Tinh sạch sắc tố prodigiosin do vi khuẩn serratia marcescens tổng hợp trên môi trường đậu phộng và khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm tinh sạch

MỤC LỤC

.........................................................................................................................i
Ắ ................................................................................. v
.............................................................................................. vi
....................................................vii
.......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................... 1
ục đích của nghiên cứu ......................................................................................... 2

2.

3. Nhiệm vụ của nghiên cứu ........................................................................................ 2
c ế

4.
Ư

1

u đ đ

c của đề

.............................................................................. 2

ỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3

1.1. Tổng quan prodigiosin .......................................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc prodigiosin ................................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc và đặc đ ểm của prodigiosin ............................................................ 4

1.2. Tiềm năng s n xuất prodigiosin của Serratia marcescens .................................... 6
1.2.1. ơ chế tổng h p prodigiosin .......................................................................... 6
1.2.2. Yếu tố nh h ởng đến tổng h p prodigiosin ................................................ 12
1.2.3. Thu nhận, tinh s ch và định l

ng prodigiosin ............................................ 13

1. 3. Ho t tính sinh học của prodigiosin ..................................................................... 17
1.3.1 Ho t tính kháng khuẩn .................................................................................. 17
i


1

ín

1

ín

ng nấ .................................................................................... 18
ệ

u ......................................................................................... 18

1.3.4. Ho t tính chống tế bào ung

.................................................................... 18

1.3.5. Ho t tính ức chế miễn dịch........................................................................... 21

1.4. Tình hình nghiên cứu prodigiosin ở Việ
Ư

Ư

2.1. Thờ g an

a

Ư

-

n

ếg

......................... 22

................................ 24

địa đ ểm nghiên cứu ....................................................................... 24

2.1.1. Thời gian ...................................................................................................... 24
1

ịa đ ểm ....................................................................................................... 24

2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất ................................................................................ 24
1

ậ

ệu

ac ấ

n

ậ

ng ệ ........................................................ 24

2.2.6. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 25
ơng p p........................................................................................................ 26
2.3.1. Mục đíc ....................................................................................................... 26
2.3.2. Nội dung ....................................................................................................... 27
2.3.3. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 27
4

ơng p p ng
41

íc

4
4
4
44

ng

n cứu..................................................................................... 28
ng ........................................................................................ 28

ơng p p ắc
ắc

gấ

cộ .............................................................................. 30
n a

a g ap

....................................... 31

X c định phổ hấp thụ của ắc ố ................................................................. 33
ể

a n an

pc ấ c

ng ắc ố .................................................... 33
ii


46
4

ơng p p
ể

a

/

/

u ắc

............................................................................ 33
uang p ổ ấp

ụ c c đ ......................................... 34

2.4.8. Xây d ng đ ờng c uẩn sắc tố ...................................................................... 34
2.4.9. Kh o sát ho t tính kháng khuẩn của STSTLLL và STSSKC ...................... 35
2.4.10. Ho t tính kháng nấm .................................................................................. 37
2.4.11. Ho t tính diệt sâu ....................................................................................... 39
2.4.12. Ho
Ư

ín

ng ế

............................................................................... 40
ẬN ................................................................. 41

T QU

3.1. Trích ly l ng l ng ................................................................................................ 41
3.1.1. Quy trình trích ly l ng l ng.......................................................................... 41
3.1.2. Quang phổ hấp thụ của STSTLLL ............................................................... 43
3.1.3. Các thành phần hóa học

c và sau trích ly l ng l ng .............................. 43

3.1.4. Kh o sát phổ LC/MS/MS của STT và STSTLLL ....................................... 48
3.2. Sắc

cộ ........................................................................................................... 52

3.2.2. Các thành phần hóa học

c và sau sắc ký cột.......................................... 58

3.8 Xây d ng đ ờng c uẩn sắc tố .............................................................................. 60
3.9 Kh o sát ho t tính kháng khuẩn của STSTLLL và STSSKC .............................. 61
3.11 Ho t tính diệt sâu ............................................................................................... 69
3.11 1

ệu

11

ố

3.12 Ho
1

ể

ín
a

c

ệ
ng
ng ế

u ắc

u.......................................................................................... 69
u ............................................................................................ 73
....................................................................................... 73
uang p ổ ấp
iii

ụ c c đ ............................................... 74


Ậ ................................................................................................................ 77
............................................................................................................... 79
Ệ

.......................................................................................... 80

Ư

.............................. 1

.............................................................................................. 3
Ư

Ắ

.................................................................... 14

STSTLLL ............................................................................................................... 14
STSSKC ................................................................................................................. 15
X

Ệ .................................................................................... 16

iv


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ồ n ố ng ệp
HPLC: High-performance liquid chromatography
LC/MS: Liquid chromatography–mass spectrometry
PG: prodigiosin
ắc ố thô
ắc ố au íc
STSSKC

