NUÔI CẤY MÔ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

NUÔI CẤY MÔ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM
CỦA CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN LONG THUẬN
Ngành: NÔNG HỌC
Niên khoá: 2005 - 2009

Tháng 7/2009


NUÔI CẤY MÔ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM
CỦA CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)

Tác giả

NGUYỄN LONG THUẬN

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư
ngành Nông Học

Giáo viên hướng dẫn:
TS. TRẦN THỊ DUNG
TS. TỪ THỊ MỸ THUẬN

Tháng 7/2009
i

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lòng biết ơn đến :
- Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
- Ban giám đốc Trung Tâm Nghiên Cứu Và Phát Triển Cây Xanh Hoa Kiểng –
Công Ty Cây Xanh TP. HCM.
- Ban chủ nhiệm, quý thầy cô Khoa Nông học.
Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập hoàn
thành đề tài.
Em trân trọng biết ơn:
- TS. Trần Thị Dung.
- TS. Từ Thị Mỹ Thuận.
Đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kinh
nghiệm, kiến thức quý báu, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến:
- Các anh chị tại Trung Tâm Nghiên Cứu Và Phát Triển Cây Xanh Hoa Kiểng –
Công Ty Cây Xanh TP. HCM Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian
làm luận văn.
- Các bạn lớp Nông học 31, các anh chị và các bạn trong Bộ môn Bệnh cây – Khoa
Nông Học – Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian làm đề tài.

Tháng 7 năm 2009
Nguyễn Long Thuận

ii


TÓM TẮT

Đề tài “Nuôi cấy mô và khảo sát hoạt tính kháng nấm của cây Bạch hoa xà –
Plumbago zeylanica L.” được tiến hành tại Trung Tâm Nghiên Cứu Và Phát Triển Cây
Xanh Hoa Kiểng – Công Ty Cây Xanh TP. HCM và Bộ Môn BVTV – Khoa Nông
Học – Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM, thời gian thực hiện từ tháng 02 đến tháng 07
năm 2009.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố. Nhằm xác
định nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho thí nghiệm tạo chồi, tạo rể
của cây Bạch hoa xà và khả năng kháng nấm của dịch chiết thô từ cây Bạch hoa xà.
Qua quá trình thực hiện thí nghiệm chúng tôi nhận thấy:
Thí nghiệm tạo chồi:
Trên môi trường MS, nồng độ BA thích hợp cho sự hình thành cụm chồi từ đoạn thân
của cây Bạch hoa xà là 1mg/l
Thí nghiệm tạo rễ:
Từ mẫu lá của cây Bạch hoa xà, nồng độ NAA 2mg/l cho rễ có chiều dài nhất và hình
thành nhiều rể thứ cấp nhưng nồng độ NAA 4mg/l lại cho nhiều rễ cấp một hơn.
Khảo sát khả năng kháng trên 5 loại nấm gây bệnh cây trồng:
Dịch chiết của cây Bạch hoa xà không có khả năng hạn chế nấm Colletotrichum
gloeosporioides, Phytophthora palmivora. Nhưng đối với nấm Corynespora cassicola,
Ceratocystis sp, Fusarium moniliforme thì dịch chiết của cây Bạch hoa xà lại có khả
năng hạn chế.
Dịch chiết của cây Bạch hoa xà có khả năng hạn chế nấm Corynespora cassicola,
Ceratocystis sp, Fusarium moniliforme, riêng phần dịch chiết từ rễ có khả năng hạn
chế nấm mạnh hơn thân lá.

iii


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................ iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................................... vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................. vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH.............................................................................. viii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ.......................................................................... ix
Chương 1.MỞ ĐẦU........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1
1.2.Mục đích, yêu cầu..................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích........................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu............................................................................................. 2
Chương 2.TỔNG QUAN ................................................................................... 2
2.1. Vài nét về cây Bạch hoa xà Plumbago zeylanica L................................. 3
2.1.1. Vị trí phân loại thực vật .................................................................... 3
2.1.2. Nguồn gốc, phân bố .......................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây Bạch hoa xà ..................................... 3
2.1.4. Điều kiện sinh thái ............................Error! Bookmark not defined.
2.1.5. Các hợp chất hóa học và công dụng của cây Bạch hoa xà ................. 4
2.2. Một số đặc điểm của các nấm .................................................................. 5
2.2.1. Nấm Corynespora cassicola................................................................ 9
2.2.2. Nấm Colletotrichum gloeosporioides. ................................................ 10
2.2.3. Nấm Fusarium moniliforme. ............................................................. 12
2.2.4. Nấm Phytophthora palmivora. .......................................................... 13
2.2.5. Nấm Ceratocystis sp. ...................................................................... 15
Chương 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 17
3.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 17
3.1.1 Địa điểm .......................................................................................... 17
3.1.2 Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 17
3.2.Trang thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 17
3.3.Vật liệu................................................................................................... 17
3.3.1.Vật liệu nuôi cấy cây Bạch hoa xà .....Error! Bookmark not defined.
3.3.2.Vật liệu thử hoạt tính kháng nấm .......Error! Bookmark not defined.
3.4.Thành phần môi trường .......................................................................... 18

