Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin cnazu10 và ruazu12 từ clostridium nexile và ruminococcus sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ÂU THỊ HẠNH

TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN
CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE
VÀ RUMINOCOCCUS SP.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ÂU THỊ HẠNH

TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN
CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE
VÀ RUMINOCOCCUS SP.
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành đào tạo:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60420201

Quyết định giao đề tài:

67/QĐ – ĐHNT ngày 24/01/2017

Quyết định thành lập HĐ:
Ngày bảo vệ:

16/05/2018

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN VĂN DUY
2. PGS.TS. PHAN THỊ PHƢỢNG TRANG
Chủ tịch hội đồng:
PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa
Phòng đào tạo sau đại học:

KHÁNH HÒA – 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế
bacteriocin Cnazu10 và Ruazu12 từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp.” đƣợc
trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn
thành luận văn đều đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính
xác và đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Khánh Hòa, ngày 20 tháng 04 năm 2018
Tác giả luận văn

Âu Thị Hạnh

i


LỜI CẢM ƠN
Lời tri ân đầu tiên tôi xin gửi đến Quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học &
Môi trƣờng và Khoa Sau đại học - Trƣờng Đại học Nha Trang đã truyền đạt, dạy bảo
những kiến thức quý báu cũng nhƣ đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chƣơng trình
đào tạo Thạc sĩ.
Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Văn Duy, Viện Công
nghệ sinh học & Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang và PGS.TS. Phan Thị
Phƣợng Trang, Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hƣớng dẫn, định hƣớng và truyền đạt
cho tôi những kinh nghiệm nghiên cứu vô cùng quý báu cũng nhƣ những kinh nghiệm
cuộc sống hữu ích. Đồng thời, Thầy Cô luôn hỗ trợ tôi hết mình trong quá trình học
tập, nghiên cứu, cũng nhƣ tạo mọi điều kiện cho tôi có thể phát huy tốt năng lực của
mình. Tôi xin cảm ơn Thầy Cô vì tất cả những thành quả tôi đạt đƣợc ngày hôm nay.
Tôi xin cảm ơn các em Trí, Phƣơng, Tƣơm, Duyên, Diệu làm việc tại Trung tâm
Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí
Minh là những ngƣời luôn bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã đóng góp công sức, động viên tôi hoàn thành
luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Khánh Hòa, ngày 20 tháng 04 năm 2018
Tác giả luận văn

Âu Thị Hạnh

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..............................................................vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .............................................................................................ix
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
1.1. Tổng quan về bacteriocin .........................................................................................4
1.1.1. Khái niệm về bacteriocin .......................................................................................4
1.1.2. Phân loại bacteriocin ............................................................................................. 4
1.1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin..........................................................................6
1.2. Một số bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ ........................................................8
1.2.1. Azurin ....................................................................................................................8
1.2.2. Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ khác..................................................9
1.3. Tình hình nghiên cứu tuyển chọn các bacteriocin có tiềm năng kháng ung thƣ ....10
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................................10
1.3.2. Tình hình nghiên cứu bacteriocin tại Việt Nam ..................................................11
1.4. Giới thiệu về các peptide kháng ung thƣ tiềm năng từ Clostridium nexile và
Ruminococcus sp. ..........................................................................................................12
1.5. Kỹ thuật tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein....................................................14
1.5.1. Khái niệm về tạo dòng ......................................................................................... 14
1.5.2. Vector và chủng chủ ............................................................................................ 15
1.5.3. Một số enzyme dùng trong tạo dòng ...................................................................16
1.5.4. Kỹ thuật tạo dòng biểu hiện protein mục tiêu trong vi khuẩn Escherichia coli .......19
1.5.5. Tinh chế protein ....................................................................................................21
1.6. Hệ thống biểu hiện protein dung hợp đuôi Histidine .............................................21

1.6.1. Đuôi Histidine .....................................................................................................21
1.6.2. Hệ thống vector pET-42a(+) ...............................................................................22
iii


1.6.3. Hệ thống tế bào chủ E. coli BL21 .......................................................................23
1.7. Chất cảm ứng IPTG ..............................................................................................214
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 25
2.1. Vật liệu ...................................................................................................................25
2.1.1. Chủng vi sinh vật .................................................................................................25
2.1.2. Plasmid ................................................................................................................25
2.1.3. Enzyme ................................................................................................................26
2.1.4. Mồi.......................................................................................................................26
2.1.5. Thang DNA và protein chuẩn..............................................................................27
2.1.6. Hóa chất sinh học phân tử ...................................................................................27
2.1.7. Thiết bị chuyên dụng ........................................................................................... 28
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................29
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 29
2.3.1. PCR (Polymerase chain reaction) ........................................................................30
2.3.2. Điện di DNA trên gel agarose .............................................................................31
2.3.3. Tạo plasmid tái tổ hợp pCnazu10 và pRuazu12 biểu hiện trong E. coli .............32
2.3.3.1.Thu nhận gen p2seq08 và p3seq02 bằng phƣơng pháp PCR ............................ 32
2.3.3.2. Thực hiện phản ứng cắt plasmid pET-42a(+) và các gen p2seq08, p3seq02 ...33
2.3.3.3. Tạo 2 vector tái tổ hợp pET-42a(+) mang gen p2seq08 và p3seq02 ..............34
2.3.4. Tạo chủng E. coli chứa plasmid pCnazu10 và pRuazu12 ...................................34
2.3.5. Điện di protein bằng SDS-PAGE ........................................................................36
2.3.6. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện của protein tái
tổ hợp ............................................................................................................................. 37
2.3.6.1. Khảo sát nồng độ IPTG ....................................................................................37
2.3.6.2. Khảo sát nhiệt độ .............................................................................................. 37