ắc ố au ắc

ng

ng

cộ

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Xác định cấu trúc của một số chất đ i diện prodigiosin ........................................5
Bảng 1.2.
Bả

nh h ởng của prodigiosin đến kh năng tồn t i của các tế bào miễn dịch 22

2.1: ố í

í ng ệ

ố

u ung

íc

.................................................. 30

ã p a

ãng để d ng đ ờng chuẩn STSTLLL ........................................ 35

Bảng 2.3. ã p a

ãng để d ng đ ờng chuẩn STSSKC .......................................... 35

Bảng 2.2
Bả

ị

3.1:

u

của tỉ lệ P

n

c

uố

ã

a n

năng

thu nhận sắc tố bằng trích ly l ng l ng ......................................................................... 42
Bả

3.2: ịnh tính các

Bả

3.3.

p c ấ trong STT và STSTLLL ......................................... 43

n íc c c p n

n

p n

p

g

n ị

n

a

p n íc

ố p ổ E -MS........................................................................................................... 52

Bảng 3.4. Tóm tắ c c p n đ n sau sắc ký cột .......................................................... 54
Bả

3.5: ế

u c c

Bả

3.6: K

năng

ng

Bả

3.7

năng

ng Neoscytalidium dimidiatum của

Bả

3.8: ế

độ 1
Bả

u

ệ

ng ệ

pc ấ c

ng STSSKC................................... 59

uẩn của
g

.................................... 61

độc ế

n

ng ế

66
ung

- ở nồng

µg/ml. ................................................................................................................ 74
3.9:

u

uang p ổ ấp

ụ c c đ của ắc ố

vi

ờ g an ...................... 74


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Các chất đ i diện prodigiosin ......................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc của prodigiosin ................................................................................. 5
Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng h p prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
uđ

39.006, Sma 274 và các cụm sinh tổng h p undecylprodigiosin (cụ

từ

Streptomyces coelicolor A3(2) ............................................................................................8
Hình 1.4. Con đ ờng đ
n

cũng

ơng

n

c đề xuất cho quá trình sinh tổng h p p

g

n

ề xuất

đề xuấ đối v i undecylprodigiosin ......................................... 11

Hình 1.5. ơ chế kháng tế bào ung
H

2.1

H

2.2: ơ đồ íc

của prodigiosin ............................................. 19

ơ đồ thí nghiệm kh o sát ho t tính sinh học h p chất thứ cấp màu ........... 28
p

g

n ừ can

ờng nu

cấ ..................................... 29

Hình 2.3. Cách chuẩn bị giấy ch y sắc ký.................................................................... 32
Hình 2.4.
H

3.1

c đục các giếng th ch của thí nghiệm kháng khuẩn ............................... 37
ế

u

u

uang p ổ ấp thụ UV/VIS cho STT ..................................... 42

ố p ổE -

Hình 3.2.

Hình 3.3. ắc

đồ

u

ừ

a u của

-

ẫu

........................ 48

ẫu STSTLLL ............................................................................. 49

Hình 3.4.

ố p ổE -

Hình 3.5.

n íc

của

ẫu

.................................................................. 50

ố p ổ E -MS prodigiosin ...................................................... 51

H

3.6:

cp nđ n

H

3.

n ắc

u n ận au

c

c

ng ung

ắc

n-hexan

cộ ........................................ 53
ac a

1;

c

khi phun thuốc th Dragendorff, B) sau khi phun thuốc th Dragendorff. ................. 55
H

3.

ế

u

c c p n đ n au ắc

cộ

ằng ung

u

:

Acetone (7 :3 ; v :v) ..................................................................................................... 56
Hình 3.9. ế
Hình 3.10.

u

ắc

ố p ổE -

n

ng g a
u

ừ

ắc ố ở
a u của

-

vii

ẫu

ệ ung

. ........ 57

....................... 58


H

3.11:

ờng c uẩn

H

3.12

ờng c uẩn STSSKC............................................................................... 61

H

3.13. ế

u đố

H

3.14

năng

H

3.15.

năng

H

3.16 ế

u

ng nấ

Neoscytalidium dimidiatum của ắc ố ........................ 66

H

3.17

u

ng nấ

Colletotrichum p của ắc ố; ..................................... 67

Hình 3.18.

ế

............................................................................ 60
ng của ắc ố

c ủng

ng E. coli của ắc ố
ng S. aureus của ắc ố

ệ c ế của

u an

uẩn c ỉ

ị .......................... 62

au n

c ....................... 63

c
c

au n

a ng Spodoptera exigua uổ

c .................... 64

c

ăn của

ờ g an .............................................................................................. 69
Hình 3.19.
STSSKC
Hình 3.20.