3.4.1.Thành phần môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô......................... 18
3.4.2.Hóa chất cho thử nghiệm vi sinh...................................................... 18
3.5.Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 19
3.5.1 Thí nghiệm 1. .................................................................................. 19
3.5.2. Thí nghiệm 2. ................................................................................. 20
3.5.3. Thí ngiệm 3. ................................................................................... 21
3.6. Phương pháp xử lí số liệu ...................................................................... 22
iv


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 23
4.1. Thí nghiệm tạo rễ................................................................................... 23
4.2. Thí nghiệm tạo chồi.............................................................................. 24
4.3 .Khảo sát hoạt tính kháng nấm................................................................ 26
4.3.1.Nấm Corynespora cassicola............................................................... 26
4.3.2 Nấm Colletotrichum gloeosporioides............................................... 28
4.3.3 Nấm Fusarium moniliforme............................................................. 30
4.3.4 Nấm Phytophthora palmivora.......................................................... 32
4.3.5 Nấm Ceratocystis sp. ....................................................................... 34
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................. 37
5.1. Kết luận ................................................................................................. 37
5.2. Đề nghị.................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 38

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B(0 – 4)

:Môi trường MS có bổ sung BA (từ 0 – 4 mg/l)

BA

: N6 – benzyladenine

CV

: Cofficient of Variation

LSD

: Least Significant Difference

MS

: Môi trường Murashige and Skoog(1962)

N(0 -4)

:Môi trường MS có bổ sung NAA (từ 0 – 4 mg/l)

NAA

: α – napthylacetic acid

PGA

:Potato Glucose Agar

NSC

: ngày sau cấy

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Thành phần môi trường MS. ......................................................................18
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự hình thành rễ 28 ngày sau cấy .........23
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành chồi của cây Bạch hoa xà 28
ngày sau cấy ..............................................................................................................25
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà lên đường kính tản
nấm Corynespora cassicola. sau 8 ngày nuôi cấy. .....................................................26
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết của cây Bạch hoa xà lên đường kính tản
nấm Colletotrichum gloeosporioides..........................................................................28
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết của cây Bạch hoa xà lên đường kính tản
nấm Fusarium moniliforme........................................................................................30
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết của cây Bạch hoa xà lên đường kính tản
nấm Phytophthora palmivora.....................................................................................32
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết của cây Bạch hoa xà trong môi trường lên
đường kính tản nấm Ceratocystis sp. .........................................................................34

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cây bạch hoa xà ...........................................................................................3
Hình 2.2. Nấm Corynespora cassicola trên môi trường PGA.......................................9
Hình 2.3. Nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường PGA .......................10

Hình 2.4. Nấm Fusarium moniliforme trên môi trường PGA .....................................12
Hình 2.5. Nấm Phytophthora palmivora trên môi trường PGA .................................13
Hình 2.6. Nấm Ceratocystis sp. trên môi trường PGA................................................15
Hình 4.1. Rễ của cây Bạch hoa xà trên môi trường MS, bổ sung NAA sau 28 ngày
nuôi cấy. ....................................................................................................................24
Hình 4.2. Cụm chồi của cây Bạch hoa xà trên môi trường MS, bổ sung BA sau 28
ngày nuôi cấy.............................................................................................................25
Hình 4.3. Tản nấm Corynespora cassicola trên môi trường PGA, bổ sung dịch chiết
của cây Bạch hoa xà sau 8 ngày nuôi cấy...................................................................27
Hình 4.4. Tản nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường PGA, bổ sung dịch
chiết của cây Bạch hoa xà sau 8 ngày nuôi cấy. .........................................................29
Hình 4.5. Tản nấm Fusarium moniliforme trên môi trường PGA, bổ sung dịch chiết
của cây Bạch hoa xà sau 6 ngày nuôi cấy.................................................................. 31
Hình 4.6. Tản nấm Phytophthora palmivora trên môi trường PGA, bổ sung dịch chiết
của cây Bạch hoa xà sau 8 ngày nuôi cấy.................................................................. 33
Hình 4.7. Tản nấm Ceratocystis sp. trên môi trường PGA, bổ sung dịch chiết của cây
Bạch hoa xà sau 8 ngày nuôi cấy. ..............................................................................35

viii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Sự tăng trưởng của nấm Corynespora cassicola trên môi trường có các
loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà..............................................................................27
Biểu đồ 4.2. Sự tăng trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường
chứa các loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà ...............................................................29
Biểu đồ 4.3. Sự tăng trưởng của nấm Fusarium moniliforme trên môi trường chứa các
loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà..............................................................................31
Biểu đồ 4.4. Sự tăng trưởng của nấm Phytophthora palmivora trên môi trường chứa
các loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà........................................................................33

