Bước đầu phân lập tuyển chọn một số chủng vi khuẩn xử lý nitrate trong nước thải

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN XỬ LÝ NITRATE TRONG NƯỚC THẢI

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS.Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện
MSSV: 107111096

: Nguyễn Thanh Nam
Lớp:07DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2011


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Vấn đề ô nhiễm môi trường đã và đang là vấn đề nóng mà xã hội đang quan tâm,
không giới hạn ở phạm vi khu vực một quốc gia nào mà là vấn đề toàn cầu. Nền công
nghiệp hiện đại đã mang lại nhiều lợi ích thiết thực không thể phủ nhận. Thế nhưng
đằng sau những lợi ích đó con người đang dần làm hủy hoại môi trường sống của mình
như:Vấn đề ấm lên toàn cầu, ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm không khí, ô nhiễm đất…
nhưng trên hết là vấn đề ô nhiễm nguồn nước kể cả nguồn nước ngầm có nguy cơ đe
dọa sự sống còn của chúng ta.
Trong rất nhiều tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước thì nitrate là tác nhân gây ô
nhiễm phổ biến hơn cả trong hoạt động công nghiệp lẫn nông nghiệp. Ô nhiễm nitrate
ảnh hưởng trực tiếp đến sự tồn tại của các sinh vật thủy sinh và sức khỏe con người.
Hiện nay có khá nhiều phương pháp để xử lý nitrate trong nước thải như thẩm thấu
ngược, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học... nhưng trong tất cả các phương
pháp thì phương pháp sinh học mang lại hiệu quả nhiều hơn thông qua việc sữ dụng
các vi sinhh vật để xử lý chúng. Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả làm giảm lượng
nitrate trong nước thải thì việc phân lập và chọn lọc các chủng vi sinh vật có khả năng
khử nitrate mạnh trong nước là điều cần thiết.
Các vi sinh vật khử nitrate phân bố rất nhiều trong đất, bùn và trong nước, chúng
bao gồm vi khuẩn, vi khuẩn cổ và nấm. Gần đây, khả năng khử nitrate có thể có ở
khoảng 150 loài thuộc 50 họ. Trong số các loài này, Pseodomonas, Neisseria, Bacillus
là những vi khuẩn khử nitrate phồ biến nhất và quá trình khử nitrate của chúng có thể
1


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

thực hiện ở điều kiện kỵ khí và bán kỵ khí. Tuy nhiên, Alcaligenes faecalis và
Paracoccus denitrificans được chứng minh là có khả năng thực hiện sự khử nitrate
bằng cách sử dụng đồng thời nitrate và oxy như chất nhận điện tử.

Vì vậy, việc tìm ra chủng có hoạt tính khử nitrate mạnh, thích ứng điều kiện xử lý
khác nhau nhằm xử lý thích hợp cho từng loại nước thải khác nhau là việc làm hết sức
cần thiết. Với ý nghĩa khoa học và thực tiển nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Bước
đầu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn xử lý nitrate trong nước thải”,
đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Vi sinh Trường Đại Học Kỹ Thuật Công
Nghệ TP.HCM.
1.2 Mục đích
Tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính khử nitrate mạnh từ nước thải nhà máy
giấy nhằm ứng dụng xử lý nitrate trong nước thải công nghiệp.
1.3 Nội dung
- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate.
-Thử nghiệm khả năng xử lý nitrate của các chủng này trong phòng thí nghiệm.
1.4 Phạm vi nghiên cứu
Những nghiên cứu hiện thời đang ở giai đoạn đầu sàng lọc tuyển chọn các chủng
có hoạt tính khử nitrate và đánh giá hiệu quả làm giảm nitrate được thực hiện ở phạm
vi phòng thí nghiệm.

2


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu về nước thải và nitrate trong nước thải
2.1.1 Đôi nét về nước thải

Trên toàn cầu, nước là một tài nguyên vô cùng phong phú nhưng nước chỉ hữu

dụng với con người khi nó ở đúng nơi, đúng chỗ, đúng dạng và đạt chất lượng theo
yêu cầu. Hơn 99% trữ lượng nước trên thế giới nằm ở dạng không hữu dụng đối với
đa số các mục đích của con người do độ mặn (nước biển), địa điểm, dạng (băng hà).
2.1.1.1. Phân bố và dạng của nước trên trái đất
Bảng 2.1.Bảng phân bố và dạng của nước trên Trái đất

