Phân lập tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp ứng dụng bảo quản nông sản

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................. Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ,ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ......... Error! Bookmark not defined.
TÓM TẮT CÔNG TRÌNH ................................................................ Error! Bookmark not defined.
1.

ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................... 1

2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.

Nấm Aspergillus flavus ................................................... Error! Bookmark not defined.

1.1.1

Hình thái .................................................................. Error! Bookmark not defined.

1.1.2.

Sinh thái................................................................... Error! Bookmark not defined.

1.1.3.

Thành tế bào ............................................................ Error! Bookmark not defined.

1.2.

Độc tố aflatoxin ............................................................... Error! Bookmark not defined.

1.2.1.

Lịch sử phát hiện aflatoxin ..................................... Error! Bookmark not defined.

1.2.2.

Các loài có khả năng sinh độc tố ............................ Error! Bookmark not defined.

1.2.3.

Cơ chất và môi trường ............................................. Error! Bookmark not defined.

1.2.4.

Cấu trúc và tính chất của aflatoxin......................... Error! Bookmark not defined.

1.2.5.

Cơ chế gây độc của aflatoxin .................................. Error! Bookmark not defined.

1.2.6.

Độc tính của aflatoxin ............................................. Error! Bookmark not defined.

1.2.7.

Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin ................. Error! Bookmark not defined.
i


Đồ án tốt nghiệp

1.2.8.
1.3.

Tình hình nhiễm độc aflatoxin ............................... Error! Bookmark not defined.

Các phương pháp phát hiện aflatoxin ........................... Error! Bookmark not defined.

1.3.1.

Phương pháp phát quang sinh học (Hamed K.Abass và cộng sự, 2004) .......Error!

Bookmark not defined.
1.3.2.

Phát hiện bằng đường lý - hoá học ......................... Error! Bookmark not defined.

1.3.3.

Các phương pháp định lượng ................................. Error! Bookmark not defined.

1.4.

Phương pháp khử nhiễm aflatoxin................................ Error! Bookmark not defined.

1.4.1. Phương pháp vật lý học................................................. Error! Bookmark not defined.
1.4.2. Phương pháp hóa học ................................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.3. Phương pháp sinh học: ................................................. Error! Bookmark not defined.
3. MỤC TIÊU – PHƯƠNG PHÁP .................................................... Error! Bookmark not defined.
4.

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ........................................................ Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG I: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 3
2.1. Vật liệu – thiết bị – hóa chất .............................................................................................. 35
2.1.1. Vật liệu ......................................................................................................................... 35
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................................... 35
2.1.3. Môi trường - Hóa chất................................................................................................ 35
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 37
2.2.1. Mục tiêu: ...................................................................................................................... 37
2.2.2. Nội dung: ...................................................................................................................... 37

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Bố trí thí nghiệm và phương pháp ............................................................................. 37
CHƯƠNG II: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................. 51
3.1 Phân lập nấm sinh aflatoxin từ sản phẩm nông nghiệp.................................................... 51
3.1.1 Phân lập nấm từ sản phẩm nông nghiệp và khảo sát đặc điểm hình thái ................ 51
3.1.2 Khảo sát hình thái nấm phân lập trên môi trường phân biệt AFPA ........................ 53
3.1.3 Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập ............................... 54
3.1.4 Định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC ........................................................... 55
3.2.Phân lập vi khuẩn Bacillus spp. từ các nguồn nông sản dễ nhiễm mốc và đất trồng

..................................................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3. Tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp hợp chất kháng nấm sinh aflatoxinError!

Bookmark

not defined.
3.3.1 Khảo sát vi khuẩn có khả năng kháng nấm khi đồng nuôi cấy với nấm sinh
aflatoxin ................................................................................................................................. 57
3.3.2

Chọn lọc chủng có khả năng tổng hợp chất kháng nấm mạnh nhất .................. 59

3.3.3

Phương pháp đối kháng sử dụng dịch nuôi cấy có tơ nấm làm chất cảm ứng .. 59

3.4. Khảo sát đặc điểm của VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất kháng nấm .. 62
3.4.1 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng
VK chọn lọc ............................................................................................................................ 62
3.4.2 Xác định tác nhân đối kháng nấm mốc ........................................................................ 65
3.5. Khảo sát khả năng sử dụng sản phẩm trao đổi chất chủng CS1b trong bảo quản hạt
bằng phương pháp tạo màng bao ............................................................................................. 69
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 73
iii


Đồ án tốt nghiệp

5.

