Ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ HUY THƯỞNG

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG GIÁM SÁT
CHỦ ĐỘNG BỆNH ĐỐM TRẮNG VÀ BỆNH HOẠI TỬ
GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Đặng Thị Lụa
TS. Nguyễn Hữu Đức

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Huy Thưởng

i


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực tập tại Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản miền
Bắc, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, nhờ sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình của
các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của trung tâm và sự nỗ lực bản thân,
tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới TS. Đặng Thị Lụa, phó
Giám đốc trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản miền Bắc và TS. Nguyễn
Hữu Đức, Trưởng bộ môn công nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học đã
hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các phòng, ban của khoa Công nghệ
sinh học, các phòng ban thuộc trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản miền
Bắc và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
thực tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã động viên, cổ vũ tinh
thần giúp tôi hoàn thành khóa luận này!
Hà nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Huy Thưởng

ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn....... ................................................................................................................. ii
Mục lục............ ................................................................................................................ iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục biểu đồ, hình .................................................................................................. vii
Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii
Thesis abstract.................................................................................................................. ix
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.4.

Ý nghĩa đề tài nghiên cứu ................................................................................... 2

1.4.1.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2

1.4.2.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và ở Việt Nam......................... 4

2.1.1.

Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới ................................................. 4

2.1.2.

Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng tại Việt Nam ................................................ 4

2.2.

Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam ............................ 7

2.2.1.

Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi trên thế giới ..................................................... 7

2.2.2.

Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi tại Việt Nam .................................................. 10

2.3.

Thực trạng áp dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh trên tôm ............. 12

2.3.1.

Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 13

2.3.2.

Kỹ thuật nested PCR (PCR mồi đôi) ................................................................ 13

2.3.3.

Kỹ thuật real-time PCR .................................................................................... 14

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 15
3.1.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 15

3.1.1.

Địa điểm thu mẫu ............................................................................................. 15

iii


3.1.2.

Địa điểm tiến hành phân tích mẫu .................................................................... 15

3.2.

Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 15

3.3.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 15

3.4.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 15

3.4.1.

Phương pháp chọn điểm giám sát tác nhân gây bệnh trên tôm và thời
điểm giám sát .................................................................................................... 15

3.4.2.

Thông số, tần suất giám sát và phương pháp phân tích thông số giám sát .............. 16

3.4.3.

Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu ........................................................... 17

3.4.4.

Phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh trên tôm ......................................... 17

3.4.5.

Phương pháp xử lý số liệu: ............................................................................... 22

Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận ................................................................... 23
4.1.

Kết quả nghiên cứu ........................................................................................... 23

4.1.1.

Thông tin về ao nuôi tôm được lựa chọn để thu mẫu định kỳ .......................... 23

4.1.2.

Kết quả phân tích mầm bệnh trên tôm nuôi...................................................... 25

4.1.3.

Một số biện pháp kỹ thuật được khuyến cáo nhằm giảm thiểu nguy cơ

bùng phát dịch bệnh đốm trắng và hoại tử gan tụy cấp .................................... 35

4.2.

Thảo luận .......................................................................................................... 37

4.2.1.

Thảo luận về bệnh WSSV ................................................................................ 37

4.2.2.

Thảo luận về bệnh AHPND .............................................................................. 38

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 42
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 42

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 42

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 44
Phụ lục……… ................................................................................................................ 47

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

WSSV

Vi rút gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus)

AHPND

Vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease)

EMS

Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome)

PCR

polymerase chain reaction

ĐBSCL

Đồng bằng sông cửu long

NTTS

Nuôi trồng thủy sản

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Vùng, điểm giám sát và thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV và
AHPND thường xuyên trên tôm nuôi .......................................................... 16
Bảng 3.2. Vùng, điểm giám sát và thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV và
AHPND đột xuất trên tôm nuôi ................................................................... 16
Bảng 3.3. Thông số, tần suất thu mẫu tôm và phương pháp phân tích mầm bệnh
trên tôm ........................................................................................................ 16
Bảng 3.4. Trình tự cặp mồi VP28 dùng xác định WSSV ............................................. 17
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định WSSV ................................ 18
Bảng 3.6. Kết quả đọc điện di ...................................................................................... 20
Bảng 3.7. Trình tự cặp mồi (AP3) dùng xác định AHPND ......................................... 20
Bảng 3.8. Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định AHPND .............................. 21
Bảng 3.9. Kết quả đọc điện di ...................................................................................... 22
Bảng 4.1. Thông tin về ao nuôi được giám sát định kỳ tại Nghệ An ........................... 23
Bảng 4.2. Thông tin về ao nuôi được giám sát định kỳ tại Quảng Ninh ...................... 24
Bảng 4.3. Bảng tổng hợp số mẫu được phân tích định kỳ và phân tích đột xuất
trên tôm ........................................................................................................ 25
Bảng 4.4. Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu định kỳ tại
Nghệ An ....................................................................................................... 26
Bảng 4.5. Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu định kỳ tại
Quảng Ninh .................................................................................................. 26
Bảng 4.6. Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu đột xuất tại
Nghệ An ....................................................................................................... 27
Bảng 4.7. Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu đột xuất tại
Quảng Ninh .................................................................................................. 28
Bảng 4.8. Kết quả phân tích mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại
Nghệ An ....................................................................................................... 29

Bảng 4.9. Kết quả phân tích mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại
Quảng Ninh .................................................................................................. 30
Bảng 4.10. Kết quả phân tích mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu đột xuất tại
Nghệ An ....................................................................................................... 32
Bảng 4.11. Kết quả phân tích tác nhân gây bệnh AHPND trên mẫu tôm thu đột
xuất tại Quảng Ninh (ngày 2/6/2015) .......................................................... 34