Địa điểm

Diện tích
(km2)

Tổng thể tích
nước (km3)

% Tổng
lượng
nước

Các đại dương và biển (nước mặn)

361.000.000

1.230.000.000

97.2000

Khí quyển (hơi nước)

510.000.000

12.700

0,0010

-------

1.200

0,0001

130.000.000

4.000.000

0,3100

855.000

123.000

0,0090

28.200.000

28.600.000

2.1500

Sông, rạch
Nước ngầm (đến độ sâu 0,8 km)

Hồ nước ngọt
Tảng băng và băng hà

3


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Con người khai thác các nguồn nước tự nhiên để cung cấp nước cho các nhu cầu
sinh hoạt và sản xuất. Sau khi sử dụng nước bị nhiễm bẩn do chứa nhiều vi trùng và
các chất thải khác. Nếu không được xử lý trước khi thải vào các nguồn nước công
cộng, chúng sẽ làm ô nhiễm môi trường. Vì vậy, nước thải trước khi thải vào sông, hồ
nguồn nước) cần phải được xử lý thích đáng. Mức độ xử lý phụ thuộc vào nồng độ bẩn
của nước thải, khả năng pha loãng giữa nước thải với nước nguồn và các yêu cầu về
mặt vệ sinh, khả năng "tự làm sạch của nguồn nước".
Theo các quy định về bảo vệ môi trường của Việt Nam, ô nhiễm nước là việc đưa
vào các nguồn nước các tác nhân lý, hóa, sinh học và nhiệt không đặc trưng về thành
phần hoặc hàm lượng đối với môi trường ban đầu đến mức có khả năng gây ảnh hưởng
xấu đến sự phát triển bình thường của một loại sinh vật nào đó hoặc thay đổi tính chất
trong lành của môi trường ban đầu.
Theo một định nghĩa khác "Ô nhiễm nước mặt diễn ra khi đưa quá nhiều các tạp
chất, các chất không mong đợi, các tác nhân gây nguy hại vào các nguồn nước, vượt
khỏi khả năng tự làm sạch của các nguồn nước này"

4


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Bảng 2.2. Các đặc điểm lý học, hóa học và sinh học của nước thải và nguồn sinh ra nó
(Wastewater Engineering: treatment, reuse, disposal, 1991)
Đặc điểm

Nguồn

Lý học
Màu

Nước thải sinh hoạt hay công nghiệp, thường do sự phân
hủy của các chất thải hữu cơ.

Mùi

Nước thải công nghiệp, sự phân hủy của nước thải

Chất rắn

Nước cấp, nước thải sinh hoạt và công nghiệp, xói mòn
đất.

Nhiệt

Nước thải sinh hoạt, công nghiệp

Hóa học
Carbohydrate

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp

Dầu, mỡ

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp

Thuốc trừ sâu

Nước thải nông nghiệp

Phenols

Nước thải công nghiệp

5


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Protein

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp

Chất hữu cơ bay

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp

hơi

Các chất nguy

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp

hiểm

Các chất khác

Do sự phân hủy của các chất hữu cơ trong nước thải trong
tự nhiên

Tính kiềm

Chất thải sinh hoạt, nước cấp, nước ngầm

Chlorides

Nước cấp, nước ngầm

Kim loại nặng

Nước thải công nghiệp

Nitrogen

Nước thải sinh hoạt, công nghiệp

pH

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp

Phosphorus

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp, rửa trôi

Sulfur

Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp, nước cấp

6


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Hydrogen sulfide

Sự phân hủy của nước thải sinh hoạt

Methane

Sự phân hủy của nước thải sinh hoạt

Oxygen

Nước cấp, sự trao đổi qua bề mặt tiếp xúc không khí nước

Sinh học
Động vật

Các dòng chảy hở và hệ thống xử lý

Thực vật

Các dòng chảy hở và hệ thống xử lý

Eubacteria

Nước thải sinh hoạt, hệ thống xử lý

Archaebacteria

Nước thải sinh hoạt, hệ thống xử lý

Virus

Nước thải sinh hoạt, hệ thống xử lý

7


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

2.1.1.3 Những chất gây ô nhiễm cần chú trọng và nguyên nhân
Bảng 2.3.Các chất ô nhiễm quan trọng cần chú trọng đến trong quá trình xử

lý nước thải (Wastewater Engineering: Treatment, Diposal, Reuse, 1989)
Chất gây ô nhiễm

Nguyên nhân được xem là quan trọng

Các chất rắn lơ

Tạo nên bùn lắng và môi trường yếm khí khi nước thải

lửng

chưa xử lý được thải vào môi trường. Biểu thị bằng
đơn vị mg/L.

