................9

1.2.2

Nƣớc......................................................................................................12

1.2.3

Muối ......................................................................................................12

1.2.4

Enzyme protease...................................................................................13

1.3.

TÌNH HÌNH SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁ Ở CÁT HẢI....................16

1.3.1

hái quát về công nghệ sản xuất nƣớc mắm Cát Hải ...........................16

1.3.2

Quy trình sản xuất .................................................................................17

1.4.

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ LĨNH VỰC SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ

CÁ…. .....................................................................................................................22
1.4.1 Nghiên cứu bổ sung protease trong sản xuất nƣớc mắm ........................22
1.4.2 Nghiên cứu tạo hƣơng nhờ vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm ..........24
1.5.

VAI TRÕ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƢỚC

MẮM. ....................................................................................................................25
1.6.

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT LƢỢNG NƢỚC MẮM ........27

1.6.1

Ảnh hƣởng của độ muối .......................................................................27

1.6.2

Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................28

1.6.3

Ảnh hƣởng của pH ................................................................................28

1.6.4

Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất ...........................................................28

III


1.6.5

Ảnh hƣởng của diện tích tiếp xúc .........................................................28

1.6.6

Ảnh hƣởng của chất hoạt hoá ...............................................................29

CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............30
2.1.

NGUYÊN LIỆU ..........................................................................................30

2.2.

HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .........................................................................30

2.2.1

Hóa chất................................................................................................30

2.2.2

Thiết bị dùng trong nghiên cứu.............................................................30

2.3.

MÔI TRƢỜNG PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT ...................31

2.4.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................31

2.4.1

Định lƣợng và phân lập vi khuẩn hiếu khí tổng số ...............................31

2.4.2

Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease định

t nh ….................................................................................................................32
2.4.3

Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hƣơng định t nh ......32

2.4.4

Giải trình tự đoạn ARNr 16S ................................................................33

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..............................35
3.1.

SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI

HUẨN Ở CHƢỢP MẮM TRONG CÁC

GIAI ĐOẠN LÊN MEN HÁC NHAU ...............................................................35
3.2.

TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI HUẨN CHỊU MẶN CÓ HOẠT TÍNH

CAO.. .....................................................................................................................39
3.2.1

Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease trong các

chƣợp lên men nƣớc mắm ..................................................................................39
3.2.2

Sàng lọc các chủng vi khuẩn yếm kh chịu mặm có khả năng sinh

hƣơng trong các chƣợp lên men nƣớc mắm .......................................................41
3.2.3.

Định tên đến loài các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh cao phân

lập đƣợc từ các chƣợp lên men nƣớc mắm bằng kỹ thuật phân tử.....................42
NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC ĐIỀU

IỆN NUÔI CẤY TỚI

HẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI

HUẨN M1, M2, H10

3.3.

VÀ H12 ..................................................................................................................49
3.3.1

Ảnh hƣởng của nhiệt độ .......................................................................49

3.3.2

Ảnh hƣởng của pH ...............................................................................50

IV


3.3.3
3.4.

Khảo sát đặc tính chịu mặn của các chủng vi khuẩn ...........................50

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH SỬ DỤNG TRONG

SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁC CHỦNG VI HUẨN M1 VÀ H12...........51
3.4.1

Ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy chế phẩm .................................................51

3.4.2.

Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm ............................................52

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55

V


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

VK

Vi khuẩn

g/l

Gam/lít

Naa

Nito acid amin

Nts

Nito tổng số

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

CH

Cát Hải

Môi trƣờng NA

Môi trƣờng Nutrient Agar

Môi trƣờng MRS

Môi trƣờng De Man, Rogosa and Sharpe

CFU/ gram

Tổng số khuẩn lạc / gam

CT

Công thức

VI


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tên các loại nƣớc mắm và tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm ở cá nƣớc khác
nhau .............................................................................................................................3

Bảng 1.2: Hàm lƣợng axit amin trong nƣớc mắm mg ml .. ......................................5
Bảng 1.3: Thành phần các chất bay hơi trong nƣớc mắm...........................................7
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của cá ......................................................................10
Bảng 1.5. Thành phần hóa học cá biển .....................................................................10
Bảng 1.6: Các acid amin chủ yếu % trong các protein khác nhau .........................12
Bảng 1.7: Yêu cầu cảm quan của nƣớc mắm ............................................................20
Bảng 1.8: Các chỉ tiêu hóa học của nƣớc mắm .........................................................21
Bảng 1.9: Chỉ tiêu vi sinh của nƣớc mắm .................................................................21
Bảng 3.1: Số lƣợng các loại khuẩn lạc quan sát trên các môi trƣờng NA
NaCl và MRS

