Nghiên cứu vi tảo biển dị dưỡng thraustchytrids ở rừng ngập mặn xuân thủy, nam định

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Đình Tuấn

NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids
Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Đình Tuấn

NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids
Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, TS. Phạm
Thế Hải những người Thầy, Cô tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên Tôi trong
suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những đóng góp quý báu cho luận văn của
ThS. Phạm Thị Bích Đào, TS. Trần Văn Tuấn, ThS. Nguyễn Thị Khuyến.
Xin cảm ơn các Thầy, Cô, Anh, Chị, Em Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh
học, tổ Bộ môn Vi sinh vật học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để Tôi thực hiện các nghiên cứu của
mình.
Xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã quan tâm động viên, giúp đỡ
Tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2017
Học viên

Nguyễn Đình Tuấn


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết đầy đủ

Chữ viết tắt
DHA

Docosahexaenoic Axit

DPA

Docopentaenoic Axit

EPA

Eicosapentaenoic Axit

FAS

Fatty Axit synthase – Tổng hợp axit béo

MUFA

Monounsanturated fatty Axit - Axit béo không no một nối đôi

GPY

Glucose – Peptone – Cao nấm men (Yeast extract)

PUFA

Polyunsanturated fatty Axit - Axit béo không no đa nối đôi

TLK

Tổng lượng khô

VTBDD

Vi tảo biển dị dưỡng

ω-3

Omega-3

ω-6

Omega-6


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây phả hệ thraustochytrid dựa trên trình tự gen 18S rRNA thu được từ
các nghiên cứu trước đó [10, 14] ................................................................................9
Hình 1.2. Đặc điểm hình thái các dạng tế bào của họ thraustochytrid .....................11
Hình 1.3. Chu kỳ sinh trưởng của các chi chính trong họ thraustochytrid [15] .......12
Hình 1.4. Tổng hợp axit béo bão hòa thông qua con đường FAS [18] ....................16
Hình 1.5. Tổng hợp DHA bởi quá trình kéo dài chuỗi và khử bão hòa [19] ...........18
Hình 1.6. Con đường cơ bản của sinh tổng hợp axit béo và polyketide .................20
Hình 2.1. Các vị trí thu mẫu tại Rừng ngập mặn Xuân Thủy ……………………..25
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của 10 chủng thraustochytrid trên đĩa thạch GPY sau
72h nuôi cấy (thanh kích thước 5mm)……………………………………………. 35
Hình 3.2. Hình thái tế bào của chủng PT-268 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
trưởng thành; (B) Túi bào tử với sự phân chia hướng tâm của các động bào tử; (C)
Giải phóng động bào tử; (D) Tế bào sinh dưỡng; (E) Động bào tử hai roi ..............36
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng PT-271 (thanh kích thước 10 µm). (A, B, C)
Sự thay đổi hình dạng của tế bào dạng amip; (D, E, F) Túi bào tử. .........................37
Hình 3.4. Hình thái tế bào của chủng PT-272 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản

trưởng thành; (B,C) Túi bào tử; (D) Tản chưa trưởng thành. ...................................37
Hình 3.5. Hình thái tế bào của chủng PT-277 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
chưa trưởng thành; (B) Túi động bào tử; (C) Thay đổi hình dạng ở tế bào dạng
amip; (D) Các cấu trúc giống động bào tử được giải phóng .....................................38
Hình 3.6. Hình thái tế bào của chủng PT-278 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
chưa trưởng thành; (B, C) Túi động bào tử; (D) Tế bào dạng amip; (E) Thay đổi
hình dạng ở tế bào dạng amip ...................................................................................39


Hình 3.7. Hình thái tế bào của chủng PT-279 (thanh kích thước 10 µm). (A) Nang
bào tử; (B) Tản chưa trưởng thành; (C) Túi động bào tử; (D) Thay đổi hình dạng ở
tế bào dạng amip; (E) Giải phóng động bào tử .........................................................39
Hình 3.8. Hình dạng tế bào của chủng PT-280 (thanh kích thước 10 µm). (A) Túi
bào tử; (B) Sự phân cắt hướng tâm của các động bào tử nguyên phát từ túi động bào
tử; (C) Tế bào dạng amip ..........................................................................................40
Hình 3.9. Hình dạng tế bào của chủng PT-281 (thanh kích thước 10 µm). (A) Thay
đổi hình dạng ở tế bào dạng amip; (B) Sự vê tròn của tế bào dạng amip; (C) Sự giải
phóng các cấu trúc dạng động bào tử ........................................................................40
Hình 3.10. Hình thái tế bào của chủng PT-283 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
trưởng thành với các hạt tế bào; (B, C, D) Túi bào tử ..............................................41
Hình 3.11. Hình dạng tế bào của chủng PT-286 (thanh kích thước 10 µm). (A, B)
Tản; (C) Túi bào tử....................................................................................................41
Hình 3.12. Cây phả hệ của chủng đại diện PT-268 dựa trên trình tự gen 18S rRNA
và các chủng có mối quan hệ gần..............................................................................43
Hình 3.13. Tỷ lệ % tổng số axit béo no (SFA), axit béo không no một nối đôi
(MUFA) và axit béo không no đa nối đôi (PUFA) của mười VTBDD
thraustochytrid...........................................................................................................46
Hình 3.14. So sánh thành phần các axit béo không no đa nối đôi của mười VTBDD
thraustochytrid...........................................................................................................50
Hình 3.15. Tỷ lệ % axit béo EPA, DPA so với tổng số axit béo (TFA) của mười

