Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn bacillus n6 1 đối kháng edwardsiella ictaluri gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS
N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện
MSSV: 107111217

: MAI NGỌC TUYỀN
Lớp: 07DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2011


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nuôi trồng thủy sản là một trong những thế mạnh của Việt Nam. Tính đến thời
điểm này, kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt hơn 3 tỷ USD với trên

843.000 tấn thủy sản các loại. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn dự báo, giá trị
xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đến hết quý IV năm 2010 nhiều khả năng sẽ đạt mức
4,74 tỷ USD, trong đó riêng kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ chiếm ưu thế đạt khoảng
1,38 tỷ USD. Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng thì luôn đi kèm theo sự phát sinh của
dịch bệnh. Một trong những bệnh quan trọng trên cá tra nuôi là bệnh gan thận mủ, đã
có một số công trình nghiên cứu về bệnh này. Và nguyên nhân gây bệnh được xác định
chủ yếu do vi khuẩn E. ictaluri (Crumlish và ctv, 2002). Khi bệnh xảy ra, nông dân
thường lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để phòng bệnh và điều trị cho cá
việc này đã tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (Schwarz và ctv., 2001;
Akinbowale và ctv., 2006). Để thay thế dần dần phương pháp phòng bệnh truyền
thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học như sử dụng vaccine,
các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh
học), đặc biệt là phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) ngày
càng được ưa chuộng. Việc sử dụng vi sinh vật thay thế kháng sinh để chữa bệnh đã trở
thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản.
Với ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Khảo sát
một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh
gan thận mủ trên cá tra”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Phòng
Sinh học thực nghiệm – Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II.
1.2. Tình hình nghiên cứu
Trong năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã tiến hành phân
lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Nguồn vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa, nước, bùn
1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

ao nuôi cá tra và nguồn vi sinh từ ngân hàng vi sinh. Đã tiến hành 5 đợt thu mẫu với
tổng số mẫu là 284 mẫu (hệ tiêu hóa, nước và bùn), số khuẩn lạc đã sàng lọc qua AHLs
là 592, vi khuẩn lactic là 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus là 165 khuẩn lạc
Một số nghiên cứu khác về các vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi
khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Sàng lọc những vi khuẩn có đặc tính đối
kháng vi khuẩn gây bệnh vẫn là cách tiếp cận được sử dụng chủ yếu trong việc phân
lập vi khuẩn probiotic. Trong quá trình sàng lọc này, đa số các nhà nghiên cứu áp dụng
phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro (Spangaard và ctv., 2001; Chythanya và
ctv., 2002; Hjelm và ctv., 2004). Hiện nay, có bốn phương pháp thường được sử dụng
để sàng lọc các chủng vi khuẩn tiết ra các hợp chất ức chế in vitro: phương pháp lớp
kép (Dopazo và ctv., 1988), phương pháp đục lỗ trên mặt thạch, phương pháp cấy ria
vuông góc, và phương pháp đĩa giấy khuếch tán. Tất cả các phương pháp trên đều dựa
trên một nguyên tắc là khi một chủng vi khuẩn sản xuất ra một hợp chất ngoại bào có
tính chất ức chế một chủng vi khuẩn khác, hoạt tính này sẽ được thể hiện thông qua
việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn khác trong môi trường agar.
1.3. Mục đích nghiên cứu
Làm cơ sở để tạo ra những sản phẩm probiotic phù hợp có đặc tính đối kháng
với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E. ictaluri
1.4. Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối
kháng với E.ictaluri của Bacillus N6.1
 Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật
 Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone
 Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E. ictaluri
bằng phương pháp nuôi chung (co-culture)