25%

25% NaCl .......................................................................................39

Bảng 3.2: Một số chủng vi khuẩn có hoạt t nh protease cao nhất ...........................41
Bảng 3.3: Đánh giá cảm quan các mẫu nghiên cứu ..................................................42
Bảng 3.4: Đánh giá chất lƣợng chế phẩm vi sinh sử dụng trong sản xuất nƣớc mắm
sau bảo quản ..............................................................................................................53

VII


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Quy trình sản xuất nƣớc mắm Cát Hải – Hải Phòng ................................19
Hình 3.1: Sự biến động mật độ vi khuẩn hiếu kh trong mẫu chƣợp ở các giai đoạn
lên men khác nhau trên môi trƣờng NA và môi trƣờng NA 25% NaCl ..................36
Hình 3.2: Sự biến động mật độ vi khuẩn hiếu kh trong mẫu chƣợp ở các giai đoạn
lên men khác nhau trên môi trƣờng MRS và môi trƣờng MRS

25% NaCl...........37

Hình 3.3: Hình ảnh số lƣợng và các loại khuẩn lạc vi khuẩn hiếu kh mọc trên môi
trƣờng NA

25% NaCl. Hình ảnh chụp từ c ng nồng độ pha loãng mẫu ở chƣợp

lên men ở tháng 1 A và chƣợp lên men tháng 12 B . ...........................................38
Hình 3.4: hả năng sinh protease của 87 chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm .40
Hình 3.5: hả năng sinh protease của một số chủng vi khuẩn hoạt t nh cao ..........40
Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ ADN tổng
số. ..............................................................................................................................43
Hình 3.7:

huẩn lạc và tế bào chủng M1.

huẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi cấy, tế

bào chụp sau 24 giờ nuôi cấy ....................................................................................44
Hình 3.8:

huẩn lạc và tế bào chủng M2.

huẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi cấy, tế

bào chụp sau 24 giờ nuôi cấy ....................................................................................45
Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại của chủng M1 và M2 và các loài vi khuẩn thuộc
nhóm Bacillus amyloliquefaciens xây dựng dựa trên đoạn gene 16S rRNA............46
Hình 3.10: huẩn lạc và tế bào chủng H12 ..............................................................47
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại của chủng H12 với các loài có quan hệ họ hàng

gần trong chi Lysinibacillus dựa vào trình tự gen rRNA 16S……………..……..48
Hình 3.12: Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn .................50
Hình 3.13: hả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ...........................................51
Hình 3.14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy đến khả năng sống sót của tế bào trong chế
phẩm sau khi sấy .......................................................................................................52

VIII


MỞ ĐẦU

Nƣớc mắm là một loại nƣớc chấm quen thuộc đƣợc ƣa chuộng nhất ở nƣớc ta
và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày. Nƣớc mắm có giá trị dinh dƣỡng
cao, hấp dẫn ngƣời ăn bởi hƣơng vị đậm đà, đặc trƣng mà không loại sản phẩm nào
có thể thay thế đƣợc.
Nƣớc mắm là một mặt hàng chính của ngành thủy sản. Sản xuất nƣớc mắm
tiêu thụ khoảng 40-60% tổng số cá đánh bắt và đƣợc chế biến khắp nơi trên toàn
quốc. Nƣớc mắm đƣợc sản xuất từ cá và muối không chỉ đƣợc sử dụng rộng rãi ở
Việt Nam mà hiện nay còn đƣợc ƣa chuộng ở nhiều nƣớc trên thế giới. Mỗi quốc
gia có quy trình sản xuất nƣớc mắm khác nhau, tạo hƣơng vị riêng đặc trƣng cho
từng quốc gia, dân tộc: Jeot-kal ở Hàn Quốc, Shottusuru ở Nhật, Nam-pla ở Thái
Lan, Budu ở Malaysia…
Nƣớc mắm xuất hiện ở khắp mọi nơi, từ bữa ăn gia đình tới các bữa tiệc nhà
hàng, khách sạn ch nh điều đó nói lên t nh quan trọng của nƣớc mắm đối với đời
sống ẩm thực của dân tộc Việt Nam. Nƣớc mắm sản xuất theo phƣơng pháp cổ
truyền ở Việt Nam có mùi vị thơm ngon đặc trƣng. Tuy nhiên, nó có nhƣợc điểm là
hàm lƣợng nitơ không cao, chu kì sản xuất quá dài (từ 6 tháng đến 1 năm hoặc có
thể lâu hơn), tỷ lệ thu hồi không cao, thời gian ủ càng dài thì tỷ lệ thu hồi càng thấp,
giá thành sản phẩm cao vì vậy không kinh tế.
Mặt khác, trong quá trình ủ ch n cần sử dụng rất nhiều nhân công để theo dõi