VTBDD thraustochytrid. ...........................................................................................51


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Các chủng phân lập được và đặc điểm của vị trí thu mẫu .......................31
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 10 chủng Thraustochytrid tại 72 giờ .32
Bảng 3.3. Hình thái tế bào của mười chủng thraustochytrid ....................................37
Bảng 3.4. So sánh trọng lượng khô và % TFA của 10 chủng nghiên cứu với một số
chủng thraustochytrid khác đã được công bố............................................................45
Bảng 3.5. Thành phần axit béo của 10 VTBDD Thraustochytrid ............................48
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và Lipit tổng số của mười
VTBDD thraustochytrid ............................................................................................52
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng và Lipit tổng số của
mười VTBDD thraustochytrid ..................................................................................54


MỤC LỤC

Chương 1 - TỔNG QUAN .................................................................................................... 6
1.1.

Giới thiệu về vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid ..................................................... 6

1.1.1.

Vị trí phân loại VTBDD thraustochytrid ............................................................. 7

1.1.2.

Đặc điểm sinh học của VTBDD thraustochytrid ............................................... 10

1.1.2.1.

Đặc điểm tế bào ............................................................................................. 10

1.1.2.2.

Chu kỳ sinh trưởng ........................................................................................ 12

1.1.3. Vai trò của thraustochytrid trong hệ sinh thái............................................................ 13
1.2.

Axit béo VTBDD thraustochytrid............................................................................. 15

1.2.1.

Tổng hợp axit béo bằng con đường FAS (Fatty Axit Synthase) ....................... 15

1.2.2.

Tổng hợp axit béo bằng con đường PKS (polyketide synthase) ....................... 18

1.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sản xuất PUFA ....................................... 22

1.3.1.

Dinh dưỡng ........................................................................................................ 22

1.3.1.1.

Nguồn Cacbon ............................................................................................... 22

1.3.1.2.

Nguồn Nitơ .................................................................................................... 23

1.3.2.

Hệ thống nuôi cấy .............................................................................................. 23

1.3.3.

Pha sinh trưởng .................................................................................................. 24

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 25
2.1.

Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 25

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 25

Môi trường nuôi cấy ......................................................................................................... 25
2.1.2.
2.2.

Hóa chất và thiết bị ............................................................................................ 26

Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26

2.2.1.

Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu............................................................. 26

2.2.2.

Phương pháp phân lập ....................................................................................... 27

1


2.2.2.1.

Phân lập bằng micropipette............................................................................ 27

2.2.2.2.

Kiểm tra và thuần khiết giống trên đĩa thạch ................................................. 27

2.2.3.

Phương pháp phân loại hình thái học ................................................................ 27

2.2.4.

Phương pháp phân tích trình tự gen .................................................................. 27

2.2.4.1.

Tách chiết DNA ............................................................................................. 27

2.2.4.2.

Giải trình tự gen 18S ...................................................................................... 28

2.2.5.

Phân tích thành phần axit béo ............................................................................ 29

2.2.5.1.

Phân tích Lipit tổng số ................................................................................... 29

2.2.5.2.

Xác định thành phần axit béo bằng sắc ký khí .............................................. 29

Thành phần axit béo bằng sắc ký khí theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998, LB Đức .. 29
2.2.6.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến sinh trưởng và tổng hợp Lipit .... 30

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 31
3.1.

Đặc điểm của mười chủng VTBDD Thraustochytrid phân lập từ RNM Xuân Thủy ...

.................................................................................................................................. 31

3.1.1.

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc ............................................................................ 32

3.1.2.

Đặc điểm hình thái tế bào 10 chủng thraustochytrid ......................................... 35

3.2.

Phân tích trình tự gen 18S......................................................................................... 31

3.3.

Thành phần axit béo của mười VTBDD thraustochytrid .......................................... 44

3.4.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến sinh trưởng và tổng hợp Lipit ............... 51

3.4.1.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon ........................................................................... 51

3.4.2.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ ................................................................................ 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 56