ệ c ế của

u an

a ng Spodoptera exigua uổ

c

ăn

ờ g an ................................................................................................. 71
ệg

ố

ng của

u

ng

viii

í ng ệ

ờ g an73


MỞ ĐẦU
1. Tí

cấp t iết của đề tài
Prodigiosin là sắc tố đ có b n chấ p
n

chủ yếu

n

ộ c ấ c

n

a a

đ

ờng peptone glycerol.

năng

u c c c

ín

n

c tổng h p và kh o sát

g
ọc n

nđ

c

ế đến n

ức c ế ăng tr ởng

của mộ số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng s , 2006), gây độc tế bào và có thể
c ống l

ộ

các dòng tế

ở ng ờ nh ng vẫn duy trì các tế bào lành

ung

ng nấ

tính (Pandey và cộng s ,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 201
cộng
íc

1
p

ệ

c

u

gu ễn

ếu

n

ể ứng ụng ắc ố này vào

ĩn v c nông nghiệp

1

ếu

đ

an n

(

c u

n

n xuấ

ệc s n xuất các s n phẩm phục vụ cho

ọc Ngoài ra, v

ệc ứng dụng quá trình sinh tổng

p

các chấ màu vào ngành dệ may đang ngày mộ thu hút trong nh ng năm gần đây
(Chidambaram và Perumalsamy, 2009), tiềm năng s
nhuộm cũng rấ đ
g

P

c quan tâm.

nđ

c kh o sát chủ yếu khi lên men Serratia marcescens trên môi

ờng peptone glycerol n
phộng

ụng ắc ố đ này làm màu

ng S.marcescens lên men

n

ờng huyền p ù đậu

ăng nồng độ prodigiosin tổng h p đ ng ể theo báo cáo của

Quyên (2014). Tuy nhiên quy trình tinh s ch h p chất này từ can
đậu phộng c
ẫn đ
a

Ti
trƣờ

ađ

c mô t chi tiết. Vì vậy

c c
n cơ ở đ

ín

n

ng ờ

ọc của p
c

đ up

và

ả s t

g

ện đề

s c s c t pr di i si d vi

t tí

ệc

a u
n đang

đã c ọn

u

n

ần

ờng huyền phù
n xuấ

ấn đề cần đ
ng c

1

p

c uan

đồ n ố ng ệp

Serratia marcescens tổ

si

íc

c của c c sả p

p tr
ti

s c .

i


2. Mục đíc của

i

u n ận p
đậu phộng

g

n

cứu
n do vi khuẩn Serratia marcescens tổng h p

c

n

ờng

n ho t tính sinh học của các s n phẩm tinh

kh o sát

s ch.
3. N iệ

vụ của

i

cứu

-

X c địn

ệ íc

ố

u

-

Tinh s ch một phần bằng trích ly l ng l ng

-

Tinh s ch ần a bằng sắc ký cột

-

Kh o sát a

s n phẩm tinh s ch bằng th nghiệm nhanh, sắc ký b n m ng,

sắc ký l ng cao áp/ khối phổ
-

Kh o sát ho t tính sinh học của s n phẩm tinh s ch một phần là sắc tố sau trích
ly l ng l ng (STSTLLL) và sắc tố tinh s ch ần a bằng sắc ký cột gọ
au ắc

ắc ố

cộ (STSSKC).

4. C c ết quả đ t đƣ c của đề tài
đ

-

u

-

ế
c

n

c ung

íc

íc

n

u

ín
năng

ng

uẩn

p

g

c đều
n

n

u n ận đ

ọc c
ệ

íc

u

2

ấ

p
cp

g

ắc ố au íc

n
n

c đều


CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổ

qua pr di i si

1.1.1. Nguồn gốc prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole đ

c phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn l c đặc tr ng

của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “p
“p

gi

n” c

g u ” c nghĩa là một đ ều gì đ kỳ diệu. Prodigiosin đ

bên ngoài tế bào cũng n

nguồn gốc từ

c tìm thấy ở d ng túi

các tế bào liên kết, và d ng h t ở bên trong tế bào

(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Prodigiosin đ
4-methoxy-2,
tripyrrole, đ

c hình thành qua hai giai đo n: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và
2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC),

t o

nên

dẫn

xuất

c gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Có rất ít thông tin về

con đ ờng sinh tổng h p ở giai đo n MAP hoặc MBC, ngo i trừ việc mô t về phân t
proline kết h p nguyên vẹn thành một trong nh ng nhóm pyrrole của MBC. Quá trình
tổng h p sắc tố này cần có không khí và phân t oxy (Williams và Qadri, 1980).
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, đ
n

c s n xuất bởi các vi khuẩn

Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,

Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các x
khuẩn Gram d ơng chẳng h n Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces
longisporus (Khanafari và cộng s , 2006).

3

Hình 1.1. Các chất đ i diện prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)
1.1.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của p
Serrattia marcescens m i đ

g

nđ

c tổng h p bởi

c biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do s tiến bộ

nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở nh ng năm tiếp theo, mà cấu
trúc của prodigiosin dần đ
Prodigiosin

v i

tên

c nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).
gọi

(5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-

methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân t C20H25N3O và trọng
l

ng phân t

là 323,44 Da (Harris và cộng s , 2004; Song và cộng s , 2006;

Williamson và cộng s , 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, v i ba vòng pyrrole t o
thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đ hai vòng đầu liên kết tr c tiếp v i
nhau, còn vòng thứ ba đ

c gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams,
4


1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có b y liên kết đôi và đ

c miêu t là

t o sắc tố m nh (Krishna, 2008).