1.

Kết luận .............................................................................................................................. 73

2.

Kiến nghị ............................................................................................................................ 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC ................................ Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 75
PHỤ LỤC....................................................................................................................................... 77

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT
AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar
EA: Ethyl Acetat
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth
MT: Môi trường
PDA: Potato dextrose agar
HPLC: High ferformane thin layer chromatography
TLC: Thin layer chromatographi
UV: Ultraviolet

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
TRANG
Bảng 1.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sinh Aflatoxin. .................................. 7
Bảng 1.2: Ảnh hưởng của chủng Asp. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh
ra Aflatoxin. .............................................................................................................. 10
Bảng 1.3: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra.
.................................................................................................................................... 11
Bảng 1.4: Tính chất hóa lý của một số aflatoxin.. ................................................... 14
Bảng 1.5: Ảnh hưởng của Aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý
ở vật nuôi. .................................................................................................................. 16
Bảng 1.6: Giới hạn aflatoxin ở một số nuớc theo tiêu chuẩn của FDA................... 18
Bảng 1.7: Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên
liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. ................................................................... 19
Bảng 1.8: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học. ........ 34
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch được sử dụng để làm màng bao đậu phộng........ 48
Bảng 3.1: Khả năng sinh aflatoxin của các nấm mốc phân lập trên sản phẩm nông
nghiệp.. ...................................................................................................................... 55
Bảng 3.2: Tỉ lệ đối kháng trực tiếp của các chủng vi khuẩn với các chủng nấm.. .. 57
Bảng 3.3: Tỉ lệ đối kháng (%) của 4 chủng vi khuẩn tuyển chọn đối với chủng nấm
CĐP1 theo cả 3 phương pháp.. ................................................................................. 60

vi


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4: Đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn CSb1. ................................................... 62

Bảng 3.5: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch nuôi cấy CSb1. ................ 65
Bảng 3.6: Kết quả phân tích định tính các chất có trong các dung dịch trích ly. .... 66
Bảng 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng
được bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b. ...................................... 69

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
TRANG
Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus. .................................................................. 3
Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng. .................................................. 5
Hình 1.3: Cấu tạo của Aflatoxin. ............................................................................. 13
Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan.. ............................. 15
Hình 2.1: Sơ đồ chi tiết phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, đậu nành,
cà phê hư hỏng, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của chúng................................... 38
Hình 2.2: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus spp. từ các nguồn hạt. ........................ 41
Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm sàng lọc tuyển chọn VK đối kháng nấm mốc sinh
aflatoxin.. ................................................................................................................... 43
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm VK chọn lọc và xác định sản
phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm. ............................................................. 46
Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao
kháng nấm.................................................................................................................. 48
Hình 3.1: Mẫu hạt nuôi cấy trên môi trường WA. ................................................... 51
Hình 3.2: Các chủng nấm phân lập trên PDA. ......................................................... 53
Hình 3.3: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng (TLC) của các chủng vi nấm phân lập
phát hiện phát huỳnh quang khi chiếu tia UV 254 nm. ............................................ 54
Hình 3.4: Kết quả định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC. ........................... 55

viii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.5: Kết quả khẳng định khả năng sinh tính aflatoxin bằng phương pháp tái
nhiễm.. ....................................................................................................................... 56
Hình 3.6 : Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus
spp. đối với các nấm sinh aflatoxin. .......................................................................... 59
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của 4 chủng vi khuẩn đối với nấm
CĐP1.......................................................................................................................... 61
Hình 3.8: Kết quả đối kháng của VK CS1b với nấm mốc CĐP1 sau 72 giờ.......... 62
Hình 3.9: Hình thái vi khuẩn CS1b. ......................................................................... 64
Hình 3.10: Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng CS1b sau 48 giờ ủ. .......... 65
Hình 3.11: Khảo sát đối kháng của cao ethyl acetate đối với sự phát triển nấm mốc.
.................................................................................................................................... 68
Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm mốc CĐP1 của dịch nuôi cấy
cảm ứng ly tâm, cao ethyl acetate trong DMSO và bản thân DMSO. ..................... 68
Hình 3.12: Kết quả coating đậu phộng ngày thứ 10. ............................................... 72

ix


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên
lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật
nuôi.

Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc
cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư
gan…), gây quái thai, gây đột biến, thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử
vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất
độc nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của Asp. flavus không phải lúc nào cũng
gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện
nguy cơ lớn về việc có thể nhiễmaflatoxin.
Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường
cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện
thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là
điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi.
Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng. Giới hạn về mức
nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm.
Bảo quản nông sản bằng áp dụng các chất chống mốc hóa học có thể ảnh hưởng xấu
lên sức khỏe người tiêu dùng. Để áp dụng “bảo quản sinh học”, các sản phẩm trao
đổi chất vi sinh vật thường được áp dụng. Đó là lý do chúng tôi đã chọn nghiên cứu
về: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng bảo quản nông sản”.

1


Đồ án tốt nghiệp

2. Mục đích nghiên cứu
-

Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật trong bảo quản nông sản (bảo quản
sinh học)

3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ nông sản có khả năng đối kháng nấm
mốc sinh aflatoxin để ứng dụng trong bảo quản nông sản.
4. Nội dung nghiên cứu
i) Phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt nông sản sau thu hoạch như hạt đậu
phộng, hạt đậu nành và hạt cà phê, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các
chủng nấm phân lập.
ii) Phân lập vi khuẩn Bacillus spp. từ các nguồn trên bị nhiễm nấm mốc
iii) Khảo sát khả năng đối kháng của các Vi khuẩn Bacillus spp. với các nấm
sinh aflatoxin, chọn lọc chủng Vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh nhất.
iv) Khảo sát các đặc điểm nuôi cấy của chủng Vi khuẩn chọn lọc và xác định
sản phẩm trao đổi chất của Vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm
v) Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của Vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm
trong bảo quản hạt.
5. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp luận
Có nhiều phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn đối với
nấm sinh aflatoxin. Trong đó, hai phương pháp tối ưu đã được sử dụng là phương
pháp đồng nuôi cấy ly tâm và phương pháp sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng. Tuy
nhiên, môi trường đồng nuôi cấy và môi trường sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng
chứa nhiều chất dinh dưỡng, ảnh hưởng đến khả năng kháng nấm trong điều kiện in
vivonên cần xác định tác nhân đối kháng để loại bỏ môi trường dinh dưỡng mà vẫn
giữ được khả năng đối kháng cao nhất.

1


Đồ án tốt nghiệp

b. Phương pháp xử lý số liệu
-

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

-

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lí số liệu

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Nấm Aspergillus flavus

1.1.1 Hình thái
Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón
cục của tán. Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình
thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài. Các thể
chai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một
lớp thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại.

Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus.
Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng nâu
đến hơi lục, hơi sần sùi. Đôi khi người ta chỉ coi là thuộc loài Asp.flavus những loài
nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài Asp. parasiticus thì

cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp.
1.1.2. Sinh thái
Asp. flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất, trên các chất
hữu cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu. Từ lâu, người ta đã phát hiện sự có
mặt của nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạc
Sahara, hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì. Người ta
còn coi nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước. Đất
đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới. Nó
thường gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì.
Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này. Nó có rất nhiều
trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc
3


Đồ án tốt nghiệp

nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra. Ngoài ra người ta còn thấy nó trên: hạt
và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin,
thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường,
quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác. Sự có mặt của các loài này trong
các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có ngô lạc, trên cỏ khô gia
súc cũng vậy. Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mì
tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử của nó chiếm từ 50-100%
tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ
cứng sâu tới 0.6m. Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5%.
Nấm mốc độc Asp. flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm khác nhau,
nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển của nó,
và cũng ở lạc độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất. Người ta nghiên cứu hơn
1.000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc - 1kg chứa trên
0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Asp. flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75%

số củ không độc. Còn trên khô lạc: 42% số mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có
8,7% là không độc. Như vậy chất độc tích lũy lại trong khô lạc là do sự chế biến,
hoặc do Asp. flavus phát triển mạnh lên.
Bào tử của nấm Asp.flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước, trong
đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực,
thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng. Vì phạm vi ký
chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn.
Nấm Asp. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên
một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng, trên thực phẩm như: các sản
phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ, và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị dập
như: thanh long, nhãn, xoài, vải. Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển,
chúng tiết ra độc tố Aflatoxin.