2


MỞ ĐẦU
Việt Nam có trên 3200 km bờ biển và các vùng rừng ngập mặn ven biển, như
vườn quốc gia Xuân Thủy là một khu rừng ngập mặn thuộc khu dự trữ sinh quyển
châu thổ sông Hồng. Đây là rừng ngập mặn đầu tiên ở Việt Nam được quốc tế công
nhận theo công ước Ramsar, là rừng ngập mặn thứ 50 của thế giới. Với một nguồn
sinh vật biển nhiệt đới đa dạng và phong phú về thành phần loài và giàu các hợp
chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y
dược…. Trong đó các loài vi tảo biển dị dưỡng là nguồn sinh khối sơ cấp quan
trọng trong chuỗi thức ăn biển đồng thời chúng cũng chứa nhiều hợp chất quan
trọng cho con người và động vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất,
protein, Lipit… đặc biệt là các loại axit béo không no đa nối đôi PUFA
(polyunsaturated fatty axit).
Trong những năm gần đây, vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thu hút sự quan
tâm của các nhà khoa học và doanh nghiệp. Sự quan tâm đó có cơ sở vì các loài vi
tảo biển dị dưỡng chứa rất nhiều axit béo không no cần thiết như PUFA.
Thraustochytrid là nhóm sinh vật có khả năng tạo ra Axit béo không no omega-3,
Axit docosahexaenoic (DHA), astaxanthin, carotenoids, docopentaenoic Axit
omega-6 (DPA), đây là những chất có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con
người và trong nuôi trồng thủy sản (NTTS). Bên cạnh đó, hiện nay nhiên liệu sinh
học chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật và động vật. Nguồn nguyên liệu này làm cho
chi phí sản xuất cao, tốn năng lượng. Thraustochytrid tạo ra hàm lượng lớn các Axit
béo không no, điều này làm cho thraustochytrid trở thành đối tượng tiềm năng sản
xuất dầu diesel sinh học. Tập trung sản xuất dầu diesel sinh học từ thraustochytrid
cho hiệu quả kinh tế cao hơn, thân thiện với môi trường và giảm sự leo thang về chi

phí nhiên liệu do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng.
Ngoài ra, các VTBDD có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng duy trì điều
kiện nuôi cấy tối ưu, không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ và khí hậu, có thể kiểm soát
được quá trình sản xuất và chất lượng sản phẩm. Trên thế giới, trong một vài năm
gần đây, các loài VTBDD thuộc chi Thraustochytrium, Schizochytrium,

3


Labyrinthula, Ulkenia,…đã trở thành đối tượng nghiên cứu chính cho các nhà khoa
học ở một số nước như: Úc, Nhật Bản… để sản xuất DHA làm thực phẩm chức
năng cho con người và phối trộn chúng cùng nấm men và một số vi tảo biển khác
làm thức ăn tươi sống hoặc nhân tạo trong nuôi trồng thủy sản. Vì vậy, việc phân
lập và tuyển chọn các VTBDD cho các ứng dụng mang tính thương mại là hết sức
quan trọng và cần thiết.


Nội dung nghiên cứu:
• Phân lập và tuyển chọn được 10 vi tảo dị dưỡng ở rừng ngập mặn Xuân

Thủy, Nam Định.
• Phân loại vi tảo biển dị dưỡng:
− Phân loại theo hình thái học: miêu tả, kích thước hình dạng tế bào vi tảo
biển dị dưỡng họ thraustochytrid.
− Phân loại bằng sinh học phân tử: phân tích giải trình tự rDNA 18S
• Sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng họ thraustochytrid giàu thành phần Axit béo
không no quan trọng như DHA, AA, EPA.
• Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến sinh trưởng và tổng hợp chất béo.


Mục tiêu nghiên cứu
Luận văn tập trung vào các thông tin liên quan tới tính đa dạng và hình thái

học, lưu giữ nguồn gen của thraustochytrid trong môi trường cửa sông và biển rừng
ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định và cũng đưa ra sơ lược các phương pháp để phán
loại thraustochytrid.


Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Góp phần bổ sung vốn kiến thức cho chuyên ngành sinh

thái học và là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu về nguồn gen vi tảo biển dị
dưỡng đa dạng sinh học và nuôi trồng thủy sản
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài phục vụ trực tiếp việc bảo tồn nguồn gen
vi tảo biển dị dưỡng ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định, tuyển chọn được vi

4


tảo biển dị dưỡng thraustochytrid đưa vào khai thác nhân nuôi trên quy mô công
nghiệp


Điểm mới của luận văn
Cung cấp một số dẫn liệu cập nhật về nguồn gen vi tảo biển dị dưỡng

thraustochytrid ở rừng ngập mặn tại khu vực nghiên cứu.

5

Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid
Vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thraustochytrid thuộc giới Straminipila có mối