“chăm sóc” hàng ngày với các hoạt động khấy đảo, phơi nắng, kéo rút… Để sản
xuất ra 1 l t nƣớc mắm thành phẩm thì công nhân phải tốn rất nhiều “mồ hôi và
công sức” nhƣng hiệu quả kinh tế mang lại không cao, thị trƣờng tiêu thụ hạn chế,
phản hồi từ ngƣời tiêu d ng không tốt nhƣ: vị quá mặn, màu không ổn định, bao bì
đơn giản không bắt mắt, thiếu quảng bá hình ảnh thƣơng hiệu…

1


Nhằm rút ngắn chu kỳ sản xuất, nâng cao hƣơng vị và chất lƣợng nƣớc mắm,
đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của thị trƣờng, góp phần giảm giá thành trong sản
xuất nƣớc mắm theo phƣơng pháp truyền thống là vấn đề cần thiết hiện nay.
Xuất phát từ yêu cầu đó tôi đã tiến hành đề tài : “Phân lập và tuyển chọn các
chủng vi khuẩn có hoạt tính cao trong quá trình lên men chượp mắm Cát Hải”.

2


CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN
Khái quát về nuớc mắm

1.1

1.1.1 Khái niệm
Nƣớc mắm là một dung dịch bao gồm các acid amin, muối NaCl và các chất
thơm, đƣợc tạo thành do quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease và
vi sinh vật có trong cá.
Nƣớc mắm là sản phẩm truyền thống của Việt Nam. Nƣớc mắm có từ lâu
đời, nó đã gắn liền với đời sống hàng ngày, mang nét đặc trƣng rất riêng.
1.1.2 Các loại nƣớc mắm

Nƣớc mắm đƣợc sản xuất từ cá và muối không chỉ đƣợc sử dụng rộng rãi ở
Việt Nam mà còn đƣợc ƣa chuộng tại nhiều nƣớc trên thế giới. Đặc biệt, nƣớc mắm
đƣợc sản xuất ở hầu hết các nƣớc Châu Á. Mỗi nƣớc có điều kiện sản xuất khác
nhau tạo ra sản phẩm có giá trịnh dinh dƣỡng và giá trị cảm quan khác nhau mang
hƣơng vị riêng đặc trƣng cho từng quốc gia, dân tộc.
Bảng 1.1: Tên các loại nước mắm và tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm ở cá nước khác
nhau
Nƣớc sản

Điều kiện và thời gian lên men

Tên gọi

xuất
Nhật Bản

Shottsuru Uwo- Tỷ lệ 5 : 1 = Cá : Muối + gạo lên men và koji
shoyu

(3:1), Thời gian lên men 6 tháng

Hàn Quốc

Jeot-kal

Tỷ lệ 4 : 1 = Cá : Muối (6 tháng)

Việt Nam

Nƣớc mắm

Thái Lan

Nam-pla

Malaysia

Budu

Tỷ lệ 3 : 1 - 3 : 2 = Cá : Muối (6-12 tháng)
Tỷ lệ 5 : 1 = Cá : Muối (5-12 tháng)
Tỷ lệ 5 : 1 - 3 : 1 = Cá : Muối

đƣờng + me (3-12

tháng)
Philippine

Patis

Tỷ lệ 3 : 1 - 4 : 1 = Cá : Muối (3-12 tháng)

Các loại nƣớc mắm ở Việt Nam
Trên thị trƣờng Việt Nam hiện nay có rất nhiều thƣơng hiệu nổi tiếng về
nƣớc mắm truyền thống, nhƣng đặc trƣng nhất và mang nét riêng của mỗi vùng
miền vẫn là nƣớc mắm Cát Hải (Hải Phòng , nƣớc mắm Phan Thiết (Bình Thuận),