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Diện tích, sản lượng và năng suất tôm thẻ từ năm 2008 đến 2015 ................ 6
Hình 2.2. Đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu tôm ............................................................ 7
Hình 2.3. Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy ...................... 10
Hình 4.1. Hình ảnh triển khai đề tài ............................................................................. 25
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh WSSV trên mẫu
tôm thu tăng cường tại Nghệ An .................................................................. 28
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu
tôm thu định kỳ tại Nghệ An (ngày 16/6/2015) ........................................... 29
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu
tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh (ngày 2/6/2015) ........................................ 30
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu
tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh (ngày 9/6/2015) ........................................ 31
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu
tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh (ngày 9/6/2015) ........................................ 31
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu
tôm thu đột xuất tại Nghệ An ....................................................................... 33
Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu tôm thu đột xuất tại Nghệ An ............ 33
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu tôm thu đột xuất tại Quảng Ninh ....... 34
Hình 4.10. Hình ảnh tôm trong đợt thu mẫu đột xuất tại Nghệ An .............................. 39

Hình 4.11. Dấu hiệu bệnh lý xuất hiện trên gan tụy ...................................................... 39

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Lê Huy Thưởng
Tên Luận văn: “Ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm
trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng”.
Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Hoạt động giám sát trên tôm nuôi nước lợ tập trung thuộc xã Quỳnh Bảng,
Quỳnh Lưu, Nghệ An và phường Hải Hòa, Móng Cái, Quảng Ninh đã giúp chủ động
tầm soát mầm bệnh gây bệnh AHPND, WSSV trên tôm. Đề tài đã phát hiện sớm tác
nhân gây bệnh AHPND, WSSV và đưa ra khuyến cáo, cảnh báo góp phần giảm thiểu tỷ
lệ tôm chết và ngăn ngừa sự bùng phát dịch bệnh. Ngoài ra, đề tài cũng thực hiện một số
đợt giám sát tăng cường, đột xuất vùng nuôi tôm tập trung tại phía Bắc khi tôm nuôi có
dấu hiệu chết bất thường. Việc thực hiện hoạt động giám sát vùng tôm nuôi tại Quảng
Ninh, Nghệ An còn có ý nghĩa trong việc chủ động nắm bắt tình hình vùng nuôi và kịp
thời phát hiện sự xuất hiện dịch bệnh trên tôm, góp phần xác định tác nhân gây bệnh
làm cơ sở để địa phương công bố dịch. Kết quả giám sát được kịp thời chuyển tải tới
các hộ nuôi, cơ quan quản lý địa phương bằng hình thức điện thoại trao đổi trực tiếp,
email và báo cáo. Nhiệm vụ còn thể hiện vai trò trong việc tăng cường sự kết nối phối
hợp giữa cơ quan nghiên cứu, cơ quan quản lý chỉ đạo sản xuất với địa phương và cơ
sở/hộ nuôi.

viii

THESIS ABSTRACT
Master candidate: Le Huy Thuong
Thesis title: “Application of molecular biology technology to monitor diseases
by white spot syndrome virus and pathogenic hepato pancreatic acute necrosis in the
white shrimp”
Major: Biotechnology

Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Disease monitoring in white-leg shrimp cultured in Quynh Bang, Quynh Luu,
Nghe An and Hai Hoa, Mong Cai, Quang Ninh has helped to control WSSV and
AHPND in shrimp actively. These studies early found out WSSV and pathogens caused
AHPND in shrimp and make warnings, and also give technical recommendation to local
authorities and shrimp farmers in order to reduce the deaths of shrimp and prevent
disease outbreaks. Moreover, this study also collected shrimp samples in shrimp farms
when cultured shrimp showed clinical signs and analyse pathogens caused for WSD and
AHPND. These results have played important roles in control of disease outbreak in
shrimp as well as in reduction of mortalities caused by WSD and AHPND. Moreover,
based on these results, the provical authority, such as Quang Ninh province, could make
officially announcement on AHPND outbreak in shrimp. These results, together with
some technical advices have also sent to local authorities and shrimp framers via email,
telephome and documents. Finally, the studies also play a role in stimulating the
coorperation among research institutions, local authorities and shrimp farmers.

ix

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nguồn lợi thủy sản tự nhiên dù có phong phú và đa dạng bao nhiêu cũng
không bao giờ là vô tận để đáp ứng nhu cầu cuộc sống của con người. Vì thế,
khai thác nguồn thủy sản tự nhiên cần phải đi liền với việc nuôi trồng thủy sản.
Nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã và đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia nói
chung và Việt Nam nói riêng. NTTS được coi là ngành kinh tế mũi nhọn, chiếm
một vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế, xã hội của mỗi
quốc gia.
Hiện nay, ở nước ta nghề nuôi tôm nước lợ đem lại hiệu quả đáng kể về
kinh tế. Do vậy, trong những năm gần đây, diện tích nuôi thả tôm nước lợ tăng
lên nhanh chóng. Tôm thẻ chân trắng là đối tượng đang được ngành thủy sản
Việt Nam quan tâm và phát triển với hình thức thâm canh hoặc bán thâm canh là
chủ yếu. Thực tế, càng thâm canh hóa thì dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều.
Dịch bệnh ở tôm, đã và đang là nỗi lo của người nuôi tôm, là một trở
ngại lớn đối với việc thâm canh nghề nuôi tôm nước lợ và sự phát triển bền
vững của ngành NTTS ở nước ta. Trong đó, bệnh hoại tử gan tuỵ cấp (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) và bệnh đốm trắng (white spot
disease – WSD) là hai bệnh nguy hiểm, thường gặp nhất trên tôm nước lợ. Vì
các tác nhân này có khả năng lây lan rất nhanh, tỉ lệ tôm chết khi bị nhiễm bệnh
rất cao.
Tuy nhiên, đến nay chưa có thuốc đặc hiệu để trị hai bệnh WSD và
AHPND nên công tác phòng ngừa tổng hợp, bao gồm: tẩy trùng ao nuôi, ngăn
cản sự xâm nhập của các sinh vật mang mầm bệnh vào ao nuôi và sử dụng tôm
giống sạch bệnh được khuyến cáo như một biện pháp an toàn sinh học (Escobedo
Bonilla et al., 2008).
Do đó, phương pháp phát hiện sớm sự hiện diện của mầm bệnh trên đàn
tôm trước khi thả và suốt quá trình nuôi trong ao nhằm hạn chế nguy cơ bùng
phát dịch bệnh, giảm thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm. Các phương pháp
chẩn đoán truyền thống như: quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh

học không cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh. Vì thế, nhiều phương pháp
phân tử như lai in situ, western blot, PCR, nested PCR, rea-time PCR được phát
triển nhằm khắc phục những nhược điểm trên (Trần Việt Tiên và cs., 2009).

1


Đề tài nghiên cứu đã nghiên cứu áp dụng sinh học phân tử trong việc xét
nghiệm phát hiện sớm mầm bệnh trên tôm, với mong muốn mang lại những giá
trị thực tiễn và những giá trị khoa học cho ngành thủy sản nói chung và ngành
nuôi tôm thẻ chân trắng nói riêng.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Năm 2015, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã được Tổng cục
Thủy sản giao nhiệm vụ “Giám sát chủ động vùng nuôi tôm nước lợ và ngao nuôi
tập trung tại một số tỉnh phía Bắc” nhằm đảm bảo phát triển bền vững nghề nuôi
tôm tại Việt Nam, gắn với việc giảm ô nhiễm môi trường và giảm thiệt hại về
dịch bệnh trong nghề nuôi tôm nước lợ ở nước ta nói chung và tại miền Bắc nói
riêng, mang lại giá trị kinh tế lâu dài cho người nuôi trồng thủy sản.
Trong khuôn khổ nhiệm vụ trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh
hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng” với mục tiêu cụ thể sau:
+ Theo dõi, giám sát chủ động và phát hiện sớm mầm bệnh WSSV và
AHPND trên tôm tại một số vùng nuôi tập trung thuộc Quỳnh Lưu, Nghệ An và
Móng Cái, Quảng Ninh.
+ Đề xuất, khuyến biện pháp xử lý kịp thời khi phát hiện tôm nhiễm mầm
bệnh WSSV và AHPND để ngăn ngừa nguy cơ bùng phát bệnh.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trong khuôn khổ đề tài luận văn tốt nghiệp cao học, tôi chỉ ứng dụng
phương pháp PCR trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan
tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng, tại hai tỉnh Quảng Ninh và Nghệ An, thời gian từ

tháng 4 đến tháng 7 năm 2015.
Đây là một phần công việc thuộc nhiệm vụ “Giám sát chủ động vùng nuôi
tôm nước lợ và ngao nuôi tập trung tại một số tỉnh phía Bắc”do Viện Nghiên cứu
NTTS 1 thực hiện năm 2015 tại các tỉnh nuôi tôm phía Bắc của nước ta.
1.4. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
+ Áp dụng kỹ sinh học phân tử trong phát hiện sớm mầm bệnh nguy hiểm
thường gặp trên tôm nuôi.
+ Từng bước đưa quy trình theo dõi, giám sát chủ động mầm bệnh trong
quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng vào thực tế sản xuất.

2


1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
+ Góp phần kiểm soát chủ động bệnh trên tôm nuôi, góp phần phát triển
bền vững nghề nuôi tôm nước lợ của Quảng Ninh và Nghệ An nói riêng và của
cả nước nói chung.
+ Góp phần giảm ô nhiễm môi trường do giảm thiểu dịch bệnh tôm và sử
dụng hóa chất bừa bãi.
+ Là cơ sở khoa học để các cơ quan quản lý chỉ đạo sản xuất.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ
Ở VIỆT NAM
2.1.1. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới
Tôm thẻ chân trắng được nuôi vào khoảng thập niên 80, đến năm 1992,