2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG II: TỒNG QUAN
2.1. Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long
Trong các năm gần đây, nghề nuôi thủy sản trong nước đã phát triển nhanh và
có nhiều nổi bật. Hiện nay ở Đồng bằng sông Cửu Long, mặc dù diện tích nuôi cá tra
không lớn (năm 2009 là 5540 ha) nhưng sản lượng hàng năm cho trên 1.000.000 tấn.
Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra ở vùng ĐBSCL có nhiều biến
động. Đến hết tháng 11/2010, tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ
con cá giống, diện tích thả nuôi 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao năng
suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt
95,1%/năm. Sản lượng cá xuất khẩu đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3
tỉ USD, giảm 2,8% về lượng, 7,8% về kim ngạch xuất khẩu so cùng kỳ năm 2009. Dự
kiến cả năm xuất khẩu đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,4 tỉ USD.
Đi sâu vào hình thức và mô hình nuôi, nghề nuôi cá tra có sự chuyển đổi từ mô
hình nước chảy trong lồng bè, đăng quần trên sông vùng thượng nguồn sông Tiền và
sông Hậu sang mô hình nuôi ao dọc cồn bãi ven sông và càng dịch chuyển về phía hạ
lưu với chất lượng cá tốt hơn. Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra đang thể
hiện sự thiếu bền vững, trong đó có nhiều nguyên nhân chủ yếu là:
 Việc phát triển cá tra quá nhanh trong những năm vừa qua, đôi khi vượt quá quy
hoạch của ngành, vượt ngoài sự quản lý của nhà nước dẫn đến các sự cạnh tranh không
lành mạnh nhất là việc tiêu thụ sản phẩm trên thị trường quốc tế.
 Sự không ổn định về mặt cung cầu do thiếu cơ chế liên kết phối hợp giữa các
chuổi trong hệ thống đã dẫn đến các hệ lụy về biến động giá cả trên thị trường, chất
lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường, sự phá sản của người nuôi .
 Với số lượng lên đến trên 3 tỉ con giống hàng năm nhưng việc quản lý đàn cá bố

mẹ của các trại sản xuất trong thời gian dài vừa qua chưa thật sự được quan tâm về mặt
quản lý và hổ trợ về mặt kỹ thuật. Hệ quả dẫn đến chất lượng con giống cá tra đang có

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

biểu hiện giảm sút, tốc độ tăng trưởng chậm hơn, dể nhiễm bệnh trong quá trình ương
nuôi, tỉ lệ hao hụt cao khi nuôi.
 Bệnh cá tra nuôi là một trong những nguyên nhân gây hao hụt cho người nuôi.
Trong đó các loại bệnh gan thận mủ, bệnh trắng gan, trắng mang là những bệnh gây
thiệt hại to lớn cho người nuôi có thể thiệt hại đến 20 – 30% sản lượng ao nuôi. Ngoài
ra các bệnh nội và ngoại ký sinh cũng là tác nhân gây tổn thất cho ao nuôi.
 Vấn đề ảnh hưởng đến môi trường nuôi cũng như chất lượng môi trường nước
cấp cho ao nuôi cũng là một thách thức đối với sự ổn định và bền vững trong nghề nuôi
cá tra. Việc giải quyết chất thải và nước thải từ ao nuôi cá tra là thách thức lớn, đỏi hỏi
phải có những giải pháp công nghệ và kỹ thuật để đảm bảo sự bền vững về môi trường.
 Vần đề thị trường tiêu thụ cá tra, tương tự với sản phẩm tôm nuôi, chất lượng
sản phẩm chế biến đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm và đáp ứng yêu cầu truy
xuất nguồn gốc của nhà nhập khẩu cũng được đặt ra đối với việc sản xuất, chế biến,
bảo quản và xuất khẩu sản phẩm cá tra.(Oanh Lê - Nguồn viện nghiên cứu nuôi trồng
thủy sản II)

Hình 2.1: Thu hoạch cá tra ở ĐBSCL
4

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Edwardsiella spp. và bệnh gan thận mủ trên cá tra
2.2.1. Vi khuẩn Edwardsiella spp.
2.2.1.1. Phân loại
Phân loại khoa học, Edwardsiella thuộc:
Ngành: Proteobacteria.
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Edwardsiella thường gặp hai loài gây bệnh là: E.tarda và E.ictaluri. E.tarda là
tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn. E. ictaluri gây
bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng gan, thận, tụy của cá không vảy, gây
bệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ, là tác nhân gây bệnh gan thận mủ
trên cá tra ở Việt Nam. Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá
sấu, cá… và một số động vật thủy sản khác. Ở Việt Nam đã phân lập được E.tarda từ
cá trê giống; E.ictaluri từ cá tra, cá basa…. Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá
hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, ít xuất hiện hơn ở cá có kích cỡ trên 15cm, tỷ
lệ tử vong của cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100%. Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào
mùa xuân, mùa thu và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè.