3

nƣớc mắm Phú quốc

iên Giang . Hiện nay, trên thị trƣờng nƣớc mắm truyền

thống đƣợc phân loại theo độ đạm, có 4 loại cơ bản: loại cao đạm 40-60g gN/l; loại
33-35gN l, 27-30gN l và loại 15-18gN/l
1.1.3 Đặc điểm chung của nƣớc mắm
Theo Nguy n Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, Nguy n Việt Dũng, Nguy n Anh
Tuấn xuất bản năm 2011, thành phần dinh dƣỡng của nƣớc mắm là sự kết hợp tổng
hòa giữa các thành phần hóa học cơ bản và các thành phần tạo giá trị cảm quan
màu, m i, vị… . Thành phần của nƣớc mắm biến đổi liên tục trong quá trình chế
biến. Nƣớc mắm đƣợc chế biến theo phƣơng pháp cổ truyền sau 6 tháng coi nhƣ là
đã ch n và thành phần của chúng cũng tạm coi nhƣ đã ổn định, tuy vậy từ sau 6
tháng chúng vẫn tiếp tục biến đổi.
1.1.3.1 Độ mặn
Độ mặn là một trong những đặc điểm quan trọng để phân biệt nƣớc mắm
truyền thống và công nghiệp. Theo phƣơng pháp truyền thống, nƣớc nắm Cát Hải
đƣợc dùng muối để chế biến và bảo quản nên độ mặn phải đạt trong khoảng từ 245
– 290g muối/ lít sản phẩm theo quy định của của TCVN 5107-2003.
Trên thực tế, nếu độ mặn giảm xuống thấp hơn thì nƣớc mắm sẽ nhanh
chóng bị hƣ thối trong khoảng từ 7 – 10 ngày. Do đó, các loại mắm công nghiệp có
vị nhạt hơn thƣờng phải thêm nhiều chất bảo quản để lƣu giữ đƣợc trong thời gian
dài.
Với phƣơng pháp sản xuất nƣớc mắm Cát Hải, chƣợp đƣợc phơi nắng đánh
đảo đến trên 12 tháng nên hơi nƣớc sẽ bay lên và mất đi, lƣợng muối ở lại chỉ khi
đạt ngƣỡng nhƣ trên mới kết tinh thành hạt. hi đó, lƣợng muối trong phần nƣớc đã
đạt đến bão hòa.
1.1.3.2. Độ đạm
Các chất có đạm chiếm hàm lƣợng chủ yếu trong nƣớc mắm và nó cũng là
thành phần quyết định giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm.

4


Bảng 1.2:

m lượng a it amin trong nước mắm mg ml Đỗ Đình

ọc, 1990)

Theo Đỗ Đình Học 1990 hàm lƣợng axit amin trong ba loại nƣớc mắm
bảng 1.2), các chất có đạm trong nƣớc mắm bao gồm nitơ toàn phần, nitơ axit
amin, nitơ các chất bay hơi chủ yếu là NH3 … Ngƣời ta đã dựa vào lƣợng nitơ toàn
phần để phân hạng nƣớc mắm. Nƣớc mắm có thành phần dinh dƣỡng cao là vì nó
có đầy đủ các axit amin mà đặc biệt là các axit amin thiết yếu nhƣ valin, lơxin,
isolơxin, threonin, methionin, lysin, phenylalanin, triptophan và histidin.
Các th nghiệm nhỏ chế biến nƣớc mắm từ cá cơm đại diện cho cá nổi và cá
lƣợng đại diện cho cá đáy cho thấy hàm lƣợng các axit amin ở nƣớc cá cơm cao
hơn nhiều ở cá lƣợng là xistin, lysin, histidin, axit aspactic, treonin và alanin. Riêng
phenylalanin, xerin, tyrisin thì ở cá lƣợng cao hơn cá cơm một t. Từ đó cho ta thấy
thành phần hóa học của nƣớc mắm có khác nhau theo các nguyên liệu đem chế

5


biến, các axit amin có hàm lƣợng cao trong nƣớc mắm cá cơm và cá lƣợng là:
tyrosin, lơxin

isolơsin, lysin và xêrin; với hàm lƣợng trung bình là axit glutamic,

arginnin, treonin ở cá cơm và axit aspactic ở cá lƣợng ; với hàm lƣợng t là xistin,
lysin, alanin, prolin, phenylalanin…
1.1.3.3 Màu sắc
Nƣớc mắm ngon thƣờng có màu từ vàng rơm đậm đến vàng cánh gián, với
trạng thái: trong suốt, độ sánh cao, không có váng trên mặt, thể hiện nguồn nguyên
liệu cá tƣơi ngon và chất lƣợng. Nƣớc mắm ngon sau thời gian mở nắp và tiếp xúc
với không kh sẽ chuyển màu sẫm hơn. Đây chính là hiện tƣợng tự nhiên của nƣớc
mắm truyền thống, khi độ đạm trong nƣớc mắm bị oxy hóa. Thêm vào đó, cũng nên
chú ý quan sát kỹ chai nƣớc mắm dƣới ánh sáng và dốc ngƣợc chai. Nếu nƣớc mắm
trong và không có cặn là tốt, còn nếu có cặn và lắc không tan thì đó là tạp chất.
1.1.3.4 . Hƣơng vị
Thành phần các chất bay hơi của nƣớc mắm rất phức tạp và nó quyết định
hƣơng vị của nƣớc mắm. Theo nghiên cứu của Nonaka và cộng tác viên cho thấy
trong hợp chất bay hơi của nƣớc mắm có 12 loại trung t nh, bốn loại axit bay hơi,
tám loại amin bay hơi và bảy loại cacbonyl bay hơi nhƣ ở hình dƣới.
Hàm lƣợng các chất bay hơi trong nƣớc mắm mg 100g nƣớc mắm:
- Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde)
- Các acid bay hơi: 404-533 (propionic)
- Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin)
- Các chất trung t nh bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde)