chúng đã được nuôi phổ biến trên thế giới, nhưng chủ yếu tập trung ở các nước
Nam Mỹ. Khi đó nhiều nước Châu Á đã tìm cách hạn chế phát triển tôm chân
trắng do sợ lây bệnh cho tôm sú. Nhưng từ năm 2003, các nước châu Á bắt đầu
nuôi loại tôm này.
Trước năm 2003, các nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới như
Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ, chủ yếu nuôi tôm sú hay tôm bản địa.
Nhưng sau đó, các nước này đã tập trung phát triển mạnh đối tượng tôm chân
trắng. Sản lượng tôm chân trắng của Trung Quốc năm 2003 đạt 600 nghìn tấn
(chiếm 76% tổng sản lượng tôm nuôi tại nước này), đến năm 2008 tôm chân
trắng đạt sản lượng 1,2 triệu tấn (trong tổng số 1,6 triệu tấn tôm nuôi). Inđônêxia
nhập tôm chân trắng về nuôi từ năm 2002 và năm 2005 đạt 40 nghìn tấn, năm
2007 là 120 nghìn tấn (trong tổng sản lượng 320 nghìn tấn).
Năm 2004, tôm chân trắng dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi, đóng góp trên
50% tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới. Năm 2007, tôm chân trắng chiếm
75% tổng sản lượng tôm nuôi toàn cầu và là đối tượng tôm nuôi chính ở Thái
Lan, Trung Quốc, Inđônêxia. Ba nước này cũng chính là những quốc gia dẫn đầu
thế giới về nuôi tôm.
Sản lượng tôm trên thế giới liên tục tăng nhanh qua các năm, đến năm
2010 sản lượng tôm đạt khoảng 2,7 triệu tấn (FAO, 2011). Đến năm 2012 sản
lượng tôm đạt khoảng 4 triệu tấn. Các nước nuôi tôm chủ yếu trên thế giới gồm
Trung Quốc, Thái Lan, Inđônêxia, Brazil, Ecuador, Mexico, Venezuela,
Honduras, Việt Nam, Malaysia, Peru, Costa Rica, Panama, Hoa Kỳ, Ấn Độ,
Philippines, với hình thức nuôi chủ yếu là thâm canh và siêu thâm canh.
2.1.2. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng tại Việt Nam
Tôm thẻ chân trắng đang nuôi ở nước ta là đối tượng ngoại nhập, có
nguồn gốc từ Châu Mỹ. Đây là loài có giá trị kinh tế cao đang được người tiêu

4

dùng ở các thị trường lớn ưa chuộng như Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản... Việt Nam
đã và đang là nhà cung cấp tôm số một cho Nhật Bản, với thị trường Mỹ Việt
Nam xếp vị trí thứ tư sau Ấn Độ, Inđônêxia và Ecuador.
Tôm thẻ chân trắng có thời gian sinh trưởng ngắn (3 – 3,5 tháng), năng
suất cao (trên 4 tấn/ha/vụ), thâm canh có thể đạt đến 20 tấn/ha/vụ và có giá trị
dinh dưỡng rất cao, dễ nuôi, lớn nhanh và sản lượng lớn (Trần Việt Mỹ, 2009).
Do vậy, loại tôm này được nhiều nước ưu tiên phát triển nhất là các nước châu Á.
Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt Nam năm 2001 và được nuôi thử nghiệm
tại Quảng Ninh, Phú Yên và Bạc Liêu. Đến năm 2006, ngành thuỷ sản đã cho
phép nuôi bổ sung tôm chân trắng tại một số tỉnh, nhưng vẫn cấm nuôi tại khu
vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Nhận thấy tôm thẻ chân trắng là đối
tượng nuôi có hiệu quả kinh tế cao đồng thời nhu cầu của mặt hàng này trên thế
giới đang có chiều hướng tăng nhanh do sự hấp dẫn về giá thành. Đến
25/01/2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành Chỉ thị số
228/CT-BNN-NTTS về việc phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng tại các tỉnh vùng
ĐBSCL nhằm nâng cao sản lượng và đa dạng hoá sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu,
đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.
Trong lĩnh vực xuất khẩu thuỷ sản, mặt hàng tôm thẻ chân trắng đang
khẳng định được vị thế. 7 tháng đầu năm 2013, trong khi xuất khẩu tôm sú chỉ
tăng 1,3% so với cùng kỳ năm 2012 (đạt xấp xỉ 680 triệu USD) thì xuất khẩu tôm
thẻ chân trắng đạt 609 triệu USD, tăng 51,5% so với cùng kỳ năm 2012, chiếm
43,7% trong tổng kim ngạch xuất khẩu tôm của Việt Nam.
Từ một số mô hình nuôi thành công, tôm chân trắng đang ngày càng được
các hộ nuôi trồng thuỷ sản quan tâm đầu tư phát triển. Điều này được thể hiện
thông qua diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng không ngừng tăng lên nhanh chóng
qua các năm (Hình 2.1).

5

Hình 2.1. Diện tích, sản lượng và năng suất tôm thẻ từ năm 2008 đến 2015
Nguồn: Tổng hợp từ báo cáo thống kê của Tổng cục thủy sản

2.1.2.1. Hoạt động nuôi tôm tại Nghệ An
Theo thống kê từ chi cục Nuôi trồng Thủy sản Nghệ An (nay là chi cục
Thủy sản Nghệ An), diện tích nuôi tôm mặn, lợ của Nghệ An năm 2014 ước đạt
2.360 ha, trong đó diện tích nuôi tôm vụ 1 (từ tháng 4 đến tháng 7) là 1.320 ha và
vụ 2 (từ tháng 7 đến tháng 11) là 1.040 ha. Mật độ thả giống bình quân đối với
tôm chân trắng từ 60 – 100 con/m2. Năng suất bình quân đạt được đối với nuôi
tôm chân trắng là 3,7 tấn/ha và tôm sú là 0,7 tấn/ha.
Kết quả hoạt động NTTS, đặc biệt là nuôi tôm nước lợ của Nghệ An trong
năm 2014 bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh. Trong năm này, Nghệ An đã công bố dịch
bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. UBND tỉnh có Quyết định số 1845/QĐ-UBND về
việc công bố dịch đốm trắng ở tôm trên địa bàn xã Hưng Hòa, Thành phố Vinh
và xã Nghi Thái, huyện Nghi Lộc.
2.1.2.2. Hoạt động nuôi tôm tại Quảng Ninh
Theo số liệu thống kê, tổng diện tích NTTS của Quảng Ninh năm 2014
vào khoảng 21.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm chiếm khoảng 10.000 ha.
Trong những năm gần đây nghề NTTS tại Quảng Ninh đã có sự phát triển mạnh
mẽ và đã trở thành một lĩnh vực kinh tế mũi nhọn trong nông nghiệp, nhiều vùng