2.3.7. Tinh chế protein Cnazu10 và Ruazu12 chứa đuôi His ........................................38
2.3.7.1. Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu .............................................38
2.3.7.2. Tinh chế protein mục tiêu bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực ............................. 39
2.3.8. Phƣơng pháp cắt protein dung hợp ......................................................................39
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41
3.1. Tạo plasmid tái tổ hợp pCnazu10 và pRuazu12 biểu hiện trong E. coli ................41

iv


3.1.1. Thu nhận gene p2seq08, p3seq02 bằng phƣơng pháp PCR ................................ 41
3.1.2. Tạo plasmid tái tổ hợp pET-42a(+) mang gene p2seq08, p3seq02 và biến nạp
vào E. coli OmniMax ....................................................................................................41
3.2.Tạo chủng E. coli mang plasmid tái tổ hợp và kiểm tra khả năng biểu hiện protein
tái tổ hợp ........................................................................................................................ 50
3.2.1. Tạo chủng E. coli BL21 (DE3) mang plasmid pCnazu10 và pRuazu12.............50
3.2.2. Kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ...................................................51
3.2.2.1. Khảo sát nồng độ IPTG ....................................................................................51
3.2.2.2. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng ...............................................................................53
3.3. Tinh chế protein Ruazu12 dung hợp chứa đuôi His và thu nhận protein Ruazu12 .......55
3.3.1.Tinh chế protein Ruazu12 dung hợp chứa đuôi His .............................................55
3.3.2. Kết quả cắt loại đuôi dung hợp và thu nhận protein Ruazu12 ............................ 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................59
Kết luận.......................................................................................................................... 59
Kiến nghị .......................................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60
PHỤ LỤC

v

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ

Stt

Chữ viết tắt

1

bp

2

DNA

Deoxyribonucleic Acid

3

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

4

L

5

PCR

Ghi chú
Cặp bazơ

Base pair

lít
Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi
trùng hợp

6

6xHis

HexaHistidine

7

dNTP

Deoxy Nucleotide Triphosphate

8

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

9

KDa

Kilo Dalton

10

Kan

Kanamycin

11

LB

Môi trƣờng Luria – Bertani

12

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

13

SDS - PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate –

Điện di

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

polyacrylamide
với SDS

14

TEMED

Tetramethylethylenediamine

15

TAE

Tris – Acetate –EDTA

16

MCS

Multiple Cloning site

17

EBW

Equilibrate – Binding – Wash buffer

18

PMSF

Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Trình tự gen, amino acid và kích thƣớc của Cnazu10 và Ruazu12 ..................14
Bảng 1.2 . Các trình tự nhận biết và vị trí cắt của các enzyme giới hạn đƣợc chọn lọc ........17
Bảng 2.1. Trình tự các mồi đƣợc sử dụng .............................................................................26
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR thu gen ......................................................................32
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn .............................................33
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối ......................................................................................34
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc ..................................................................35
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt protein dung hợp Ruazu12 .........................................40
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ của gen p2seq08 và p3seq02 .............................................42
Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và mức độ tinh sạch của các plasmid tái tổ hợp ................47

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của nisin ..................................................................................................... 5
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin............................................................................ 7
Hình 1.3. Bacteriocin Cnazu10 từ Clostridium nexile (A) và Ruazu12 từ Ruminococcus

sp.(B) .......................................................................................................................13
Hình 1.4. Sơ đồ quy trình tạo dòng ........................................................................................20
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc plasmid pET-42a(+) ......................................................................25
Hình 2.2. Thang DNA (A) và thang protein (B) ...................................................................27
Hình 2.3. Sơ đồ chƣơng trình chạy PCR ...............................................................................30
Hình 3.1. Kết quả PCR thu gen ............................................................................................. 41
Hình 3.2. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp pCnazu10 mang gen p2seq08 ....................................43
Hình 3.3. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp pRuazu12 mang gen p3seq02 ......................................43
Hình 3.4. Kết quả biến nạp sản phẩm nối pCnazu10 vào E.coli OmniMAX.......................44
Hình 3.5. Kết quả biến nạp sản phẩm nối pRuazu12 vào E.coli OmniMAX.......................44
Hình 3.6. Kết quả PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pCnazu10 ..............................................45
Hình 3.7. Kết quả PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pRuazu12 ..............................................46
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen p2seq08 ..........................................................................48
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự gen p3seq02 ..........................................................................49
Hình 3.10. Kết quả biến nạp plasmid pCnazu10 vào E. coli BL21 (DE3).......................... 50
Hình 3.11. Kết quả biến nạp plasmid pRuazu12 vào E. coli BL21 (DE3).......................... 50
Hình 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên sự biểu hiện của protein
Cnazu10 trong chủng E.coli BL21 (DE3)............................................................. 51
Hình 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên sự biểu hiện của protein
Ruazu12 trong chủng E.coli BL21(DE3).............................................................. 52
Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên tính tan của protein
Cnazu10...................................................................................................................53
Hình 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên mức độ biểu hiện
Ruazu12...................................................................................................................54
Hình 3.16. Kết quả tinh chế protein dung hợp Ruazu12 ......................................................56
Hình 3.17. Kết quả cắt loại đuôi dung hợp và thu nhận protein Ruazu12 ................................ 57