Hình 1.2. Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008)
Prodigiosin nh y c m v i ánh sáng và không tan đ
tan t ơng đối trong alcohol và ether; bên c nh đ

c trong n

c. Prodigiosin có thể

nó dễ tan trong chloroform,

methanol, acetoneitrile và DMSO (Grimont và cộng s , 1977; Khanafari và cộng s ,
2006).

Bảng 1.1. Xác định cấu trúc của một số chất đ i diện prodigiosin (Williams, 1973)
Tr ng
Loài

Tên s c t

Danh pháp prodigiosin ƣ

p

tử

và công thức
Serratia marcescens

Serratia marcescens

Serratia marcescens

Nocardia
(Actinomadura)

Prodigiosin

Norprodigiosin

2-Methyl-3-amyl-6methoxy-prodigiosene

C20H25N3O

2-Methyl-3-amyl-6-

309,4 Da

hydroxy-prodigiosene

Dipyrrolyl-

2-(2-pyrryl)-4,6-

dipyrromelhenr

dimethoxypy-

prodigiosin

prodigiosene

Nonylprodigiosin

madurae
Nocardia

Cyclononyl-

(Actinomadura)

prodigiosin

323,4 Da

2-Nonly-6-methoxyprodigiosene
2,10-Nonano-6melhoxy-prodigiosene

madurae
5

C10H23N3O
334,4 Da
C19H18N4O2
363,5 Da
C23H31N3O
265,5 Da
C23H33N3O


Nocardia

Methyl cyclodc

2,10-Nonano-6-

391,5 Da

(Actinomadura)

cyl-prodigiosin

Methoxy-prodigiosene

C25H33N3O

longisporusruber và

Undecyl-

2-Undecyl-6- Rnethoxy-

393,6 Da

Nocardia

prodigiosin

prodigiosene

C25H35N3O

pelletieri
Streplonlyces

Metacyclo-

2,4-(9-Ethylnonano)

391,6 Da

longisporusruber

prodigiosin

-6-methoxy- prodigiosene

C25H33N3O

pellctieri
Streptomyces

(Actinomadura)

1.2. Tiề

ă

sả xuất pr di i si của Serratia marcescens

1.2.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin
Các gene sinh tổng h p prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon l n.
Cấu t o của các gene sinh tổng h p prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC
39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma
274) đã đ

c báo cáo (Cerdeno và cộng s , 2001).

Nhiều chủng Serratia marcescens s n xuất sắc tố thông qua hai giai đo n: 2methyl-3-amylpyrrole
(MBC),

t o

nên

(MAP)
dẫn

và

xuất

4-methoxy-2,

tripyrrole,

đ

2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde
c

gọi

là

2-methyl-3-amyl-6-

methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và
cộng s (1984) đã phân lập đ

c một chủng Serratia marcescens có kh năng t o

MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình t
của dòng Serratia marcescens này đ

c báo cáo.

Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để th c hiện th

nghiệm trong các chất

chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể h u ích đối v i việc nghiên cứu một hệ
thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi khuẩn. Tách
các phân t

tái tổ h p mã hóa cho quá trình tổng h p prodigiosin sẽ là một cách

tiếp cận để xác định s n phẩm gene và s hiểu biết về enzymology và di truyền học của
6


quá trình sinh tổng h p prodigiosin. Việc tách trình t của DNA mã hóa một phần
trong quá trình tổng h p prodigiosin bằng cách s dụng hệ thống nhân b n vector ở
Escherichia coli cosmid đã đ

c báo cáo (Dauenhauer và cộng s , 1984).

Một cosmid có chứa ít ơn 35 kb nhiễm sắc thể của Serratia nhằm mã hóa tổng h p
các sắc tố đ

c biểu hiện trong Erwinia carotovora là cơ sở đầu tiên để chứng minh

rằng cụm gene sinh tổng h p prodigiosin hoàn chỉnh đã đ
chức năng của nó đã đ

c nhân b n vô tính và các

c biểu hiện (Thomson và cộng s , 2000). Tr

này, nhóm sinh tổng h p các sắc tố undecylprodigiosin (đ ), đ
Streptomyces coelicolour A3(2), cũng đã đ

c nghiên cứu
c s n xuất bởi

c nhân b n vô tính (Tsao và cộng s ,

1985). Vì Streptomyces coelicolour A3(2) Red2 đột biến đã đ

c đối chiết v i

prodigiosin của Serratia marcescens đột biến (Feitelson và Hopwood, 1983), việc s n
xuất undecylprodigiosin đ

c cho là có con đ ờng sinh tổng h p t ơng t n

con

đ ờng sinh tổng h p prodigiosin bởi Serratia marcescens. Các chất sinh tổng h p
màu đ của Streptomyces coelicolour A3 (2) đã đ

c nhân b n d a vào nhiễm sắc thể

cosmid trên 35,7 kb nhiễm sắc thể (Malpartida và cộng s , 1990.)

