topic 9 pp khối khổ và dấu phóng xạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC

----------------

TIỂU LUẬN MÔN CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN
TRONG NGHIÊN CỨU SINH HỌC THỰC
NGHIỆM

Đề tài :

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ VÀ
DẤU PHÓNG XẠ TRONG NGHIÊN CỨU
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Giảng viên hướng dẫn :
Học viên
Mã học viên

:
:

PGS.TS Lê Thị Phương Hoa
TS. Đào Văn Tấn
Nguyễn Thị Ngọc Liên
K27 0257


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

MỤC LỤC:
A. PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ........................................................................................3
I. TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ........................................................................................3
1. Khối phổ là gì..................................................................................................................3
2. Nguyên lý của phương pháp khối phổ.............................................................................3
3. Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa)................................................................................4
4. Máy khối phổ...................................................................................................................4
II. ỨNG DỤNG...................................................................................................................6
1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein.....................................................7
2. Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác........................................................9
2.1 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas Chromatography Mass
Spectometry).................9
2.2 Sắc lí lỏng kết hợp khối phổ(LS/MS/MS)...................................................................11
2.3 Điện di kết hợp khối phổ.............................................................................................11
III. ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ..........................................12
1. Ưu điểm.........................................................................................................................12
2. Nhược điểm...................................................................................................................12
B. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ...............................................................12
I. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ..............................................................12
1. Khái niệm......................................................................................................................12
2. Nguyên lý.......................................................................................................................13
3. Yêu cầu của các đồng vị phóng xạ................................................................................13
II. ỨNG DỤNG.................................................................................................................14
1. Trong nghiên cứu sinh học và công nông nghiệp..........................................................14
2. Trong y học....................................................................................................................17
3. Trong khảo cổ................................................................................................................18

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................18

2


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

A. PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ
I. TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ:
- Khối phổ (mass spectrometry – MS): là một kỹ thuật quang phổ do nhà vật lí h ọc
người Anh Joseph John Thomson phát minh ra vào năm 1897.
- Chính nhờ kĩ thuật này đã giúp Thomson phát hiện ra các đồng vị của nguyên tố
và chứng minh sự tồn tại hai đồng vị của khí Neon.
- Với phát minh này đã giúp Thomson giành được giải thưởng Nobel năm 1906 .
1. Khối phổ là gì?
Là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa
học có trong một mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích và s ố lượng của
các ion pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
- Dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế.
- Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân
tử khác như:
•

Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.

•

Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.

•

Khối phổ kết hợp điện di

2. Nguyên lý của phương pháp khối phổ:
-

Là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích đi ện khi
chúng di chuyển trong điện trường.

-

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ
bộ phận phân tích khối phổ trước khi đến detector.

-

Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không.

-

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.

-

Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng mẫu bằng
các công cụ tin sinh học. Đồng thời, có thể xác định cấu trúc cũng như là đ ịnh
lượng các chất trong mẫu mà ta phân tích

3


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

/>3. Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa):
- Để có thể nghiên cứu các chất bằng pp khối phổ thì các phân tử chất nghiên cứu ở
dạng khí hoặc hơi phải được ion hóa bằng phương pháp thích hợp.
* Phương pháp ion hoá bằng va chạm điện tử (dùng phổ biến nhất)
•

Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode (làm bằng vonfram ho ặc
reni) bay về anode với vận tốc lớn.

•

Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong
buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá.

* Phương pháp ion hóa bằng trường điện từ (dùng khá phổ biến)
4. Máy khối phổ:

- là một thiết bị dùng cho phương pháp khối phổ, cho ra phổ khối lượng của một
mẫu, để tìm ra thành phần của nó.
- Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại
thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion.
- Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân bi ệt máy kh ối
phổ ion dương hoặc ion âm.
* Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:
•

phần nguồn ion
4


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM
•

phần phân tích khối lượng

•

phần đo đạc.

