Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ TRÚC LINH

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC
KHÁNG VỚI VI KHUẨN
GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH
(Vibrio parahaemolyticus)
TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
(Penaeus vannamei)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CẦN THƠ, 2018


TÓM TẮT
Tuyển chọn vi khuẩn lactic (LAB) kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử
gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei) được thực hiện tại Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 12/2014 đến
4/2017. Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra chủng LAB có khả năng phòng
bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng. Nghiên cứu
được thực hiện với các nội dung (1) Phân lập LAB từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô
phi và bùn đáy ao nuôi tôm ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng và sàng
lọc các chủng LAB bằng các chỉ tiêu: hình thái, sinh lý, sinh hóa; (2) Xác định
tính đối kháng của LAB phân lập được với vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng
phương pháp khuếch tán giếng thạch, đồng thời xác định khả năng kháng V.
parahaemolyticus bằng bacteriocin và khả năng chịu đựng nồng độ muối của 5
chủng LAB kháng với V. parahaemolyticus mạnh nhất cũng được tiến hành;

(3) Thử nghiệm ảnh hưởng của LAB bổ sung vào thức ăn lên khả năng kháng
AHPND. Thí nghiệm này đã được tiến hành nhằm xác định ảnh hưởng của
LAB bổ sung vào thức ăn đến tỷ lệ sống và khả năng kháng AHPND trên tôm
thẻ chân trắng. Đồng thời, ảnh hưởng của việc bổ sung C, N và P lên khả năng
kháng AHPND của 3 chủng LAB cũng được xác định; (4) Định danh chủng
LAB có khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ.
Kết quả phân lập LAB từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao
nuôi tôm biển ở 3 tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng và Bến Tre đã thu được 94 chủng
LAB bao gồm: 30 chủng LAB ở Trà Vinh, 25 chủng LAB ở Sóc Trăng, và 39
chủng LAB ở Bến Tre. Kết quả sàng lọc về các chỉ tiêu hình thái cho thấy tất
cả các khuẩn lạc phân lập được đều có màu trắng đục, tròn, lồi, có kích cỡ 1-2
mm sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS agar bổ sung 1,5% NaCl. Đối
với chỉ tiêu sinh lý cũng cho thấy rằng dưới kính hiển vi LAB có hình cầu và
hình que, Gram dương, không sinh bào tử. Kết quả xác định đặc điểm sinh hóa
đã chỉ ra rằng tất cả các chủng LAB được lựa chọn đều có khả năng làm tan
CaCO3, âm tính oxidase và catalase nhưng dương tính với O/F.
Kết quả xác định tính đối kháng bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch đã cho thấy hầu hết 94 chủng LAB phân lập được đều có khả năng
kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Trong 94 chủng phân lập được có 82
chủng LAB có khả năng kháng với V. parahaemolyticus nhưng chỉ ở mức yếu
(+) và trung bình (++). Mười hai chủng LAB còn lại bao gồm 08 chủng phân
lập được ở Trà Vinh và 04 chủng LAB phân lập ở Bến Tre có khả năng kháng
V. parahaemolyticus ở mức cao (+++) với vòng kháng khuẩn lớn hơn 16 mm,
đặc biệt có 05 chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) có khả năng
kháng V. parahaemolyticus mạnh nhất với vòng kháng khuẩn từ 17,5-18,5

iii


mm. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo bacteriocin và tính kháng khuẩn của

LAB với V. parahaemolyticus cho thấy rằng chúng không có khả năng ức chế
vi khuẩn V. parahaemolyticus thí nghiệm. Các chủng LAB dùng trong thí
nghiệm đều phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn
5‰ với thời gian nuôi 48 giờ và phát triển chậm hơn ở độ mặn 25‰ với thời
gian nuôi 96 giờ. Kết quả xác định thời gian và mật số LAB khác nhau lên khả
năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus cho thấy mật số LAB đến 107
CFU/mL với các thời gian nuôi từ 24 đến 96 giờ đều không có khả năng kháng
vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của việc bổ sung LAB vào thức ăn đến
tỷ lệ sống và khả năng kháng AHPND trên tôm thẻ chân trắng đã cho thấy ở
các nghiệm thức có bổ sung LAB vào thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn
V. parahaemolyticus thì tỷ lệ sống của tôm rất cao và khác biệt không có ý
nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm (87,77%). Tỉ lệ sống của tôm
cao nhất là ở nghiệm thức bổ sung chủng LAB5 (92,23%). Ngoài ra, tôm ở các
nghiệm thức này không có dấu hiệu AHPND. Ở các nghiệm thức cảm nhiễm
vi khuẩn V. parahaemolyticus, tôm có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của AHPND
và chết nhiều nhất ở nghiệm thức VP+LAB3, tỉ lệ chết lên đến 70,02%, kế đến
là nghiệm thức đối chứng dương (54,43%) và nghiệm thức VP+LAB4
(43,33%). Tuy nhiên, ở các nghiệm thức VP+LAB1,VP+LAB2 và VP+LAB5
tôm có tỷ lệ sống khá cao từ (73,33-79,77%), khác biệt không có ý nghĩa
thống kê so với nghiệm thức ĐCA (87,77%) và phần lớn mẫu gan tụy thu
được không có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
khi phân tích mô bệnh học.
Kết quả thử nghiệm khả năng kháng AHPND của LAB có bổ sung các
thành phần acid glutamic, đường trehalose, KH2PO4, và K2HPO4 với tỷ lệ C,
N, P là 15, 1, 0,1 cho thấy hầu hết các nghiệm thức khi bổ sung các thành phần
trên, tỷ lệ sống của tôm thấp hơn so với các nghiệm thức không bổ sung trong
trường hợp có và không có cảm nhiễm V. parahaemolyticus. Đối với các
nghiệm thức không cảm nhiễm V. parahaemolyticus thì tôm không có biểu
hiện bệnh lý đặc trưng của AHPND, tỷ lệ sống của tôm lên đến 88,2% đối với

nghiệm thức không bổ sung C, N, P và 82% đối với nghiệm thức có bổ sung
C, N, P. Tuy nhiên, hai nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa thống kê
với nhau. Kết quả phân tích mô bệnh học cũng không thấy mẫu gan tụy có dấu
hiện bất thường. Tuy nhiên, các nghiệm thức có cảm nhiễm V.
parahaemolyticus và bổ sung C, N, P thì tỷ lệ sống của tôm thấp hơn so với
các nghiệm thức còn lại. Tỷ lệ sống thấp nhất là ở nghiệm thức đối chứng
dương có bổ sung và không bổ sung C, N, P lần lượt là (47 và 52%) và tỉ lệ

iv


sống cao nhất là nghiệm thức LAB1 (76 và 78%). Kết quả mô bệnh học cho
thấy ở các nghiệm thức bổ sung C, N, P và LAB đồng thời cảm nhiễm V.
parahaemolyticus thì gan tụy tôm ít bị ảnh hưởng của sự cảm nhiễm AHPND.
Việc bổ sung LAB vào thức ăn đặc biệt là chủng LAB1 có khả năng làm hạn
chế AHPND trên tôm thẻ. Kết quả định danh chủng LAB1 bằng phương pháp
giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA đã xác định chủng vi khuẩn này là
Lactobacillus plantarum.
Từ khóa: AHPND, LAB, Lactobacillus plantarum, Tôm thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei), Vibrio parahaemolyticus.