Biểu đồ 4.5. Sự tăng trưởng của nấm Ceratocystis sp. trên môi trường chứa các loại
dịch chiết từ cây Bạch hoa xà.....................................................................................35

ix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây xanh giữ vị trí rất quan trọng với nhiều vai trò khác nhau như: cung cấp
lương thực, thực phẩm, làm cảnh…một vai trò nữa mà không thể bỏ qua đó chính là
nguồn dược liệu vô cùng phong phú, có nhiều bài thuốc chữa bệnh từ những loại cây
trong tự nhiên dựa theo kinh nghiệm dân gian và đã được khoa học chứng minh. Cây
Bạch hoa xà là một trong số đó.
Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) mọc hoang ở hầu hết các nước trong vùng
có khí hậu nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Nhiều nghiên cứu cho thấy, trong cây
Bạch hoa xà có chứa các hợp chất quinon là những hợp chất đã được chứng minh có
hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, trị sốt rét, ức chế sự phát triển của
những tế bào ung bướu, các tế bào ung thư biểu bì.
Giá trị của cây Bạch hoa xà đã được khẳng định, và cũng đã có nhiều nghiên cứu
trích ly hợp chất quinon trong cây Bạch hoa xà nhưng lại chưa có quan tâm nhiều đến
nguồn cung cấp cây Bạch hoa xà để thực hiện việc trích ly. Cho nên việc tìm một
phương pháp nhân giống để trong một thời gian ngắn có thể cung cấp với số lượng lớn
cây Bạch hoa xà, hay cụ thể hơn là tạo ra bộ phận mong muốn (rễ, thân hay lá) là rất
cần thiết và nuôi cấy mô là phương pháp đáp ứng được những yêu cầu trên.
Trong xu thế hội nhập hiện nay, ngành nông nghiệp nước ta đứng trước một
thách thức không nhỏ. Thách thức đó là việc làm sao để sản xuất được một lượng lớn
nông sản phẩm có chất lượng và độ an toàn cao.Vì vậy, việc sử dụng các loại thuốc
bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ thiên nhiên đang là sự lựa chọn hàng đầu, do an toàn
với người sử dụng và thân thiện với môi trường.

Từ những lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nuôi cấy mô và khảo sát hoạt
tính kháng nấm của cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.)”

1


1.2 Mục đích, yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Tạo ra nguồn thân lá, rễ cây Bạch hoa xà để cung cấp cho việc trích ly các hợp
chất quinon bằng phương pháp nuôi cấy mô.
Xác định và so sánh khả năng kháng nấm của cây Bạch hoa xà in vitro với cây
Bạch hoa xà ngoài tự nhiên.
1.2.2 Yêu cầu
Thực hiện giai đoạn vô mẫu, cấy chuyền, tạo nguồn cây Bạch hoa xà in vitro
cho các thí nghiệm tạo rễ, tạo chồi, khảo sát hoạt tính kháng nấm.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA lên sự hình
thành rễ của cây Bạch hoa xà từ mẫu lá.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA lên sự tạo chồi
của đoạn thân cây Bạch hoa xà.
Khảo sát hoạt tính kháng nấm của cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên, cây Bạch
hoa xà in vitro trên các loại nấm gây hại cho cây trồng: Corynespora cassicola,
Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium moniliforme, Phytophthora palmivora,
Ceratocystis sp.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Vài nét về cây Bạch hoa xà Plumbago zeylanica L.

2.1.1 Vị trí phân loại thực vật

Giới - Plantae
Ngành - Magnoliophyta
Lớp - Magnoliopsida
Bộ - Plumbaginales
Họ - Plumbaginaceae
Giống - Plumbago
Loài - Plumbago zeylanica L.

Hình 2.1. Cây bạch hoa xà
2.1.2 Nguồn gốc, phân bố
Bạch hoa xà còn có tên là bạch tuyết hoa, đuôi công, đuôi công hoa trắng, cây
lá đinh, thiên lý cập, bạch hoa đơn, tên khoa học là Plumbago zeylanica L.
Cây mọc tự nhiên ở Ấn Độ và Malaixia, nhưng thuần hoá và thường trồng trong
tất cả các xứ nhiệt đới, nhất là ở Java (Inđônêxia). Ở nước ta, cây cũng được trồng
nhiều trong các vườn gia đình; trồng chủ yếu bằng cành ở nơi ẩm mát.
2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây Bạch hoa xà
Hoa: Hoa màu trắng mọc thành bông ở đầu cành hay kẻ lá, đài hoa có lông dài,
nhớt. Tràng dài gấp hai lần đài. Mùa hoa gần như quanh năm, nhưng nhiều nhất vào
các tháng 5-6
Thân: Bạch hoa xà là một loài cây sống dai, cao hàng mét, có thân cỏ, thân có
đốt và nhẵn.
Lá: Lá mọc so le, hình trứng đầu nhọn, phía cuống hơi ôm vào thân, mép
nguyên không có lông, nhưng mặt dưới hơi trắng
3