6


nuôi tôm thẻ chân trắng đạt năng suất cao từ 10-15 tấn/ha/2 vụ. Tại thành phố
Móng Cái, có những đơn vị, hộ gia đình nuôi đạt sản lượng trên 20 tấn/ha/2 vụ.
Đặc biệt, những năm gần đây, tình hình sản xuất và cung ứng giống thuỷ sản trên
địa bàn đã có những chuyển biến tích cực. Hiện nay, toàn tỉnh có 17 cơ sở sản
xuất và kinh doanh giống thuỷ sản, các cơ sở này có thể đáp ứng được khoảng
30% nhu cầu giống thuỷ sản trên địa bàn tỉnh.

Tuy nhiên, năm 2014 nghề NTTS tại Quảng Ninh cũng phải đối diện với
nhiều thách thức do dịch bệnh. Năm 2014, dịch bệnh thuỷ sản xuất hiện ở hầu hết
các đối tượng chủ lực tại các vùng nuôi tập trung của tỉnh, gây thiệt hại lớn cho
người dân, trong đó có dịch bệnh đốm trắng và hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi.
UBND tỉnh đã có Quyết định số 1469/QĐ-UBND về việc công bố dịch bệnh
đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm sú nuôi tại xã Hải Lạng
(huyện Tiên Yên).
2.2. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở TÔM NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
2.2.1. Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi trên thế giới
Tôm thẻ chân trắng được coi là loài có khả năng chống bệnh tốt hơn các
loài tôm khác (Wyban. 1991). Mặc dù trong thực tế cũng thường xảy ra nhiều
loại bệnh, có những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn như bệnh đốm trắng
(WSD) và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND).
2.2.1.1. Bệnh đốm trắng

Hình 2.2. Đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu tôm
Nguồn: Viện nuôi trồng Thủy sản 1

7


Bệnh đốm trắng xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 1992 sau đó là các nước
Châu Á và tác nhân gây bệnh là do vi rút đốm trắng WSSV. WSSV đã gây bệnh
cho nhiều trang trại nuôi tôm ở Đông Nam Á (Flegel et al., 1995) và các quốc gia
khác như Nhật Bản và Hàn Quốc (Inouye et al., 1994). WSSV là vi rút hình que
có vỏ protein, có nhân là phân tử ADN kiến trúc sợi đôi (Wongteerasupaya et al.,
1996) và được xác định thuộc giống mới Whispovirus, họ mới Nirnaviridae có
kích thước 70-150 nm x 275- 380 nm. Dấu hiệu bệnh lý điển hình của bệnh là sự
xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp vỏ- kitin, đặc biệt các đốm trắng tập trung

ở giáp đầu ngực và đốt bụng cuối cùng (Hình 2.2).
WSSV là tác nhân gây bệnh có thể xâm nhập, gây hại trên hầu hết các cơ
quan nội tạng của tôm và sở hữu cả hai phương thức lây lan ngang (sự lan truyền
của bệnh qua động vật trung gian, qua ăn thịt đồng loại và qua nguồn nước) và
dọc (sự lan truyền của bệnh từ tôm bố mẹ cho con cái). Với khả năng lan truyền
bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh đốm trắng là một trong những tác nhân gây
bệnh chính gây thiệt hại lớn đến nền công nghiệp nuôi tôm của nhiều nước trên
thế giới trong đó có Việt Nam.
WSSV có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm, đặc biệt
giai đoạn tôm 50-70 ngày tuổi, WSSV có thể làm chết 100% tôm chỉ trong vòng
3-10 ngày (Lightner, 1996).
2.2.1.2. Bệnh hoại tử gan tụy cấp AHPND
AHPND là một trong số những bệnh nguy hiểm mới xuất hiện trong mấy
năm gần đây tại khu vực Châu Á, ban đầu được đặt tên là hội chứng chết sớm
trên tôm (EMS). EMS lần đầu được ghi nhận tại Trung Quốc (năm 2009), đến
năm 2011 được gọi là hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp (AHPND). Bệnh đã bắt đầu
gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng tôm ở phía Nam Trung Quốc từ năm
2009, đến năm 2010 dịch bệnh xảy ra trên diện rộng tại Trung Quốc, sau đó bệnh
được ghi nhận có tại Việt Nam năm 2010. Dịch bệnh tương tự cũng được báo cáo
ở Malaysia năm 2011, Thái Lan vào đầu năm 2012 và Mexico năm 2013
(Schryver et al., 2014).
Nguyên nhân gây nên bệnh AHPND là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây ra (Lightner, 2013). Vi khuẩn V. parahaemolyticus tấn công vào các tế bào
biểu mô gan tụy tôm và sau đó gây chết tôm trong vòng 30 ngày sau khi thả tôm