liên quan đến tảo lông doi lệch như tảo vàng ánh (Chrysophytes), tảo vàng lục
(Xanthophytes), tảo nâu (Phaeophytes) và tảo silic (Diatoms), trước đây chúng được
xếp vào giới nấm do đặc điểm hóa dị dưỡng điển hình kết hợp hình thái học giữa
nấm thực và nấm noãn [23, 34].
Nấm và nguyên sinh vật dạng nấm là sinh vật phân giải trong các hệ sinh thái,
tầm quan trọng của chúng đối với các hệ sinh thái trên cạn từ lâu đã được nghiên
cứu và công nhận. Tuy nhiên các nguyên sinh vật dạng nấm trong môi trường nước
mặn lại ít được quan tâm hơn so với vi khuẩn, chủ yếu do sự phong phú và hàm
lượng sinh khối thấp cũng như vai trò sinh thái chưa được biết nhiều của chúng.
Thraustochytrid do đó có thể được coi là một phần quan trọng của chuỗi thức ăn
nước mặn đã bị bỏ qua. Mặc dù vậy chúng xuất hiện ở hầu hết các vùng ngập mặn
cửa sông và vùng biển trên toàn thế giới [32]. Mật độ của phù du thraustochytrid
được ước tính khoảng từ 103- 105/l bằng cách đếm trực tiếp bằng kính hiển vi ngoại
huỳnh quang [45]. Dù mật độ này rất nhỏ nếu so sánh với số lượng của vi khuẩn
phù du trong nước mặt (ước tính vào khoảng 108- 109/l), tuy vậy thể tích tế bào của
thraustochytrid có thể lớn hơn 103 lần so với vi khuẩn phù du. Sinh khối tế bào
thraustochytrid cũng đã được tính toán lớn hơn sinh khối vi khuẩn phù du khoảng
104 lần. Sự phong phú tương đối thấp của thraustochytrid do đó được bù đắp bởi thể
tích tế bào và sinh khối cao của chúng [27]. Ngoài ra, thraustochytrid có khả năng
sản xuất cellulase và xylanases ngoại bào để phân hủy các vật liệu thực vật như tảo
và lá rụng trong rừng ngập mặn [35]. Chúng cũng được biết với khả năng tích lũy
một lượng lớn omega-3 PUFA như DHA và DPA [45], do đó chúng có tiềm năng
trở thành nguồn thức ăn cho sinh vật ở bậc dinh dưỡng cao hơn ở biển môi trường.

Hơn nữa, một số loài thraustochytrid liên quan đến các mầm bệnh ảnh hưởng đến
động vật thân mềm [53]. Những đặc điểm đặc biệt trên cho thấy thraustochytrid

6


đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển và cần được nghiên cứu, đánh giá
nhiều hơn.
Thraustochytrid được Sparrow mô tả lần đầu tiên vào năm 1936 và từ cuối
những năm 1930 đến những năm 1960 đã có nhiều báo cáo về việc phân lập và mô
tả về đặc điểm của chúng [23]. Đến những năm 1990, sự xuất hiện của chúng trong
các môi trường sống khác nhau và nhu cầu sinh lý của chúng đã được nghiên cứu
rộng rãi [9]. Trong những năm 1990 và 2000, mật độ tế bào của thraustochytrid
trong các thủy vực và trầm tích được đo bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính
hiển vi [42]. Vào giai đoạn này sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử
đã dẫn đến việc tái phân loại thraustochytrid dựa trên trình tự 18S rRNA và trình tự
gen khác [27, 57]. Sau đó, các kỹ thuật phân tử mới cho việc phát hiện
thraustochytrid cũng đã được phát triển [35].
1.1.1. Vị trí phân loại VTBDD thraustochytrid
Thraustochytrid lần đầu tiên được Sparrow phát hiện trên bề mặt của các mẫu
rong biển thu từ Woods Hole, MA, USA, và đã được mô tả là loài
Thraustochytrium proliferum [52]. Mặc dù Thraustochytrium ban đầu được ghi
nhận là một dạng nấm chytridiaceous, nhưng sau đó được tái phân loại là một thành
viên của Saprolegniales trong ngành Oomycetes dựa trên các đặc điểm đã quan sát
được về động bào tử hai roi của chúng [14]. Tuy nhiên, do siêu cấu trúc
sagenogenetosome của các thraustochytrid là đồng nhất so với cấu trúc của các
labyrinthulid được mô tả bên dưới, nên các thraustochytrid và labyrinthulid sau đó
được phân thành một nhóm đơn [38]. Các tế bào thraustochytrid thường có hình
ovan hoặc hình cầu (hình 1.2) và trong hầu hết các trường hợp, sagenogenetosome
thường xuất hiện ở một vùng đơn lẻ trên bề mặt tế bào [34]. Các tế bào không được

bọc hoặc bao phủ hoàn toàn bởi mạng lưới ectoplasmic của chúng. Những mạng
lưới này không được sử dụng để di chuyển, nhưng có chứa các enzym ngoại bào
cho phép xâm nhập vào các bề mặt rắn và phân hủy các hợp chất hữu cơ cho quá
trình hấp phụ và vận chuyển các chất dinh dưỡng [11, 13]. Các trạng thái tế bào
sinh dưỡng của thraustochytrid bao gồm các tế bào đơn có đường kính đo được từ 4