A

B

Hình 2.2: Vi khuẩn E.ictaluri (hình A) và cá tra bị bệnh do nhiễm

Edwardsiella (hình B)
5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

2.2.1.2. Đặc điểm sinh hóa
Theo

Hawke

và

ctv.

(1981)

Edwardsiella

ictaluri,

là

loài

thuộc

Enterobacteriacea, Gram âm, hình que, ngắn, kích thước 0.75x1.5-2.5μm. Di động yếu
ở 25-300C, không di động khi nhiệt độ cao hơn, catalase dương tính, cytochrome
oxidase âm tính và lên men glucose (Shott, 1989). Không sinh ra H2S và Indole âm
tính. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI (36-48 giờ
tại 28-300C).
Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (ở tất
cả các giai đoạn phát triển). Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về
kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g ( Thanh Dung và ctv., 2004). Theo
Ferguson và ctv (2001), bệnh này được ghi nhận xuất hiện ở ĐBSCL vào cuối năm
1998 và có tên là BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius).
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được phân lập trên cá tra nuôi bè ở Việt Nam,
với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan (Thanh Dung và ctv., 2005)
2.2.2. Bệnh gan thận mủ trên cá tra
2.2.2.1. Lịch sử phát hiện
Bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân
gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stirling phối
hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp. (Ferguson và ctv., 2001). Đến năm
2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra
là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv., 2002). E. ictaluri được báo cáo
đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus (Hawke, 1979). E. ictaluri gây bệnh
nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC
(Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá nheo Mỹ (Austin
và Austin, 1999).
Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ. Bệnh xảy
ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống
6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

(USDA/APHIS, 2003). Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt
độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker và ctv., 2004). Cá bị bệnh ESC thường
giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng.
Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da. Cá nhiễm bệnh thường

Các bệnh thường gặp ở cá tra giống và thịt

lồi mắt và bụng trương to.

Bệnh do vi khuẩn
Bệnh xuất huyết:
Aeromonas hydrophila,
Clostridium botulinum,
Pseudomonas spp., Edwardsiella
tarda: mass mortality: 70-80%

Edwardsiella ichtaluri gây bệnh
gan thận mủ
Tỉ lệ chết cao: 80-100%
Bệnh do ký sinh trùng:
Cryptobia spp., Ichthyophthyrius
multifiliis, Trichodina, Epistylis.
----- tỉ lệ chết: 15-20%

Hình 2.3: Các bệnh thường xuyên xuất hiện trên cá tra qua các giai đoạn nuôi (Lý Thị
Thanh Loan và ctv., 2007).
2.2.2.2. Dấu hiệu bệnh lý

Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 35mm. Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và làm
cho da bị mất sắc tố. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị rách, gẫy.
Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí có
mùi hôi. Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh. Bệnh xuất hiện khi
7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

chất lượng nước trong môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày. Nhiệt độ thích hợp để
phát triển khoảng 300C.
2.2.2.3. Một số nghiên cứu về biện pháp phòng bệnh gan thận mủ
Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng
bệnh do E. ictaluri gây ra trên cá da trơn. Shoemaker và ctv. (1999) nghiên cứu ảnh
hưởng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2
X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33). Cá nheo Mỹ
(Ictalurus punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi
khác nhau (từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi). Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã
thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày
tuổi. Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 –
77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9%. Ba năm sau
đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in vivo đối với việc sử dụng các
loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ,
bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút. Kết quả cho thấy phương pháp gây
miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker và ctv.,
2002).
Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát

triển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào
thức ăn để phòng bệnh E. ictaluri ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus).
Shelby và ctv. (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus
sp. và Enterococcus sp. (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ
(Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vòng 5-8 tuần. Sau đó tiến hành đo các chỉ
tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch như protein
huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement. Các số liệu về vi sinh cho thấy
hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sung trong thời
gian bảo quản khoảng 4 tuần. Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự khác biệt nào về
8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sau thời gian cho ăn
thức ăn có bổ sung probiotic.
Aboagye và ctv. (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh
Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm với
Edwardsiella ictaluri. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung
Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây
nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so
với nghiệm thức đối chứng (80%).
Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai
peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh
trên cá, trong đó có E. ictaluri (Kjuul và ctv., 1999). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µm. Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến
có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, và có khả năng tăng

cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E. ictaluri (Kelly và ctv.,
1993).
Prebiotic là những hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh
trưởng và hoạt tính của hệ vi khuẩn có lợi hiện diện trong hệ tiêu hóa của vật chủ
(Delzenne & Roberfroid, 1994). Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic
(gọi là synbiotic). Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng phổ biến như là
prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, trong số đó bao gồm: Inulin, fructoseoligosaccharide, transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomaltooligosaccharide (Li và ctv., 2009). Hiệu quả về dinh dưỡng và sức khỏe của một số
oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross và ctv., 2003; Li & Gatlin,
2005; Pryor và ctv., 2003). Isomalto-oligosaccharide ở nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp
với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 cfu/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tôm thẻ
chân trắng (Penaeus vannamei) đã giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng
cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề kháng đối với virus đốm trắng, thông qua
9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li và ctv., 2009).
Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã
được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối
với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker và
ctv., 2007).
2.3. Tổng quan về probiotic trong nuôi trồng thủy sản
2.3.1. Định nghĩa probiotic
Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa là “cho sự
sống”. Qua thời gian cùng với sự phát triển của khoa học và sự hiểu biết của nhân loại
thuật ngữ này được định nghĩa nhiều lần.

Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy
sự phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật. Vào năm 1974, Parker đã định nghĩa
probiotic dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và
những cơ chất có lợi cho động vật có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột”. Đến
năm 1989, Fuller đã mở rộng định nghĩa về probiotic: “probiotic là sinh vật sống được
cung cấp dưới dạng thức ăn cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường
ruột”. Havenaar và Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một
hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng
cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật bản địa”. Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic
là những sinh vật sống cung cấp dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật
chủ”.
FAO/WHO (2002), Reid và cộng sự (2003) lại định nghĩa “probiotic là những vi
sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật
chủ”
Vào năm 2003, Jean Fioramonti và cộng sự đã định nghĩa probiotic một cách
ngắn gọn nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh
hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”.
10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn,
vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ yếu
là Lactobacillus và dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng nhiều
gồm cả vi khuẩn gram âm, gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào, phạm
vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được

ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản.
Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi
trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ. Những
vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu thụ thức
ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết quả của
mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy sản.
Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới hạn
trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả môi
trường nước xung quanh vật chủ. Do vậy, Verschuere và cộng sự (2000) đã đề xuất
một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi
trồng thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được thêm vào có lợi cho vật chủ
bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật xung
quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường chống
chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”.
2.3.2. Đặc điểm chung của probiotic
 Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc
hình thành khuẩn lạc trong ruột non.
 Không gây hại cho vật chủ.
 Probiotic phải tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ.
 Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với các sinh vật gây
bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử
dụng được).
11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

 Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh
2.3.3. Các cơ chế tác động của probiotic
Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp, những ảnh hưởng có hại của
tác nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc
trong suốt quá trình nhiễm bệnh. Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi
khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau. Đa
số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều
nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic. Nhìn chung, probiotic có các cơ
chế tác động sau:
2.3.3.1. Sản sinh ra các hợp chất ức chế
Kháng khuẩn là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên. Vì vậy, sự tương tác
giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh
vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh.
Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có
khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng
hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos, 1981). Những hợp chất này bao
gồm: bacteriocin, siderphore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu
cơ. Vi khuẩn sinh acid lactic tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác.
Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của
một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng.
Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển
có khả năng ức chế Vibrio sp. Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) mô tả một nghiên
cứu sản sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể từ đó nhiều nghiên cứu tiếp theo, theo
hướng sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học. Nogami và Maeda
(1992), Nogami và ctv (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi
khuẩn Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh
Portunus trituberculatus, đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương ấu
12

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

trùng. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi
khuẩn V. angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda
limanda. Sử dụng V. alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường khả
năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các
trại nuôi ở Ecuador. Gần đây một chủng vi khuẩn nước mặn, Pseudomonas I2 được
phân lập từ cửa sông, có khả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên tôm.
Hợp chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan
trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme (Chythanya và cộng sự,
2002).
2.3.3.2. Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có
Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng một
vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi trường
nuôi thủy sản.
Minh chứng điển hình cho tác động này là những vi khuẩn có khả năng sinh
siderophore. Tất cả vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng, siderophore là chất có trọng
lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với ion sắt. Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa
thành dạng dễ sử dụng, do đó nó là một công cụ thu lượm sắt hiệu quả.
Các chủng vi khuẩn vô hại có thể sản xuất siderophore được sử dụng như
probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính gây bệnh có liên quan đến
việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt
ở giai đoạn cần thiết (Verchuere và ctv., 2000). Chủng Vibrio E có thể cải thiện khả
năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ở ấu trùng cá
bơn. Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng, Vibrio E có thể phát triển trong môi trường đã
bị tách hết sắt trong khi Vibrio P thì không. Hơn nữa, cá bơn bột được cho ăn rotifer
được làm giàu chất siderophore deferoxamine của Vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao

hơn sau khi gây nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng (Gatesoupe, 1997). Từ những
kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết
13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

luận rằng hiệu quả probiotic của Vibrio E có thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy
phân tử sắt với tác nhân gây bệnh.
2.3.3.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại
Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu
mô ruột và trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác
nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian,
oxy và sự sản sinh các cơ chất kháng khuẩn. Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính
của vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị
trí gắn dựa trên các cấu trúc chuyên biệt. Những đặc tính này là một thế mạnh cạnh
tranh quan trọng giúp duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật.
Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành khuẩn lạc của vi sinh vật có thể phụ
thuộc vào:
 Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ cơ thể, enzyme, đặc tính do kháng di
truyền. Ví dụ, vi khuẩn có thể theo nguồn nước và thực phẩm đến miệng và đóng góp
vào quá trình dinh dưỡng, ở đó một số chủng được giữ lại trở thành quần cư của vi
khuẩn đường ruột. Những chủng còn lại bị tiêu diệt thông qua quá trình tiêu hoá và bị
loại thải thông qua quá trình bài tiết. Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn trong
đường ruột còn có thể bị ức chế do hợp chất kháng khuẩn tiết ra từ vật chủ.
 Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng của các hợp chất
kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, sự hình thành NH3, diacetyl, và

sự biến đổi pH do sản sinh các acid hữu cơ.
 Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả
năng bám dính và hình thành màng nhầy bên trong đường ruột, chủng này sử dụng vị
trí gắn chuyên biệt là manose để cạnh tranh vị trí gắn với các chủng gram âm gây bệnh
trên lớp nhầy đường ruột của cá.
Ngoài ra, sự hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic đóng vai
trò quan trọng trong điều hòa và kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào chủ.
14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