4


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng.
Gạo và lạc là nguồn lương thực, thực phẩm rất cần thiết và quan trong đối với con
người. Song nếu gạo và lạc không đảm bảo an toàn thì đây lại là nguồn lây nhiễm
cho con người những căn bệnh hiểm nghèo, đặc biệt là ung thư gan. Đứng trên góc
độ an toàn thực phẩm các nhà khoa học đều cho rằng tác nhân gây ngộ độc thực
phẩm lớn nhất trong gạo và lạc là nấm mốc.
Lạc và các sản phẩm từ lạc chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất của Asp.flavus.
Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi kèm với nó,
trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật: một số loài
Fusarium trong đó có F. monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium
citrinum, P. purpurogenum.
Lạc là một loại hạt có nước: 7,4%, protein: 28%, lipid: 44,5%, glucid: 15%. Các

nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong lạc có một loài nấm độc Asp.flavus và
thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây đều liên quan đến nấm mốc độc đó.
Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác nhưng với lạc có thể là
môi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển. Nấm mốc khi xâm nhập vào trong lạc
chúng phát triển làm cho lạc bị mốc xanh hoặc mốc vàng. Đặc biệt nấm mốc này
sinh ra độc tố Aflatoxin.
Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein:
6,6%, nước: 10%, lipid: 1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitamin B1: 0,08%. Do đó đây là
một môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện pháp
bảo quản không hiệu quả. So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, các
chất dinh dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại. Đặc
5


Đồ án tốt nghiệp

biệt ở nước có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh
trưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng của gạo.Các nhà khoa học đã phân lập được
nhiều loài nấm mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay
gặp nhất là Aspergillus và Penicilium.
1.2.

Độc tố Aflatoxin

1.2.1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn
10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là“bệnh gà tây X” (Turkey X disease). Sau
đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều. Qua
điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có
trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hoá học của chất

này là Aflatoxin do vi nấm Asp. flavus và Asp. parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất
quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2.Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm
nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ
biến nhất (Nabil Saad, 2004).
Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được sinh ra bởi
nấm Asp. flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật.Trên động
vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố Aflatoxin trên cá hồi được thực
hiện bởi Ashley và các cộng sự.
Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin.Các nhà khoa học
cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin.
1.2.2. Các loài có khả năng sinh độc tố
Aflatoxin được sản sinh chủ yếu từ 2 chủng nấm quen thuộc là chủng Asp. flavus và
Asp. parasiticus.Ngoài ra còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin
nhưng yếu hơn như Asp.nomius (C.P. Kurtzman và cộng sự, 1987) và Asp.
Bombycis (S.W. Peterson và cộng sự, 2001).

6


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sinh Aflatoxin
Loài nấm mốc

Aflatoxin
B1

B2

G1

G2

Aspergillus flavus

+

+

Aspergillus parasiticus

+

+

+

+

Aspergillus nomius

+

+

+

+

Aspergillus oryzae

+

Aspergillus niger

+

Aspergillus wentii

+

Aspergillus ruber

+

Aspergillus ostianus

+

Aspergillus orchraceus

+

Penicilliumpuberulum

+

Penicilliumvariabile

+

+

+

+

+

Penicillium frequentans +
Penicilliumcitrinum

+

Rhizopus sp.