viii

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Hiện nay, cách tiếp cận điều trị ung thƣ sử dụng các vi khuẩn sống và sản phẩm
tinh sạch từ chúng đang đƣợc quan tâm. Đặc biệt, bacteriocin – chất kháng khuẩn có
bản chất protein và peptide – đang hứa hẹn là một trong những chất kháng ung thƣ
hiệu quả và an toàn do có hoạt tính kháng ung thƣ mạnh và thấm chọn lọc với tế bào
ung thƣ mà không gây độc đối với tế bào thƣờng. Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo
dòng, biểu hiện và thu nhận các đoạn peptide Cnazu10 và Ruazu12 có nguồn gốc từ vi
sinh vật đƣờng ruột ngƣời vào trong E. coli BL21 (DE3). Nghiên cứu này làm cơ sở
cho việc tiếp tục thử hoạt tính kháng ung thƣ trên tế bào nuôi cấy nhằm phát triển
thuốc điều trị ung thƣ thế hệ mới ở ngƣời. Trong thời gian thực hiện khóa luận này, đề
tài tập trung thực hiện các nội dung chính sau:
- Tạo vector tái tổ hợp pET-42a(+) mang gene p2seq08, p3seq02 mã hóa cho
Cnazu10 và Ruazu12 dung hợp với đuôi GST-6His-TEV.
- Biến nạp và khảo sát sự biểu hiện của protein dung hợp trên chủng E. coli
BL21 (DE3).
- Tinh chế protein mục tiêu đã đƣợc biểu hiện.
Chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả phù hợp với mục tiêu đề ra nhƣ sau:
- Tạo dòng thành công vector pET-42a(+) cho phép biểu hiện các protein mục
tiêu (Cnazu10, Ruazu12) trong chủng E. coli BL21 (DE3).
- Khảo sát đƣợc các điều kiện nuôi cấy và cảm ứng ảnh hƣởng đến sự biểu hiện
protein mục tiêu: nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng ở 23oC protein Ruazu12 ở dạng tan, nồng
độ chất cảm ứng IPTG là 0,01 mM.
- Protein biểu hiện tốt ở các điều kiện cảm ứng.
- Đã tinh chế thành công protein dung hợp pRuazu12 trong đó có chứa protein
mục tiêu Ruazu12, làm nền tảng cho các thí nghiệm tiếp theo để thu nhận protein mục
tiêu.
Từ khóa: Bacteriocin, Cnazu10, Ruazu12, protein tái tổ hợp, kháng ung thư

ix

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ung thƣ là bệnh lý trong đó một số tế bào thoát ra khỏi sự kiểm soát phân bào,
sự biệt hóa tế bào và tiếp tục nhân lên. Những tế bào này có khả năng xâm lấn và phá
hủy các tổ chức xung quanh. Đồng thời, chúng di trú đến phát triển ở nhiều cơ quan
khác nhau và hình thành nên di căn, cuối cùng ung thƣ gây ra tử vong.
Điều trị ung thƣ rất phức tạp. Phẫu thuật sớm đƣợc xem là phƣơng pháp tốt nhất
để loại bỏ khối u gây ung thƣ. Nhƣng bệnh ung thƣ vẫn có thể phát triển trở lại nếu có
bất kỳ tế bào gây bệnh nào bị bỏ sót. Các tế bào ung thƣ là tế bào của cơ thể con ngƣời
nên nhiều phƣơng pháp điều trị tiêu diệt tế bào ung thƣ có nguy cơ phá hủy cả những tế
bào khỏe mạnh trong cơ thể sống. Phƣơng pháp xạ trị và hóa trị liệu có thể gây ra tác
động phụ với các tế bào bình thƣờng và dẫn tới hiện tƣợng kháng thuốc (đối với hóa trị
liệu) của tế bào ung thƣ. Vì vậy, việc tìm kiếm liệu pháp điều trị mới là cấp thiết.
Các nghiên cứu hiện nay cũng đang tập trung vào việc tìm ra phƣơng pháp mới
để điều trị có hiệu quả hơn căn bệnh ung thƣ nhƣng hạn chế tối đa các tác dụng phụ và
tình trạng kháng thuốc.
Gần đây các loại thuốc điều trị ung thƣ mới từ vi khuẩn sống và các sản phẩm
tinh sạch của chúng đƣợc quan tâm trở lại. Trong đó, điển hình là việc nghiên cứu các
bacteriocin từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột của ngƣời tiết ra, có thể thấm chọn lọc các tế
bào ung thƣ ở ngƣời, gây độc và cảm ứng quá trình chết tế bào theo chƣơng trình,
nhƣng không tác động lên tế bào bình thƣờng. Ví dụ, Azurin từ Pseudomonas
aeruginosa là bacteriocin có tiềm năng ứng dụng điều trị bệnh ung thƣ nhằm thay thế
các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật và xạ trị. Điều này có thể giúp cho ngƣời bệnh không
phải chịu những tác dụng phụ do hóa chất gây ra.
Azurin là bacteriocin đã đƣợc chứng minh hoạt tính kháng ung thƣ nhất là vùng
chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung thƣ của Azurin
từ vị trí acid amin 50 – 77, gọi là p28 – Azurin. Một thử nghiệm cận lâm sàng tiến
hành trên linh trƣởng và chuột đã chứng minh peptide này không độc và không cảm
ứng đáp ứng miễn dịch. Đồng thời, p28 – Azurin đã vƣợt qua 2 vòng thí nghiệm lâm

sàng giai đoạn I trên ngƣời và và đƣợc FDA (Hoa Kỳ) chứng nhận làm thuốc kháng
ung thƣ.
1