v


2.3.6. Các yếu tố môi trường tác động đến vi khuẩn V. parahaemolyticus 18
2.3.7. Một số giải pháp được áp dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy ... 19
2.4. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic ..................................................... 21
2.4.1. Sơ lược về vi khuẩn lactic ................................................................. 21
2.4.2. Đặc tính chung của vi khuẩn lactic ................................................... 23
2.4.3. Ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên sự phát triển của LAB .......... 24

2.4.4. Khả năng kháng với kháng sinh ........................................................ 25
2.4.5. Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ........................................... 25
2.4.6. Các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic trong
nuôi trồng thủy sản ...................................................................................... 28
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 38
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 38
3.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 38
3.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị phục vụ nghiên cứu .................................. 38
3.2.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................... 38
3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 39
3.3.1. Phân lập LAB từ nhiều nguồn khác nhau.......................................... 39
3.3.2. Xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi
khuẩn V. parahaemolyticus trong điều kiện in vitro ................................... 41
3.3.3. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp khi bổ sung
các chủng LAB vào thức ăn ........................................................................ 43
3.3.4. Định danh chủng LAB có khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp
tính ............................................................................................................... 49
3.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 49
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ........................................................... 50
4.1. Phân lập các chủng LAB và xác định các chỉ tiêu hình thái sinh lý sinh
hóa. ................................................................................................................... 50
4.1.1. Phân lập LAB .................................................................................... 50
4.1.2. Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của LAB .......... 51
4.2. Kết quả xác định tính đối kháng của vi khuẩn lactic với vi khuẩn V.
parahaemolyticus trong điều kiện in vitro ....................................................... 52

x


4.2.1. Kết quả xác định khả năng tạo ra bacteriocin và tính kháng khuẩn

của LAB với V. parahaemolyticus .............................................................. 56
4.2.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của mật số nuôi vi khuẩn
lactic và thời gian ủ khác nhau lên khả năng kháng V. parahaemolyticus . 58
4.2.3. Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng lên mật số của
vi khuẩn lactic.............................................................................................. 58
4.3. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp của các chủng
LAB bằng phương pháp cho ăn. ...................................................................... 60
4.3.1. Biến động các yếu tố môi trường trong các lô thí nghiệm ................ 60
4.3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng tôm thí nghiệm ..................................... 61
4.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung LAB vào thức ăn lên tỷ lệ sống và khả
năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei). ................................................................................................... 61
4.4. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của chủng vi
khuẩn lactic có bổ sung các thành phần C,N,P (acid glutamic, KH2PO4,
K2HPO4, và đường trehalose) vào môi trường nước thí nghiệm. .................... 71
4.4.1. Mật số vi khuẩn Vibrio trong nước ................................................... 71
4.4.2. Mật số vi khuẩn Vibrio tổng trong ruột tôm thí nghiệm ................... 73
4.4.3. Mật số Vibrio có khuẩn lạc màu xanh trong ruột tôm thí nghiệm .... 75
4.4.4. Mật số vi khuẩn lactic trong ruột tôm thí nghiệm ............................. 77
4.4.5. Dấu hiệu bệnh lý và tỷ lệ sống ......................................................... 80
4.4.6. Kết quả phân tích mô bệnh học ......................................................... 83
4.5. Kết quả định danh LAB có khả năng kháng mạnh nhất với vi khuẩn V.
parahaemolyticus ............................................................................................. 85
4.5.1. Kết quả định danh LAB1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ... 86
4.5.2. Kết quả định danh LAB2 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ... 87
4.5.3. Kết quả định danh LAB3 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ... 87
4.5.4. Kết quả định danh LAB4 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ... 88
4.5.5. Kết quả định danh LAB5 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ... 89
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................... 91
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 91

xi


5.2. Đề xuất ...................................................................................................... 91
DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ ....................................................... 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 93

xii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Tỷ lệ các thành phần nguyên tố và protein trong vi khuẩn ....... 13
Bảng 2.2: Các sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động của vi khuẩn lactic
..................................................................................................................... 26
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic... 51
Bảng 4.2: Biến động của mật số LAB ở các nồng độ muối khác nhau theo
thời gian nuôi cấy ........................................................................................ 59
Bảng 4.3: Biến động các yếu tố thủy lý hóa trong các lô thí nghiệm ......... 60
Bảng 4.4: Biến động của mật số Vibrio trong nước thí nghiệm ................. 62
Bảng 4.5: Mật số vi khuẩn Vibrio tổng trong ruột tôm thẻ ......................... 64
Bảng 4.6: Mật số LAB trong ruột tôm thẻ thí nghiệm ................................ 67
Bảng 4.7: Biến động mật số Vibrio trong nước thí nghiệm ........................ 72
Bảng 4.8: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio tổng trong ruột tôm thí nghiệm
..................................................................................................................... 74
Bảng 4.9: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio có khuẩn lạc màu xanh trong
ruột tôm thí nghiệm ..................................................................................... 75
Bảng 4.10: Biến động mật số LAB trong ruột tôm thí nghiệm................... 78

xiii

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Sản lượng tôm nuôi thế giới.......................................................... 6
Hình 2.2: Sản lượng tôm thẻ nuôi ở chấu Á giai đoạn 2011-2018 ............... 7
Hình 2.3: Diễn biến diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng trong giai đoạn 20082014 ............................................................................................................... 9
Hình 2.4: Biểu hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm ....................... 14
Hình 2.5: Mô bệnh học tôm hoại tử gan tụy AHPND ................................ 16
Hình 2.6: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic ........................................ 22
Hình 4.1: Các chủng LAB được phân lập từ ruột tôm ................................ 50
Hình 4.2: Các chủng LAB được phân lập từ ruột cá rô phi ........................ 50
Hình 4.3: Các chủng LAB được phân lập từ bùn ....................................... 51
Hình 4.4: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V. parahaemolyticus tại Trà
Vinh ............................................................................................................. 53
Hình 4.5: Khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng vi khuẩn lactic
phân lập được tại Trà Vinh ......................................................................... 54
Hình 4.6: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V. parahaemolyticus tại Sóc
Trăng ........................................................................................................... 54
Hình 4.7: Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với vi khuẩn V.
parahaemolyticus ở tỉnh Sóc Trăng ............................................................ 55
Hình 4.8: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V. parahaemolyticus tại Bến
Tre ............................................................................................................... 55
Hình 4.9: Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với vi khuẩn V.
parahaemolyticus ở tỉnh Bến Tre ................................................................ 56
Hình 4.10: Kết quả xác định khả năng tạo bacteriocin và tính kháng khuẩn
của LAB với V. parahaemolyticus .............................................................. 57
Hình 4.11: Tỷ lệ chết của tôm qua từng mốc thời gian thí nghiệm ............ 68
Hình 4.12: Tỷ lệ sống của tôm thẻ được cho ăn thức ăn có bổ sung LAB . 68
Hình 4.13: Mô bệnh học tôm thí nghiệm .................................................... 71