Các chất hữu cơ có

Bao gồm chủ yếu là carbohydrate, protein và chất béo.

thể phân hủy bằng

Thường được đo bằng chỉ tiêu BOD và COD. Nếu thải

con đường sinh học

thẳng vào nguồn nước, quá trình phân hủy sinh học sẽ
làm suy kiệt oxy hòa tan của nguồn nước.

Các mầm bệnh

Các bệnh truyền nhiễm có thể lây nhiễm từ các vi sinh

vật gây bệnh trong nước thải. Thông số quản lý là
MPN (Most Probable Number).

Các dưỡng chất

N và P cần thiết cho sự phát triển của các sinh vật. Khi
được thải vào nguồn nước nó có thể làm gia tăng sự
phát triển của các loài không mong đợi. Khi thải ra với
số lượng lớn trên mặt đất nó có thể gây ô nhiễm nước
ngầm.

8


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Các chất ô nhiễm

Các hợp chất hữu cơ hay vô cơ có khả năng gây ung

nguy hại

thư, biến dị, thai dị dạng hoặc gây độc cấp tính.

Các chất hữu cơ

Không thể xử lý được bằng các biện pháp thông

khó phân hủy

thường. Ví dụ các nông dược, phenols...

Kim loại nặng

Có trong nước thải thương mại và công nghiệp và cần
loại bỏ khi tái sử dụng nước thải. Một số ion kim loại
ức chế các quá trình xử lý sinh học

Chất vô cơ hòa tan

Hạn chế việc sử dụng nước cho các mục đích nông
nghiệp, công nghiệp

Nhiệt năng

Làm giảm khả năng bão hòa oxy trong nước và thúc
đẩy sự phát triển của thủy sinh vật

Ion hydrogen

Có khả năng gây nguy hại cho thủy sinh vật

9


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

2.1.2 Giới thiệu về nitrate trong nước thải
Cấu tạo hóa học:
Nitrate là muối của acid nitrite. Trong muối nitrat, ion NO3- có cấu tạo hình tam
giác đều với góc ONO bằng 120 độ và độ dài liên kết N-O bằng 1,218 Angtron.

Hình 2.1: Cấu tạo hóa học nitrate
Đặc điểm về muối nitrate: Ion NO3- không có màu nên các muối nitrat của những
cation không màu đều không có màu. Hầu hết các muối nitrate đều dễ tan trong nước.
Một vài muối hút ẩm trong không khí như NaNO3 và NH4NO3. Muối nitrate của những
kim loại hóa trị hai và hóa trị ba thường ở dạng hydrat. Muối nitrate khan của kim loại
kiềm khá bền với nhiệt ( chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 380 - 500 độ C).
Còn các nitrate của kim loại khác dễ phân hủy khi đun nóng. Độ bền nhiệt của muối
nitrate phụ thuộc vào bản chất cation kim loại.
Nitrate có mặt trong môi trường qua các hoạt động cộng nghiệp, nông nghiệp…
chính vì lẽ đó chúng cũng có mặt trong nước.Trong nông nghiệp: Nitrate đi vào nguồn
nước qua việc bón phân, phân bón gốc nitrate sử dụng phổ biến nhất là NaNO3 và
NH4NO3. Sau khi bón phân, thực vật lấy đi một phần lượng nitơ được bón vào, cụ thể
là 25-30%. Dư lượng còn lại di vào trong nước ngầm và nước mặt do các hợp chất
nitrate thường có thể tan trong nước.