Gần đây, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và cộng sự ở Trƣờng Đại học
Nha Trang đã sàng lọc các bacteriocin khác có những đặc điểm tƣơng tự Azurin và
p28 – Azurin nhất là về các vùng chức năng sinh học trong cấu trúc, tỉ lệ acid amin kỵ
nƣớc và khả năng gắn kết với protein p53 của tế bào ung thƣ. Trong số này có 2
bacteriocin từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp.
Trong đề tài: “Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin Cnazu10 và Ruazu12
từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp.”, Các gene p2seq08 và p3seq02 mã hóa cho
Cnazu10 và Ruazu12 sẽ đƣợc dòng hóa và biểu hiện vào plasmid pET-42a(+) trên E.
coli và sau đó tinh chế thu nhận bacteriocin tƣơng ứng làm cơ sở cho những nghiên cứu
tiếp theo về thử nghiệm hoạt tính kháng ung thƣ và ứng dụng của chúng.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo dòng, biểu hiện và thu nhận đoạn peptide
Cnazu10 và Ruazu12 trong E. coli BL21 (DE3). Nghiên cứu này làm cơ sở cho việc
tiếp tục thử hoạt tính kháng ung thƣ trên tế bào nuôi cấy nhằm phát triển thuốc điều trị
ung thƣ thế hệ mới ở ngƣời.
3. Nội dung chính của đề tài
- Dòng hóa gene p2seq08, p3seq02 mã hóa cho Cnazu10 và Ruazu12 vào
plasmid pET-42a(+).
- Tạo chủng E. coli mang plasmid tái tổ hợp và kiểm tra khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp.
- Tinh chế protein Cnazu10 và Ruazu12 chứa đuôi Histidine.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học:
- Xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tốt nhất để có thể tạo dòng gene mã hóa
Cnazu10 và Ruazu12 biểu hiện đƣợc protein Cnazu10 và Ruazu12 từ các bacteriocin

của vi khuẩn Clostridium nexile và Ruminococcus sp. tiết ra.
- Nghiên cứu này cung cấp quy trình tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein từ vi
khuẩn đƣờng ruột ngƣời trong E. coli. Đây là cơ sở khoa học cho công nghệ protein tái tổ
hợp nhằm phát triển liệu pháp điều trị ung thƣ từ các protein và peptide của vi khuẩn.

2


Ý nghĩa thực tiễn:
- Kết quả là tiền đề cho định hƣớng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong việc
sản xuất thuốc điều trị ung thƣ thế hệ mới với hoạt tính kháng ung thƣ mạnh và hiệu
quả phụ thấp.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bacteriocin
1.1.1. Khái niệm về bacteriocin
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptite hoặc protein do gene
mã hóa đƣợc sản sinh từ cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng để ức chế các
vi khuẩn cạnh tranh khác.
Bacteriocin có hoạt tính kháng các vi sinh vật cạnh tranh trong cùng ổ sinh thái,
thƣờng kháng các loài có quan hệ tiến hóa gần nhau (phổ hẹp) nhƣng đôi khi kháng
nhiều loài vi khuẩn khác thậm chí kháng các tế bào sinh vật nhân chuẩn nhƣ tế bào
ung thƣ (phổ rộng). Vì vậy, chúng đƣợc mong đợi có tác động có lợi đến sức khỏe của
ngƣời, động vật nuôi và một số thực vật (Riley, 2009). Bacteriocin hứa hẹn là một
trong các chất kháng ung thƣ hiệu quả, các tính chất hóa sinh của chúng đã và đang
đƣợc nghiên cứu.
1.1.2. Phân loại bacteriocin

Bacteriocin đƣợc phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau nhƣ: họ vi khuẩn sản
sinh, trọng lƣợng phân tử của chúng và trình tự chuỗi acid amin…Cho tới hiện nay
bacteriocin đƣợc chia thành 4 lớp.
a) Lớp I: là lớp lantibiotic, là polypeptite có trọng lƣợng phân tử < 5 kDa, bền
nhiệt, hoạt động theo cơ chế tác động lên màng tế bào. Lantibiotic bacteriocin lớp I
đƣợc chia thành hai lớp phụ.
Lớp Ia: thƣờng là những protein nhỏ (2-5 kDa) có hình ốc vít, kéo dài và chứa
những phân tử mang điện tích dƣơng. Nisin thuộc vào lớp này.
Nisin là loại bacteriocin có bản chất là một peptide đa vòng, chứa 34 acid amin.
Nisin đƣợc sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic. Nisin có phổ kháng khuẩn
Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hƣởng bởi nisin khi
màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin đƣợc cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu
quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dƣỡng của
Bacillus spp. và Clostridium spp. (Vesterlund et al, 2004). Chúng đƣợc sử dụng chủ
yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô
mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt nhƣ Bacillus và Clostridium.
4


Hình 1.1. Cấu trúc của nisin
( Nguồn: Poeta et al, 2005)
Lớp phụ Ib: là những peptite đặc trƣng hình cầu, không linh động, tích điện âm hoặc
không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu đối với những phân tử
enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm. Đại diện cho nhóm này là Mersacidin.
Lớp II: gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, là những peptide có trọng
lƣợng phân tử biến thiên, nhƣng thông thƣờng nhỏ (< 10 kDa), bền nhiệt, chứa những
amino acid thông thƣờng. Nhóm này đƣợc chia vào trong ba nhóm nhỏ:
Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptide hoạt động chống Listeria, đại diện
đặc trƣng cho nhóm này là pediocin PA-1, Leucocin A và Sakacin P. Các bacteriocin
nhóm này hứa hẹn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng

Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn đƣợc chú ý hơn nhiều so với
bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng có phổ ức chế đặc hiệu với vi khuẩn đích.
Lớp IIb: đƣợc hình thành bởi phức hợp của hai peptide riêng biệt, những peptide
này ít hoặc không hoạt động. Bacteriocin đặc trƣng cho nhóm này là: Lactococcin G,
Plantaricin EF và Plantaricin JK.
Lớp IIc: là những peptide nhỏ, bền nhiệt. Trong phân lớp này chỉ tìm thấy các
bacteriocin nhƣ Divergicin A và Acidocin B.
b) Lớp III: lớp này bao gồm các peptide lớn có trọng lƣợng phân tử > 30 kDa,
không tan, không bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào có hoạt tính
kháng lại các vi khuẩn. Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ đƣợc phân lập từ chi
Lactobacillus. Đại diện: Acidofilicin A và Lactacins A,B.