đ

c cho là sẽ

chiếm ít nhất 18 gene (Coco và cộng s , 1991; Narva và Feitelson, 1990).
Cụm gene tổng h p sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đ

c biểu hiện trong

Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng th nghiệm), mặc
dù nó đã không đ

c biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc

Enterobacteriaceae, bao gồm c Escherichia coli (Thomson và cộng s , 2000). Trong
Serratia ATCC 39.006 tổng h p prodigiosin đ

c quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm

hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson
và cộng s , 2000; Slater và cộng s , 2003).

iều thú vị là việc s n xuất prodigiosin

t o thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào s biểu
hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc s n xuất một
phân t tín hiệu khác đã đ

c th c hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng s ,

2000).
7


Nhóm sắc tố Serratia đ
Streptomyces coelicolor và đ

c quy định bởi 14 gene chung cho c

Serratia và

c bố trí trong pigA đến pigN, trong đ có năm gene

tổng h p MBC (màu đ ) và bốn gene tổng h p MAP (màu xanh), đ

c mô t ở

hình 1.3. Bốn gene còn l i không có vai trò tổng h p, tuy nhiên, có một protein còn l i
(PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức h p. Thứ t
gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích th

c

và trình t amino acid khác nhau gi a các loài (Cerdeno và cộng s , 2001).

Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng h p prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và các cụm sinh tổng h p undecylprodigiosin (cụ

uđ

từ

Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng s , 2001).
Các cụm gene gi a Streptomyces coelicolor và Serratia có nh ng vị trí t ơng đồng.
Gene quy định của các cụm màu đ đ
tổng h p phân n a bipyrrole là màu đ

c hiển thị trong màu đ n chịu trách nhiệm
và chịu trách nhiệm tổng h p phân n a

monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng h p đ

c thể

hiện qua màu trắng và nh ng gene không nằm trong cụm gene sinh tổng h p đ

c thể

hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn ị phiên mã của các cụm m u đ .
8


Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là
PigO. RT-PCR v i primer extension sẽ nhận thấy có s phiên mã qua l i gi a hai
điều này phù h p v i pigO là một pig

gene pigN và pigO (Slater và cộng s , 2

operon trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đ

d

c sao chép

i d ng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater và cộng

s , 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đ

c sao chép d

i d ng

polycistronic thông tin. Có một kho ng c c đ ng kể gi a hai cụm sắc tố pigC và
pigD. Kho ng cách 184 bp gi a pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy
kh năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai
bên của kho ng cách nà đã chứng minh là t ơng t n

trong nghiên cứu dùng lacZ

h p v i pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có kho ng cách 64 bp
gi a pigC và pigD, nh

ơn so v i Serratia ATCC 39.006, kho ng cách này không có

ý ng ĩa Cụm m u đ (gồm 23 gene) l n hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể ph n ánh
s

phức t p hơn về các s n phẩm undecylprodigiosin đ

c tổng h p bởi

Streptomyces coelicolor (Harris và cộng s , 2004).
M ời hai gene đ

c l u gi gi a ba cụm, có thể mong đ i con đ ờng tổng h p cho

ra các s n phẩm t ơng t . Tuy nhiên, định h

ng và đ ều tiết của nó có s tha đổi rõ

rệt (Slater và cộng s , 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene t ơng
đồng trong cụm s n xuất các s n phẩm hóa học t ơng t đặt ra câu h i về nguồn gốc
và s tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng h p ở c vi khuẩn Gram d ơng
và Gram âm. Vẫn ch a rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng nh
h ởng đến s sắp xếp không giống nhau của các gene hay s khác biệt đã phát sinh
một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
S khác biệt ở các gene hiện diện trong nh ng operon có thể gi i thích s khác biệt
trong ph ơng thức s n xuất và con đ ờng tổng h p sinh hóa. PigD và pigE là hai pig
gene không có s

t ơng đồng trong cụm màu đ . T ơng t

n

vậy, pdtorfL và

pdtorfM thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng h p các chất kh
9

clo (carbon

tetrachloride) n

pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri

(Lewis và cộng s , 2000). PdtorfL và pdtorfM nằm c nh nhau, giống n
pigE trong cụm pig. PigE t ơng t
Streptomyces coelicolor A3(2), đ

pigD và

aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ

c mã hóa bởi một gene không liên kết v i cụm

màu đ (38% giống v i PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống v i PigE từ Sma
274; c hai đều là 50% t ơng đ ơng 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã hóa
protein tham gia vào quá trình tổng h p prodigiosin và undecylprodigiosin có thể
không đ

c liên kết v i các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không đ

t ơng đồng bởi cụm pig, nh ng chúng đ
nguyên t

c mã hóa

c cho là chỉ đ o tổng h p acetate từ ba

carbon của vòng pyrrole và chuỗi bên undecyl của undecylprodigiosin

(Cerdeno và cộng s , 2001). Các gene mã hóa t ơng đồng t ơng ứng có thể có mặt t i
một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể th c hiện vai trò
xúc tác cần thiết trong sinh tổng h p prodigiosin trong Serratia. Tuy nhiên,
prodigiosin có thể tổng h p trong s tái tổ h p gi a Escherichia coli và Erwinia đ ều
này đ

h i ho t động chức năng t ơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia

để bổ sung cho các ho t động của enzyme đ
và cộng s , 2004).