+
(Nguồn: Phạm Hoàng Thái,2007)

Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sinh ra độc tố
Aflatoxin, chỉ có 73% có khả năng sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh
Aflatoxin ở mức cao nhất. Một số tác giả ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng
về mặt sinh độc tố tùy theo cơ chất, từ đó đã phân lập chủng Asp. flavus và tùy theo
nguồn gốc địa lý: trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Mỹ có 94% số chủng sinh độc
tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc, và 71% cũng được phân lập từ lạc như ở
Ixraen. Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn vùng ôn đới.
Ngoài ra, số lượng Aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng,
người ta đã tìm thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một cơ chất
7

Đồ án tốt nghiệp

và trong những điều kiện như nhau. Người ta đã ghi lại những mức sản sinh từ một
vài mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 và thậm chí gần 2000 mg/kg cơ chất.Gần đây
hơn, ngoài việc định lượng tổng số Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ
riêng phần của các Aflatoxin đã biết. Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều
nhất trong cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó là
Aflatoxin B2, còn về G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp.
Người ta đã thử nhận dạng các chủng sinh độc tố và các chủng không sinh độc tố
qua những đặc điểm hình thái. Một số người cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ
cũng có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, thể
bình hai lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, ở những chủng sinh độc tố có sự
phình to một số phần của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ, những dị thường đặc
trưng cho các dòng sản sinh Aflatoxin. Tuy nhiên, thường rất khó thăm dò biết một
cách chắc chắn những chủng có sinh Aflatoxin và những chủng không sinh
Aflatoxin ngoài cách dùng con đường sinh học và hóa học.
Một số chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đó qua nhiều lần cấy truyền liên tiếp
trên các môi trường tổng hợp. Thế nhưng tính độc của một chủng tăng lên khi cấy
truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp.
Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin với lượng rất ít như
loài: Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc Aspergillus như Aspergillus
tamariikita, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus
ruper. Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Asp. flavus
thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với Penicillium rubrum stoll và khi
đó có thể nhầm Aflatoxin là do Penicillium sản sinh ra. Trong một số trường hợp,
cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Sterigmatoxistin và Avecsin vì có cấu tạo hóa học
gần giống với Aflatoxin.
1.2.3. Cơ chất và môi trường
Khả năng sinh độc tố của các chủng Asp. flavus và Asp. parasiticus rất khác nhau.

Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt
độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường.
8


Đồ án tốt nghiệp

Các chủng phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên lạc và những sản phẩm từ lạc
được ghi nhận sinh đôc tố nhiều hơn các chủng phân lập từ sản phẩm ngũ cốc ở các
nước thuộc địa. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống
hoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố.Ngược lại, gần
một phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin.
Tính độc của một số chủng được giảm độc tính nếu sau này các chất độc của chúng
được những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những chất dẫn xuất không hoạt
động. Chính vì vậy ở Texas, người ta rất ngạc nhiên khi thấy lạc có vỏ nhiễm Asp.
flavus rất nặng nhưng lại có độ độc thấp. Nghiên cứu các củ lạc đó, thì phát hiện có
những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình thành các Aflatoxin
hoặc biến đổi những Aflatoxin được sản sinh ra thành những chất ít độc hơn. Người
ta đã dựa trên hiện tượng này để tìm tòi một biện pháp sinh học nhằm tẩy độc các
sản vật đã bị hư hỏng.
Sản lượng Aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi
cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng nó
giảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải này
tương ứng với sự phân hủy các Aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắc
mạnh các bình nuôi cấy.
Nhìn chung, sự sản xuất Aflatoxin, trong điều kiện nuôi cấy thông thường, bắt đầu
từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Asp. flavus, nó tăng dần cho
đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ, tức là khoảng ngày thứ 6 rồi giảm sút.
Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng Aflatoxin
được sinh ra trong điều kiện nuôi cấy và điều kiện tự nhiên.Những biến thiên về

nhiệt độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45-500C cho
thấy không thuận lợi cho việc sản sinh Aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở 250C.
Hàm lượng nước của cơ chất có vai trò trong việc sản sinh Aflatoxin, gắn liền với
sự phát triển tương đối của Asp. flavus, ở 320C trên lạc có hàm lượng nước trong
khoảng 15 và 30% Aflatoxin hình thành sau 2 ngày. Như vậy, trong điều kiện nhiệt
đới, nếu Asp.flavus phát triển trên lạc không có Aflatoxin thì 48h sau có thể phát
9