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

/>* Cấu tạo:
•

Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn khối chức năng sau đây:

+ Hệ thống nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy, nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần phải
chuyển sang dạng hơi bằng các biện pháp thích hợp.
+ Buồng ion hoá: Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc h ơi .
+ Bộ phân tích: Tách các ion theo tỉ số khối lượng và điện tích của ion (m/z). Các ion
được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường , điện trường để đi đến
detector.
+ Bộ ghi tín hiệu: chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử
của máy khối phổ
- Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu s ố
phục vụ xử lí dữ liệu theo những yêu cầu khác nhau: ghi phổ khối, so sánh v ới dữ
liệu phổ trong thư viện phổ hay định lượng mẫu.

5


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

h
ttp://omnisci.com.vn/bvct/may-sac-ky-long-may-sac-ky-khoi-pho-thiet-bi-thinghiemnoi-that-thi-nghiem/11/ly-thuyet-khoi-pho.html
* Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ:
- Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu
quá trình đo khối phổ.
- Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuy ển chúng thành

các ion, kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài.
- Quá trình được thực hiện trong môi trường chân không.
- Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp suất môi trường xử lý ion
thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển).
- Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung
chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài.
- Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được
phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính.
II. ỨNG DỤNG:
- Phương pháp khối phổ có thể dùng để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp
chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
+ Đối với hợp chất vô cơ: PP khối phổ dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị
hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu.
6


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

+ Đối với hợp chất hữu cơ: PP khối phổ thường dùng trong quá trình đồng nhất
chất hoặc phân tích cấu trúc.
* Các ứng dụng cụ thể của pp khối phổ:
-

Xác định các loại vitamin, hoocmon kích thích sinh trưởng.

-

Phân tích dư lượng của các loại thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu

-

Xác định được các hợp chất chưa biết dựa vào khối lượng và thành phần của
các nguyên tố trong hợp chất đó.

-

Xác định cấu trúc của các đồng vị trong hợp chất.

1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
-

Protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme pepsin . Enzyme pepsin cắt
polypeptide tại những điểm nhất định trên chuỗi => Ta có thể dự đoán được
các mảnh (fragments) polypeptide sau khi bị cắt.

-

Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy. Laser ion hoá các
fragments làm cho chúng tích điện dương và bật ra bay vào ống. Ống này có
chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại điện cực (+) và (-).

-

Có 2 loại hệ thống hay được sử dụng chính trong proteomics là MALDI-TOF
và ESI-MS/MS. Chúng bổ sung cho nhau để nhận dạng protein.

http:
//www.biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html

7


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

http:
//www.biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html
- Ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều liên tục làm cho các mảnh
polypeptide không bám được vào thành mà bay theo chi ều xoắn ốc.
- Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố
+ điện tích (z)
+ khối lượng (m)
- Máy khối phổ đo được thời gian, biết trước quãng đường => tính được vận tốc =>
xác định được chỉ số m/z của fragment.
- Các tín hiệu được phát hiện bởi detector và khuếch đại, cuối cùng bi ểu di ễn trên
đồ thị ở dạng các đỉnh (peak). Mỗi đỉnh tương ứng 1 fragment.
- Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là lần MS thứ nhất, cho phép hi ển th ị
các fragment của một polypeptide bị cắt bằng pepsin. Lần MS thứ 2 cho phép
khẳng định chắc chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống lọc.

8

CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

Figu
re : Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer
* Phân tích kết quả:
•

Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối lượng khác nhau do đó kh ối lượng
của một trình tự đủ nhỏ cũng nói lên được trình tự của nó.
VD: Giả sử + Valin có khối lượng là 3.
+ Methionin có khối lượng là 5.
Nếu một fragment có khối lượng là 8, thì cấu trúc của fragment có th ể có 2

trường hợp hoặc : valin-methionin hoặc methionin-valin.
2. Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác:
2.1 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas Chromatography Mass Spectometry)
- Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là
một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về
thành phần các chất trong không khí.
- Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas Chromatography) và Khối phổ
(Mass Spectometry). Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram.
* Cấu tạo của GC-MS:
+ Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng

chất tinh khiết
+ Khối phổ (MS): ) xác định định tính và định lượng.