2.3.3.4. Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu
hóa của động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các
hợp chất khó tiêu như chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải
(cellulase, amylase…). Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin
B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa
(PUFAs-polyunsaturated

fatty

acids)

như

eicosapentaenoic

acid

(EPA)

và

docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sự sinh trưởng của cá.
Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho rằng khi cho cá ăn probiotic ở nồng độ
từ 103-1012 cfu/g trong thời gian từ 30-90 ngày có thể gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng
trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn.
Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về mặt dinh
dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin. Một số vi sinh vật như
Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và
Staphylococcus sp có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực
(Salvelinus alpinus L.). Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B. subtilis, B.
polymixa, B. laterosporus và B. circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm
Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn,
tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate). Ngoài ra một số vi khuẩn còn
tham gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản
sinh các enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh
dưỡng cần thiết. Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm
Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự
như ở động vật.
2.3.3.5. Cải thiện chất lượng nước
Chất lượng nước đã được cải thiện nhờ bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là
các chủng Bacillus sp. Các chủng Gram dương chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành
15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

CO2 tốt hơn các chủng gram âm. Có báo cáo cho rằng việc sử dụng các chủng Bacillus
sp. cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của Penaeus
monodon và làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio.
Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được
chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD và giảm độc tố do
amoni, nitrite và hydro sulfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh, tăng năng suất tôm
cá.
2.3.3.6. Tăng cường đáp ứng miễn dịch
Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá
trình hình thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần
thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông qua liên kết giữa các kiểu phân tử liên
quan đến vi khuẩn- BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn
cao và các thụ thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột.
Một số nghiên cứu đã chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả
năng kháng Vibrio của cá hồi và gia tăng hoạt tính thực bào của bạch cầu. Rengpipat
và ctv (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp. (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú Penaeus
monodon khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể ở
tôm. Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio sp
ảnh hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng
đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng. Sự bảo vệ
này xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt
động kháng khuẩn. Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic
Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105 cfu/g, Lactococcus
lactis, Leuconostoc mesenteroides, L. sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi
Oncorhynchus mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide,

lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50).

16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

2.3.3.7. Tác động kháng virus
Một số vi khuẩn được sử dụng như probiotic có tác dụng kháng virus, mặc dù
cơ chế này vẫn chưa được hiểu chính xác. Việc kiểm tra trong phòng thí nghiệm chỉ ra
có sự bất hoạt virus nhờ các hợp chất hóa học và hợp chất sinh học như là dịch chiết từ
tảo biển và dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn.
Kamei và ctv (1988) báo cáo cho rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp,
Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính
kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus).
Direkbusarakom và ctv (1998) phân lập được hai chủng Vibrio sp. là NICA
1030 và NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV)
với tỷ lệ giảm hai virus trên lần lượt từ 62% và 99%.
2.3.4. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản
Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẽ sinh sôi và phát
triển rất nhanh trong môi trường nước. Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các
tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản:
 Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự
gia tăng của lớp bùn đáy.
 Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát
sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước.
 Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất

dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí
thay nước.
 Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (kích thích hệ miễn dịch không đặc
hiệu ở tôm, cá).
 Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh
vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong

17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự
phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được sự phát triển của mầm bệnh.
Ngoài ra, một số probiotic còn được sử dụng bằng cách trộn vào thức ăn để
nâng cao khả năng hấp thu của tôm cá, làm giảm hệ số thức ăn và phòng chống các
bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tôm cá.
Vì vậy, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả
kinh tế cho các mô hình nuôi thủy sản như:
 Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn).
 Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi.
 Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt.
 Giảm chi phí thay nước.


Giảm chi phí sử dụng kháng sinh và hóa chất trong điều trị bệnh

2.3.5. Giới thiệu về quorum sensing và khả năng bẻ gãy hệ thống quorum sensing
ở vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản
2.3.5.1. Định nghĩa quorum sensing
Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau bằng cách sử dụng các phân tử tín hiệu hóa
học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu
này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt
giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen
đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này được gọi là quorum sensing. Nhiều
kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản
xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học ….
Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ
phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và
giữa các loài. Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân
tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL). Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình

18


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17
amino acid
Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu protein I /protein R được xem
như là cơ chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với
nhau. Hệ thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen
ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm. Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín
hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein I. Một protein khác (protein R) chịu trách

nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình hoạt hóa việc phiên
mã của một số gen đích. Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến
quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhân gây bệnh ở người và thực vật như
Pseudomonas

aeruginosa

(Rumbaugh

và

ctv.,

2000),

Erwinia

carotovora,

Agrobacterium tumefaciens (Whitehead và ctv., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi
(Manefield và ctv., 2000) và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy
sản (Bruhn và ctv., 2005).
2.3.5.2. Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella spp.
Hệ thống quorum sensing gần đây cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây
bệnh quan trọng trên cá (Edwardsiella spp.). Han và ctv. (2010) xác định có bốn loại
phân tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định
được) liên quan đến độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá
nước ngọt và nước mặn như lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, ca bơn. Gần
đây, nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn
tại ở Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá

nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam

19


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

2.3.5.3. Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Hình 2.4: Một số phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn
Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết
chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không
thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn
dịch tự nhiên của vật chủ. Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có
chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu
tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai.
Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như
là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn. Một số phương pháp bẻ
gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 2.4) :
(1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing
(2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing
(3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing
(4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn.
20

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi
khuẩn gây bệnh trong nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây
bệnh ở người và thực vật, đã chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm
năng trong việc kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản
2.3.5.4. Quá trình phân hủy sinh học bằng enzyme đối với phân tử tín hiệu quorum
sensing
Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn. Những
enzyme có thể phân hủy phân tử AHL đã được phát hiện ở nhiều lòai vi khuẩn thuộc
nhóm β-Proteobacteria (Zhang và ctv., 2002), α- Proteobacteria (Uroz và ctv., 2003) và
γ- Proteobacteria cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (Dong và
ctv., 2002). Những loài vi khuẩn thuộc các nhóm này có khả năng khóa hệ thống
quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc. Quá
trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHLacylase và AHL-lactonase (Hình 2.5).

Hình 2.5: Quá trình bẻ gãy phân tử AHL bằng enzyme.
Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon, phân hủy AHL thành
acid béo và homoserine lactone (Dong và ctv., 2001; Lee và ctv., 2002; Wang và ctv.,
2004), tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân tử AHL. Trong khi
đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen aiiA, có khả năng phân hủy phân tử
21


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn

Th.S Phạm Minh Nhựt

AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone. Điều này dẫn đến sự thay đổi về
cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử
AHL với protein điều tiết việc phiên mã protein R, vì vậy một số kiểu hình (trong đó
có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện. Gen aiiA đầu tiên
được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus sp. 240B1 (Dong và ctv., 2000).
Các dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều lòai Bacillus khác,
bao gồm Bacillus thuringiensis, B. cereus, B. anthracis, B. mycoides và B. subtilis
(Dong và ctv., 2002; Lee và ctv., 2002; Uroz và ctv., 2003; Wang và ctv., 2004; Dong
& Zhang, 2005; Pan và ctv., 2008). Các gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%) so
với gen aiiA của chủng 240B1. Gần đây, Yin và ctv. (2010) đã phân lập được gen aiiA
từ ADN của Bacillus amyloliquefaciens, một lòai gần gũi với B. subtilis. Gen này có độ
tương đồng 87 – 99,3% so với các dạng tương đồng ở các lòai Bacillus khác, trong khi
trình tự acid amin của AHL-lactonase có độ tương đồng 89,6 – 99,6%.
Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng gen aiiA tái tổ hợp như
là một biện pháp kiểm soát sinh học đối với các bệnh trên cây trồng có liên quan đến
việc tiết ra phân tử tín hiệu AHL. Báo cáo đầu tiên được ghi nhận trong nghiên cứu của
Dong và ctv. (2000). Trong nghiên cứu này, gen aiiA được gắn vào plasmid của chủng
Erwinia carotovora SCG1, vi khuẩn gây bệnh thối rễ ở bắp cải Trung Quốc. Kết quả
cho thấy sự biểu hiện của enzyme AHL lactonase làm giảm mạnh tín hiệu AHL ở
Erwinia carotovora SCG1, từ đó làm giảm độc lực của chủng vi khuẩn này. Một
nghiên cứu khác năm 2004 của cùng nhóm tác giả khẳng định, B. thuringiensis chỉ bẻ
gãy phân tử tín hiệu AHL tiết ra bởi Erwinia carotovora mà không làm ảnh hưởng đến
sự tăng trưởng bình thường khi hai lòai được nuôi chung với nhau. Khi gen aiiA bị đột
biến, B. thuringiensis bị mất khả năng kiểm sóat tác nhân gây bệnh (Dong và ctv.,
2004; Zhou và ctv., 2006). Bên cạnh đó, Dong và ctv. (2001) tiến hành tái tổ hợp gen
aiiA vào trong bộ gen của cây thuốc lá và cây khoai tây. Hoạt tính của enzyme AHLlactonase được phát hiện trong cả hai loại cây được tái tổ hợp. Điều này giúp cho
22