5


d) Lớp IV: là các bacteriocin phức hợp, ngoài thành phần chính là protein chúng
còn chứa lipid và cacbonhydrat. Cấu trúc và chức năng của nhóm này chƣa đƣợc biết
nhiều, ví dụ Leuconocin B.
1.1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Các bacteriocin thƣờng có hiệu quả chống lại vi khuẩn Gram dƣơng nhƣ:
Bactobaccilus, Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium. Các bacteriocin của
Lactacins A, B có thể không hiệu quả khi ức chế hoạt động của vi khuẩn Gram âm vì
màng ngoài của chúng gây cản trở cho hoạt động của bacteriocin. Cơ chế tác động của
bacteriocin rất đa dạng, có thể làm biến đổi các enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử,
hoặc xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng của màng
nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào do đó tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục
đƣợc dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA,
RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Thomas et al, 1994).
Lớp I (điển hình là nisin): tác động lên thành peptidoglycan hoặc màng nguyên
sinh, hoặc kết hợp cả hai cơ chế. Ví dụ, nisin có cả hai cơ chế trong khi đó thì lacticin

chỉ có khả năng tác động lên thành peptidoglycan.
Đối với thành peptidoglycan, lipid II giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận
chuyển các đơn vị tổng hợp nên thành peptidoglycan từ trong tế bào chất. Bacteriocin
thuộc nhóm này có khả năng liên kết với lipid nằm trên màng nguyên sinh, sự liên kết
này đƣợc giải thích rằng do phần lớn bacteriocin mang điện tích dƣơng và lipid màng
mang điện tích âm, vì thế sự liên kết đƣợc dễ dàng tạo ra trên màng. Sau khi tạo liên
kết, bacteriocin sẽ khóa lipid làm chúng mất khả năng vận chuyển các tiểu đơn vị cấu
tạo nên thành peptidoglycan (Heschard et al, 2002).
Đối với màng sinh chất, bacteriocin liên kết và sử dụng lipid trên màng nguyên
sinh thực hiện quá trình oxi hóa khử, lúc này lipid có tác dụng nhƣ những con dao cắt
tạo nên những lỗ hỏng trên màng nguyên sinh. Những lỗ hỏng này làm thất thoát nhiều
các ion, các chất hòa tan trong nguyên sinh chất (muối khoáng, acid amin, acid
nucleic…), làm thủy phân và thất thoát nhiều ATP dẫn đến tế bào chết nhanh hơn
(Heschard et al, 2002).

6


Lớp II (điển hình là Sakacin): do có nhóm kỵ nƣớc nên sau khi tạo ra kênh dẫn
trong màng, bacteriocin thuộc nhóm này sẽ liên kết với lipid trong thành phần
phospholipid màng, và gắn trực tiếp vào màng nhƣ một thành phần của màng, sau đó
thực hiện các phản ứng oxi hóa khử tạo nên những lỗ hỏng và tác động nhƣ nhóm I
(Heschard et al, 2002).
Lớp III (điển hình là lysostaphin): tác động trực tiếp lên thành tế bào, làm phân
hủy thành tế bào và thay đổi tính thẩm thấu (Heschard et al, 2002).
Lớp IV : Hiện vẫn chƣa có kết luận rõ ràng về cơ chế hoạt động của nhóm này.
Tuy nhiên các nhà khoa học giả định rằng cơ chế hoạt động của nhóm này chủ yếu tác
động lên DNA, RNA và sự tổng hợp protein. Các bacteriocin nhóm này có thể tạo
phức hợp không tan với DNA, ngăn cản DNA tổng hợp nên RNA và protein hoặc liên
kết với DNA làm cho quá trình dịch mã sinh ra các protein bất thƣờng (Heschard et al,

2002).

Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
(Nguồn: Cotter et al, 2005)

7


1.2. Một số bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ
1.2.1. Azurin
Azurin là một bacteriocin thuộc họ protein cupredoxin do Pseudomonas
aeruginosa tiết ra, có thể thấm chọn lọc các tế bào ung thƣ ở ngƣời, gây độc và cảm
ứng quá trình chết tế bào theo chƣơng trình, nhƣng không tác động đối với tế bào bình
thƣờng. Azurin có thể tƣơng tác trực tiếp và làm ổn định cấu trúc protein p53 (Punj et
al, 2003). Vùng chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung
thƣ của azurin nằm từ vị trí axit amin từ 50–77 (đƣợc gọi là vùng p28). Vùng này có
cấu trúc xoắn alpha và lƣỡng tính. Quá trình xâm nhập vào tế bào của azurin không
kèm theo phá vỡ màng tế bào và dẫn tới làm tan bào. Một thử nghiệm cận lâm sàng
nhằm đánh giá các thông số dƣợc động học, trao đổi chất và độc tính của azurin-p28
(đoạn peptite tổng hợp dài 28 aa có nguồn gốc azurin) tiến hành trên linh trƣởng và
chuột đã chứng minh peptite này không độc và không cảm ứng đáp ứng miễn dịch (Jia
et al, 2011). Hơn thế nữa, gần đây tƣơng tác protein-protein giữa azurin và p53 đã
đƣợc phân tích bằng công cụ tin sinh học và kính hiển vi lực nguyên tử (Grandis et al,
2007; Taranta et al, 2009).
Tƣơng tự Azurin, thông qua phƣơng pháp động học phân tử và sử dụng kính
hiển vi lực nguyên tử, peptite p28 - Azurin đƣợc ghi nhận có khả năng liên kết với
protein p53 cũng nhƣ ức chế sự hình thành mạch máu mới, và các đặc tính ức chế khối
u khác. Vì vậy, peptite p28 – Azurin đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên
ngƣời bởi công ty CDG Therapeutics Inc, Mỹ. Thử nghiệm đƣợc tiến hành với mƣời
lăm bệnh nhân ung thƣ di căn giai đoạn IV đã không còn đáp ứng với điều trị bằng các