9


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

Nguồn />* Công dụng:
+ Phân tách: GC-MS có thể phân tách các hỗn hợp hóa chất phức tạp trong
không khí hay trong nước
+ Định lượng: GC-MS có thể định lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu
chuẩn ( mẫu chuẩn là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng
GC-MS).
+ Nhận dạng: Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể
nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó. Cấu trúc của chất này sau đó
được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã bi ết.
* Máy sắc kí khí kết hợp với khối phổ nhiều lần(GC/MSn)

10


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

2.2 Sắc lí lỏng kết hợp khối phổ(LS/MS/MS)
- Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là phương pháp được hiểu là mẫu được
phân tách và tinh sạch qua sắc ký, sau đó mẫu được đưa qua máy khối phổ đ ể ti ếp
tục xác định khối lượng nguyên tử của nó.
- Kết thúc quá trình ta thu được lượng mẫu nhất định và cấu trúc của nó.

/>2.3 Điện di kết hợp khối phổ
- Thường được dùng để xác định protein. Phương pháp này cho phép ta quan sát và
nhận dạng sự hiện diện tất cả các protein.
- Khối phổ là phương pháp mang lại năng suất và độ chính xác cao trong quá trình
nhận biết những protein đã phân tách bằng điện di 2 chiều.
11


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

III. ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ:
1. Ưu điểm:
•

Giới hạn phát hiện nhỏ.

•

Độ nhạy cao

•

Độ đặc hiệu cao do tính phân mảnh riêng biệt của các ion.

•

Thời gian phân tích nhanh.

•

Độ phân giải cao.

•

Có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau.

2. Nhược điểm:
•

Giá thành cao.

•

Chỉ áp dụng cho những chất bền nhiệt và bay hơi.

B. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ:
I. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ:
1. Khái niệm:
- Là phương pháp khảo sát các quá trình bằng cách đưa các hợp chất thích hơp phát
phóng xạ vào cùng với vật liệu trong hệ thống để khảo sát quá trình vận động,
chuyển hóa của hệ thống thông qua hệ máy đo phóng xạ mà không cần dừng hoạt
động của hệ thống.

Nguồn:

/>2. Nguyên lý:

12


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

- Tất cả các vật chất thông thường được cấu tạo bởi sự liên kết của các nguyên tố
hóa học, mỗi nguyên tố có một số nguyên tử đặc trưng cho số proton trong hạt
nhân nguyên tử. Thêm vào đó, các nguyên tố có thể tồn tại ở một vài dạng đồng vị,
mỗi đồng vị khác nhau về số lượng neutron trong hạt nhân. Ngoài các đồng vị
thường các nguyên tố còn có các đồng vị phóng xạ.
- Đồng vị là hiện tượng các nguyên tử có cùng số proton nhưng khác nhau về s ố
nơtron, do đó số khối A của chúng khác nhau.
- Các đồng vị phóng xạ là đồng vị không ổn định. Theo thời gian nguyên tử của

các đồng vị phóng xạ này sẽ biến đổi thành một đồng vị khác. Sự biến đổi này có
thể diễn ra với nhiều các khác nhau như phân rã phóng xạ, hoặc là phát ra các hạt
(thường là các điện tử (phân rã bêta), positron hoặc hạt alpha) hoặc bằng sự phân
hạch tự nhiên, và hấp thu điện tử.
•

Các đồng vị của nguyên tố Hidro:

- Số khối: A = Z + N.
- Số khối A và số proton (số đơn vị điện tích hạt nhân) Z là 2 đại lượng đặc trưng
cho nguyên tử.
- Đồng vị phóng xạ của một nguyên tố có cùng tính chất hóa học giống đồng vị bền.
- Do đó nếu trộn một lượng nhỏ đồng vị phóng xạ với đồng vị bền của một nguyên
tố rồi theo dõi sự thay đổi hoạt động của đồng vị phóng xạ trong quá trình vật lý,
hóa học…mà nguyên tố đó tham gia, người ta có thể biết được một s ố tính ch ất của
quá trình đó.
3. Yêu cầu của các đồng vị phóng xạ:
- Chu kỳ bán rã phải phù hợp với thời gian tiến hành thực nghiệm, phải phù hợp
với khoảng cách giữa nơi sản xuất đồng vị phóng xạ đến vị trí làm vi ệc.
13


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

- Cường độ đủ lớn cho sự pha loãng và tách dòng mà vẫn còn đủ cho sự phát hi ện

bức xạ khi đo dòng xuống.
- Chất mang đồng vị phóng xạ đánh dấu phải xâm nhập và đồng nhất với môi
trường nghiên cứu, phải tồn tại bền vững với môi trường nghiên cứu trong suốt
quá trình thực nghiệm.
- Chất mang đồng vị phóng xạ phải giống với môi trường đánh dấu để không làm
nhiễu loạn môi trường đánh dấu.
II. ỨNG DỤNG:
1. Trong nghiên cứu sinh học và công nông nghiệp:
- Trong nghiên cứu di truyền học, giải mã gen, tìm hiểu sự vận chuy ển các aa trong
cơ thể sinh vật...
- Tạo giống ra các đột biến gen.
- Theo dõi sự di chuyển của nước mặt, nước ngầm, kiểm tra tốc độ thấm qua đê,
đập, thăm dò dầu khí, nghiên cứu cơ chế các phản ứng phức tạp và đo đạc các hằng
số hoá lí…
1.1 Đánh dấu đồng vị phóng xạ N15 trong phát hiện cấu tạo DNA theo nguyên
tắc bán bảo tồn:

/>14


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

1.2 Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 trong giải trình tự gen bằng phương
phương pháp phân giải hóa học (do Allan Maxam và Walter Gilbert, năm
1977).

15


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

1.3 Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 trong giải trình tự gen bằng phương
phương pháp enzym (do Frederick Sanger đề xuất, năm 1977).

16


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

* Hình ảnh điên di DNA có đánh dấu 32P trên polyacrylamide gel
•

ở phim X-quang.

17

CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

2. Trong y học:
- Trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị. Các hợp chất đánh dấu hoá phóng xạ
cung cấp các thông tin giải phẫu học về nội tạng con người, về hoạt động của các
cơ quan riêng biệt, phục vụ cho chẩn đoán bệnh.
- Tia phóng xạ được sử dụng trong các phương pháp chụp cắt lớp. Từ lâu người ta
đã sử dụng đồng vị 131I trong chẩn đoán và điều trị bệnh tuyến giáp.

18


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257

https://phau
thuatungthu.wordpress.com/2015/02/07/ky-thuat-phau-thuat-u-nao-co-huong-danbang-chat-danh-dau-phong-xa-moi/
3. Trong khảo cổ:
- Định tuổi cổ vật có nguồn gốc thực vật:

+ Trong không khí luôn tồn tại 1 lượng nhất định đồng vị 14C, đồng vị này
phóng xạ với chu kỳ bán rã vào khoảng 5730 năm.Thực vật hấp thụ đi 14CO2
trong không khí nên cũng hấp thụ luôn 14C.
+ Ở thực vật khi còn sống, tỉ lệ 14C và 12C là không thay đổi. Sau khi chết sự
trao đổi bị ngừng và hàm lượng 14C bắt đầu giảm dần do sự phân rã phóng
xạ.
+ Bằng cách đo tỉ lệ 14C và 12C trong các di vật cổ ta có thể tính ra tuổi của
chúng. Phép định tuổi cổ vật này cho phép đo được tuổi các cổ vật từ 500
năm đến 5500 năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
-

wikipedia.org

-

biomedia.vn

-

baigiang.violet.vn

19


CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU
LIÊN
SINH HỌC THỰC NGHIỆM

20

NGUYỄN THỊ NGỌC
K27-0257