6


Bảng

: Th nh ph n các ch t a h i trong nước mắm

Bản chất của quá trình sản xuất nƣớc mắm là quá trình thủy phân protein
trong cá nhờ hệ enzyme proteaza thành các sản phẩm pepton → polypeptid →

peptid → axit amin. Do vậy, trong sản xuất nƣớc mắm, quá trình thủy phân là yếu
tố mở đầu cho việc hình thành mùi vị và màu sắc của sản phẩm. Phản ứng thủy
phân tạo ra các axit amin sau đó các axit amin biến đổi theo bốn chiều hƣớng khác
nhau theo sơ đồ.
(1)
Vi sinh vật gây hƣơng
(2)

Thủy phân
Axit amin

Protein

(3)

Protease

Tạo mùi

Tạo vị ngọt đặc trƣng
Oxy hóa phi enzyme
Melanoidin

(4)
NH3
7

Mùi vị đặc trƣng

Màu

sắc
đặc trƣng


Theo sơ đồ trên:
Phản ứng theo chiều hướng (1), axit amin là cơ chất dinh dưỡng của vi sinh
vật gây hương, các vi sinh vật này hấp thụ axit amin, làm biến đổi tạo ra các chất
bay hơi tạo m i cho nƣớc mắm.
Phản ứng theo chiều hướng (2) là axit amin tạo nên vị ngọt đặc trưng của
nước mắm: Các axit amin này là sảm phẩm cuối cùng của phản ứng thủy phân
protein, vị ngọt của nƣớc mắm phụ thuộc nhiều vào hàm lƣợng và thành phần các
axit min.
Phản ứng theo chiều hướng (3) là một số axit amin bị oxy hóa tạo nên màu
sắc đặc trưng cho nước mắm hoặc tham gia phản ứng hóa học tạo màu, tạo mùi.
Màu sắc và mùi vị của nƣớc mắm dần dần đƣợc hình thành do quá trình sinh học,
hóa học xảy ra. Quá trình tạo màu đƣợc quyết định bởi những phản ứng oxy hóa
xảy ra không ngừng và là sự tổng hợp hòa giữa các chất tạo thành cùng màu sắc,
mùi vị đặc trƣng cho sản phẩm nƣớc mắm. Sự thay đổi về màu sắc trong quá trình
chín của chƣợp nguyên nhân do chính bản thân nguyên liệu và do phản ứng của các
axit amin gây nên nhƣ phản ứng oxy hóa nhƣ phản ứng melanoidin,
quinonmonin,… tạo sẫm màu cho sản phẩm.
Phản ứng theo chiều hướng (4) là một phần axit amin bị phân hủy bởi vi sinh
vật tạo ra NH3, chất này cũng tham gia tạo nên mùi vị cho nƣớc mắm. Lƣợng axit
amin còn lại sẽ tạo nên vị ngọt cho nƣớc mắm.
Trong quá trình ủ chín dịch đạm có hai phản ứng di n ra đồng thời để hình
thành nên mùi mắm đặc trƣng. Một là, phản ứng thủy phân protein do enzyme xúc
tác vẫn hoạt động, nhƣng với tốc độ yếu hơn so với điều kiện thủy phân tối ƣu. Hai
là, vi sinh vật sẽ sử dụng các nguồn chất hữu cơ sẵn từ các sản phẩm của phản ứng
thủy phân có để sinh tổng hợp tạo nên các chất m i đặc trƣng nhƣ 2 methylpropanal, 2 - methylbutanal, 2 – ethylpyridine và trisulfide dimethyl.
Nhƣ vậy, quá trình ủ ch n là công đoạn quan trọng để hình thành các giá trị

