N NGHIÊN SINH N CỨU S H HỌC T SỬ SẢN XUẤ TỪ CÁC C Ử DỤNG ẤT CHẾ CHỦNG CHO ĐẬ PHẨM C G Bradyrh ẬU XAN CỐ ĐỊNH hizobium NH H ĐẠM spp.

BỘ
B GIÁO D
DỤC VÀ ĐÀO
Đ
TẠO
TRƯỜN
NG ĐẠI HỌ
ỌC NÔNG LÂM THÀ
ÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
M
BỘ MÔN CÔN
NG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

K
KHÓA
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆP
P
N
NGHIÊN
N CỨU SẢN
S
XUẤ
ẤT CHẾ PHẨM C
CỐ ĐỊNH
H ĐẠM
SINH

H HỌC TỪ
T CÁC C
CHỦNG
G Bradyrh
hizobium spp.
SỬ
Ử DỤNG CHO ĐẬ
ẬU XAN
NH

Nggành học

: CÔNG NGH
HỆ SINH HỌC
H

Sin
nh viên thự
ực hiện : N
NGUYỄN THỊ
T DƯỢC
Kh
hóa học

: 20009 - 2013

Th
háng 6/2013

 

BỘ
B GIÁO D
DỤC VÀ ĐÀO
Đ
TẠO
TRƯỜN
NG ĐẠI HỌ
ỌC NÔNG LÂM THÀ
ÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
M
BỘ MÔN CÔN
NG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

K
KHÓA
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆP
P
N
NGHIÊN
N CỨU SẢN
S
XUẤ
ẤT CHẾ PHẨM C

CỐ ĐỊNH
H ĐẠM
SINH
H HỌC TỪ
T CÁC C
CHỦNG
G Bradyrh
hizobium spp.
SỬ
Ử DỤNG CHO ĐẬ
ẬU XAN
NH

Hướn
ớng dẫn khooa học

S
Sinh
viên th
hực hiện

PGS
S.TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

N
NGUYẾN
THỊ
T DƯỢC
C

KS. TRẦN TH
HỊ QUỲNH DIỆP

háng 6/2013
Th
 


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời tri ân đến Thầy Lê Đình Đôn. Thầy đã hết lòng dạy bảo,
hướng dẫn tận tình để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Xin cảm ơn Ông Nguyễn Kim Long giám đốc công ty TNHH An Phú Nông đã
cung cấp giống đậu xanh ANP 208 và hổ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này. 
Em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh. Quý Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các Thầy Cô đã tận tình
dạy bảo, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em
theo học học tập và rèn luyện tại trường.
Em xin cảm ơn KS. Trần Thị Quỳnh Diệp, Thầy Cô và các Anh Chị đang công
tác tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và
Môi Trường, đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và hổ trợ về vật chất cũng như tinh thần
cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn Cô chủ nhiệm Tô Thị Nhã Trầm, các bạn sinh viên lớp DH09SH,
lớp DH09BVvà em Ngô Thị Lệ Trinh đã hết lòng giúp đỡ, động viên em trong suốt
quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng em xin tri ân công ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục. Cha Mẹ luôn
bên cạnh yêu thương, dạy bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể có được ngày
hôm nay.
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Dược

 
 
 
 
 

 

i

 


TÓM TẮT
Tình trạng thoái hóa đất nông nghiệp đang diễn ra ngày càng nghiêm trọng do
việc lạm dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật. Việc cộng sinh giữa vi
khuẩn cố định đạm trong đất và thực vật họ đậu hàng năm đã cung cấp lại cho đất
200- 300 kg/ha , ước tính mỗi năm, trên toàn thế giới 70 triệu tấn nitơ được tạo ra từ
quá trinh cố định đạm cộng sinh. Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn cố định đạm và
thực vật họ đậu có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng xuất cây trồng
và bền vững hệ sinh thái.Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn
chế chưa đáp ứng đủ đối với nhu cầu của cây. Việc sản suất tạo chế phẩm đạm sinh
học là vô cùng cần thiết cho nền nông nghiệp nước ta.
Đề tài bao gồmcác thí nghiệm xác định chỉ số tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình lên men Bradyrhizobium, thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh học từ
các chủng Bradyrhizobium.Sử dụng 4 chủng Bradyrhizobium đã được xác định bằng
sinh hóa và phân tử từ trước, khảo sát các yếu tố: thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy,
nguồn cacbohydrate thích hợp, tỉ lệ nguồn cacbohydrate. Khảo sát tỉ lệ than bùn:xơ
dừa thích hợp làm chất mang tạo chế phẩm, khảo sát hoạt tính của chế phẩm lên cây
đậu xanh trên mô hìnhbioassay, thử nghiệm hiệu quả chế phẩm trên cây đậu xanh

trồng ngoài vườn ươm.
Với những phương pháp trên đã xác định được cả 4 chủng vi khuẩn
Bradyrhizobium sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 35 - 37oC.Môi
trường rỉ đường 0,5% là thích hợp nuôi cấy 4 chủng Bradyrhizobium trong quy mô lớn.
Thử nghiệm sản xuất thành công chế phẩm trên nền chất mang than bùn và xơ dừa với tỉ
lệ 3:1. Chế phẩm Bradyhizobium tác động tích cực đến sự hình thành nốt sần và cố định
đạm cung cấp cho cây đậu xanh cả trên mô hình bioassayvà ngoài vườn ươm.

ii

 