Đồ án tốt nghiệp

hiện được Aflatoxin. Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% hoặc trên ngô 19-24%,
Aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng như vậy nếu nhiệt độ khá ấm.
Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin.Giá trị pH thích
hợp để Asp.flavus sinh độc tố aflatoxin ở giá trị pH giữa 4-5. Hàm lượng khí
cacbonic tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của Asp. flavus do đó
giảm lượng Aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khí
quyển hàm lượng Aflatoxin cũng giảm. Các Aflatoxin được xem là nhạy cảm với
ánh sáng, nhưng thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại.
Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về tầm quan trọng của các yếu tố
dinh dưỡng khác nhau lên sản lượng Aflatoxin thể hiện qua các điều kiện nuôi cấy
khác nhau.
Bảng 1.2: Ảnh hưởng của chủng Asp. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh
ra Aflatoxin.
Chủng

Môi trường nuôi cấy

Tổng

Số lượng so sánh (% các

lượng

Aflatoxin)

Aflatoxin

B1

B2

G1

G2

(mg/l hoặc
mg/kg)
ATCC 15517

Tổng hợp

45

87

4

9

<1

Chưa xác định

Lạc

265

44

1

54

1

Chưa xác định

Lạc

14

98

2

0

0

NRRL 2999

Lúa mì

870

35

9

48

7

NRRL 2999

Lúa mì +metionin

700

44

11

38

7

NRRL 2999

Gạo

?

23,8

6,3

6,8

0,9

NRRL 3000

Saccarose + acid

86

26

0

74

0

154

70

0

30

0

amin (nuôi cấy
chìm) 72h ở 200C
NRRL 3000

-Nt- ở 250C
10


Đồ án tốt nghiệp

Ghi chú: ATCC, NRRL : ký hiệu của bộ sưu tập chủng chuẩn
(Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007)
Nguồn Cacbon : Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường
hexose vào môi trường nuôi cấy chất khoáng lên hàm lượng Aflatoxin do A. flavus
sinh ra và ghi nhận các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp
Aflatoxin.
Bảng 1.3: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra.
Glucid

Nồng độ
1%

3%

D – glucose

+++

+++

D – manose

+++

+++

D – fructose

+++

+++

D – galactose

-

++

D – glucose

-

0

D – arabinose

-

-

D – xylose

+

++

D – ribose

-

+

D – eritrose

-

0

D – glyceraldehyde

+++

+++

Ghi chú: Số dấu + chỉ lượng aflatoxin nhiều hay ít, dấu – chỉ không có, số 0 là
không thí nghiệm
Nguồn đạm: Sản lượng Aflatoxin cao nhất thu được trên môi trường có tính chất
nấm men hoặc có peptone hoăc tốt hơn nữa là có acid amin trong đó glycin hoặc
glutamat, alanin và acid aspartic thì kém hơn một ít. Tiamin và các vitamin nhóm B
kích thích sự tổng hợp các Aflatoxin.
Các ion kim loại: Sự có mặt của Zn, catmi, Mg hoặc Fe kích thích sự sản sinh
Aflatoxin, Co, Cr, Ca, Mn chỉ có ít hiệu lực. Thêm 3,9 μmol Bari acetate thì sự tạo
thành Aflatoxin bị ức chế.
11


Đồ án tốt nghiệp

Các chất khác: khi Asp. flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng Aflatoxin tạo ra ở
giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn ở giai đoạn phôi nhũ. Ngoài ra, người ta thấy
việc thêm lipid (chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì
đã loại bỏ lipid có hiệu quả tốt đến việc sản sinh Aflatoxin. Ảnh hưởng có lợi của
các acid béo đến việc hình thành độc tố được nhiều người công nhận, làm cho người
ta nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp các Aflatoxin;
việc phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hình thành các tiền sản phẩm tham gia
vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp Aflatoxin. Thêm dimetylsulfoxide (DMSO) vào
môi trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ Aflatoxin hoặc tăng lên chút ít hoặc giảm sút
nhiều. Ở đây có lẽ là một tác động chuyển hóa qua lại hơn là một phản ứng hóa học
giữa DMSO và các Aflatoxin.
1.2.4. Cấu trúc và tính chất của Aflatoxin
Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Hiện nay người ta đã tìm
thấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất
gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi
nấm Asp.s flavus và Asp. parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2.

Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng.B là chữ viết tắt của
Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây).
Các sắc kí đồ lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom : metanol
(98.5 : 1.5) được tách bằng hệ thống clorofrom : cacbon tetraclorua : nước : metanol
(2 : 2.5 : 1 : 3) đã phát hiện hai vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: một vết
huỳnh quang xanh tím, đó là aflatoxin B1, một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnh
quang màu lục, đó là aflatoxin G1. Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc
aflatoxin B1: nó có hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một. Bằng cách khử nối
đôi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu được
hai sản phẩm độc khác là aflatoxin B2 và G2. So với aflatoxin B1, độc tính của
chúng đối với vịt con kém hơn từ 60 đến 100 lần; như vậy chúng sẽ không độc, nếu
không có các khả năng mất hidrat chuyển thành aflatoxin B1 rất độc.

12


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3: Cấu tạo của Aflatoxin
Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá và gọi là Aflatoxin M1 và
Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk). Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh
tím, aflatoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím. Aflatoxin M1 là hidroxi – 4
aflatoxin B1, và aflatoxin M2 là hidroxi – 4aflatoxin B2.
Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá và gọi là Aflatoxin M1 và
Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk). Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh
tím, aflatoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím. Aflatoxin M1 là hidroxi – 4
aflatoxin B1, và aflatoxin M2 là hidroxi – 4aflatoxin B2.
Các aflatoxin tan trong methanol, acetone và chloroform, không tan trong dung môi
không phân cực. Aflatoxin tương đối không ổn định khi tiếp xúc với ánh
sáng, đặc biêt là khi tiếp xúc với tia cực tím, các tác nhân oxy hóa, trong các dung

môi phân cực hay trong các dung dịch có pH nhỏ hơn 3 hay lớn hơn 10. Aflatoxin
có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), nhƣ ng không bị phá hủy
trong điều kiện nấu ăn bình thường. Có thể phân hủy hoàn toàn chúng bằng nồi hấp
tiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac hoặc xử lý băng chất tẩy rữa.

13


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.4: Tính chất hóa lý của một số aflatoxin.
Công thức

Trọng lượng

Điểm nóng

phân tử

phân tử

chảy (0C)

B1

C17H12O6

312

268 – 269

Xanh lam

B2

C17H14O6

314

268 – 289

Xanh lam

G1

C17H12O7

328

244 – 246

Xanh lục

G2

C17H14O7

330

229 – 231

Xanh lục

M1

C17H12O7

328

299

Xanh lam tím

M2

C17H14O7

320

293

Tím

Aflatoxin

Huỳnh quanh

(Nguồn: Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxin
khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin:

− Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của aflatoxin B1.
Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2 (Rohm và Haas).Trọng
lượng phân tử của nó, xác định bằng khối phổ là 2.8.Sản phẩm này là kết quả sự
khửmetyl của aflatoxin B1.
− Aflatoxin 3B hay toxin B3: một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy A.
flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kémaflatoxin B1 từ 40 đến 50 lần.
− Aflatoxin B3 ( được Siubblefield và đồng sự phân lập) còn gọi là porositicol:
nhân xiclopenten tận cùng của aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi bên
etanol, do đó chất này là 6 –metoxi -7 - (2 ’ – hidroxictyl) difurocumarin.
1.2.5. Cơ chế gây độc của Aflatoxin
Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào.Sự liên kết này gây ức
chế enzym polymerase của RNA.Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và
ức chế polymerase t-RNA.Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein
trong tế bào.

14


Đồ án tốt nghiệp

Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α,β -lacton không bão hòa có trong phân tử
aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton
này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng
bình thường của tế bào.
Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, Aflatoxin phải trải qua một
quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1
– dhd) ở trong gan. Theo Neal và cộng sự (1981), hợp chất này là nguyên nhân gây
hủy hoại gan rất nhanh.Nhóm dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để
tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây
nhiễm độc cấp tính.(Hình 1.4).

Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan. (Cliford và
Rces,1967 trích dẫn bởi bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003).
1.2.6. Độc tính của Aflatoxin
Theo Dương Thanh Liêm (2002), Aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể
con người và động vật. Những tác hại đó như sau:
15