7


– 20 µm, và hầu hết các thraustochytrid tái sản sinh bằng các động bào tử [42].
Trong khi nhiều tế bào trưởng thành các tế bào sinh dưỡng chuyển hóa trực tiếp
thành túi bào tử động, một số khác lại chuyển thành dạng tế bào amip, các tê bào
amip này sau đó chuyển hóa thành các bào tử động [20]. Trạng thái của các tế bào
sinh dưỡng và các đặc điểm hình thái khác nhau thay đổi tùy theo các chi
thraustochytrid khác nhau [38, 57].
Họ Thraustochytriaceae ban đầu được phân loại bao gồm 7 chi dựa trên các
đặc điểm hình thái như sau [33, 38]: Althornia Jones và Alderman, Aplanochytrium
Bahnweg và Sparrow, Japonochytrium Kobayasi và Ookubo, Labyrinthuloides
Perkins, Schizochytrium Goldstein và Belsky emend. Booth và Miller,
Thraustochytrium Sparrow c. Johnson, và Ulkenia Gaertner. Tuy nhiên, một nghiên
cứu khá toàn diện được thực hiện bởi Honda và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng sự
phân loại ở mức chi này không bao gồm sự phân loại gen dựa trên các dải trình tự
rRNA 18S [23]. Sử dụng kết hợp các đặc điểm hình thái và phân loại phân tử,
Levàer và Porter (2000) đã kết luận rằng Aplanochytrium và Labyrinthuloides là
tương đồng và do đó đã sửa đổi lại định nghĩa về chi Aplanochytrium, chi này bao
gồm tất cả các loài Labyrinthuloides. Ngoài ra, các loài thuộc chi Schizochytrium
được tái sắp xếp lại thành 3 chi riêng biệt Schizochytriumsensu stricto,
Aurantiochytrium và Oblongichytrium gen. nov. dựa trên các đặc điểm về hình thái,
phân loại sinh hóa, và phân loại gen theo trình tự rRNA 18S [46]. Hơn nữa, chi
Ulkenia cũng được phân tách thành 4 chi có chứa 3 chi mới, Ulkeniasensu stricto,

Botryochytrium, Parietichytrium và Sicyoidochytriumgen. nov. [58].

8


Hình 1.1. Cây phả hệ thraustochytrid dựa trên trình tự 18S rRNA của các
chủng đã công bố [58], [21]
Họ này hiện nay gồm 11 chi: Aplanochytrium, Althornia, Japanochytrium,
Aurantiochytrium,

Oblongichytrium,

Schizochytrium,

Thraustochytrium,

Sicyoidochytrium, Ulkenia, Parietichytrium và Botryochytrium [58]. Sự phân loại

9


các chi đầu tiên dựa trên hình thái học khuẩn lạc, tế bào, sự khác biệt trong quá
trình hình thành, giải phóng bào tử, kích thước túi bào tử và những dạng thức phân
cắt của túi bào tử, sau đó kết hợp dữ liệu về gen 18S rDNA. Phương thức sinh sản
thường thấy ở VTBDD Thraustochytrid là sinh sản vô tính bằng cách sản xuất động
bào tử hai doi lệch. Doi gắn ở phần ngọn, doi trước dài, bề mặt được bao phủ bởi
lớp lông tơ và doi sau ngắn, trơn, không có lông tơ. Động bào tử phát triển trong
các túi động bào tử có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng, sau đó chúng được giải
phóng rồi mất doi, hình thành tế bào mới. Giai đoạn amip cũng đã được quan sát
[17].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của VTBDD thraustochytrid
1.1.2.1. Đặc điểm tế bào
Thraustochytrid là sinh vật đơn bào, nhân thực, hóa dị dưỡng. Tế bào sinh
dưỡng trong môi trường dịch thể tồn tại ở dạng tản hình trứng hoặc hình cầu với
đường kính từ 4 - 20µm [8], được liên kết với một mạng lưới ngoại chất (EN) dạng
sợi như rể giả (hình 1.2 b-h), ngoại trừ ở chi Althornia không có EN [4], nhiệm vụ
của EN là làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, hỗ trợ tế bào gắn kết với chất nền,
thủy phân các hạt cơ chất rắn sau đó cung cấp dinh dưỡng cho tế bào [8]. Thành tế
bào của chúng gồm nhiều lớp, các lớp này không chứa xenlulloza mà hình thành từ
fucoza hoặc dẫn xuất của galactoza và có nguồn gốc từ thể Golgi [8, 27, 41]. Rể giả
được kết nối với tản qua một cấu trúc nút phức tạp (hình 1.2 b) còn được gọi là bào
quan sagenogenetosome [42] hoặc bothrosome [29].
Phương thức sinh sản thường thấy ở VTBDD thraustochytrid là sinh sản vô
tính bằng cách tạo ra động bào tử hai doi lệch. Doi gắn ở phần ngọn, doi trước dài,
bề mặt được bao phủ bởi lớp lông tơ và doi sau ngắn, trơn, không có lông tơ. Động
bào tử phát triển trong các túi động bào tử có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng,
sau đó chúng được giải phóng rồi mất doi, hình thành tản mới [5]. Giai đoạn amip
cũng đã được quan sát [16]. Ở một số chi của họ thraustochytrid tản sinh phát triển
ở bên trong, như ở T. rossi (hình. 1.2 c-e) [4], trong khi ở chi Schizochytrium, sự

10


phân chia tản phân đôi liên tiếp (hình 1.2). Bào tử nghỉ Epibiotic được tạo ra một số
loài, mặc dù nó đã không được ghi nhận là những kết quả của sinh sản hữu tính [4].