10


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

2.1.3 Nguồn gốc hình thành nitrate
Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn không thể thiếu trong vòng tuần

hoàn của nitơ trong tự nhiên. Nitrate hình thành qua quá trình nitrate hóa

Hình 2.2: Chu trình nitơ
(Nguồn />Quá trình nitrate hóa là quá trình oxy hóa sinh hóa nitơ của các muối amon đầu
tiên thành nitrite và sau đó thành nitrate trong điều kiện thích ứng (có oxy và nhiệt độ
trên 4oC) nhờ hoạt động của các vi sinh vật.
Khi bón các phân N hữu cơ như phân bánh dầu, phân cá, bèo hoa dâu...chúng ta
cung cấp cho đất lượng protein khá cao. Các chất này sẽ bị khoáng hóa nhanh chóng và
phóng thích NH4+.
11


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Phân hóa học chứa N hữu cơ như urea, khi bón vào đất cũng cần có vi sinh vật
phân giải thành ammonium mới được cây sử dụng. Do vi sinh vật tiết ra phân hóa tố
urease để thủy phân urea, để sau cùng cho ra NH3 theo phản ứng:
CO(NH2)2 + H2O  (NH4)2CO2  2NH3 + CO2
Vi khuẩn tham gia quá trình nitrate hóa gồm có 2 nhóm , trong đó có 7 nhóm vi
khuẩn tự dưỡng:


Vi khuẩn nitrite: oxy hóa amoniac thành nitrite hoàn thành giai đoạn thứ nhất.



Vi khuẩn nitrate: oxy hóa nitrite thành nitrate, hoàn thành giai đoạn thứ hai.

+ Nhóm vi khuẩn ôxít hoá NH4 thành NO2:
Nhóm này do 5 chi vi khuẩn đảm nhiệm:
 Vi khuẩn hình (que) bầu dục: Nitrosomonas
 Vi khuẩn hình cầu: Nitrosococcus
 Vi khuẩn xoắn: Nitrosospira
 Vi khuẩn có khuẩn lạc nhầy nhụa và có nang : Nitrosococystis
 Vi khẩn có khuẩn lạc nhầy nhụa, không có nang: Nitrosogcola
+ Nhóm vi khuẩn ôxít hoá nitrite thành nitrate
 Vi khuẩn không có zoogloea: Nitrobacter
 Vi khuẩn có zoogloea: Nitrocystis
Trong bảy chi vi khuẩn trên đây, Nitrosomonas và Nitrobacter là thường gặp nhất.
Ngoài các vi khuẩn trên, các vi sinh vật dị dưỡng như Streptomyces, Pseudomonas,
12


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Aspergillus... cũng có tham gia quá trình chuyển hóa N này nhưng không quan trọng
lắm.

Các phản ứng được biểu diễn qua các phương trình sau:
Nitrosomonas

2NH3 +

3O2 -------------

2HNO2 + 2H2O

Nitrobacter

2HNO2 + O2

2HNO3

------------

Hoặc
(NH4)2CO3 + 3O2 = 2HNO2 + CO2 + 3H2O

2HNO2 + O2 = 2 HNO3
Nếu cây cối không kịp hấp thụ hết lượng nitrate này thì nước mưa và nước tưới sẽ
làm cho nó ngấm vào lòng đất, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm.
Tuy nhiên con người lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ô nhiễm nitrate lớn nhất
thông qua các hoạt động nông nghiệp như:


Sử dụng phân bón hóa học hoặc hữu cơ



Chăn nuôi



Thải nước và rác không qua xử lý



Hệ thống bể phốt

13


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

2.1.4 Quá trình phản nitrate (Denitrification)
Con đường chuyển hoá của nitrate qua các quá trình đồng hoá - dị hoá để trở về
các dạng như N2, NO, N2O được gọi là quá trình phản nitrate. Trong quá trình khử
nitrate thì nitrate bị khử thành nitrite, oxit nitơ, amoniac, hoặc nitơ nguyên tố. Thông
thường nhất , các nitrate được chuyển đổi thành các phần tử nitơ tinh khiết.
Quá trình khử sinh học của nitrate đến khí nitơ (N2) thực hiện bởi những vi khuẩn
dị dưỡng tùy ý. Những vi khuẩn này cần nguồn cacbon như là nguồn thức ăn, chúng có
thể sử dụng nguồn oxy hòa tan trong nước hoặc lấy từ nitrate. Những đại diện của vi
khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình này là