2.1.4 Các hợp chất hóa học và công dụng của cây Bạch hoa xà
Thành phần hoá học: Trong cây có chất oxymethyl-naphto-quinon chính là

plumbagin hay plumbagon. Chất này ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn.

Plumbagin
Tính vị, tác dụng: Rễ có vị đắng, chát và gây nôn. Lá cay, có độc. Có tác dụng
khu phong trừ thấp, tán ứ tiêu sưng; còn có thể thư cân hoạt huyết, làm sáng mắt.
Plumbagin là một tác nhân làm viêm tấy và sát trùng tốt; nó kích thích mô cơ với liều
thấp và làm tê liệt với liều cao, gây co thắt mô cơ của quả tim, ruột và giun ký sinh,
kích thích sự tiết mồ hôi, nước tiểu và mật, còn có tác dụng kích thích đối với hệ thần
kinh.
Công dụng, chỉ định và phối hợp: Ở Trung Quốc, thường dùng trị 1. Phong thấp
đau nhức xương, da thịt thâm tím; 2. Đau dạ dày, gan lách sưng phù; 3. Bệnh ngoài da
(hecpet mọc vòng), nhọt mủ, bong gân. Dùng rễ 10-15g đun sôi kỹ trong 4 giờ, lấy
nước uống hoặc lấy rễ ngâm rượu xoa bóp. Dùng lá giã ra đắp vào phần da nhưng
không nên kéo dài quá 30 phút vì dùng lâu thì da bị kích ứng, lên mụn bỏng. Ta
thường dùng một miếng giấy bản làm đệm hay lấy vải gạc lót để da đỡ bị phồng. Lá
dùng đắp làm tiêu sưng mụn nhọt, lại có thể dùng trị rắn cắn và giã vắt nước bôi ghẻ
ngứa. Kinh nghiệm dân gian dùng lá giã đắp chữa đinh nhọt rất đặc hiệu, do đó có tên
là cây lá dính. Ở Inđônêxia, cũng dùng chữa bệnh ngoài da, thấp khớp, nhức đầu, các
bệnh về cơ quan tiết niệu và làm thuốc gây sẩy thai. Để chữa các bệnh ngoài da, người
ta lấy lá và rễ giã ra trộn lẫn với bột gạo làm thuốc đắp. Để trị nhức đầu, chỉ cần dùng
một lượng nhỏ thuốc đắp vào phía sau tai sẽ làm giảm đau. Ở Philippin, nước sắc rễ
dùng trị ghẻ. Ở Ấn Độ, người ta dùng rễ trị các bệnh ngoài da, tiêu chảy, khó tiêu,
bệnh trĩ, phù toàn thân, làm thành bột đắp với giấm, sữa hay muối và nước dùng đắp
4


ngoài trị phong hủi và những bệnh ngoài da khác. Cồn thuốc của rễ cây có khả năng
làm ra mồ hôi. Dịch sữa của cây dùng đắp trị ghẻ và mụn loét.
*Chú ý: Không dùng cho phụ nữ có thai. Nếu bị bỏng rộp, dùng acid boric để rửa chỗ
da bị tổn thương.

2.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro
2.2.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro
Ý kiến cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in vitro) đã được
nhà thông thái Haberlandt thử nghiệm từ rất sớm (từ những năm 1902).
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc
nuôi cấy tế bào rễ cà chua.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn và cây white lupin từ
môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống vẫn chưa hoàn thiện. Sau đó
nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần
thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy như White (1951), Gauthere
(1939), Van Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951).
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra những hợp chất có thể điều khiển
sự nhân chồi.
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một
bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho
việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.
Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó lan được coi là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương
mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với
tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramakl, 1971; Murashige, 1972; Miller và
Muashige, 1976) và được ứng dụng thương mại hóa (Dương Công Kiên, 2002).