xiv


Hình 4.14: Hình tôm và gan tụy tôm .......................................................... 80
Hình 4.15: Tỷ lệ chết của tôm qua từng giai đoạn thí nghiệm .................... 82
Hình 4.16: Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm ..... 82
Hình 4.17: Kết quả mô bệnh học gan tụy tôm ............................................ 85
Hình 4.18: Kết quả tương đồng của chủng LAB1 với Lactobacillus
plantarum . .................................................................................................. 86
Hình 4.19: Kết quả tương đồng của chủng LAB2 với Pediocococcus
pentosaceus . ............................................................................................... 87
Hình 4.20: Kết quả tương đồng của chủng LAB3 với Lactococus garvieae .
..................................................................................................................... 88
Hình 4.21: Kết quả tương đồng của chủng LAB4 với Lactobacillus
fermentum . .................................................................................................. 89
Hình 4.22: Kết quả tương đồng của chủng LAB5 với Pediocococcus
pentosaceus. ................................................................................................ 90

xv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

FAO:

Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông
nghiệp Liên Hợp Quốc)

OIE:

Office International des Epizooties (Tổ chức thú y thế giới)

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long
CFU:

Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

AHPNS:

Acute Hepatapancreatic Necrosis Syndrome (hội chứng hoại tử gan
tụy cấp)

AHPND: Acute Hepatapancreatic Necrosis Disease (bệnh hoại tử gan tụy cấp
tính)
EMS:

Early Mortality Syndrome (hội chứng tôm chết sớm)

NA:

Nutrient Agar (cấy tổng vi khuẩn)

TCBS:

Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (cấy vi khuẩn Vibrio)

MRSA: Man Rogosa Sharpe Agar (cấy vi khuẩn lactic)
MRSB: Man Rogosa Sharpe Broth (Môi trường nuôi vi khuẩn lactic)
TSA:

Tryptone Casein Soy Agar (cấy tổng vi khuẩn)

TSB:

Tripticase Soya Broth (môi trường nuôi cấy tổng vi khuẩn)

GAV:

Gill Associated Virus (Bệnh liên quan đến mang)

HPV:

Hepatopancreatic Parvovirus (Parvovirus gây bệnh gan tụy)

IHHNV: Infectious Hypothermal And Hematopoietic Necrosis Virus ( Virus
gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu)
MBV:

Monodon Baculo Virus (Virus gây bệnh còi trên tôm)

TSV:

Taura Syndrome Virus (Hội chứng taura)

WSSV:

White Spot Syndrome Virus (Virus gây bệnh đốm trắng)

YHV:

Yellow Head Virus (Bệnh đầu vàng)

PCR:

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuổi

DNA:

Deoxyribo Nucleic Acid

PL:

Post Larval (Hậu ấu trùng)

VASEP: Vietnam Association of Seafood Exporters and producers (Hiệp hội

xvi


chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam)
NTTS:

Nuôi trồng thủy sản

BTS: Bộ Thủy sản
GRAS: Generally Recognized as Safe (Chứng nhận an toàn thực phẩm)
NCBI: National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin
Công nghệ Sinh học Quốc gia)
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

xvii


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Việc nuôi tôm sú, tôm thẻ ở Đồng Bằng sông Cửu Long trong những
năm trước đây đã đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể và góp phần vào việc phát
triển nền kinh tế cho cả nước. Nhưng trong khoảng thời gian gần đây, nghề
nuôi tôm đang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô
nhiễm và hiện tượng tôm chết hàng loạt. Trong đó đáng quan tâm nhất là hội
chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome AHPNS) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early mortality
syndrome – EMS) (Lightner et al., 2012). Bệnh đã gây ra thiệt hại cho người
nuôi trên 1 tỷ USD/năm (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015). Hội
chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt
Nam vào năm 2010 rồi đến Thái Lan và Mã Lai vào năm 2011 (Lightner et al.,
2012; Flegel, 2012). Bệnh xuất hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các
Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, và Cà Mau. Tổng số diện tích nuôi thiệt
hại ở ĐBSCL là 39.000 ha (FAO, 2013). Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ
khoảng 10-45 ngày sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những
ao bị nhiễm nặng. Tác nhân gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi
khuẩn V. parahaemolyticus (Lightner et al., 2012) mang thể thực khuẩn
(Bateriophage) (Loc Tran et al., 2013). Hiện nay có nhiều biện pháp được đề
xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây hội
chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng kháng sinh,
áp dụng biện pháp sinh học,.... Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất, kháng
sinh thì hiệu quả không cao, dễ gây ra nguy cơ phát sinh nhiều loài vi khuẩn
gây bệnh kháng với kháng sinh. Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc trong thực
phẩm cũng là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm nông
nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện
pháp pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi có khả năng đối kháng với vi khuẩn

gây bệnh. Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn
gây bệnh mà còn đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường
do chỉ sử dụng các loài vi khuẩn hữu ích (Huỳnh Ngọc Trưởng và ctv., 2015).
Vi khuẩn lactic (LAB) đã được ứng dụng rộng rãi và ngày càng phổ biến
trong việc sản xuất chế phẩm sinh học, bổ sung trong thức ăn động vật thủy
sản, thức ăn chăn nuôi cũng như việc bón vào ao nuôi để ức chế các loài vi
khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản. Trong nghiên cứu về các loài vi khuẩn
hữu ích thì có một số dòng vi khuẩn tiết ra chất ức chế đề kháng lại với vi
khuẩn khác như Lactobacillus sp. kháng lại vi khuẩn Vibrio sp. (Trịnh Hùng
Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả năng kháng mạnh đối với