Pseudomonas,

Stenotrophomonas, Escherichia. Phần lớn những vi khuẩn khử nitrate chỉ khử nitrate
đến nitrite, các loài khác lại khử nitrite đến amoniac.
Vi khuẩn khử nitrate phần lớn là những vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, chúng sử dụng
oxy hòa tan hoặc nitrate như là nguồn oxi cho quá trình trao đổi chất và oxy hóa các
chất hữu cơ.Tuy nhiên sự khử nitrate chỉ xảy ra khi có sự thiếu hụt oxy và khi đó
nitrate trở thành nguồn cung cấp oxy chính cho các vi sinh vật .Nếu trong môi trường
tồn tại oxy hòa tan và nitrate thì vi khuẩn sẽ sử dụng oxy hòa tan trước. Điều này sẽ
dẫn đến lượng nitrate bị khử sẽ thấp hơn, do sự khử nitrate chỉ xảy ra dưới điều kiện

yếm khí hoặc thiếu oxi ( khi nồng độ oxy hòa tan ít hơn 0.5mg/L , lý tưởng là dưới
0.2mg/l). Khi đó vi khuẩn phá vỡ nitrate (NO3- ) thành oxi (O2), lượng nitrate sẽ bị khử
về dạng N2O và lần lượt thành khí nitơ, và thoát ra khí quyển do độ hòa tan thấp.
Phương trình mô tả quá trình khử nitrate như sau:
6 NO3- + 5 CH3OH 

3N2+ 5 CO2+ 7 H2O + 6 OH-

Trong phương trình trên CH3OH đóng vai trò là nguồn cacbon cho quá trình khử
nitrate xảy ra, pH tối ưu cho quá trình khử nitrate là từ 7.0 - 8.5, quá trình khử nitrate là
một quá trình làm tăng độ kiềm, làm pH môi trường tăng cao.
14


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

2.1.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử nitrate
Những điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả khử nitrate là :
 Nồng độ nitrate
 Điều kiện yếm khí
 Sự hiện diện của chất hữu cơ
 pH môi trường
 Nhiệt độ ( chỉ từ 5oC-30oC)
 Độ kiềm
 Kim loại dạng vết
Ảnh hưởng của nguồn carbon :Tỉ lệ tăng trưởng cao nhất là khi xử dụng nguồn
cacbon methanol hoặc acid acetic, thấp hơn khi sử dụng nước thải thô và thấp nhất là
khi sử dụng nguồn carbon nội sinh ở nhiệt độ thấp.

Ảnh hưởng pH :Sự gia tăng oxít nitơ (NO) xuất hiện ở pH < 7, nếu pH > 7,3 thì
dinitơ oxyt (N2O) có xu hướng bị tái hấp thụ và tiếp theo bị khử trong quá trình phản
nitrate trở thành nitơ phân tử.
Điều kiện yếm khí :Quá trình phản nitrate đến nitơ phân tử chỉ xảy ra trong điều
kiện kỵ khí hay kỵ khí một phần, nên quá trình này thường gặp trong đất yếm khí và
trong đáy sâu của các hồ, các biển...không có oxy hoặc giàu các chất hữu cơ đang bị
phân huỷ.
2.1.5 Những tác động tích cực và tiêu cực của nitrate
2.1.5.1Tích cực
Hơn 90% nitơ được hấp thụ ở thực vật là ở dạng nitrate, nitơ cần thiết cho sự tăng
trưởng và sinh sản cho cả thực vật và động vật, là thành phần cơ bản của protein, khi
động vật ăn thực vật, thì các dạng nitơ trong thực vật có tác động quan trọng trên sự
15


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

tăng trưởng và sinh sản của chúng. Do vậy, việc cung cấp đầy đủ lượng nitrate cần
thiết có lợi cho sự tăng trưởng ở thực vật ( Marshall Christy and George S. Smith).
Trong nông nghiệp : Nitrate được sử dụng chủ yếu làm phân bón.
Trong công nghiệp : Nitrate được dùng làm thủy tinh và thuốc nổ và tham gia
trong sản xuất nhiều hóa chất khác.
Trong thực phẩm nitrate được sử dụng rộng rãi để tăng cường màu sắc và kéo dài
tuổi thọ của các loại thịt chế biến (Human Health Fact Sheet, August 2005).
Tất cả các nhóm vi sinh vật, nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn đều cần N để sinh trưởng và
sinh sản. Chúng cũng sữ dụng nitơ dạng nitrate hoặc ammoni hoặc cả hai dạng
Nitrate còn đóng vai trò là chất nhận điện tử trong điều kiện thiếu oxy ở ở vi
khuẩn ky khí tùy nghi và một số loài vi khuẩn ky khí.

Những nghiên cứu của Abir U. Igamberdiev và Robert D. Hill , 2004, chứng minh
nitrate tham gia vào duy trì năng lượng ở tế bào thực vật trong điều kiện thiếu oxy.