2.2.2 Khái niệm và ứng dụng
2.2.2.1 Khái niệm
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
5

kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường.
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ
quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ.
Trước kia người ta dùng phương pháp nuôi cấy mô thực vật và tế bào để nghiên
cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các
hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy.
2.2.2.2 Ứng dụng
Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực
tiễn vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng:
Nhân giống trong ống nghiệm (nhân giống vô tính in vitro) bằng kỹ thuật nuôi
cấy tế bào, mô và cơ quan của thực vật. Với kỹ thuật này trong một thời gian rất ngắn
có thể sản xuất một lượng lớn cây con giống hệt nhau và giữ nguyên kiểu di truyền của
cây mẹ ban đầu.
Sản xuất cây đơn bội (n) bằng cách nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn cho phép
tạo ra các dòng thuần (đồng hợp tử) để phục tráng giống cây trồng bị thoái hóa sau
một thời gian dài canh tác. Hoặc tìm kiếm các tính trạng lặn dị hợp tử ưu việt thu được
trong quá trình chọn giống.
Lai vô tính (somatic hybridization) hay còn gọi là dung hợp tế bào trần
(protoplast fusion) giữa các loài xa nhau về quan hệ họ hàng mà trong thực tế không
thể tiến hành bằng phương pháp lai hữu tính, nhờ vậy mà có khả năng tạo ra những
giống cây trồng mới.
Ứng dụng kỹ thuật chọn dòng tế bào biến dị soma (somaclonal variation) trong
nuôi cấy in vitro để tạo ra những giống mới chống chịu các bệnh vi khuẩn, virus và vi
nấm, chịu được các điều kiện canh tác khắc nghiệt như hạn hán, ngập mặn, nóng và
lạnh.

2.2.3 Vai trò của chất điều hoà sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng
Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hoà sinh trưởng thực vật là

các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất
6


tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm
biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không
phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố trong thực vật.
Về đại cương các chất điều hoà sinh trưởng được chia làm hai nhóm: các chất
kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự
cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng với nhau là điều cần thiết.
2.2.3.2 Một số chất điều hoà sinh trưởng thường sử dụng
Hiện nay 5 nhóm chất điều hoà sinh trưởng thường sử dụng: auxin, gibberellin,
cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh
trưởng.
* Auxin
Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được
vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế
bào. Auxin bị phân huỷ bởi ánh sáng, có tính phân cực.
Chức năng của auxin
Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thước
của các cơ quan, ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử
cấu trúc nên thành tế bào như cellolose, pectin. Điều chỉnh tính hướng động của cây:
quang hướng động và địa hướng động. Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích
bằng việc ức chế sinh trưởng của chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống
dưới. Kích thích sự hình thành rễ. Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo
nên quả đơn tính không hạt và kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy
huyền phù.
Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý,
trao đổi chất khác. Mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hoá protein
không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử

lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử
lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, một vị trí quan trọng chịu sự tác động của
các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Torry và ctv, 1981). Auxin làm giảm pH do
kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hoá các enzyme tác động nới lỏng vách tế

7


bào và enzyme tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào
(Roger Prat, 1993).
Auxin hoạt hoá sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose,
pectin,…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng,
2002).
*Cytokinin
Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ
quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi,
lá non, quả non, tầng phát sinh.
Đây là chất hoạt hoá sự phân chia tế bào, đồng thời làm tăng quá trình chuyển
hoá acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin được sử dụng khá nhiều
trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
Đặc điểm của cytokinin
Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng
ngọn và hướng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng như
các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản
phẩm cuối cùng là ure.
Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA và TDZ
Chức năng của cytokinin
Vai trò sinh lý đặc trưng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân
chia mạnh mẽ của tế bào. Ảnh hưởng lên sự hình thành và phân hoá cơ quan đặc biệt
là phân hoá chồi. Kìm hãm quá trình hoá già của các cơ quan và của toàn cây, kìm

hãm sự phân huỷ của diệp lục, protein và acid nucleic. Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt,
kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn. Ảnh
hưởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi
chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô gồm mô sẹo sinh
trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm
(Nester và ctv, 1985; Taiz L. và ctv, 1991).
Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi
Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián
tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỷ lệ
8


thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu
cấy.
Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình
thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị
biến dạng hoặc làm cho chồi có nhiều nước.
Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo
mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin.
Nồng độ cytokinin cao (0,5 - 10 mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ
(Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và ctv, 1991;
Humphries, 1960; trích bởi Vũ Văn Vụ, 2003).
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì tuỳ vào mẫu cấy và yêu cầu của từng thí
nghiệm mà các chất điều hoà sinh trưởng được dùng một cách hợp lý.
2.3 Một số đặc điểm của các loại nấm
2.3.1 Nấm Corynespora cassicola.