1


Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu và ctv., 2010). Trong
quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra acid hữu cơ, chúng ức chế vi khuẩn
gây bệnh do sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức
năng bảo vệ của màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000; Gerald, 1999;
Kuipers et al., 2000). Các nghiên cứu vừa nêu đã cho thấy dòng vi khuẩn
lactic có khả năng tiết ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh. Việc nghiên cứu khả
năng phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn là rất khả thi và đặc biệt là việc
giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại chế phẩm vi sinh. Chúng được
phân chia thành các loại như chế phẩm cải thiện sức khỏe (probiotics); chế
phẩm cải thiện môi trường (bioremediation); và chế phẩm ức chế tác nhân gây
bệnh (bio-control). Trên thực tế, người nuôi đã sử dụng nhiều loại chế phẩm vi
sinh khác nhau trong quá trình nuôi tôm, nhưng bệnh hoại tử gan tụy vẫn diễn
ra và gây thiệt hại to lớn về kinh tế. Thế nhưng, vẫn chưa có công bố nào về
việc nghiên cứu chế phẩm vi sinh trong phòng bệnh hoại tử gan tụy trên tôm
biển. Do đó, để giải quyết vấn đề cấp bách trong việc phòng trị bệnh hoại tử

gan tụy cấp tính cũng như góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng
cao chất lượng tôm biển trên thị trường thế giới. Việc tuyển chọn vi khuẩn
lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (V.
parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) là việc thật sự
cấp thiết.
1.2. Mục tiêu tổng quát
Sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ao nuôi
tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh
học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản đồng thời làm giảm việc sử dụng hóa chất
kháng sinh, là sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng thực phẩm thủy sản.
1.3. Mục tiêu cụ thể
Sưu tập và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô
phi và bùn đáy ao nuôi tôm đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm he, từ đó
sử dụng chúng để phòng bệnh AHPND trên đàn tôm nuôi.
1.4. Nội dung nghiên cứu
 Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao
nuôi tôm thẻ
 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng đối
kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn lactic

2


 Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp khi bổ sung các
chủng LAB vào thức ăn.
 Định danh loài vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh nhất với vi
khuẩn V. parahaemolyticus.
1.5. Ý nghĩa nghiên cứu
 Luận án đã sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ

ruột cá rô phi và ruột tôm thẻ nhằm góp phần tạo nguồn vi khuẩn hữu ích
có khả năng ngăn ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nước lợ
nói chung và tôm thẻ nói riêng. Đồng thời, các chủng LAB này có thể sử
dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản,
đóng góp vào sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững.
 Luận án đã góp phần mở rộng cơ hội cho người nuôi tôm giảm thiểu việc
sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi tôm vùng ven biển, đồng thời tạo ra
sản phẩm sạch và giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực của nghề nuôi đến môi
trường xung quanh.
1.6. Điểm mới của luận án
 Luận án đã sàng lọc được 12 chủng LAB có khả năng kháng tốt với V.
parahaemolyticus với đường kính vòng vô khuẩn từ 16,5-18,5mm. Trong
đó có 05 chủng có khả năng kháng V. parahaemolyticus rất tốt, đường
kính vòng vô khuẩn là 17,5-18,5mm.
 Luận án xác định được các chủng LAB được lựa chọn đều phát triển tốt
nhất ở nồng độ muối 5‰ và chúng có thể phát triển trong môi trường có
nồng độ muối từ 0-25‰.
 Luận án đã định danh được chủng LAB có khả năng làm giảm thiểu đáng
kể bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong nuôi tôm thẻ là chủng
Lactobacillus plantarum khi trộn vào thức ăn với mật số 109CFU/g.
Chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học.
 Luận án đã xác định được khi bổ sung các thành phần acid glutamic,
KH2PO4, K2HPO4, và đường trehalose theo tỷ lệ C, N, và P theo tỷ lệ 15,
1 và 0,1 đã làm tăng sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hoại tử cấp tính,
đồng thời làm tăng khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm
thẻ.

3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về tôm thẻ chân trắng
Theo ITIS (2016), tôm thẻ chân trắng được phân loại theo hệ thống như
sau:
Ngành (phylum):
Arthropoda
Ngành phụ (subphylum):
Crustacea Brünnich, 1772
Lớp (class):
MalacostracaLatreille, 1802
Lớp phụ (subclass):
Eumalacostraca Grobben, 1892
Liên bộ (superorder):
Eucarida Calman, 1904
Bộ (order):
Decapoda Latreille, 1802
Liên họ (superfamily): Penaeoidea Rafinesque, 1815
Họ (family):
Penaeidae Rafinesque, 1815
Giống (Genus):
Litopenaeus Pérez Farfante, 1969
Loài (species): Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)
Tôm thẻ chân trắng phân bố tự nhiên ở bờ Đông của Thái bình Dương từ
Sonora phía Bắc Mexico đến Trung, Nam Mỹ và xa nhất về phía nam là
Tumbes của Peru. Tôm thẻ chân trắng sống trong môi trường biển nhiệt đới,
nơi có nhiệt độ lớn hơn 20o C trong suốt năm. Tôm trưởng thành sống và sinh
sản ở biển, trong khi hậu ấu trùng (postlarvae) di cư vào ven bờ và sống suốt
giai đoạn ấu niên và tiền trưởng thành ở vùng cửa sông ven biển. Tôm đực lần
đầu thành thục khi đạt 20 g và tôm cái lần đầu thành thục khi đạt 28 g. Tôm 6
-7 tháng tuổi có khối lượng khoảng 30-45 g sẽ sinh sản 100.000-250.000

trứng, đường kính trứng khoảng 0,22 mm. Trứng sau khi thụ tinh 16 giờ sẽ nở
thành ấu trùng nauplius, lúc này ấu trùng không ăn thức ăn ngoài mà sống nhờ
noãn hoàng. Các giai đoạn ấu trùng tiếp theo (zoea và mysis) sống trôi nổi và
ăn phytoplankton và zooplankton. Hậu ấu trùng sẽ chuyển sang sống đáy sau 5
ngày biến thái (lột xác thành hậu ấu trùng), lúc này chúng ăn mùn bã hữu cơ,
giun, giáp xác và hai mảnh vỏ (FAO, 2006).
Tôm thẻ chân trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh, trung bình khoảng 11,5 g/tuần cho đến khi đạt kích cỡ 20 g (mật độ nuôi 150 con/m2). Tôm nuôi
sẽ sinh trưởng chậm lại khi tôm lớn hơn 20 g chỉ khoảng 1g/tuần (FAO,
2004). Trong điều kiện nuôi tôm ao đất tại Châu Á cho thấy tốc độ sinh trưởng
phổ biến 1,3-1,5 g/tuần với tỷ lệ sống từ 60–90% (Chamberlain, 2001). Thông
thường mật độ nuôi tôm thẻ chân trắng phổ biến khoảng 60-150 con/m2 và
thậm chí trên 400 con/m2 trong điều kiện kiểm soát và quản lý tốt (Browdy et
al., 2012).