8


giống. Các nghiên cứu tiếp theo đã xác định được một plasmids lớn gắn vào
DNA nhiễm sắc thể của V. parahaemolyticus là nguồn gốc của các độc tố gây

bệnh AHPND tạo ra bởi dòng vi khuẩn đặc biệt này (Lightner, 2013). Plasmids là
các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể. Chúng
thường hiện diện trong vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật có nhân thật
(eukaryote). Chúng có kích thước khoảng từ 1 đến hơn 400 kbp (kilobase pairs).
Chúng có thể hiện diện chỉ một bản sao, đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản
sao trong cùng một tế bào. Plasmid thường chứa các gen hay nhóm gen (genecassettes) mang lại một ưu thế chọn lọc nào đó cho tế bào vi khuẩn chứa nó, ví
dụ như khả năng giúp vi khuẩn kháng kháng sinh, gen gây độc.
Sau khi phân lập và giải trình tự gen của plasmid này, các phương pháp
PCR dùng để phát hiện chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND
đã được công bố rộng rãi ra công chúng vào tháng 12/2013. Hai phương pháp
PCR phát hiện chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND dựa trên
hai cặp mồi (primer) AP1 và AP2 được gọi tên là AHPND Primer set 1 và
AHPND Primer set 2. Thử nghiệm với cặp mồi AP2 cho tỷ lệ dương tính chính
xác 96% (Lightner, 2013). Trong một nghiên cứu khác, đã công bố một phương
pháp PCR mới dựa trên cặp mồi AP3 cho kết quả dương tính chính xác 100% khi
thử nghiệm trên 104 mẫu tôm nhiễm bệnh EMS/AHPND. Trình tự các cặp mồi
liên quan đã được công bố rộng rãi và miễn phí kể từ 18/6/2014 tại trang web của
Mạng lưới các Trung tâm Nuôi trồng thủy sản ở châu Á Thái Bình Dương
(NACA) (Sirkharin et al., 2014). Ngoài ra, bộ kit PCR phát hiện EMS/AHPND
thương mại sử dụng công nghệ chuyển giao từ Đại học Arizona hiện cũng được
bán trên thị trường (EMS-2, IQ2000).
AHPND xảy ra ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng, chủ yếu ở các vùng
nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh ở giai đoạn 15 - 45 ngày sau khi thả nuôi
và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Tôm bệnh có biểu hiện ngừng ăn, bơi chậm,
màu tôm nhợt nhạt, gan tụy có biểu hiện sưng, nhũn, teo. Dịch bệnh xảy ra ở hầu
hết các tháng trong năm (Schryver et al., 2014).

9

Hình 2.3: Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy
(A). Gan tụy (HP) teo, màu nhợt nhạt; dạ dày (ST) và ruột (MG) không có thức ăn. Hình (C, D) là tôm
khỏe cho thấy HP có kích thước bình thường với màu da cam hơi tối, dạ dày và ruột đầy thức ăn. Hình
(B) và (D) là mẫu lấy từ hai con tôm ở hình (A) và (C) tương ứng.

Nguồn: Trần Lộc và cs. (2013)

2.2.2. Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi tại Việt Nam
2.2.2.1. Bệnh đốm trắng (WSSV)
Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê, diện tích nuôi tôm nước lợ bị bệnh
đốm trắng liên tục tăng trong những năm gần đây.
Năm 2014, dịch bệnh đốm trắng đã xảy ra trên phạm vi rộng tại 250 xã, 73
huyện thuộc 23 tỉnh/thành phố với diện tích bị bệnh là 23.850 ha, chiếm 3,5%
tổng diện tích thả nuôi của cả nước, trong đó diện tích nuôi tôm thâm canh và
bán thâm canh bị bệnh là 13.329 ha; diện tích nuôi quảng canh, quảng canh cải
tiến bị bệnh là 10.521 ha. Bệnh xảy ra trên cả tôm chân trắng và tôm sú ở thời
điểm 10-110 ngày sau thả nuôi. Năm 2015 tổng diện tích bị bệnh đốm trắng có
giảm như bảng 2.1.

10


Bảng 2.1. Tổng hợp dịch bệnh WSSV trên tôm nuôi nước lợ theo các năm
Năm theo dõi

Các thông số theo dõi

2012

2013

2014

2015

Số tỉnh có dịch
Số huyện có dịch
Số xã có dịch
Tổng diện tích bị bệnh (ha)

19
54
120
8.734

28
94
281
12.265

23
73
259
23.850

23
28
254
5.237

Tỷ lệ diện tích nuôi bị bệnh (%)

1,33

1,84

3,50

0,77

Nguồn: Các báo cáo liên quan tại Hội nghị Tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và
xây dựng kế hoạch năm 2015, Báo cáo tổng kết của Cục Thúy y (2015)

Hiện tại, thế giới vẫn chưa có vắc xin hữu hiệu cho bệnh đốm trắng trên
tôm nên công tác quản lý chất lượng con giống, quản lý tốt môi trường và tầm
soát tác nhân gây bệnh là giải pháp để giảm thiểu sự nhiễm và lan truyền bệnh.
2.2.2.2. Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND)
Ở Việt Nam, hiện tượng tôm chết với các biểu hiện bất thường trên gan
tụy đã được thông báo chính thức bằng văn bản tại tỉnh Sóc Trăng tháng 5 năm
2011, mặc dù hiện tượng tôm chết tương tự đã được ghi nhận tại một số tỉnh
Đồng Bằng Sông Cửu Long như Sóc Trăng, Bạc Liêu từ cuối năm 2010. Từ đó
đến nay, dịch bệnh tiếp tục xảy ra cả mức độ nông hộ và trang trại với mức độ
thiệt hại cao. Dịch bệnh xảy ra trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng.
Trong những năm gần đây dịch bệnh AHPND diễn ra trên diện rộng, tuy
tổng diện tích bị dịch bệnh trên cả nước có chiều hướng giảm, nhưng số tỉnh, số
huyện, số xã bị dịch bệnh lại tăng liên tục qua các năm (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Tổng hợp dịch bệnh AHPND trên tôm nuôi nước lợ theo các năm
Năm theo dõi