Hình 2.2 Nấm Corynespora cassicola trên môi trường PGA
2.3.1.1 Đặc điểm hình thái
Khuẩn ty có màu xám đến nâu và rất biến thiên về hình thái, hình dạng bào tử

trên vết bệnh cũng như trên môi trường nhân tạo ( Phan Thanh Dũng, 1995 ).
Bào tử trên lá màu nâu nhạt với dạng lưỡi liềm có nhiều vách ngăn với chiều
dài từ 20 – 300µm, đôi khi đạt 700µm. Chiều rộng từ 5 - 10µm. Bào tử đơn và đôi khi
dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu ( Phan Thanh Dũng, 1995 ).
Trái với ngoài tự nhiên nấm corynespora rất khó sinh bào tử trong môi trường
nhân tạo. Chúng chỉ sinh bào tử ở những điều kiện rất đặc biệt về nhu cầu ánh sáng,
9


nhiệt độ hay dinh dưỡng. Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc thay đổi tuỳ vào điều kiện
nuôi cấy ( Phan Thanh Dũng, 1995 ).
2.3.1.2 Khả năng gây bệnh
Corynespora cassicola được ghi nhận tại hơn 80 nước thuộc nhiều vùng khí
hậu khác nhau từ ôn đới đến nhiệt đới như: Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia,
Indonesia, Australia, Nigeria, Sri Lanka, Campuchia, Thái Lan, Cameroon, Congo,
Cuba, Argentina,…( Phan Thành Dũng, 1995 ).
Corynespora cassicola có khoảng 160 loài kí chủ như : cao su, đu đủ, cà
chua… Tuy nhiên Corynespora cassicola trên cây cao su là chuyên biệt ( Phan Thành
Dũng, 1995).
Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá.
Trong quá trình sinh trưởng nấm có thể tiết ra chất độc ( CC toxin ), hợp chất
này rất độc trên cao su, cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân lá cũng làm rụng lá.
Đây là loại chất độc có tính chuyên biệt, gây ra hiện tượng chết mô lá, vỏ, kích thích lá
hình thành tầng rời, dẫn đến rụng lá.
2.3.1.3 Biện pháp phòng trừ
Không trồng những dòng vô tính mẫn cảm với bệnh
Ghép tán bằng những dòng vô tính kháng bệnh
Có thể sử dụng một số loại thuốc trừ nấm như: Bordeaux 0,75%, Zineb 80WP
0,75%, Benlate 0,5%, Anvil 5SC ( hexaconazole ), Score ( dexaconazole ), Probineb
50WP 0,5%... Cần chú ý phun mặt dưới lá là nơi nấm xâm nhập với chu kì từ 10 – 14

ngày phun 1 lần.
2.3.2 Nấm Colletotrichum gloeosporioides.

Hình 2.3 Nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường PGA
10


2.3.2.1 Đặc điểm hình thái
Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, sinh sản vô tính tạo ra conidia, sinh sản hữu
tính rất hiếm gặp hoặc không có.
Đĩa cành có lông gai, màu nâu đậm hay đen. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ
ngắn hơi tròn ở hai đầu hoặc hình lưỡi liềm hơi cong, không màu.
2.3.2.2 Khả năng gây bệnh
Nấm Colletotrchum gloeosporioides gây thán thư trên xoài, sầu riêng, được
ghi nhận ở hầu hết các tỉnh khu vực miền Tây Nam Bộ như: Tiền Giang, Đồng Tháp,
Vĩnh Long, An Giang, Sóc Trăng, Cần Thơ, Cà Mau và Trà Vinh. (Lê Hoàng Lệ
Thủy và Phạm Văn Kim, 2008).
Colletotrichum gloeosporioides là một trong những tác nhân gây bệnh thán thư
trên cây nho tại Ninh Thuận. Trong đó, Colletotrichum gloeosporioides xuất hiện và
gây hại phổ biến.( Phan Công Kiên, 2006)
Ngoài ra Colletotrichum gloeosporioides còn gây bệnh trên nhiều cây trồng
khác như: bệnh héo đen đầu lá trên cao su, bệnh thán thư trên măng cục, bệnh
Anthracnose trên cà phê, bệnh thán thư trên chanh,...
2.3.2.3 Biện pháp phòng trừ
Nên trồng với mật độ vừa phải để tạo sự thông thoáng trong vườn.
Tỉa bỏ cành lá rậm rạp cho vườn thông thoáng.Thu gom tiêu hủy các cành lá bị
bệnh.
Trong mùa mưa cần phun thuốc ngừa định kỳ. Phòng trừ bệnh thán thư nên
phun thuốc khi phát hiện bệnh chớm xuất hiện, nếu bệnh phát triển mạnh cần phun
nhiều lần mỗi lần cách 7-15 ngày để ngăn chận sự phát triển và lây lan bệnh.

Sử dụng các loại thuốc trừ nấm sau: Bavistin 50FL, Carbenda 50SC (10ml/10
lít nước); Polyram 80DF (30g/10 lít nước); Dithane Xanh M-4580WP, Manozeb
80WP (40g/10 lít nước), Bemyl 50WP (25g/10 lít nước); Cozol 250EC (5ml/10 lít
nước)…, nên thay đổi thuốc sau vài lần phun để tránh sự quen thuốc của mầm bệnh.