10

c mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris


Hình 1.4. Con đ ờng đ
n

cũng

ơng

n

c đề xuất cho quá trình sinh tổng h p p

g

n

ề xuất

đề xuấ đối v i undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng s , 2001)

ời hai Red protein v i s mã hóa trong cụm pig “ õ ” là enzyme prodigiosin) có
kích th

c t ơng t nhau trong b n sao của Pig. Một ngo i lệ là PigB (670 aa) t ơng

đồng v i RedS (Sc3f7.05c), là một protein nh

ơn nhiều (146 aa) và t ơng t gắn

vào cuối đầu N của PigB. Phần còn l i của PigB gắn v i các amine oxidase. Các
protein PigI và PigJ đều nh hơn RedM và t ơng đồng v i RedX (Harris và cộng
s , 2004).
PigA là trình t tổng h p một lo t các acyl-CoA dehydrogenases. Chuỗi liên kết
v i human isovaleryl-CoA dehydrogenases, cấu trúc tinh thể trong đ đã đ

c xác

định, cho thấy rằng phần l n các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl
moiety của CoA đ

c b o vệ nh ng các acid amin tham gia vào kiên kết các nhóm

11

adenisyl của CoA không đ

ều này hỗ tr

c b o vệ (Tiffany và cộng s , 1997).

cho ý kiến cho rằng PigA là một PCP prolyl ơn là prolyl- CoA.
1.2.2. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đo n
phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng s , 2004). B n chất màu đ

t ơ của

prodigiosin giúp việc nghiên cứu h p chất thứ cấp này dễ dàng ơn (Chidambaram và
Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng h n nh : nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, ánh
sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi tr ờng nh h ởng đến quá trình s n xuất
prodigiosin (Heinemann và cộng s , 1970; Sole và cộng s , 1994; Rjazantseva và cộng
s , 1995; Williamson và cộng s , 2005).
Quá trình s n xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nh y c m v i nhiệ độ
và bị ức chế đ ng kể ở nhiệt độ cao ơn 37°C (Giri và cộng s ,
tr ờng thông th ờng đ

c s

4

ơn n a, môi

dụng để sinh tổng h p prodigiosin bởi các chủng

Serratia marcescens là môi tr ờng phức t p và rất giàu dinh d ỡng (Yamashita và
cộng s , 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng s , 2004). Một số chất dinh d ỡng n
thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối v i s n xuất
prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng s , 1977), adenosine triphosphate và
ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) l i có tác dụng ức chế s n l

ng

prodigiosin.
Giri và cộng s (2004), đã so sánh s phát triển của Serratia marcescens trên các
môi tr ờng khác nhau nh : môi tr ờng h t mè, nutrient broth và peptone glycerol
broth,... Các môi tr ờng cũng đ

c so sánh tốc độ ăng tr ởng và kh năng xuất

prodigiosin ở các nhiệ độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò
của các acid béo trong việc s n xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần
trong h t có thể kích thích ăng mật độ tế bào và sinh tổng h p nhiều prodigiosin ơn
Trên môi tr ờng peanut broth thì prodigiosin có thể tổng h p ở nhiệt độ 37oC trong
khi trên các môi tr ờng n

nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có
12


bổ sung đ ờng cũng không thể làm đ

c đ ều này (Chidambaram và Perumalsamy,

2009).
Quá trình s n xuất prodigiosin ở Serratia marcescens gi m bởi glucose và các
lo i đ ờng metabolizable khác do s

gi m pH trong canh tr ờng nuôi cấy

(Khanafari và cộng s , 2006). Bên c nh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon
trong quá trình s n xuất sắc tố.

ểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ b n là môi

tr ờng này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose là

ăng

c ờng việc s n xuất sắc tố, trong tr ờng h p s dụng môi tr ờng sesame broth thì
nguồn carbon ở d ng các acid béo. Maltose và glucose đ

c thêm vào nutrient broth

làm ăng gấp đ

năng suất so v i chỉ s dụng môi tr ờng nutrient broth hoặc peptone

glycerol broth.

iểm thứ hai là s s n xuất sắc tố đ

c tăng c ờng trong trong môi

tr ờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này có thể
là do s hiện diện của glycerol n
carbon giúp hỗ tr

là một nguồn carbon. Rõ ràng trong th c tế nguồn

ăng tr ởng tế bào và s n xuất prodigiosin (Chidambaram và

Perumalsamy, 2009).
Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi tr ờng
l ng của Serratia marcescens cũng dẫn đến s

ăng tr ởng tế bào, s n xuất

prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng s , 2001).