Hình 2.3: Vai trò Nitrate, NO, Haemoglobin trong duy trì chuổi chuyền điện tử, duy trì
năng lượng giúp thực vật thích nghi trong điều kiện thiếu oxi
( />16


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

2.1.5.2 Tác hại nitrate
Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới WHO thì hàm lượng NO3 - trong nước
ngầm sử dụng cho cấp nước sinh hoạt ở hầu hết các nước phát triển đang tăng lên.
NO3- khi vào cơ thể người tham gia phản ứng khử ở dạ dày và đường ruột do tác
dụng của các men tiêu hoá sinh ra NO2-. Nitrite sinh ra phản ứng với Hemoglobin tạo
thành Methaemoglobinemia làm mất khả năng vận chuyển oxi của Hemoglobin. Thông
thường Hemoglobin chứa Fe2+, ion này có khả năng liên kết với oxi. Khi có mặt NO2nó sẽ chuyển hoá Fe2+ làm cho hồng cầu không làm được nhiệm vụ chuyển tải O2. Nếu
duy trì lâu sẽ dẫn tới tử vong.
4HbFe2+ O2 + 4 NO2- + 2 H2O ----> 2 HbFe3+ + OH- + 4 NO3- + O2

Sự tạo thành methaemoglobinemia đặc biệt thấy rõ ở trẻ em. Trẻ em mắc chứng
bệnh này thường xanh xao ( bệnh Blue baby ) và dễ bị đe doạ đến cuộc sống đặc biệt là
trẻ dưới 6 tháng tuổi.

Hình 2.4:Hội chứng trẻ xanh
Ngoài ra, NO2- trong cơ thể dễ tác động với các amin tạo thành nitrosamine một
hợp chất tiền gây ung thư.
17

SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Các hợp chất nitroso được tạo thành từ amin bậc hai và axit nitrơ (HNO2) có thể trở
nên bền vững hơn nhờ tách loại proton để trở thành nitrosamine như sau:

Các amin bậc ba trong môi trường axit yếu ở pH = 3- 6 với sự có mặt của ion
nitrite chúng dễ dàng phân huỷ thành anđehit và amin bậc hai. Sau đó amin bậc hai tiếp
tục chuyển thành nitrosamin.
Các amin bậc hai thường xuất hiện trong quá trình nấu rán thực phẩm giàu protein
hay quá trình lên men. Nitrite có trong rau quả vào khoảng 0,05 - 2 mg/kg. Khi dùng
thực phẩm hay nguồn nước chứa hàm lượng nitrite vượt quá giới hạn cho phép sẽ gây
ngộ độc, ở liều lượng cao có thể gây chết người.
Do nitrate và nitrite có độc tính cao như vậy nên tổ chức y tế thế giới và các quốc
gia đều có những quy định về hàm lượng nitrat và nitrite trong các rau quả, trong nước
uống. Quy định về hàm lượng nitrate và nitrite trong trong nước uống của một số quốc
gia, tổ chức như sau

18


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Bảng 2.4.Tiêu chuẩn về hàm lượng nitrate và nitrite trong nước uống theo các tổ chức
( /2-2620098-43-19PM.png)

STT

Tổ chức

Hàm lượng NO3-(mg/l) Hàm lượng NO2-(mg/l)

1

WHO

45

..

2

TCVN 5501-91

50

0,1

3

Canada

10

1

4

EEC

50

0,1

5

CHLB Đức

50

0,1

2.2 Giới thiệu về vi sinh vật xử lý nitrate
Vi khuẩn khử nitrate đã được nghiên cứu khá rộng do bởi chúng có sự tham gia
vào chu trình chuyển hóa nitơ.
2.2.1 Vi khuẩn Paracoccus species
Paracoccus là cầu khuẩn, Gram âm , không di động , không sinh bào tử, ky khí,
có hoạt tính khử nitrate, 14 loài thuộc chi này đã được xác định và chúng có hình thái
tương tự nhau như: P. alcaliphilus, P. aminophilus, P. denitrificans, P.solventivorans
và P. versutus

19


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Hình 2.5.Vi khuẩn Paracoccus ()
2.2.2 Rhodobacter sphaeroides
Vi khuẩn Rhodobacter sphaeroides thuộc nhóm thuộc chi Proteobacteria. Nhóm
này có khả năng phát triển trong các điều kiện khác nhau.Vi dụ Rhodobacter
sphaeroides

có thể nhận năng lượng từ nhiều nguồn khác nhau: quang hợp,

lithotrophyl , hố hấp hiếu khí và kỵ khí. Chúng có thể cố định phân tử nitơ, tổng hợp
các tetrapyrole quan trong, dịp lục tố, heme, và các vitamin B12.