thuốc chống ung thƣ khác nhau và có tuổi thọ dự tính không quá 6 tháng thử nghiệm.
Trong số này có 7 bệnh nhân ung thƣ da, 4 bệnh nhân ung thƣ trực tràng, 2 bệnh nhân
ung thƣ mô mềm sarcoma, 1 bệnh nhân ung thƣ tuyến tụy và 1 bệnh nhân ung thƣ
tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy độc tính và đáp ứng miễn dịch đã không đƣợc ghi
nhận ở tất cả các bệnh nhân. Đặc biệt, ung thƣ đã suy giảm một phần ở hai bệnh nhân
trong khi ở hai bệnh nhân khác ung thƣ hoàn toàn suy giảm, chứng tỏ cơ chế tác động
hiệu quả của p28 – Azurin đối với các bệnh nhân này (Yamada et al, 2011).

8


1.2.2. Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ khác
Azurin không phải là bacteriocin kháng ung thƣ duy nhất do các vi sinh vật của
khu hệ vi sinh đƣờng ruột ngƣời tiết ra. Đặc tính kháng ung thƣ của dịch bacteriocin
thô đã đƣợc phát hiện từ những năm 1970. Ngày nay, nhiều bacteriocin tinh sạch thể
hiện hoạt tính ức chế đối với nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau đã đƣợc phát hiện,
bao gồm pyocin, colicin, pediocin và microcin.
Nisin là đại diện điển hình lớp Ia của các bacteriocin, là một peptite kháng khuẩn
đa vòng, đƣợc cấu tạo từ 34 gốc acid amin do vi khuẩn Lactococcus lactis trong quá
trình lên men lactic tiết ra, là một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên không thể tổng hợp
nhân tạo, có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn Gram dƣơng, đã đƣợc sử dụng phổ
biến trong bảo quản thực phẩm, không độc đối với các động vật và con ngƣời.
Bacteriocin này đã đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cấp phép sử dụng năm 1969 và
Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép năm 1988. Nisin còn
là chất kháng ung thƣ đối với ung thƣ tế bào vảy ở đầu và cổ (HNSCC) bằng khả năng
cảm ứng quá trình chết theo chƣơng trình, làm ngừng chu trình tế bào, ức chế quá trình
tăng sinh tế bào chọn lọc ở tế bào HNSCC so với các tế bào sừng (keratinocyte) (Joo
et al, 2012).
Tƣơng tự, plantaricin A (PlnA) là một bacteriocin có điện tích dƣơng từ chủng
Lactobacillus plantarum C11 có khả năng thấm qua màng và có hiệu quả kháng

khuẩn. Điều thú vị là PlnA cũng có thể thấm qua màng các tế bào nhân chuẩn với hiệu
quả tùy thuộc từng loại tế bào, bao gồm cả tế bào ung thƣ và các tế bào thƣờng khác.
Kết quả nghiên cứu cơ chế thấm qua màng cho thấy, tƣơng tác tĩnh điện giữa PlnA và
các glycoprotein màng đóng vai trò then chốt cho PlnA bắt đầu tƣơng tác với các
phospholipit màng (Sand et al, 2013).
Trong số các bacteriocin kháng ung thƣ nói trên, azurin đƣợc sản sinh từ vi khuẩn
Gram âm, trong khi nisin và PlnA đƣợc sản sinh từ vi khuẩn Gram dƣơng. Điều này
gợi ý rằng, cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm, cũng nhƣ các vi khuẩn gây bệnh và
hội sinh ở ngƣời đều có thể sản xuất ra các bacteriocin, vừa có hoạt tính kháng vi sinh
vật vừa có hoạt tính chống ung thƣ. Điều này mở ra kỷ nguyên mới trong việc phát
triển thuốc chữa bệnh góp phần bảo vệ sức khỏe con ngƣời. Nếu các vi sinh vật gây
bệnh và hội sinh cùng tồn tại lâu dài trong cơ thể ngƣời sản xuất ra các protein để bảo
9


vệ môi trƣờng sống của chúng khỏi ung thƣ và các bệnh gây chết ngƣời khác, điều này
có nghĩa là chúng ta có thể tìm ra các chất chống ung thƣ mới từ khu hệ vi sinh của
ngƣời.
1.3. Tình hình nghiên cứu tuyển chọn các bacteriocin có tiềm năng kháng ung thƣ
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của
Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia coli
và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về
bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây
tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tƣơng tự nhƣ vi khuẩn sản xuất.
Ba chủng vi khuẩn Gram (+) đƣợc nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy
giờ là: Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những
năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lƣợng các công bố trên bacteriocin.
Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hƣớng nhƣ một
chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (Desriac et al, 2010).