đặc trƣng màu sắc; mùi; vị cho nƣớc mắm truyền thống mà ở phƣơng pháp sản xuất
nƣớc mắm ngắn ngày và nƣớc mắm công nghiệp không thể có. Trong quá trình ủ
chín xảy ra hàng loạt các phản ứng thủy phân ở các cấp độ khác nhau, kết hợp với

8


hoạt động của các chủng vi sinh vật tạo lên sự biến đổi theo chiều hƣớng có lợi và
hình thành mùi vị đặc trƣng cho nƣớc mắm.
Qua các tài liệu tổng quan cho thấy hệ vi sinh vật đóng vai trò quan trọng và
có tính chất quyết định đến việc hình thành hương vi đặc trưng của nước mắm.
Nguồn nguyên liệu, quy trình sản xuất khác nhau sẽ có những hệ vi sinh vật gây
hương khác nhau. Trong pham vi luận văn sẽ hoàn thiện quy trình tạo hương nước
mắm đặc sản Cát Hải (từ cá quẩn, cá nhâm) bằng chế phẩm vi sinh.
1.2. Nguyên liệu sản xuất nƣớc mắm
1.2.1

Cá
Nguyên liệu ch nh d ng để sản xuất nƣớc mắm là các loại cá. Nó đóng vai

trò quan trọng, quyết định nhiều đến phần chất lƣợng và giá thành của nƣớc mắm,
do vậy, việc lựa chọn loại cá để đƣa vào sản xuất cũng là một vấn đề đáng quan tâm
và đƣợc nhà sản xuất hết sức coi trọng.
Nƣớc mắm chủ yếu đƣợc sản xuất từ các loại cá biển nhỏ nhƣ: cá nục, cá
tráp, cá liệt, cá tạp… là những loài cá có giá trị kinh tế thấp. Tuy nhiên, việc sử
dụng loại cá gì còn phụ thuộc vào từng vùng miền, từng mùa vụ khác nhau.
Các loài cá nhƣ cá Quẩn (cá Nục – Chi cá Nục Decapterus thuộc họ cá Khế
Carangidae), cá Nhâm (cá Trích – Clupeidae đƣợc phần lớn cơ sở sản xuất nƣớc
mắm lựa chọn, nguyên nhân chính là loài cá này có nguồn cung cấp dồi dào, giá
thành rẻ, d kiếm. Mặt khác, nƣớc mắm làm từ cá Nhâm cho màu nƣớc mắm đẹp

nhất (màu cánh dán), cá Quẩn cho lƣợng nƣớc mắm cốt nhiều hơn.
Vì cá là nguồn nguyên liệu ch nh để sản xuất ra nƣớc mắm nên ảnh hƣởng
trực tiếp tới chất lƣợng nƣớc mắm, do đó khi lựa chọn cá để làm mắm, cần phải đạt
các yêu cầu sau:
-

Nên sử dụng loại cá gầy, có hàm lƣợng lipit thấp (nên < 0,1%)

-

Nên sử dụng các loại cá có k ch thƣớc nhỏ, vì vậy sẽ không tốn nhân công

cho công đoạn xử lý nguyên liệu, đồng thời k ch thƣớc nhỏ diện tích bề mặt tiếp
xúc giữa muối và cá sẽ tăng lên làm cho quá trình thủy phân di n ra nhanh chóng.

9


Tuyệt đối không dùng các loại cá có chứa độc tố để làm nguyên liệu chế biến

-

nƣớc mắm. Nhƣ trong cá nóc có độc tố tetrodotocxin, không bị thủy phân trong quá
trình chế biến nƣớc mắm và không mất đi khả năng gây độc tố cho ngƣời sử dụng.
Thành phần hóa học của cá gồm: nƣớc, protide, lipid, glucid, muối vô cơ,
vitamine,... trong đó nƣớc chiếm tỉ lệ rất lớn, protide và lipid chiếm một phần đáng
kể, glucid trong cá thƣờng rất ít và tồn tại dƣới dạng glycogen. Các thành phần này
khác nhau và thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới t nh, điều kiện sinh sống.
Ngoài ra, các yếu tố nhƣ thành phần thức ăn, môi trƣờng sống, kích cỡ cá và các
đặc tính di truyền cũng ảnh hƣởng đến thành phần hóa học, đặc biệt ở cá nuôi.

Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau.
Bảng 1.4: Thành ph n hóa học của cá
Thành phần
Nƣớc

Protein

Lipid

Muối vô cơ

Thịt cá

48 – 85,1

10,3 – 24,4

0,1 – 5,4

0,5 – 5,6

Trứng cá

60 – 70

20 – 30

1 – 11

1–2

Gan cá

40 – 75

8 – 18

3–5

0,5 – 1,5

Da cá

60 – 70

7 – 15

5 – 10

1–3

Chỉ tiêu

Sự khác nhau về thành phần hóa học của cá và sự biến đổi của chúng có ảnh
hƣởng đến mùi vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm, việc bảo quản tƣơi nguyên
liệu và qui trình chế biến.
Bảng 1.5. Thành ph n hóa học cá biển
Thành phần hóa học (%
khối lƣợng)

TT

Nƣớc

Protein

Lipit

Tên loại cá
1

Nục sổ

76.80

21.75

0.85

2

Mối thƣờng

77.50

19.26

1.80

3

Trích

75.90

21.76

3.15

4

Phèn hai sọc

76.20

20.35

2.20

10


5

Lƣơn ngắn

79.30

19.03

1.21

6

Cơm

75.14

11.25

2.10

7

Mòi

76.60

9.37

14.40

8

Lẹp

81.84

10.00

1.40

9

Chuồn

76.17

9.75

7.50

Nƣớc: Đóng vai trò và chức năng quan trọng trong đời sống, chất lƣợng của
cá. Nƣớc tham gia vào phản ứng sinh hoá, vào các quá trình khuếch tán trong cá,
tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển.
Lipid: Cá sử dụng chất béo nhƣ là nguồn năng lƣợng dự trữ để duy trì sự
sống trong những tháng m a đông, khi nguồn thức ăn khan hiếm. Hàm lƣợng lipid
trong cá dao động nhiều (0,1-30%).
Protein: Có thể chia protein của mô cơ cá ra thành 3 nhóm sau:
- Protein cấu trúc: Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và tropomyosin,
chiếm khoảng 70 - 80% tổng lƣợng protein (so với 40% trong các loài động vật có
vú). Các protein này hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá
cao (> 0,5 M). Các protein cấu trúc có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động
của cơ.
-

Protein tƣơng cơ: Gồm myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm

khoảng 25-30% tổng luợng protein. Các

protein

này hòa

tan

trong

nuớc,

trong dung dịch muối trung tính có nồng dộ ion thấp <15M . Đa số
protein tƣơng cơ là các enzyme tham gia vào sự trao đổi chất của tế bào, nhƣ sự
chuyển hoá năng lƣợng trong điều kiện yếm khí từ glycogen thành ATP.
-

Protein mô liên kết: Bao gồm các sợi collagen. Chiếm khoảng 3% tổng

lƣợng protein trong cá xƣơng và khoảng 10% trong cá sụn. Có trong mạng luới
ngoại bào, không tan trong nuớc, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ
ion cao.
Protein của cá có thành phần acid amin gần giống protein trong cơ thịt của
động vật có vú, mặc d đặc tính vật lý có thể khác nhau đôi chút. Điểm đẳng điện
(pI) của protein cá vào khoảng pH 4,5 - 5,5. Tại giá trị pH này, protein có độ hòa

11


tan thấp nhất. Giống nhƣ protein trong sữa, trứng và thịt của động vật có vú, protein
trong cá có tất cả các acid amin chủ yếu và có giá trị sinh học rất cao.
Bảng 1.6: Các acid amin chủ yếu (%) trong các protein khác nhau

Acid amin

Cá

Sữa

Thịt bò

Trứng

Lysine

8.8

8.1

9.3

6.8

Trytophan

1.0

1.6

1.1

1.9

Histidine

2.0

2.6

3.8

2.2

Phenylalanine

3.9

5.3

4.5

5.4

Leucine

8.4

10.2

8.2

8.4

Isoleucine

6.0

7.2

5.2

7.1

Threonine

4.6

4.4

4.2

5.5

Methionine-cystine

4.0

4.3

2.9

3.3

Valine

6.0

7.6

5.0

8.1

1.2.2 Nƣớc
Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình
thủy phân nhanh hơn. Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân tốt nhất là
khoảng 30 – 40% so nguyên với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10%
muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 540C – 580C trong suốt thời gian lên men
là 64 – 72 giờ.
1.2.3 Muối
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc mắm, thiếu
muối nƣớc mắm sẽ không hình thành đƣợc.
Nhờ khả năng hút nƣớc nên muối đƣợc dùng tồn trữ thực phẩm, ức chế đƣợc
vi sinh vật phát triển trong thực phẩm trừ các loại vi sinh vật chịu mặn
Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nƣớc mắm phải là muối ăn
(NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn
cao, màu trắng óng ánh, không đóng cục, không có vị đắng chát.