4


2.1.1. Hiện trạng nghề nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới
Nghề nuôi tôm ven biển phát triển mạnh từ những năm cuối của thập
niên 80 và sự thâm canh hóa từ đầu thập niên 90 ở các quốc gia Đông Nam
Á. Nghề nuôi tôm biển không những góp phần nâng cao sản lượng tôm cho
toàn thế giới mà còn tạo việc làm và tăng nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều
lao động địa phương ven biển. Tôm thẻ chân trắng di nhập và được nuôi ở
nhiều quốc gia như Đài Loan (1995), Philippines (1997), Trung Quốc, Thái
Lan (1998), Việt Nam (2000) và nhiều nước khác (Briggs et al.,2005). Châu
Á có vị trí hàng đầu trong sản xuất tôm của thế giới, tôm nuôi của khu vực
này chiếm phần lớn trong sản lượng toàn cầu. Có thể chia sản lượng tôm nuôi
châu Á theo 3 khu vực chính là Đông Nam Á, Trung Quốc và Ấn
Độ/Bangladesh.
Trung Quốc là nước có nghề nuôi tôm phát triển rất nhanh, vượt qua tất

cả các nước khác để dẫn đầu thế giới về sản lượng nuôi, từ 1,5 triệu tấn (2010)
lên trên 1,7 triệu tấn (2011). Năm 2012 do dịch bệnh AHPND nên sản lượng
tôm nuôi của Trung Quốc giảm còn khoảng 1,5 triệu tấn và tiếp tục giảm còn
900 ngàn tấn trong năm 2013. Do dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp năm 2013 đã
làm thiệt hại khá lớn nên diện tích nuôi giảm đi đáng kể trong năm 2014. Tuy
nhiên, nghề nuôi tôm ở quốc gia này có dấu hiệu phục hồi về sản lượng đạt
1,02 triệu tấn (Hình 2.1). Theo ước tính (vào thời điểm 2015) thì từ 2016-2018
thì tốc độ tăng sản lượng tôm trung bình của Trung Quốc khoảng 4%/năm.
Trong tổng sản lượng tôm nuôi của Trung Quốc thì sản lượng tôm thẻ chân
trắng chiếm tỉ trọng rất lớn, đạt khoảng 1,45 triệu tấn trong năm 2012. Cũng
do dịch bệnh AHPND sản lượng tôm thẻ chân trắng của năm 2013 giảm xuống
chỉ còn 0,85 triệu tấn, sau đó phục hồi lại 0,955 triệu tấn trong năm 2014
(Zuridah, 2015; Anderson et al., 2016).
Năm 2006, sản lượng tôm nuôi của khu vực Đông Nam Á đạt 1,4 triệu
tấn, sản lượng tôm khu vực này sản xuất tăng lên gần 1,7 triệu tấn vào năm
2010. Dịch bệnh AHPND cũng làm giảm nhẹ sản lượng tôm nuôi ở khu vực
này nhưng sau đó sản lượng tôm nuôi có khuynh hướng tăng trở lại trong năm
2013 và 2014. Các quốc gia ở Đông Nam Á có tiềm năng sản xuất tôm như
Thái Lan, Việt Nam, Indonesia…Thái Lan là nhà sản xuất tôm lớn thứ hai thế
giới sau Trung Quốc, tính đến thời điểm cuối năm 2012, sản lượng tôm thẻ
chân trắng của Thái Lan đạt 540.000 tấn. Tuy nhiên, sau dịch bệnh AHPND
vào đầu năm 2013, sản lượng tôm thẻ chân trắng của Thái Lan chỉ còn
250.000 tấn và tiếp tục giảm xuống 220.000 tấn trong năm 2014. Việt Nam
được đánh giá là một trong những nước có nhiều tiềm năng về điều kiện tự
nhiên, thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm, kế đến là Indonesia đứng thứ 4

5


thế giới về sản xuất tôm. Năm 2013, Indonesia, Việt Nam đã vượt qua Thái

Lan trở thành nước xuất khẩu tôm hàng đầu khu vực Đông Nam Á (Hình 2.2)
(Anderson et al., 2016). Indonesia là quốc gia không bị ảnh hưởng của dịch
bệnh AHPND nên sản lượng tôm nuôi liên tục tăng từ 369.000 tấn (2012) lên
565.000 tấn (2013) và 630.000 tấn (2014), trong đó sản lượng tôm thẻ chân
trắng tăng từ 251.763 tấn (2012) lên 386.314 tấn (2013) và 504.000 tần (2014)
(Zuridah, 2015).

Hình 2.1: Sản lượng tôm nuôi thế giới (Anderson et al., 2016)

Ở khu vực Đông Nam Á, ngoài Indonesia, Việt Nam và Thái Lan thì
Malaysia và Philippines cũng phát triển nghề nuôi tôm thẻ chân trắng. Tuy
nhiên, sản lượng thấp do ảnh hưởng của dịch bệnh đốm trắng và AHPND. Sản
lượng tôm thẻ chân trắng của Malaysia giảm từ 48.991 tấn (2012) xuống
40.000 tấn (2014). Nghề nuôi tôm thẻ chân trắng thâm canh của Philippines
bắt đầu từ năm 2007, nhưng nghề nuôi tôm chịu tác động của dịch bệnh đốm
trắng và những cơn bão nhiệt đới nên đến năm 2014 sản lượng tôm thẻ chân
trắng chỉ đạt 27.000 tấn, từ năm 2015 trở đi thì tốc độ tăng sản lượng ước tính
khoảng 10% (Zuridah, 2015).
Trong khu vực Châu Á còn có Ấn Độ và Bangladesh là những nước nuôi
tôm có quy mô lớn. Sản lượng tôm giai đoạn từ năm 2012 trở về trước ổn định
ở mức khoảng 300.000 tấn. Tuy nhiên, năm 2013-2014 sản lượng tôm của 2
nước này tăng lên đạt 405 ngàn tấn (sản lượng tôm Ấn Độ chiếm 85%)
(Zuridah, 2015). Hiện nay, Ấn Độ đang triển khai một số chính sách về kiểm
soát dịch bệnh và an toàn vệ sinh thực phẩm còn chính phủ Bangladesh vừa
cho phép nuôi tôm thẻ chân trắng vì thế, sản lượng tôm thẻ chân trắng của 2
nước sẽ tăng trong thời gian tới (Hình 2.2) (Anderson et al., 2016).
Sản lượng tôm nuôi của châu Mỹ tập trung ở 6 nước là Ecuador, Mexico,
Brazil, Colombia, Honduras và Nicaragoa. Nuôi tôm ở khu vực này có tốc độ

6

tăng trưởng ổn định 3% từ 2010-2014, tổng sản lượng xấp xỉ 400-500 ngàn
tấn. Ecuador có sản lượng tôm nuôi lớn nhất khu vực (340 ngàn tấn năm 2014)
(Zuridah, 2015).
Khu vực sản xuất tôm còn lại của thế giới là châu Phi chỉ chiếm tỷ lệ sản
lượng rất nhỏ nhưng tốc độ tăng trưởng hằng năm khá ổn định, bằng 4,6% và
4,8% trong giai đoạn 2006-2010 và 2010-2014 (Anderson et al., 2016).