Các nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng nhiều bacteriocin vào trong các
lĩnh vực nhƣ công nghệ thực phẩm, y tế, thú y… và thu đƣợc các thành tựu to lớn. Đây
là kết quả tất yếu dẫn đến sự bùng nổ các nghiên cứu về bacteriocin của vi khuẩn vào
những thập niên cuối thế kỷ XX và đầu thế kỷ XXI. Các khả năng ứng dụng khác của
bacteriocin nhƣ ngăn ngừa nhiễm trùng khu trú, làm chất bảo vệ thực vật, làm chất
thay thế kháng sinh…cũng đã đƣợc đề xuất và nghiên cứu bƣớc đầu. Ví dụ: Các chủng
probiotic và các chủng tạo bacteriocin có khả năng bảo vệ đƣờng tiêu hóa chống lại vi
khuẩn gây bệnh.
Nhiều protein và peptite vi khuẩn có hoạt tính kháng với nhiều loại tế bào ung
thƣ khác nhau ở giai đoạn thử nghiệm cận lâm sàng đã đƣợc phát hiện. Các protein và
peptite này đƣợc tìm thấy ở các vi khuẩn đƣợc cho là không liên quan đến hoạt tính
kháng ung thƣ. Ví dụ, SSL10, một protein giống siêu kháng nguyên từ Staphylococcus
aureus, có khả năng ức chế sự di chuyển của tế bào ung thƣ máu Jurkat và tế bào ung
thƣ cổ tử cung Hela theo cơ chế cảm ứng biểu hiện CXCl12 (Walenkamp et al, 2009).
SSL5, một protein giống siêu kháng nguyên khác từ S. aureus, có thể ngăn chặn sự dính
bám của các tế bào bạch cầu lên các tế bào nội mạc của thành mạch máu và các tiểu cầu.
10


Sự dính bám của các tế bào khối u vào tế bào nội mạc kích thích sự hình thành mạch
máu và di căn, do vậy, protein SSL5 đóng vai trò quan trọng trong việc kìm hãm sự phát
triển của khối u (Walenkamp et al, 2010).
Các trƣờng hợp khác, ActA là protein cảm ứng sự tập hợp actin, đóng vai trò quan
trọng trong tiến trình gây bệnh của L. monocytogens, đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong liệu
pháp miễn dịch đối với các đáp ứng miễn dịch trung gian qua tế bào TCD8 (Wood et al,
2010). Romidepsin, một dipeptite tự nhiên từ Chromobacterium violaceum có hoạt tính
ức chế các histone deacetylase, enzyme quan trọng trong sự phát triển và lan rộng của
khối u, vì vậy là một trong các đích quan trọng đối với bệnh ung thƣ máu (Vinodhkumar
et al, 2008). Spiruchostatin B, một peptite có cấu trúc tƣơng tự Romidepsin từ
Pseudomonas sp. cũng thể hiện hoạt tính tƣơng tự đối với các tế bào ung thƣ (Kanno et al,

2012). Cuối cùng, Pep27anal2, phân tử có cấu trúc tƣơng tự peptite Pep27, từ
Streptococcus pneumoniae cảm ứng quá trình chết theo chƣơng trình của các tế bào ung
thƣ theo các con đƣờng truyền tín hiệu khác nhau. Peptite này sau đó đã đƣợc cải biến
nhằm làm tăng hoạt tính chống ung thƣ ở các nồng độ thấp hơn (Lee et al, 2005).
1.3.2. Tình hình nghiên cứu bacteriocin tại Việt Nam
Ở Việt Nam, gần đây đã có những sàng lọc các chất chống ung thƣ từ các nguồn
khác nhau. Các chất có hoạt tính kháng ung thƣ từ thực vật nhƣ arabinoxylan cám gạo
MGN-3 (Bang et al, 2010), dịch chiết ethanol của cây Selaginella tamariscina (Le et al,
2012), cleistanthane diterpene từ hạt cây Caesalpinia sappan (Nguyen et al, 2013) và
geranyl dihydrochalcone từ cây Artocarpus altilis (Nguyen et al, 2014); Các hoạt chất từ
tảo nhƣ fucoidan từ tảo nâu Sargassum mcclurei (Thinh et al, 2013); Các hoạt chất từ
động vật nhƣ các steroid của bọt biển Ianthella sp. (Nguyen et al, 2009) và sao biển
Astropecten polyacanthus (Thao et al, 2013). Bên cạnh đó, ngƣời ta cũng tổng hợp hóa
học và đánh giá hoạt tính kháng ung thƣ của các chất ức chế histone deacetylase mới
(Nam et al, 2013) và các dendrimer (polymer với kích thƣớc nano) (Ly et al, 2013). Tuy
vậy, cho đến nay những nghiên cứu về các thuốc điều trị ung thƣ từ vi khuẩn và các sản
phẩm của chúng nhƣ peptite và bacteriocin là rất hạn chế ở Việt Nam.
Hiện có một vài nghiên cứu cơ bản hoặc ứng dụng về bacteriocin từ vi khuẩn
lactic tại Việt Nam. Điển hình nhƣ nhóm tác giả ở Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên
cứu và phát hiện khả năng sinh bacteriocin II của chủng vi khuẩn Lactobacillus
11


plantarum L24 (Nguyễn Thị Hoài Hà và cs, 2002). Trong nghiên cứu này, bacteriocin
đƣợc tinh sạch bằng sắc kí lọc gel và phân tách bằng điện di trên gel SDS - PAGE với
trọng lƣợng phân tử vào khoảng 10-30 kDa.
Tại Viện Sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, một báo cáo khoa học cho
thấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một
số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm nhƣ E. coli, Salmonella và một số vi khuẩn
lactic khác (Lê Thị Hồng Tuyết và cs, 2004). Bacteriocin này nhạy cảm với protease