12


1.2.4. Enzyme protease
Quá trình chế biến nƣớc mắm các thành phần cơ thịt cá bị biến đổi mà chủ

yếu là protein bị thủy phân dƣới tác dụng của các enzyme có sẵn trong bản thân cá
thành các sản phẩm trung gian và cuối cùng là các acid amin.
Nhƣ vậy sản phẩm thủy phân của protein là bao gồm các polypeptide,
peptone, peptide và các acid amin. Trong hầu hết các acid amin thu nhận đƣợc khi
thuỷ phân protein đều ở dạng L - α amino acid. Vị của acid amin phụ thuộc vào cấu
trúc không gian, dạng L có vị đắng, dạng D có vị ngọt, còn acid amin có gốc R
mạch vòng có cả vị đắng và vị ngọt.
Quá trình thủy phân là một quá trình phức tạp vì t nh đặc hiệu enzyme chỉ
tác dụng lên một vài cơ chất đặc biệt nào đó và một vài kiểu liên kết nhất định.
- Nhóm protease có tác dụng thủy phân protein nhƣ pepsin, trypsin, papain, bromelin.
- Nhóm peptidase có tác dụng thủy phân các polypeptide, nhóm này gồm các
enzyme nhƣ carboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase.
Sự tham gia của enzyme trong quá trình theo cơ chế xúc tác gồm 3 bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein, bƣớc này
xảy ra nhanh và không bền.
Bƣớc 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối
liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. hi đó phức chất ES đồng thời xảy ra
hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến cực hóa các mối liên kết
tham gia vào phản ứng và sự biến dạng mối hình học của nối liên kết đồng hóa trị
trong phân tử protein cũng nhƣ trung tâm hoạt động của enzyme làm cho quá trình
thủy phân di n ra d dàng hơn.
Bƣớc 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin, peptid cấp thấp, giải phóng enzyme.
Các hệ enzyme tham gia vào quá trình chế biến nước mắm
Trong quá trình chế biến nƣớc mắm có rất nhiều hệ enzyme tham gia nhƣng
chủ yếu là hệ enzyme tham gia vào quá trình thủy phân protein, gồm có
metaloprotease và serin-protease, acid protease.
Hệ enzyme Metalo-protease
Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu đƣợc nồng độ cao nên
ngay từ đầu đã hoạt động mạnh và giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme

13


có hoạt t nh khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đâu
là nhóm thủy phân enzyme trung t nh, pH tối th ch từ 5-7.
Hệ enzyme serin-protease
Hệ này tồn tại nhiều trong nội tạng cá, điển hình là enzyme trypsin. Ở giai
đoạn đầu của quá trình sản xuất nƣớc mắm hệ enzyme hoạt động yếu, sau phát triển
dần và đạt giá trị cực đại vào tháng thứ 3 rồi giảm dần đến khi chƣợp ch n. Hệ
enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi các acid amin trong cấu trúc của enzyme.
Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH 9.
Hệ enzyme acid-protease
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme
này d bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thƣờng nó chỉ tồn tại một thời
gian ngắn ở thời kỳ đầu của quá trình thủy phân. Loại enzym này đóng vai trò thứ
yếu trong quá trình sản xuất nƣớc mắm.
Nguồn thu nhận enz me protease:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số và một số loại nấm men.


Vi khuẩn
Lƣợng protease sản xuất từ vi khuẩn đƣợc ƣớc t nh vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lƣợng enzyme đƣợc sử dụng .
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có t nh đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
Nguy n Trọng Cẩn và cs, 1998 . Các vi khuẩn thƣờng tổng hợp các protease hoạt
động th ch hợp ở v ng pH trung t nh và kiềm yếu.
Các protease trung t nh của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp pH 5-8) và có
khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung t nh tạo ra dịch thủy phân protein thực
phẩm t đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dƣỡng. Các protease

14


trung t nh có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ƣa béo và thơm. Chúng
đƣợc sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số
giống thuộc chi Clostridium.


Protease của Bacillus ƣa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lƣợng phân
tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH
rộng 7-12 . Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn protease đƣợc ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola,
A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum … Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung t nh. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác nhƣ: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho
mát.



Xạ khuẩn
Về phƣơng diện tổng hợp protease, xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu t hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao nhƣ: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn đƣợc biết nhiều là pronase Nhật đƣợc
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc t nh đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô cũ ,
ngƣời ta cũng tách đƣợc chế phẩm tƣơng tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết đƣợc keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm đƣợc sản xuất có tên là M-Zim d ng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt t nh elastase cao, do đó chúng đƣợc d ng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trƣớc. Yếu tố tăng cƣờng quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine đƣợc lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.

15