20


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Hình 2.6. Ảnh hiển vi điện tử Rhodobacter sphaeroides (The University of
Texas - Houston Health Science CenterDepartment of Microbiology &
Molecular Genetics ( />2.2.3 Thiomicrospira denitrificans
Là vi khuẩn hóa tự dưỡng phát triển nhờ việc cố định CO2 nhờ vào năng lượng
giải phóng bởi quá trình oxi hóa. Chúng có khả năng sử dụng H2S, S2O32-,So…và làm
giảm Fe2+, pyrite, NH3, NO2 và H2 (Kuenen và Bos, 1989).Chúng có thể sử dụng O2,
NO3- làm chất nhận điện tử ( Kelly và Wood, 2001)

21

SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Hình 2.7:Ảnh hiển vi điện tử vi khuẩn Thiomicrospira denitrificans
/>2.2.4 Thiobacillus denitrificans
Chúng phân bố rộng rãi và là loài vi khuẩn thuộc nhóm hóa tự dưỡng. Chúng có
khã năng oxi hóa các hợp chất sulfur vô cơ như: Hydrosulfid và Thiosulfate đến khử
nitơ. Những chất nhận điện tử mà các Thiobacillus denitrificans có thể sử dụng là
những khoáng ít hòa tan chứa những ion khử hoặc sulfur, như pyrite (FeS2) và FeS.
Các chủng vi khuẩn này được sử dụng trong hệ thống xử lý nước nhằm loại bỏ nitrate,
sự khử nitrate của Thiobacillus denitrificans phụ thuộc Fe2+ oxi hóa dưới điều kiện
yếm khí.

22


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

.

Hình 2.8:Thiobacillus denitrificans
Photo credit: T.E. Letain, S.I. Martin, H.R. Beller
( />2.3 Cơ chế sinh hóa của quá trình khử nitrate
Dưới tác động của các vi sinh vật khử nitrate, nitrate lần lượt bị khử các dạng sau:
N03-

N02-

NO

N2O

N2

Một số vi khuẩn như Paracoccus species, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas
aeruginosa, and Rhodobacter sphaeroides... có thể khử nitrate đến khí nitơ.
Phương trình khử sinh học nitrate đến khí nitơ:
Vi khuẩn khử nitrate
6 NO3- + 5 CH3OH

3 N2 + 5 CO2 + 7 H2O + 6 OH-

Quá trình khử nitrate về dạng khí nitơ bởi các chủng vi khuẩn trong giai đoạn này
không đòi hỏi sự cung cấp oxy, nó là một quá trình xử lý kỵ khí, nitơ tạo ra sẽ giải
phóng vào không khí. Nguồn carbon cũng được cung cấp để đẩy nhanh quá trình.

23


SVTH: Nguyễn Thanh Nam

GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt

Quá trình này được điều hòa chặt chẽ bởi vi sinh vật vì một số sản phẩm của sự
khử nitrate đến khí nitơ là độc đối với sự trao đổi chất. Điều này có thể giải thích dựa
số lượng lớn các gen tham gia vào quá trình này và số lượng hạn chế số vi khuẩn có

khả năng khử nitrate.
Hệ thống chuyển điện tử nitrate trên màng tế bào có vai trò như một nơi oxi hóa
NADH và có nhiều vai trò khác trong sự trao đổi chất. Sự khử nitrate nhận vào 8 điện
tử từ quá trình trao đỗi chất, các điện tử được thêm vào để hình thành khí N2 so với
chỉ hai điện tử đối với sự khử nitrate đơn độc :
N03- + 2e- + 2H+

N02- + H20

Sự cho điện tử từ NADH qua phức hợp cytochrome b/c1 và cuối cùng đến nitơ oxit
reductase qua con đường khác để bơm proton qua màng . Hình 2.9 minh họa cho sự
sắp xếp đặt biệt của các enzyme khử nitrate trên màng tế bào.

Hình 2.9: Sự khử nitrate trên màng, NADH dehydrogenase complex (DH), nitrate reductase
(NAR), nitrite reductase (NIR), NO reductase (NOR), N2O reductase (N2OR)
( />24