Hình 2.2: Sản lượng tôm thẻ nuôi ở châu Á giai đoạn 2011-2018 (Anderson et al., 2016)

2.1.2. Hiện trạng nghề nuôi tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam
Nghề nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam phát triển nhanh chóng đặc biệt là sự
phát triển của diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng. Diện tích nuôi tôm nước lợ
năm 2016 đạt 700.000 ha (ĐBSCL chiếm 90,6% diện tích nuôi tôm của cả
nước) và sản lượng nuôi đạt 650.000 tấn (VASEP, 2017). So với năm 2011 thì
diện tích nuôi tôm nước lợ tăng tăng 6,7% và sản lượng tăng 28,06%.
Tôm thẻ chân trắng được nhập vào Việt Nam năm 2001 và được nuôi thử
nghiệm tại Công ty Duyên Hải (Bạc Liêu) và công ty Asia Hawaii (Phú Yên)
trong điều kiện cách ly theo quy định của Bộ Thủy sản. Ngày 16/01/2004 Bộ
đã ban hành Chỉ thị 01/2004/CT-BTS “về tăng cường quản lý tôm chân trắng
ở Việt Nam” nhằm hạn chế phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng vì sợ lây bệnh
cho tôm sú. Đến năm 2006, Bộ Thủy sản đã ban hành Công văn 475/TS-NTTS
(ngày 06/03/2006) cho phép nuôi bổ sung tôm chân trắng tại các tỉnh từ Quảng
Ninh đến Bình Thuận, nhưng vẫn cấm nuôi tại khu vực Đồng Bằng Sông Cửu
Long. Đầu năm 2008, nhận thấy thị trường thế giới đang có xu hướng tiêu thụ
mạnh mặt hàng tôm chân trắng của Thái Lan, Trung Quốc… và sản phẩm tôm
sú nuôi hiệu quả sản xuất thấp do dịch bệnh, ngày 25/01/2008, Bộ NN&PTNT
ban hành chỉ thị số 228/CT-BNN-NTTS về việc phát triển nuôi tôm thẻ chân
trắng tại các tỉnh phía Nam. Từ đó diện tích và sản lượng tôm thẻ chân trắng

không ngừng được tăng lên ().
Theo số liệu thống kê năm 2011, thì diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng

7


của cả nước là 33.000 ha đạt sản lượng 177.000 tấn (Tổng cục Thủy sản,
2012). Mặc dù, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng chỉ chiếm 5,03% diện tích
nuôi tôm nước lợ nhưng sản lượng đạt tới 34,84% tổng sản lượng tôm nuôi
nước lợ. Tính đến tháng 10/2016, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng đã tăng lên
83.769 ha, sản lượng tôm nuôi đạt 241.707 tấn (Tổng cục Thủy sản, 2017).
Như vậy, qua 5 năm thì diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng tăng 153,8% và sản
lượng tăng 36,56%. Diện tích nuôi tăng nhanh chủ yếu là ở khu vực ĐBSCL,
nhưng do ảnh hưởng của dịch bệnh AHPND và WSSV nên người nuôi tôm ở
khu vực ĐBSCL có xu hướng giảm mật độ nuôi nên năng suất trung bình
giảm, đó cũng chính là lý do tại sao tỉ lệ tăng sản lượng tôm nuôi ít hơn so với
tỉ lệ tăng diện tích nuôi. Trong khi đó, diện tích nuôi của khu vực Miền Trung
hầu như không có nhiều thay đổi trong giai đoạn 2010-2014 (Hình 2.3). Diện
tích nuôi tôm thẻ thân trắng của 11 tỉnh Miền Bắc cũng không có nhiều thay
đổi khoảng 10.000 ha và sản lượng nuôi khoảng 40.000 tấn.
Năm 2012, bệnh AHPND xuất hiện ở 192 xã thuộc 54 huyện của 16 tỉnh
thành ở Việt Nam. Đến 2013 dịch bệnh lại tiếp tục lan rộng ở 199 xã thuộc 16
tỉnh, thành và năm 2014 dịch bệnh xuất hiện ở 233 xã thuộc 22 tỉnh thành có
nuôi tôm nước lợ trong phạm vi cả nước (Cục Thú y, 2014). AHPND xãy ra
trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng chủ yếu ở các vùng nuôi thâm canh ở giai
đoạn 20-45 ngày sau khi thả nuôi và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Tôm có
biểu hiện bệnh là ngừng ăn, vỏ mỏng, màu sắc nhợt nhạt, gan tụy mềm nhũn
hoặc teo dai và dịch bệnh xãy ra hầu hết các tháng trong năm (Schryver et al.,
2014; Leaño and Mohan, 2012). Tác nhân gây bệnh AHPND là do vi khuẩn V.
parahaemolyticus (Tran et al., 2013), ngoài ra cũng có thể do vi khuẩn Vibrio

sp. (Kwai et al., 2014). Kết quả nghiên cứu sâu về tác nhân gây bệnh AHPND
cho thấy nguyên nhân gây ra AHPND là do vi khuẩn mang Plasmid có chứa
gen độc lực gây hoại tử gan tụy cấp (Lightner, 2014; Tran et al., 2014;
Tinwongger et al., 2014).

8


Hình 2.3: Diễn biến diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng trong giai đoạn 2008-2014 (Viện Kinh
tế và Quy hoạch thủy sản, 2015a và 2015b)

2.2. Sơ lược về tình hình dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong và
ngoài nước
Theo Lightner et al. (2013) bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm biển lần
đầu tiên được phát hiện vào năm 2009 được gọi là “Hội chứng tôm chết sớmEMS (Early Mortality Syndrome)”. Năm 2011, một tên mới được đặt dựa
trên mô tả bệnh tích cấp tính, gọi là “hội chứng hoại tử gan tụy cấp” (AHPNS
-Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome). Năm 2013, tên gọi Bệnh hoại
tử gan tụy cấp (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) được
dùng khi tác nhân gây bệnh được xác định là vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Đầu năm 2013, Phòng nghiên cứu Bệnh học Thuỷ sản Trường Đại học
Arizona (UAZ-APL) đã phân lập được dòng vi khuẩn thuần gây bệnh
AHPND từ Việt Nam và Mexico. Bệnh này gây tác hại lớn trên tôm sú, thẻ
chân trắng ở các trang trại tôm Đông Nam Á, Thái Bình Dương và phía Tây
Mexico (Lightner et al., 2013).
2.2.1. Tình hình dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên thế giới
Năm 2009, trên thế giới xuất hiện dịch Hội chứng hoại tử gan tụy cấp
tính (AHPNS), gây chết với tỉ lệ cao, gây tổn thất nghiêm trọng cho nghề nuôi
tôm. Ở Trung Quốc, AHPNS xảy ra vào năm 2009 và nó bùng phát dữ dội vào
năm 2011 ở các trang trại đã nuôi tôm hơn 5 năm và ở khu vực gần biển sử
dụng nguồn nước rất mặn. Dịch bệnh đã lây lan sang 4 tỉnh nuôi tôm ở Hải