nhƣng lại ổn định với các dung môi hữu cơ, pH và nhiệt độ.
Ngoài ra, một nhóm nghiên cứu ở Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã
nghiên cứu gen minD mã hóa cho một protein tƣơng tự MinD (chất ức chế phân chia tế
bào) ở Lactobacillus acidophilus VTCC-B-871 đã đƣợc chứng minh có ảnh hƣởng đến
khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của tế bào chủ. Điều này mở ra những ứng dụng
hữu ích trong lĩnh vực kháng sinh và dẫn truyền thuốc trong hóa trị liệu ung thƣ
(Nguyen et al, 2013).
Gần đây Nguyễn Văn Duy và cộng sự tại trƣờng Đại học Nha Trang đã tiến hành
sàng lọc các bacteriocin tƣơng tự azurin có tiềm năng kháng ung thƣ từ hệ vi khuẩn
đƣờng ruột ngƣời (Nguyen and Nguyen, 2015). Các tác giả đã đƣa ra giả thuyết rằng
vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn hội sinh trong cơ thể ngƣời cũng có thể sinh ra
bacteriocin giống nhƣ azurin nhằm ngăn chặn bệnh ung thƣ. Vì vậy các bacteriocin đã
đƣợc sàng lọc từ các dữ liệu bộ gen hoàn chỉnh của 66 loài vi khuẩn ƣu thế trong ruột
ngƣời và sau đó so sánh với các vùng chức năng của azurin. Kết quả, các tác giả đã
sàng lọc đƣợc 14 bacteriocin (Nguyen and Nguyen, 2015) và 8 bacteriocin (Nguyen
and Nguyen, 2016) có hoạt tính kháng ung thƣ. Trong số này, có 3 peptide (p1seq16,
p2seq20 và p3seq24) cùng đƣợc phát hiện từ 2 nghiên cứu trên và 5 peptide (p1seq09,
p2seq05, p2seq08, p3seq02 và p3seq17) đƣợc phát hiện riêng trong nghiên cứu thứ hai
(Nguyen and Nguyen, 2016).
1.4. Giới thiệu về các peptide kháng ung thƣ tiềm năng từ Clostridium nexile và
ruminococcus sp.
Trong luận văn này, chúng tôi tập trung tách dòng, biểu hiện và tinh chế 2
peptide từ các nghiên cứu nói trên, trong đó p2seq08 (Cnazu10) từ Clostridium nexile

12


và p3seq02 (Ruazu12) từ Ruminococcus sp. đƣợc phát hiện từ nghiên cứu thứ hai
(Nguyen and Nguyen, 2016).
Clostridium là một chi trực khuẩn Gram dƣơng, thuộc ngành Firmicutes. Đây là

những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh bào tử khi môi trƣờng sống bất lợi.
Từ những đặc điểm điển hình trên, ngƣời ta xếp các vi khuẩn này vào giống
Clostridium. Tuy nhiên, gần đây nhiều chủng đã đƣợc phân loại vào các giống khác.
Chi Clostridium bao gồm khoảng 100 loài có những chủng sống tự do trong môi
trƣờng và một số loài gây bệnh tiềm ẩn với con ngƣời (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000).
Chi Ruminococcus là một chi vi khuẩn thuộc lớp Clostridia, đây là những cầu
khuẩn gram dƣơng, kỵ khí bắt buộc. Một hoặc nhiều loài trong chi này đƣợc tìm thấy
với số lƣợng lớn đáng kể trong ruột ngƣời, chúng có tác động tốt đến hệ vi sinh đƣờng
ruột (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000).
Bacteriocin Cnazu10 và Ruazu12 từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp. là 2
bacteriocin có những đặc điểm giống Azurin và p28-Azurin về các vùng chức năng sinh
học trong cấu trúc, tỷ lệ acid amin kỵ nƣớc và khả năng gắn kết với protein p53 của tế
bào ung thƣ, chúng có thể tƣơng tác trực tiếp và làm ổn định cấu trúc protein p53.

Hình 1.3. Bacteriocin Cnazu10 từ Clostridium nexile (A) và Ruazu12 từ
Ruminococcus sp. (B)
(Nguồn: Nguyen and Nguyen, 2016)
Việc nghiên cứu protein tái tổ hợp từ các bacteriocin của Clostridium nexile và
Ruminococcus sp. tiết ra có thể thấm chọn lọc các tế bào ung thƣ ở ngƣời, gây độc và
13


cảm ứng quá trình chết tế bào theo chƣơng trình, nhƣng không tác động lên tế bào bình
thƣờng. Các bacteriocin này có thể ứng dụng điều trị bệnh ung thƣ nhằm thay thế các
phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật và xạ trị. Điều này có thể giúp cho ngƣời bệnh giảm bớt
đau đớn về thể xác và không phải chịu những tác dụng phụ do hóa chất gây ra.
Bảng 1.1. Trình tự gen, amino acid và kích thƣớc của Cnazu10 và Ruazu12
Tên
bacteriocin

Kích
Nucleic acid Sequence

Amino acid

thƣớc
(kDa)

Cnazu10

Ruazu12

TTAAGCAGCTATCTGTAACTTCC
AACTCTTATATCTGTTCCGGTCA
TACCAGAATCGGAACAGATGCA
AAAGAGCACAAAGTATTCGCCT
CTGAATCCTGAACAGATTCGTC
ACGAATACAGATAATGCGATAG
ATGTCAACTGCGTTTCTTCCAGT
TTTGTGGTAATGCAGCTCATAC
CATAACAGCGTTTGCTCAGGCT
GAAGGTGCGCTCCAC

VERTFSLSKRCY

ATGCAGGTTTATTCCCTTTTTAT
ATTTTCTGCATCAGTTTACTGTA
AAATAATAACGGGTAAAGAAG
ATATAAGATGTTCTGGTACATA
CAATTAA

MQVYSLFIFSAS

GMSCITTKLEET
QLTSIALSVFVT
NLFRIQRRILCA

23

LLHLFRFWYDR
NRYKSWKLQIA
A

VYCKIITGKEDI
RCSGTYN

9

(Nguồn: Nguyen and Nguyen, 2016)
1.5. Kỹ thuật tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein
1.5.1. Khái niệm về tạo dòng
Tạo dòng là việc cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một vector (plasmide hoặc
phage λ) bằng phƣơng pháp hóa sinh. Sau đó, đƣa phân tử lai này vào tế bào chủ đã
chọn lựa bằng phƣơng pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Trƣờng hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh DNA định cài phải mã
hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó.

14