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái các dạng tế bào của họ thraustochytrid
(a) Chi tiết siêu cấu trúc của phức hệ bothrosome (sagenogenetosome) phân
tách từ lưới ngoại chất của Aplanochytrium minutum, cho thấy sự nối tiếp nhau
trong phức hệ xuyên màng. (b) Sơ đồ minh họa siêu cấu trúc tản đơn bào chưa

trưởng thành của Thraustochytrium cho thấy tinh nhánh cơ bản mạng lưới ngoại
chất và tế bào lông của quy mô hợp nhất theo Porter (1990). (c-f) Thraustochytrium
rossi về đặc điểm sinh sản cho thấy sự phát triển tản vào bên trong (c-e), giải phóng
động bào tử (e), và động bào tử hai doi lệch (f). (g, h) Ulkenia amoeboida về phấn
hoa cho thấy tản trưởng thành (g), giải phóng dạng amip nguyên sinh (h) phân chia

11


để hình thành bào tử dạng amip đặc trưng (k) từ đó hình thành và giải phóng động
bào tử hai doi lệch (i) .
1.1.2.2. Chu kỳ sinh trưởng
Thraustochytrid là họ VTBDD có các hình thức sinh sản khá đa dạng. Cho đến
nay, chưa có bằng chứng cho thấy những sinh vật này có thể sinh sản hữu tính, tuy
nhiên khả năng xuất hiện của hình thức sinh sản này không thể loại trừ. Hình thức
sinh sản giữa các chi trong họ thraustochytrid có một số khác biệt:

Hình 1.3. Chu kỳ sinh trưởng của các chi chính trong họ thraustochytrid [4]

12


• Chi Thraustochytrium, tế bào chất của các tế bào trưởng thành phân chia trực
tiếp thành động bào tử.
• Chi Althornia cũng phân chia theo cách tương tự, nhưng có một sai khác là
khi phân chia động bào tử thiếu hệ thống mạng lưới ngoại chất.
• Chi Ulkenia, Sicyoidochytrium, Parientichytrium và Botryochytrium, tế bào
chất tách ra dưới dạng tế bào hình amip trước khi hình thành động bào tử.
• Chi Schizochytrium, Aurantiochytrium và Oblongichytrium được đặc trưng
bởi sự phân đôi liên tiếp của một tế bào sinh dưỡng, hình thành nên một cụm tế bào,

mỗi cụm sau đó sẽ phát triển thành một động bào tử hay túi động bào tử.
Dù sinh trưởng theo các phương thức khác nhau nhưng khái quát vòng đời của
thraustochytrid đều trải qua 3 chu kỳ:
Chu kỳ 1: các tế bào trong giai đoạn sinh trưởng khi đạt được đến một kích
thước nhất định, chúng có thể hình thành nên các động bào tử, và giải phóng động
bào tử. Mặt khác, chúng có thể hình thành nên các tế bào dạng amip, hoặc tiếp tục
sinh trưởng đến giai đoạn trưởng thành rồi thực hiện quá trình phân chia 2, 4 tế bào.
Chu kỳ 2: tế bào tiếp tục phân chia 8, sau đó các tế bào được giải phóng tạo
thành các tế bào đơn, tiếp tục sinh trưởng tạo tế bào trưởng thành.
Chu kỳ 3: nội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt đầu
tạo thành các động bào tử. Sau một thời gian các động bào tử được giải phóng và
phát triển thành tế bào đơn theo chu kỳ khép kín.
1.1.3. Vai trò của thraustochytrid trong hệ sinh thái
Các nghiên cứu đã phát hiện ra sự hiện diện của thraustochytrid trong các môi
trường cửa sông, biển và vùng nước sâu. Thraustochytrid tồn tại trong các thủy vực
hầu hết có đường kính giữa 3.5 và 20 µm và lớn hơn đường kính của vi khuẩn phù
du (<1 μm) [35, 36, 46]. Xét về kích thước, các thraustochytrid phù du được xem là
nguồn thức ăn thích hợp cho các loài sinh vật nguyên sinh, các loài tảo đơn bào hai
roi dị dưỡng, và các loài thân mềm chọn lọc thức ăn có kích thước dưới 100 µm..
Ngoài ra, tỷ lệ cacbon/nito (C/N) ở các tế bào thraustochytrid đã nuôi cấy được xác
định là 10.5, tỷ lệ này cao hơn tỷ lệ của các loài vi khuẩn sống ven biển (5.9) và đại

13


dương (6.8) [27]. Do đó, người ta cho rằng tính trên mỗi tế bào thraustochytrid có
tác động lớn hơn đối với chu trình cacbon so với các tế bào vi khuẩn. Vì vậy,
thraustochytrid là đối thủ cạnh tranh với các vi khuẩn phù du trong việc đóng vai trò
tuần hoàn vật chất ở hệ sinh thái. Một khía cạnh quan trọng khác của chúng trong
chuỗi thức ăn là khả năng phân hủy các chất hữu cơ khó phân giải, những chất sau