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

chúng tăng sức đề kháng đối với bệnh thối rễ do E. carotovora. Tiếp tục phương pháp
tiếp cận của Dong và ctv., Ban và ctv. (2009) tổng hợp được gen aiiA và sau đó gắn nó
vào trong bộ gen của cây thảo dược Amorphallus konjac, điều này cũng giúp cho loài
cây này tăng sức đề kháng bệnh thối rễ do E. carotovora.
2.4. Khái quát về Bacillus
2.4.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus
Theo Bergey/s Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus được phân loại như
sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Chi Bacillus bao gồm 51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài khác
chưa được phân loại rõ ràng. Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong đất,
không khí, nước, trên cơ thể thực vật, bụi cỏ khô và rơm rạ, hầu hết là các vi khuẩn
hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẽ hay dính
nhau thành chuỗi ngắn. Nội bào tử được miêu tả đầu tiên bởi Cohn khi nghiên cứu về
B. subtilis và sau đó là Koch trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B.
anthracis vào năm 1976.
Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B.
thermoamylovorans (Combet- Blanc và ctv.,1995), B. halodenitrificans (Denariaz và
ctv.,1989), một số khác có Gram âm hay Cram dương yếu như B. thermosphaericus (

Andersson và ctv., 1995), B. horti (Yumoto ctv., 1998), B. oleronius (Kuhnigk ctv.,
1995), B. azotoformans (Pichinoty ctv., 1983). Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải

23


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S Võ Minh Sơn
Th.S Phạm Minh Nhựt

trình tự RNA/ DNA, dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm
Bacillus như B. infernus (Boone và ctv., 1995).
Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi theo chu trình sống của nó, chỉ các
tế bào trẻ mới chắc chắn Gram dương. Wiegel (1981) đã cho thấy rằng dưới kính hiển
vi, cấu trúc của vách tế bào, không hoàn toàn giống nhau như phản ứng nhuộm Gram.
Tức là, vách tế bào của một sinh vật nhuộm ra Gram âm, có thể có cấu trúc Gram
dương thật sự. Một vách tế bào có cấu trúc Gram âm sẽ luôn luôn nhuộm ra Gram âm.
Tuy nhiên, một vách tế bào có cấu trúc Gram dương, có thể nhuộm ra Gram âm hoặc
dương dưới một số điều kiện nhất định.
Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ 0,5 –
1,2x 2,5- 10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có nội bào tử
thì bào tử hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Tùy theo loài, bào tử có
thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không phồng . Dưới
một số điều kiện đặc biệt (có HCO3- trong bình kỵ khí hoặc môi trường CO2), B.
anthracis, B. subtilis, B. licheniformis và B. megaterium tạo ra một vỏ polypeptide (
poly- γ- D- glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào với polychrome methylene
blue. Trừ B. anthracis và B. mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có
sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài. Đa số các loài có catalase
dương tính.

2.4.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng
2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy
Phần lớn các chi Bacillus phát riển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương
mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng,
…, mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh
pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2-11, và nồng độ muối từ dưới 2-25%). Trong phòng thí
nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút.

24