11


2.3.3 Nấm Fusarium moniliforme.

Hình 2.4 Nấm Fusarium moniliforme trên môi trường PGA
2.3.3.1 Đặc điểm hình thái
Nấm bệnh có cả hai loại cuống bào tử đính nhỏ và lớn. Sợi nấm phân cành và
chia thành ngăn. Mầm bệnh sản sinh nang bào tử, được hình thành trong một túi, gọi là
túi nang. Nang chứa trong các thể quả, gọi là thể quả túi hay thể quả bào tử được xem
như là các thể quả dạng chai ( Nguyễn Đình Toàn, 2008).
Các thể quả dạng chai này có màu xanh sậm và đo được từ 250-330 x 220-280
µm. Chúng có hình cầu hay bầu dục, hơi xù xì. Nang có hình trụ, dạng pít-tông, phía
trên dẹp và kích thước từ 90-102 x 7-9 µm. Nang chứa từ 4 – 6 bào tử, có khi 8. Các
bào tử thường có một vách ngăn và kích thước khoảng 15 x 5,2 µm, có thể lớn hơn từ
27 - 45 x 6 - 7 µm ( Nguyễn Đình Toàn, 2008).
2.3.3.2 Khả năng gây bệnh
Nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von còn gọi là bệnh mạ đực, bệnh
thối gốc (Foot-rot), hay bệnh vươn lóng (elongation disease). Tiếng Nhật gọi là bệnh
bakanae.. Bệnh có thể xuất hiện và gây hại từ khi cây lúa còn ở giai đoạn mạ cho đến
lúc thu họach ( Nguyễn Đình Toàn, 2008).
Bệnh lúa von rất phổ biến và gây tác hại lớn ở nhiều nước trồng lúa trong
những năm trước đây. Năm 1943, Bugnicourt là người đầu tiên nghiên cứu và xác
nhận bệnh lúa von ở Việt Nam. Năm 1956, bệnh gây hại nặng trên diện rộng ở vùng
đồng bằng sông Hồng, có nơi thiệt hại hơn 2/3 sản lượng. Năm 1970, bệnh xuất hiện

và phá hoại nặng một số tỉnh Hải Hưng, Thái Bình, Nam Hà…trên các giống Mộc
Tuyền, Bảo Thái, 813,v.v…( Vũ Triệu Mân, 2007).
12


Một bệnh nữa do nấm Fusarium moniliforme gây ra là bệnh thối đen hạt bắp
sau thu hoạch cũng rất nghiêm trọng.
2.3.3.3 Biện pháp phòng trừ
Không sử dụng hạt lúa ở những ruộng đã bị bệnh làm giống cho vụ sau.
Đối với lúa cấy, khi nhổ mạ cần chú ý tránh làm đứt chồi, rễ, tránh dập nát cây
mạ, để hạn chế sự xâm nhập của nấm bệnh vào bên trong cây.
Kiểm tra ruộng lúa thường xuyên để phát hiện và nhổ bỏ kịp thời những cây bị
bệnh, đem ra khỏi ruộng tiêu hủy.
Bố trí mùa vụ hợp lý, sạ thưa, bón phân cân đối giữa đạm, lân và kali để cây sinh
trưởng, phát triển tốt, làm giảm bớt sự nhiễm bệnh của cây.
Bệnh chủ yếu lây qua hạt giống và lưu tồn trong đất. chính vì thế, 2 biện pháp
được đề xuất trong phòng trừ là xử lý hạt giống và đất trước khi gieo sạ.
Xử lý hạt giống bằng nước nóng 54oC, formol, Benlate - C, Rovral 50WP (0,1 - 0,2%);
Bumper 25EC (0,25 - 0,5 l/ha) để ngăn chận bệnh lúa von ( Vũ Triệu Mân, 2007).
Ở những ruộng sản xuất giống, đặc biệt trên giống Jasmine, khi lúa đã nhiễm
bệnh, có thể khống chế bằng cách:( Nguyễn Đình Toàn, 2008).
 Phun Vicarben 50HP. Phun 2 lần, lúc lúa trỗ và lúc vào chắc. Liều lượng 30/00.
Nên phun vào chiều mát.
 Xử lý Carban 50SC, liều lượng 1lít/ha. Nên phun vào chiều mát. Carban 50SC
không chỉ loại trừ được nấm gây bệnh lúa von mà còn hạn chế nấm gây bệnh
lem lép hạt.
2.3.4 Nấm Phytophthora palmivora.