phân gải đó có thể dễ dàng được các vi khuẩn phù du sử dụng. Thraustochytrid
thường xuất hiện ở dạng kết hợp với các mô tảo [50], và chúng có thể phân hủy các
nguyên liệu thực vật khó phân hủy bằng tiết enzyme xellulaza ngoại bào [35].
Ngoài ra, do thraustochytrid chứa hàm lượng cao PUFAs với chuỗi dài
omega-3 như DHA, DPA, và eicosapentaenoic axit (EPA) [25, 30, 57], những hợp
chất này tồn tại trong cơ thể các động vật biển nhưng không phải do chúng tự tổng
hợp mà phải tích lũy thông qua con đường thức ăn, là những loài sản sinh ra PUFA
trong đó bao gồm thraustochytrid [19]. Đặc biệt, có vẻ như thraustochytrid là nguồn
thực phẩm thay thế quan trọng cho các loại ấu trùng cần nồng độ DHA cao trong cơ
thể như cá mòi. Quá trình cho thấy một khía cạnh quan trọng khác trong sự đóng
góp của thraustochytrid đến chuỗi thức ăn biển và chu trình cacbon.
Với một số đặc điểm nổi bật nêu trên của VTBDD thraustochytrid chúng có
thể tạo ra những tác động đáng kể đến các hệ sinh thái đáy. Thraustochytrid được
cho là đặc biệt phong phú trong các khu vực có thực vật biển giàu hữu cơ và các
trầm tích rừng ngập mặn [26, 41]. Số lượng của chúng trong các trầm tích như vậy
được ước tính theo thứ tự từ 103-104 tế bào/g sử dụng phương pháp nhuộm
acriflavine [7]. Theo nghiên cứu của Bongiorni và cộng sự (2005) cho thấy rằng
trong thảm thực vật biển có các cấu trúc carbohydrate chịu nhiệt cao thì
thraustochytrid chiếm đến 50% tổng lượng nguyên sinh vật [8]. Ngoài ra, sinh khối
thraustochytrid (0.124 μg Cg -1) gần gấp ba lần so với nanoflagellates (0.044 μg Cg
-1). Một trong những lý do mà thraustochytrid chiếm phần lớn ở các trầm tích thực
vật được cho là do khả năng phân hủy các chất trơ. Trong thực tế, các chủng
thraustochytrid phân lập từ trầm tích có nhiều enzyme hoạt động liên quan đến sự
phân giải carbohydrate, Lipit và protein trong điều kiện phòng thí nghiệm [9]. Tuy

14


nhiên, vì những dữ liệu này thu được từ thraustochytrid nuôi cấy trong phòng thí
nghiệm nên khả năng phân hủy của thraustochytrid ngoài môi trường có thể tốt hơn

dự kiến.
1.2. Axit béo VTBDD thraustochytrid
Thraustochytrid có khả năng tích lũy hàm lượng axit béo cao, đặc biệt là axit
béo không no. Chúng có khả năng sản xuất một lượng lớn axit béo không no đa nối
đôi (PUFA -polyunsaturated fatty Axits) và axit béo không no một nối đôi (MUFA
- monounsaturated fatty Axit). Các loại axit béo không no này có ứng dụng quan
trọng trong sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm, sản xuất diesel sinh học và
một số ngành công nghiệp khác.
1.2.1.

Tổng hợp axit béo bằng con đường FAS (Fatty Axit Synthase)

Trước 2001, nhiều ý kiến cho rằng Thraustochytrid chỉ sản xuất DHA bằng
con đường tổng hợp axit béo FAS, con đường này bao gồm quá trình khử bão hòa
và kéo dài chuỗi [33]. Con đường FAS có chứa một protein đa enzyme xúc tác tổng
hợp axit béo [24]. Và được chia thành hai loại: FAS I - đặc trưng ở nấm và vật có
xương sống, trong đó các vị trí xúc tác cho các bước khác nhau trong sinh tổng hợp
Lipit chứa các vùng dọc theo chiều dài của protein đa chức năng và FAS II - đặc
trưng ở vi khuẩn và thực vật, trong đó mỗi vị trí xúc tác mang một tiểu đơn vị
protein riêng biệt. Sự kéo dài chuỗi axit béo bởi FAS dừng lại khi hình thành axit
palmitic (C16: 0) - sản phẩm cuối cùng của con đường tổng hợp FAS (hình 1.4).
Quá trình này bao gồm các chu kỳ trùng hợp lặp đi lặp lại được xúc tác bởi
ketosynthase (KS) để tạo thành một protein mang ketoacyl-acyl (ACP), tiếp theo là
quá trình khử bởi ketoreductase (KR) để tạo thành hydroxyacyl-ACP, khử nước bởi
dehydratase (DH) để tạo thành enoyl-ACP, và tiếp tục khử bởi enoyl reductase (ER)
để tạo acyl-ACP. Khi chuỗi carbon bão hòa đã đạt đến chiều dài đầy đủ - 16 nguyên
tử carbon, nó được giải phóng từ ACP nhờ thioesterase để tạo thành một axit béo.