Các thông số theo dõi

Số tỉnh có dịch
Số huyện có dịch
Số xã có dịch
Tổng diện tích bị bệnh (ha)

2012

2013

2014

2015

16
54
192
28.005

18
58
194
5.804

22
63
237
5.509

22
76

292
9.284

4,27

0,87

0,81

1,37

Tỷ lệ diện tích nuôi bị bệnh (%)

Nguồn: Các báo cáo liên quan tại Hội nghị Tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và xây
dựng kế hoạch năm 2015, Báo cáo tổng kết của Cục Thúy y (2015)

11


Năm 2014, bệnh hoại tử gan tụy cấp, đã xảy ra tại 237 xã thuộc 63 huyện
ở 22 tỉnh/thành phố với diện tích tôm nuôi bị bệnh là 5.509 ha, chiếm 0,81% tổng
diện tích thả nuôi của cả nước. Trong đó diện tích nuôi tôm thâm canh và bán
thâm canh bị thiệt hại là 5.134 ha; diện tích nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến
và tôm lúa là 456 ha. Tương tự như bệnh đốm trắng, bệnh hoại tử gan tụy cấp
cũng xuất hiện trên cả tôm sú và tôm chân trắng (khoảng 10-103 ngày sau thả
nuôi), nhưng diện tích thiệt hại chủ yếu xảy ra ở tôm chân trắng (3.557 ha, chiếm
63,6% tổng diện tích bị bệnh). Năm 2015 tình hình dịch bệnh có chiều hướng
ngày càng gia tăng.
2.3. THỰC TRẠNG ÁP DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN
ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM

Có nhiều phương pháp để chẩn đoán các tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn…
trên tôm trước khi thả và trong quá trình nuôi bao gồm các kỹ thuật như mô bệnh
học (Supamattaya, 1996) lai tạo tại chỗ sử dụng đầu dò gen (Wongteerasupaya et
al., 1996), phương pháp PCR (Lo et al., 1996), phương pháp miễn dịch như
Nitrocellulose-enzymeimmunoblot và kỹ thuật Western blot (Nadala et al., 1998).
Đối với các bệnh trên tôm nuôi, ngoài việc quan sát các dấu hiệu bệnh lý
điển hình thì phương pháp mô bệnh học và sinh học phân tử đang được ứng dụng
rộng rãi để chẩn đoán, xác định các tác nhân gây bệnh. Trong khi phương pháp
mô bệnh học được xem là chuẩn mực đủ để chẩn đoán khi bệnh đã bùng phát
thành dịch, thì phương pháp PCR lại được khuyến cáo là không cần thiết khi dịch
bệnh đã bùng phát nhưng lại đặc biệt có ý nghĩa trong trường hợp chẩn đoán
nhanh, kiểm dịch các nguồn tôm bị nhiễm bệnh, hay dùng để sàng lọc lựa chọn
nguồn giống sạch bệnh và tầm soát mầm bệnh trong quá trình nuôi.
Phương pháp PCR hiện vẫn đang được sử dụng rất rộng rãi và hiệu quả
trong việc xét nghiệm phát hiện sớm một số bệnh nguy hiểm trên tôm. Phương
pháp PCR là phương pháp dùng để khuếch đại nhanh, tạo ra nhiều bản sao từ một
số ít đoạn DNA làm khuôn nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp
mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đó mà không qua tạo dòng.Phương pháp này được
Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện vào năm 1988. Phương pháp
được tiến hành hoàn toàn trong ống eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể
thu được rất nhiều bản sao DNA. Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc
nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Nhờ đó mà ta có thể phân tích một đoạn

12


DNA đơn lẻ trong hệ gen sinh vật đơn giản chỉ là phát hiện sự có mặt đoạn DNA
trong cơ thể sinh vật, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử.
Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR
được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn,

các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành
phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn
trong phân loại các loài sinh vật.Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này
mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993.
2.3.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật khuếch đại phân đoạn ADN (của vi-rút, vi khuẩn
gây bệnh) dựa trên tiến trình các chu kỳ nhiệt liên tiếp. Tiến trình này khuếch đại
lượng ADN tăng theo lũy thừa, sản phẩm chu kỳ trước làm khuôn của chu kỳ
sau. Sản phẩm của tiến trình là những đoạn ADN nằm giữa 2 đoạn mồi chuyên
biệt (xác định đặc tính của đối tượng). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại
nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước sau:
Bước 1: Biến tính DNA (tách đôi sợi DNA)
Bước 2: Bắt cặp các đoạn mồi vào mạch DNA đã đươc làm biến tính
Bước 3: Kéo dài đoạn oligonucleotide cần tổng hợp
Một phản ứng tiêu biểu cần 20-30 chu kỳ để có đủ sản phẩm cho việc phát
hiện trên bản thạch có nhuộm ethidium bromide. Thành phần phản ứng bao gồm
mồi, dung dịch đệm, magnesium, dNTP (mononucleotide), enzim Taq ADN
polymerase và khuôn mẫu ADN
Ngày nay, dựa trên kỹ thuật PCR cổ điển, người ta đã phát triển kỹ thuật
này để chẩn đoán nhanh và chính xác hơn; đang được nhiều phòng thí nghiệm
trên thế giới sử dụng, cụ thể như nested PCR, real-time PCR, tuy nhiên với
phương pháp PCR cổ điển lại có ưu điểm là đơn giản, dễ sử dụng nên rất thích
thợp dùng để phổ biến cho việc kiểm tra tôm thường xuyên ở các địa phương.
2.3.2. Kỹ thuật nested PCR (PCR mồi đôi)
Kỹ thuật này sử dụng 2 cặp mồi thay vì 1 cặp mồi như kỹ thuật PCR cổ
điển, trong đó cặp mồi thứ hai khuếch đại đoạn gen nằm trong đoạn gen đã được
khuếch đại bởi cặp mồi thứ nhất. Kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật PCR 2
bước.Kỹ thuật này sẽ có nhiều đoạn sản phẩm DNA hơn là kỹ thuật PCR cổ điển,
số đoạn ADN được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản ứng