Hình 2.5 Nấm Phytophthora palmivora trên môi trường PGA

13


2.3.4.1 Đặc điểm hình thái
Theo Lê Lương Tề, sợi nấm Phytophthora palmivora không có vách ngăn, sinh
sản vô tính tạo bọc bào tử và động bào tử. Động bào tử có từ 1 – 2 lông roi, sinh sản
hữu tính tạo ra bào tử trứng.
Bào tử có dạng hình quả chanh, hạt bí, đơn bào, không màu, có cuống ngắn.
2.3.4.2 Khả năng gây bệnh
Nấm Phytophthora palmivora gây bệnh xì mũ cao su, đây là một bệnh phổ biến
ở các vùng trồng cao su trên thế giới như: Nam Mỹ, các nước Đông Nam Á, miền
Nam Trung Quốc và một số nước Châu Phi, Nam Á. ( Vũ Triệu Mân, 2007).
Bệnh gây hại ở giai đoạn cây con ở vườn ươm, vườn nhân gốc ghép, và ở cả
cây lớn. Khi bệnh phá hại trên mặt cắt miệng cạo được gọi là bệnh loét sọc miệng cạo
cao su. ( Vũ Triệu Mân, 2007).
Bệnh loét sọc miệng cạo làm cho chu kì khai thác mũ cao su bị rút ngắn lại,
năng suất mũ do bệnh gây thiệt hại tới 40%.( Vũ Triệu Mân, 2007).
Nấm Phytophthora palmivora còn gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác như:
bệnh thối rễ, thối thân, xì mủ, vàng lá, khô đọt, thối trái trên sầu riêng; Thối rễ, thối
thân, thối trái trên ca cao; Thối đọt, trái trên dừa; thối nõn, thối rễ, thối thân, trái trên
dứa, chuối, đu đủ.
2.3.4.3 Biện pháp phòng trừ
Trồng mật độ vừa phải kể cả cây con trong vườn ươm và trong vườn trồng.
Dọn sạch cỏ dại trong vườn, tỉa bỏ các nhánh thấp, tỉa sớm để tạo độ thông
thoáng trong vườn.Tạo dáng cây thẳng, cành thấp nhất cách mặt đất 1,5-2 m.Vệ sinh
vườn,tiêu hủy các bộ phận cây bệnh.
Tránh gây ra các vết thương trên cây, tất cả các vết thương trên cây nên bôi các
loại thuốc trừ nấm thích hợp.
Áp dụng các biện pháp canh tác như tưới nước đầy đủ, bón phân hợp lý, đặc
biệt vườn phải thoát nước không để ngập úng... làm cho cây khỏe mạnh, tăng khả năng

chống chịu.

Phun định kỳ các loại thuốc trừ nấm: Manzate, Copper B, Aliette, Mexyl–MZ.
Có thể dùng Agri-fos 400 tiêm trực tiếp vào cây hoặc phun trên gốc, trái, lá.
14


2.3.5 Nấm Ceratocystis sp.

Hình 2.6 Nấm Ceratocystis sp. trên môi trường PGA
2.3.5.1 Đặc điểm hình thái
Trên vết bệnh sợi nấm có màu trắng, sau chuyển qua màu nâu đen. Bào tử phân
sinh được sinh ra trên đỉnh của những sợi nấm, hình tròn ngắn, không màu, hình thành
từng chuỗi, trong giọt nước rất dễ nảy mầm. Bào tử túi hình bầu dục dài, không màu.
Bào tử hậu có dạng chuỗi, hình hơi tròn khi còn non màu hơi vàng nâu, khi già có màu
đen, vách dầy không nhân ( Vũ Triệu Mân, 2007).
2.3.5.2 Khả năng gây bệnh
Nấm Ceratocystis sp. gây bệnh thối đen trên mía ( Vũ Triệu Mân, 2007). Do có
phổ kí chủ tương đối rộng, nên nấm Ceratocystis sp. còn gây bệnh trên nhiều loại cây
trồng khác nhau như: héo cây sòi, bệnh thối rễ khoai tây, bệnh thối cuốn dứa, bệnh
chết cây xoài, bệnh héo cây cacao, bệnh loét trên cây cà phê, bệnh thối mốc miệng cạo
cao su, bệnh thối đen cây khoai sọ …
Gần đây khu vực trồng thanh long ở Bình Thuận ghi nhận nấm Ceratocystis sp.
gây bệnh thối trái ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến năng suất.
2.3.5.3 Biện pháp phòng trừ
Trồng cây kháng: Cây kháng đã được sử dụng thành công trên cây xoài
(Ribeiro et al., 1995; Rossetto et al., 1997), cây ca cao, cây khoai lang (Martin, 1954),
cây cà phê, đặc biệt là trên nhiều loài cây có múi (Paez-Redondo and Castano-Zapata,
2001).
Biện pháp canh tác và vệ sinh dụng cụ lao động: Vệ sinh cũng ảnh hưởng đến

việc kiểm soát bệnh do bào tử của nấm Ceratocystis sp. có khả năng tồn tại đến 4 năm
15