15

Hình 1.4. Tổng hợp axit béo bão hòa thông qua con đường FAS [24]
MT = malonyl transferase, AT = acyl transferase, KS = ketosynthase, KR =
ketoreductase, DH = dehydratase, ER = enoyl reductase, ACP = acyl carrier
protein
Quá trình khử bão hòa và kéo dài chuỗi axit béo
Chỉ axit palmitic không thể cung cấp đầy đủ các chức năng cần thiết của các
axit béo. Như vậy, một loạt các quá trình kéo dài và khử bão hòa được sử dụng để
tạo ra chuỗi dài hơn và các axit béo không bão hòa. Mặc dù có nhiều các enzyme
xúc tác khác nhau, quá trình kéo dài và khử bão hòa này quyết định sự thay đổi của
các axit béo trong cả thực vật và động vật trên cạn và ở biển. Con đường này cần
các enzyme xúc tác và điều kiện hiếu khí như cung cấp oxy phân tử [40]. Enzyme
xúc tác cho quá trình khử bão hòa có tác dụng chèn một liên kết đôi tại các điểm cụ
thể trong chuỗi carbon liên kết với nhóm axit cacboxylic, trong khi các enzyme xúc
tác cho quá trình kéo dài chuỗi lại có tác dụng kéo dài chuỗi carbon bằng hai
nguyên tử carbon được chèn vào axit cacboxylic cuối của phân tử (hình 1.5).

16


Hình 1.5 minh họa hai con đường cho sinh tổng hợp DHA phụ thuộc Δ4
desaturase và không phụ thuộc Δ4 desaturase. Từ lâu nhiều kết quả nghiên cứu
khoa học cho rằng tất cả các sinh vật, bao gồm cả động vật có vú, có gen để sản
xuất các enzyme Δ4 desaturase. Tuy nhiên, nghiên cứu của Voss (1991) kiểm tra
quá trình sinh tổng hợp các enzyme Δ4 desaturase ở động vật có vú bằng cách sử
dụng mô hình chuột đã cho kết quả bất ngờ. Sau khi ủ C đánh dấu C22:05 (n-3)
(axit docosapentaenoic, DPA) pha tạp (dope) ở vị trí C1 với tiểu thể gan chuột,
không có sản phẩm DHA đánh dấu được phát hiện. Nếu một enzyme Δ4 desaturase
có mặt thì có thể DPA đã được đánh dấu sẽ được chuyển đổi sang sản phẩm DHA
tạo DHA có đánh dấu. Voss và cộng sự tìm thấy C24: 5 (n-3) và C24: 6 (n-3) được

đánh dấu. Như vậy, trong động vật có vú, DHA được sản xuất không phụ thuộc Δ4
desaturase. Thay vào đó, DHA được sản xuất bởi sự kéo dài DPA tạo C24: 5 (n-3),
khử bão hòa thông qua Δ6 desaturase tạo C24: 6 (n-3), và cuối cùng là quá trình
oxy hóa để C22: 6 (n-3) bởi quá trình β-oxy hóa. Oxy hóa axit béo là quá trình
ngược với quá trình kéo dài, trong đó hai carbon được gỡ bỏ khỏi đầu axit
cacboxylic của axit béo [39, 54].
Không giống như động vật có vú, Thraustochytrid và nhiều vi sinh vật khác đã
được phát hiện có chứa các gen mã hóa cho enzym Δ4 desaturase. Bằng chứng cho
việc tổng hợp enzyme Δ4 desaturase và sự tham gia của nó trong tổng hợp DHA ở
Thraustochytrium spp. [41]. Trong nghiên cứu của Qiu (2001) đã xác định một
cDNA ở Thraustochytrium spp. mã hóa cho một loại protein tương tự cấu trúc
enzyme Δ4 desaturase phân lập từ các sinh vật khác.

17


Tách dòng (cloning) và
biểu hiện cDNA này trong cả
nấm

men

(Saccharomycese

cerevesia) và thực vật (Brassica
juncea) bình thường không tổng
hợp enzyme Δ4 desaturase cho
thấy liên kết đôi Δ4 được chèn
vào DPA do đó tạo ra DHA.
DHA không tự nhiên được sản

xuất trong nấm men hoặc thực
vật bằng con đường phụ thuộc
hay không phụ thuộc Δ4. Các
bằng chứng được cung cấp bởi
nghiên cứu này cho thấy rõ ràng
Thraustochytrid chứa các gen
Hình 1.5. Tổng hợp DHA bởi quá trình kéo

mã

dài chuỗi và khử bão hòa [40]

desaturase. Do đó, quá trình

hóa

cho

enzyme

Δ4

sinh tổng hợp DHA trong.
Thraustochytrid có thể đạt được bằng FAS kết hợp với quá trình kéo dài và
khử bão hòa thông qua con đường phụ thuộc vào Δ4 desaturase [41].
1.2.2.

Tổng hợp axit béo bằng con đường PKS (polyketide synthase)

Các tiêu chí ban đầu của một con đường thay thế cho quá trình sinh tổng hợp

PUFA chuỗi dài bắt đầu trên vi khuẩn biển. EPA hay DHA được tìm thấy trong một
số chủng vi khuẩn biển ưa lạnh. Sau đó, một phân đoạn DNA genome từ một loại vi
khuẩn tổng hợp EPA (Shewanella sp. SCRC-2738) được chuyển nhiễm vào
Escherichia coli và tổng hợp EPA [56]. Các protein được mã hóa bởi năm khung
đọc mở được xác định là cần và đủ để tổng hợp EPA [59]. Bốn trong số những
protein này là các tiểu đơn vị của một enzyme phức tạp có khả năng tổng hợp de
novo EPA. Metz (2001) xác định vài vùng bắt cặp của enzyme tổng hợp PUFA

18