ơn n a, prodigiosin

th ờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất ho t động bề mặt chẳng h n n
SDS vào môi tr ờng nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu qu s n xuất prodigiosin
(Feng và cộng s , 1982; Wei và Chen, 2005).
1.2.3. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin
1.2.3.1. Thu nhận và tinh sạch
Các sắc tố không tan trong n
dung môi h u cơ pha n

c mà tan trong dầu th ờng đ

c chiết xuất bằng

c nh : acetonee, methanol, ethanol, hoặc các hỗn h p của

các dung môi, để giúp các dung môi này ho t động tốt ơn Chiết xuất th ờng có chứa
một l

ng n

c đ ng kể, do đó, có thể đ

c lo i b bằng cách phân l p nhờ hexane,
13


petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn h p các dung môi. Sắc
ký, quang phổ hấp thụ ở vùng kh kiến là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các chất
màu. Quang phổ sẽ đ

c th c hiện, l u gi và sau đ tiến hành so sánh v i các phổ

chuẩn (Amaya. 2001).
Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đâ đ

c đề xuất là nên th c hiện để xác định một h p

chất ch a biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng s , 1994)
-

ến max)

ổ

- Sắc ký l p m ng (Rf).
- Sắc ký l ng cao áp (thời gian l u mẫu).
- Ph ơng pháp phổ khối (khối l

ng phân t ).

- NMR (chuyển hóa về mặt hóa học).
Các nhà khoa học đã th c hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh s ch
prodigiosin n

sau:

- Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đ

c chiết xuất từ

môi tr ờng nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, v i ethanol và
petroleum ether, tiếp theo lo i b dung môi trong một cốc n

c sôi (hay trong một bể

cách thủy) và hòa tan phần còn l i vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky,
1980).
- Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất đ
bằng acetonee, hòa v i một ít ethyl acetate, và đ
chất chiết xuất đ

c hòa tan và đ

c chiết xuất

c sấy khô bằng natri sulfat. Các

c th c hiện quét từ b

c sóng 200 – 700 nm.

Hỗn h p dung môi dichloromethane, chloroform và acetonee v i t lệ 2,5: 2,5: 0,5
đã đ

c s dụng để tách một cách hiệu qu các t p chất từ chiết xuất cùng v i các

sắc tố bằng sắc ký l p m ng. Cột silica có kích th

c từ 80 – 100

đã đ

cs

dụng để phân tách các t p chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy c độ
hấp thụ cao duy nhất t i 535 nm trong quang phổ UV. Nó đ
xác định trọng l

ng phân t bằng việc s
14

c tiếp tục phân tíc để

dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố


prodigiosin tinh khiết đ
l

c đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng

ng phân t là 324 Da (Giri và cộng s , 2004).
- Prodigiosin đ

c chiết xuất bằng cách lắc môi tr ờng nuôi cấy tế bào

Serratia marcescens 2170 v i methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml
methanol) và dịch trong suốt đ
áp của các chiết xuất đ

c làm cho bay ơ trong chân không. Sắc ký l ng cao

c th c hiện trên silica gel v i dung môi chloroform và

methanol. Các sắc tố thu đ

c sẽ đ

c r a gi i trong methanol và phân tích bởi

ph ơng pháp phổ khối (ESI-MS). Sau đ
tiếp tục đ

các sắc tố ch a tinh khiết đã thu đ

c sẽ

c th c hiện ph ơng pháp HPLC. Một cột đ o pha Nucleosil C18 (250 x 4

1 µ

đã đ

c s dụng v i một gradient tuyến ín

đến 100% trong 30
đ

phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetoneitrile). Việc r a gi

c

theo dõi bằng cách s dụng c hai máy dò UV diode-array và ESI-MS (Montaner
và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003).
- Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh tr ờng đ
nh ng chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đ
hóa (pH 3,0) đ

c lấy từ

1 lít ethanol 95% (v:v) đã ac

c thêm vào IAB. Các sắc tố đ

c chiết xuất bằng cách s dụng

một vòng tròn gi i hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem c đặc và
ly tâm. Sau đ

nó đ

c thu bằng cách s

Prodigiosin màu đ đ vào chiếm hết chỗ ở phía d
đặc bằng cách cho bốc ơ
×

c

đ

đặc đã đ

g

c và chloroform để tách pha.

dụng n

nđ

đ

i của pha chlorof

c cô

c phân tách bằng sắc ký cột silica gel (2,5

c r a v i một hỗn h p hexane: ethyl acetate (2: 1, v:v). Các sắc tố cô

c tách ra bởi việc s dụng hỗn h p chloroform:methanol 95:5 (v:v) trong

au đ

u đ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đ

và hòa tan trong acetonee. Các sắc tố ch a tinh khiết sẽ tiếp tục đ
ph ơng pháp TLC (v i t
an

c th c hiên

lệ dung môi chloroform:methanol: diethyl ether là 6:

2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (v i cột C18
tách r a v i hỗn h p

c thu nhận

n

c

/
15

đã đ

×1 c

au đ

n đ

c

c đ ều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N


HCl v i tốc độ dòng ch
c

đã đ

/p

c

c tính bằng cách đ độ hấp thụ ở 535 nm s dụng

chùm quang phổ tia UV kh kiến trong methanol đã đ

c acid hóa (0,01N HCI 4 ml +

96 ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khố
tinh khiế đ
các mẫu
đ

c lỗ

c s dụng nh s hỗ tr cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các

n đ s n xuất ra đ

prodig

íc

i thép không gỉ l n v

c
uđ

ng phân t của chất màu

c định bằng việc s dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của
c ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển

a đã

c đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đ

c

ghi nhận (Song và cộng s , 2006).
- Prodigiosin trong các môi tr ờng phân lập 2170 đ

c chiết xuất từ huyền

phù sắc tố v i methanol có tính acid (1 ml 1N HCl: 24 ml methanol) và sau đ ly tâm
(6800 vòng trong 15 phút). Các dung môi của dịch huyền phù sau đ đã đ
trong điều kiện chân không. Sắc ký l ng cao áp của các chiết xuất đ

c bốc ơ
c th c hiện

trên silica gel v i chloroform và methanol là dung môi. Các phân đo n r a gi i
đ

c gộp chung và chiết xuất bằng chlorofonn/ methanol bay

không, r a gi i v i n
ra đ

c

ơ trong chân

đ ng khô (Montaner và cộng s , 2000). Các sắc tố đã tách

c r a gi i trong methanol và phân tích bởi phân tích bởi ph ơng pháp phổ khối

(ESI-MS) s dụng một VGQuattro gấp ba lần quadrupol phổ khối. Các sắc tố đã tách ra
ch a tinh s ch sẽ đ
đã đ

c tiếp tục s dụng HPLC. Một cột đ o ng

c pha Nucleosil C18

c s dụng v i một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM

amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetoneitrile). Prodigiosin đ
2170 bằng cách chiết xuất methanol/ HCI đ
tục s dụng HPLC. ESI-MS đã đ a ra trọng l
giá trị d

c thu từ S. marcescens

c th c hiện sắc ký trên silica gel và tiếp
ng phân t là 323,4 Da, phù h p v i

kiến cho prodigiosin (C20H25N3O). Cấu trúc của prodigiosin đ

c xác

nhận thêm bởi quang phổ 3H-NMR (Montaner và cộng s , 2000).
- Các sắc tố đ

c s n xuất bởi Serratia marcescens

NMR và phổ khố để

∆ đã đ

c tinh s ch th c hiện

c định cấu trúc hóa học của nó (Wei và Chen, 2005). Các sắc
16


tố đ

c chiết xuất từ canh tr ờng lên men bằng methanol và sau đ

n chế bằng

cách s dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các s n phẩm mục tiêu trong
cột (Cang và cộng s , 2000; Montaner và cộng s , 2000). Sau đó cộ đ

cr av i

10M ethyl acetate để gi i phóng các s n phẩm hấp thụ. Màu cam sau khi r a gi i đã
đ

c thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 450oC để có đ

tinh khiết (bột màu đ ). Các sắc tố thu đ

c trong nghiên cứu đã đ

undecylprodigiosin d a trên phân tích NMR và MS, còn đ
25oC, là một trong nh ng sắc tố đ đ

c nh ng s n phẩm
c báo cáo là

c gọi là prodigiosin

c s n xuất bởi Serratia sp. và Streptomyces sp.

động ức chế miễn dịch và quá trình apoptosis-inducing t ơng t

Nó có ho

prodigiosin, nh ng í đ

n

c nghiên cứu ơn (Tomas và cộng s , 2003).

1.2.3.2. ịnh lượng
Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất t i
b

c sóng 535 nm trong quang phổ UV (Giri và cộng s , 2004). Chính vì vậy, nồng

độ của các prodigiosin đ s n xuất ra đ

c thu nhận trong ethanol đã acid hóa (v i

0,01 N HCI 4 ml và 96 ml methanol) sẽ đ

c

c tính bằng cách đ độ hấp thụ ở b

c

sóng 535 nm và s dụng quang phổ UV kh kiến (Goldschmidt và Williams, 1968).
Tổng số các sắc tố đ

c

c tính theo công thức sau (Chen và cộng s , 2006;

Williams và cộng s , 1960):

ng đ
-

ểu

-

ộ ấp

-

ệ ốp a

1. 3. H

V1
t tí

ể íc
si

ị ổng ố ắc ố
ụ của ắc ố đ

uđ

c µg/

cc ế

uấ

ãng
an

ổ ung

c của pr di i si

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn
17

ng

an

ở

n