Nam, Quảng Đông, Phúc Kiến và Quảng Tây gây thiệt hại hơn 80% sản lượng
trong nửa đầu năm 2011 (Panakorn, 2012).
Ở Malaysia, AHPND đã được ghi nhận đầu tiên vào giữa năm 2010 ở

9


các bang bờ Đông: Pahang và Johor, dịch bệnh bùng phát làm giảm đáng kể
sản lượng tôm thẻ chân trắng từ 70.000 triệu tấn vào năm 2010 xuống còn
40.000 triệu tấn vào năm 2011. Sau đó dịch bệnh AHPND lan sang các bang
Sabah và Sarawak, sản lượng năm 2012 chỉ có 30.000 tấn vào tháng 05/2012
(Eduardo and Mohan, 2012).
Ở Thái Lan, với bề dày kinh nghiệm nuôi tôm công nghiệp khá lâu trên
30 năm, người nuôi đã sử dụng con giống chất lượng và quy trình kỹ thuật tiên
tiến với lệ sống của tôm nuôi đạt 60-80% thế nhưng bệnh AHPND lần đầu tiên
được phát hiện trên các trang trại nuôi tôm ở phía Đông Vịnh Thái Lan vào
cuối năm 2011 và ảnh hưởng trên tôm thẻ trong suốt thời gian 15-35 ngày sau
khi thả nuôi, với tỉ lệ chết cao (100% ở 1 số ao) (FAO, 2013). Vào đầu năm
2012 bệnh AHPND tiếp tục xảy ra ở bờ biển phía Đông Vịnh Thái Lan, trong
thời gian này bệnh AHPND gây thiệt hại khoảng 50% diện tích nuôi tôm ở
một số khu vực như: Chachoengsao, Rayong, Chantiburi và tỉnh Trad và ở
phần phía Nam của quốc gia thuộc tỉnh Surattani và Songkhla. Tôm bị nhiễm
bệnh có biểu hiện lâm sàng như bỏ ăn, mềm vỏ, màu nhạt, tuyến gan tụy bị teo
(FAO, 2013).
Ở Mexico, tình hình dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp đã bùng phát rất dữ
dội vào năm 2013 (FAO, 2013). Sau đó, lây sang Tây bán cầu. Nguyên nhân
gây ra bệnh AHPND là do vi khuẩn V. parahaemolyticus với sự hiện diện của
gen tlh. Việc chuẩn đoán bệnh AHPND thông qua kiểm tra mô bệnh học
(Lightner, 2014).
Ở Philippine, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính đã gây thiệt hại rất nặng nề

vào năm 2015. Bệnh gây ra ở một số khu vực trung tâm của Luzon, Bohol và
Cebu. Do hiện tượng El Nino nên làm cho dịch bệnh bùng phát rất dữ rội.
Bệnh gây thiệt hại rất lớn ở những khu vực này ( de la Peña, 2015)
2.2.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp ở Việt Nam
Ở Việt Nam, năm 2012, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính đã xuất hiện ở 192
xã thuộc 54 huyện của 16 tỉnh, thành. Đến 2013, dịch bệnh lại tiếp tục lan
rộng và xuất hiện ở 199 xã thuộc 19 tỉnh thành. Đến 2014 dịch bệnh vẫn chưa
có dấu hiệu giảm mà lại lan rộng thêm 233 xã thuộc 22 tỉnh thành có tôm nước
lợ nuôi thuộc địa bàn cả nước (Cục Thú y, 2014).
Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) hay còn gọi là hội chứng chết sớm
(EMS) đã và đang trở thành một trong những mối nguy hại nhất đối với nghề
nuôi tôm công nghiệp khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Bệnh
xuất hiện trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng và thường xảy ra ở tôm 20 - 45
ngày tuổi với tỷ lệ chết lên tới 100%. Tác nhân gây bệnh AHPND được xác

10


định là do vi khuẩn mang Plasmid có chứa gen Toxin gây hoại tử gan tụy cấp.
Dựa trên đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc
hiệu nhận biết gen Toxin và giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA, kết quả nghiên
cứu đã khẳng định có ít nhất 3 chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND trên tôm
nuôi nước lợ ở Việt Nam, bao gồm 02 chủng vi khuẩn thuộc loài Vibrio
parahaemolyticus, đó là V. parahaemolyticus KC12.020 và V.
parahaemolyticus KC13.14.2 và 01 chủng vi khuẩn non - V.
parahaemolyticus, đó là V. harveyi KC13.17.5. Việc phát hiện thêm loài vi
khuẩn không phải là V. parahaemolyticus (non -V. parahaemolyticus) gây
bệnh AHPND (Đặng Thị Lụa và ctv, 2016). Tóm lại, vi khuẩn gây bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính bao gồm V. parahaemolyticus và non -V.
parahaemolyticus.

Theo Lê Hữu Tài và ctv. (2012) hội chứng hoại tử gan tụy xuất hiện và
diễn biến phức tạp ở Việt Nam từ năm 2010 và gây chết hàng loạt trên tôm
nuôi ở các tỉnh như: Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Kiên Giang và Bến Tre.
Dấu hiệu bệnh lý của tôm bệnh được mô tả như: lờ đờ, bỏ ăn và chết, gan tụy
teo dai.
Tháng 5/2011, dịch bệnh lan rộng tại các vùng nuôi tôm khu vực ĐBSCL
khiến cho diện tích nuôi tôm bị thiệt hại nặng. Diện tích thả nuôi tôm sú và
tôm thẻ chân trắng của cả nước là 558.342 ha, riêng khu vực ĐBSCL có diện
tích nuôi tôm bị thiệt hại là 52.470 ha. Trong đó Sóc Trăng có hơn 25.000 ha
tôm nuôi thâm canh, bán thâm canh bị mất trắng. Hơn thế nữa, vào tháng
6/2011, với 11.000 ha tôm sú ở Bạc Liêu, 6.200 ha ở Trà Vinh và 20.000 ha ở
Sóc Trăng bị thiệt hại. Quý I/2012 dịch bệnh AHPND tiếp tục xảy ra gây thiệt
hại cho các tỉnh ở vùng ĐBSCL và Miền Trung, diện tích bị thiệt hại ước tính
khoảng 39.000 ha (NACA, 2012).
Sau trận dịch AHPND năm 2011-2012, hoạt động sản xuất tôm nước lợ
có dấu hiệu phục hồi vào cuối năm 2013 và 2014. Trong 10 tháng đầu năm
2013 thì dịch bệnh AHPND có khuynh hướng giảm đáng kể, diện tích nuôi bị
thiệt hại chỉ bằng 20% so với năm 2012. Tổng diện tích tôm bị thiệt hại do
bệnh AHPND trong 10 tháng năm 2013 là 5.705 ha, bao gồm 2.423 ha tôm thẻ
chân trắng và 3.282 ha tôm sú (Tổng cục Thủy sản, 2013). Năm 2014 là năm
có diện tích tôm bị thiệt hại do bệnh AHPND thấp nhất tính từ khi dịch bệnh
này bùng phát (2010-2016). Theo số liệu của Cục Thú y (2016) thì diện tích
tôm bị thiệt hại do bệnh AHPND là 5.552 ha. Sau những vụ tôm thành công
của cuối năm 2013 và 2014, nhiều người dân đã mở rộng diện tích nuôi (đào
ao mới), đặc biệt là diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng thâm canh. Trong khi đó,
điều kiện thời tiết năm 2015 có nhiều bất lợi do ảnh hưởng của hiện tượng El