13


(Lo et al., 1996). Tuy nhiên quy trình thực hiện phản ứng nested PCR còn phức
tạp nên khó đưa ra ứng dụng đại trà.
2.3.3. Kỹ thuật real-time PCR
Kỹ thuật này không phân tích sản phẩm PCR trên bản thạch nên không
cần sử dụng Ethidium bromide. Kỹ thuật này làm giảm thời gian đổ bảng thạch
và thời gian chạy điện di. Phương pháp này đòi hỏi phải có máy luân nhiệt đặc
biệt, có thiết bị đo huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi
tính cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong
từng chu kỳ phản ứng khuếch đại. Có thể phát hiện ánh sáng sinh ra bằng
SYBG GREEN hoặc dùng đoạn dò TaqMan. Với phương pháp này cho kết quả
có độ chính xác cao, nhanh, không cần điện di, tránh được hiện tượng dương
tính giả, tuy nhiên giá thành cho mỗi phản ứng cao, cần phải có máy chuyên
dụng… nên không thích hợp cho việc dùng để phổ biến cho việc kiểm tra tôm
nuôi ở địa phương.
2.3.3.1. Sử dụng SYBR GREEN
Đặc tính của chất SYBR GREEN là phát huỳnh quang khi nằm chen vào
sợi DNA đôi. Số lượng sản phẩm ADN sinh ra càng nhiều thì cường độ huỳnh
quang càng cao. Tuy nhiên phương pháp dùng SYBR GREEN gặp trở ngại vì sau
phản ứng có nhiều đoạn mồi bắt cặp với nhau thành những sợi ngắn ADN đôi dài
20-40 bp. Do đó khi thiết kế phản ứng chúng ta phải tính toán lượng ADN vừa đủ
cho các đoạn mồi không tự bắt cặp với nhau.
2.3.3.2. Dùng đoạn dò TaqMan (TaqMan probe)
Đoạn dò TaqMan là đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung với trình tự
của một đoạn DNA trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung với trình tự
của hai 2 đoạn mồi, trong phản ứng PCR. Hai đầu của đoạn dò được gắn hai chất
gọi là reporter và quencher, khi reporter và quencher ở gần nhau thì quencher làm
mất màu của reporter, khi reporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh

quang. Ở mỗi chu kỳ PCR, trước hết là sự gắn vào mạch khuôn của đoạn dò và hai
đoạn mồi. Sau đó, Taq DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch DNA mới dựa trên
khuôn và đoạn mồi, đồng thời nó cũng phân cắt đoạn dò ra khỏi mạch khuôn khi
nó tiến đến vị trí của đoạn dò, trong quá trình này quencher sẽ tách ra khỏi reporter
nên làm reporter phát quang. Do đó lượng phát quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng
ADN khuếch đại lên. Kỹ thuật Real time PCR dung đoạn dò TaqMan cho kết quả
chính xác và có thể phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh (Lightner, 1996).

14


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
3.1.1. Địa điểm thu mẫu
Vùng nuôi tôm tập trung thuộc phường Hải hòa - Móng Cái - Quảng Ninh.
Vùng nuôi tôm tập trung thuộc xã Quỳnh Bảng - Quỳnh Lưu- Nghệ An.
3.1.2. Địa điểm tiến hành phân tích mẫu
Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản miền Bắc, Viện nghiên
cứu nuôi trồng thủy sản 1, Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian giám sát tiến hành từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2015
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Tôm thẻ chân trắng thu tại một số hộ giám sát thuộc phường Hải Hòa Móng Cái - Quảng Ninh và xã Quỳnh Bảng - Quỳnh Lưu - Nghệ An.
Tôm thẻ thuộc hệ thống phân loại khoa học như sau:
Lớp: Malacostraca
Bộ: Decappoda
Họ: Penaeidae
Giống: litopenaeus
Loài: Litopenaeus vannamei, Boone, 1931
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1. Phương pháp chọn điểm giám sát tác nhân gây bệnh trên tôm và thời
điểm giám sát
Điểm thu mẫu giám sát tác nhân gây bệnh WSSV và AHPND của đề tài là
các ao giám sát được lựa chọn bởi nhiệm vụ “Giám sát chủ động vùng nuôi tôm
nước lợ và ngao nuôi tập trung tại một số tỉnh phía Bắc” được thực hiện bởi
Viện Nghiên cứu NTTS 1 thực hiện tại vùng nuôi tôm thẻ chân trắng tập trung
thuộc phường Hải Hòa – Móng Cái - Quảng Ninh và xã Quỳnh Bảng - Quỳnh
Lưu - Nghệ An. Tại mỗi vùng giám sát chọn tối thiểu 6 ao nuôi tôm thâm canh
hoặc bán thâm canh để giám sát. Các ao nuôi được lựa chọn ở các vị trí khác
nhau thuộc nhiều hộ khác nhau (Bảng 3.1).

15