11

Nino, điều này đã dẫn đến diện tích tôm nuôi bị thiệt hại do bệnh AHPND
tăng trong năm 2015 (9.420 ha) (Cục Thú y, 2016).
Năm 2016 cũng được xem là năm thành công của nghề nuôi tôm nước lợ
ở Việt Nam, tổng diện tích bị thiệt hại do dịch bệnh 10.662 ha, chỉ chiếm
1,56% diện tích nuôi tôm cả nước. Diện tích nuôi tôm bị thiệt hại do bệnh
AHPND là 6.032 ha, chiếm 0,9% diện tích tôm nuôi nước lợ của cả nước (Cục
Thú y, 2016).
Trong 5 tháng đầu năm 2017, tình hình nuôi tôm tương đối ổn định, diện
tích tôm nước lợ của cả nước bị thiệt hại do dịch bệnh AHPND là 1.557 ha
chiếm 13,6% diện tích tôm bị thiệt hại do dịch bệnh (Sở NN&PTNT Khánh
Hòa, 2017).
2.3. Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và các
nghiên cứu về độc lực của V. parahaemolyticus
2.3.1. Các thông tin liên quan đến đặc điểm của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus gây bệnh trên tôm
a) Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn V.
parahaemolyticus
Vi khuẩn gây bệnh AHPND thuộc họ Vibrionaceae (Véron ,1965),
giống Vibrio và loài V. parahaemolyticus. Đặc điểm chung của các vi khuẩn
Vibrio Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi cong, kích thước 0,3-0,5 µm x 1,42,6 µm, không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc
nhiều tiên mao mảnh. Tất cả vi khuẩn Vibrio đều thuộc nhóm yếm khí chịu
đựng (aerotolerantanaerobie) và phản ứng dương tính (+) trong môi trường
O/F. Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của vi
khuẩn Vibrio. Hầu hết các chủng đều phát triển trong môi trường nước lợ
mặn, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các chủng Vibrio, chúng
không phát triển trong môi trường thiếu muối NaCl, chúng không sinh H2S,
mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino-6,7 diisopropyl pteridine phosphat
(O/129). Vi khuẩn Vibrio có khả năng di động, cho phản ứng oxidase và
catalase dương tính, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu
khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate, sinh indole và có khả năng tạo axít từ

đường mannitol và trehalose (West et al, 1986).
V. parahaemolyticus là trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí không bắt buộc
(facultative aerobe), di động bằng tiêm mao và có khả năng trượt trên bề mặt
môi trường có độ nhớt cao (McCarter, 1999). V. parahaemolyticus tồn tại phổ
biến ở hệ sinh thái nước mặn và vùng cửa sông trong đó có các ao nuôi, đặc

12


biệt ở các khu vực Đông Nam Á (Wong et al., 2000). Loài vi khuẩn này, có
thể tồn tại tự do trong môi trường nước và nền đáy, bám trên bề mặt ngoài và
xâm nhập vào bên trong cơ thể của các động vật phù du, cá và giáp xác
(Kaneko and Colwell, 1973; Kaneko and Colwell, 1975). V.
parahaemolyticus phát triển tốt hơn so với các chủng vi khuẩn khác trong điều
kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and Larock, 1985).
b) Các nguyên tố cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn
Nhu cầu dinh dưỡng của các vi sinh vật khác nhau sẽ khác nhau, nhưng
các chất dinh dưỡng hữu cơ có thể phân thành 3 loại chính như sau: (1) amino
acid, (2) purines và pyrimidines và (3) vitamin. Nguyễn Lân Dũng và ctv.
(2000) cho rằng vi sinh vật cấu tạo bởi 7 nguyên tố chính, các nguyên tố này
chiếm tới 90 - 97% toàn bộ chất khô của tế bào vi khuẩn (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Tỷ lệ các thành phần nguyên tố và protein trong vi khuẩn
Nguyên tố
Vi khuẩn (%)*
Protein (%)**
Cacbon
50
50-54
Oxy
20

20-23
Ni tơ
14
16,0
Hidro
8
6-7
Phopho
3
Lưu huỳnh
1
Kali
1
* Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2000) và ** Nguyễn Văn Kiệm và ctv. (2005)

Cấu tạo protein trong vi khuẩn là một chuỗi nhiều gồm nhiều acid amine,
protein cấu tạo bởi C (50-54%), O (20-23%), N (~ 16%), H (6-7%) và các
khoáng đa vi lượng (Nguyễn Văn Kiệm và ctv., 2005). Protein có tính ưa nước
bởi có những nhóm ưa nước (-NH2, -COOH, -OH) nên dễ tan (Lê Xuân
Phương, 2008).
Trong thí nghiệm ương tôm thẻ PL thành tôm giống cỡ lớn (4 tuần) với
nguồn carbohydrate là bột gạo được bổ sung theo hàm lượng tổng ammonia
(TAN) trong nước hay theo nitrogen của protein trong thức ăn (TA) với tỷ lệ
C:N=15:1 cho kết quả tốt nhất. Kết quả thí nghiệm chỉ ra rằng khi bổ sung
carbohydrate vào bể nuôi làm tăng mật độ tổng vi khuẩn (70,6%). Tạ Văn
Phương (2016).
2.3.2. Thông tin gen độc lực của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây
bệnh trên tôm
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có khả năng gây thành dịch bệnh với
nhiều đối tượng hải sản nuôi như: tôm, cua, hầu... Một số chủng có khả năng

gây bệnh ở người De Paola et al.(1990). Kết quả nghiên cứu bộ gen của V.

13