SUMMARY
Degradation of agricultural land is happening more seriously because of taking too
much chemical fertilizers and plant protection chemicals. Symbiotic nitrogen fixation is
an important source of nitrogen, and the various legume crops and pasture species often
fix as much as 200 to 300 kg nitrogen per hectare. Globally, symbiotic nitrogen fixation
has been estimated to amount to at least 70 million metric tons of nitrogen per year.
Symbiotic relationship between nitrogen fixing bacteria and legumes has an important
role in soil improvement, stable plant productivity, and sustainable ecosystem. However,
the number of nitrogen-fixing bacteria in the soil is limited so they do not meet enough
the needs of plant. The production of biological nitrogen product is essential for
agriculture in our country. On this basis, the thesis "Research on manufacturing
biofertilizers from biological nitrogen fixation Bradyhizobium strains used for vigna
radiata" was carried out.
The topic includes experiments to determine the optimal index of many factor
that effect on the fermentation ofBradyrhizobium, the biological production from
Bradyrhizobiumstrains. Using fourBradyrhizobium strains were identified by
biochemical and molecular earlier, survey indicators: time, temperature, carbon source

suitable carbon source ratio. Surveying appropriate rate of peatand coir to create the
carrier for making biofertilizers, surveying the activity of preparations using bioassay,
effective test of preparation on the field.
These methods identified four Bradyrhizobium strains which grew and developed
in environmental temperature from 35 - 37oC. Molasses 0,5% is appropriated to
culture 4 Bradyrhizobium strains in large-scale. Producing and successful test
preparations based carrier peat: coir with a 3:1 ratio. Biofertilizers from
Bradyrhizobiumpositive impact on the formation of nitrogen-fixing nodules and
provide forvigna radiata both onbioassay model and on the field.
Key word: Bradyrhizobium, vigna radiata,bio-fetilizer, nitrogen fixation.

iii

 


MỤC LỤC
Trang 
Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i
Tóm tắc ................................................................................................................................ ii
summary ............................................................................................................................. iii
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1
1.2Yêu cầu của đề tài........................................................................................................... 2
1.3Nội dung thực hiện ......................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
2.1.Giới thiệu cây đậu xanh ................................................................................................. 3
2.1.1Khóa phân loại ............................................................................................................. 3
2.1.2Đặc điểm cây đậu xanh................................................................................................ 3
2.1.3Đặc điểm nốt sần trên cây đậu xanh ............................................................................ 3

2.2.Quá trình cố định nitơ .................................................................................................... 4
2.2.1Vai trò của nitơ đối với thực vật .................................................................................. 4
2.2.2Chu trình nitơ trong tự nhiên ....................................................................................... 5
2.2.3Quá trình cố định nitơ .................................................................................................. 5
2.3.Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ .............................................................................. 6
2.3.1Phân loại vi khuẩn cố định nitơ ................................................................................... 6
2.3.2Đặc điểm chung của vi khuẩn cố định nitơ ................................................................. 6
2.3.3Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên ........................................................ 7
2.4.Sơ lược về vi khuẩn Bradyrhizobium ............................................................................ 8
2.4.1Phân loại khoa học....................................................................................................... 8
2.4.2Đặc điểm của vi khuẩn Bradyrhizobium ..................................................................... 8
2.4.3Cơ chế tạo thành nốt sần.............................................................................................. 9
2.5.Sơ lược về chất mang than bùn ................................................................................... 10
2.5.1Các tính chất cần thiết của chất mang ....................................................................... 10
2.5.2Sơ lược về than mùn .................................................................................................. 10
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 13
3.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 13
3.2.Vật liệu nghiên cứu...................................................................................................... 13
iv

 


3.2.1Đối tượng nghiện cứu ................................................................................................ 13
3.2.2Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................... 13
3.2.3Hóa chất ..................................................................................................................... 13
3.3.Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 14
3.3.1.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men các chủng vi khuẩn ............ 14
3.3.1.1Nguyên tắc đếm mật số vi khuẩn bằng phương pháp Drop plate Count ............... 14
3.3.1.2Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ........................................................... 15

3.3.1.3Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy............................................................. 15
3.3.1.4Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbohydrate.................................................. 15
3.3.1.5Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguồn cacbohydrate trong môi trường nuôi cấy...... 16
3.3.2. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng Bradyrhizobium ............... 16
3.3.2.1Khảo sát tỉ lệ chất mang than bùn và xơ dừa ......................................................... 16
3.3.2.2Khảo sát mật số của các chủng Bradyrhizobium trong chất mang......................... 17
3.3.2.3So sánh hiệu quả của chế phẩm với dịch tăng sinh trên mô hình bioassay ............ 18
3.3.2.4Đánh giá hiệu quả chế phẩm ngòai vườn ươm ....................................................... 18
3.4Xử lí số liệu .................................................................................................................. 19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 20
4.1.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................................ 20
4.1.1Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .................................................. 20
4.1.2Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy.......................................................... 21
4.1.3Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbonhydrate ...................................... 22
4.1.4Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường ..................................................... 23
4.2.Tạo chế phẩm vi sinh vật từ các chủng vi khuẩn Bradyrhizobium ............................. 24
4.2.1Kết quả khảo sát tỉ lệ than bùn và xơ dừa ................................................................. 24
4.2.2Kết quả khảo sát mật số của các chủng vi khuẩn Bradyrhizobiumtrên chất mang ... 25
4.2.3.Kết quả so sánh hiệu quả của chế phẩm với dịch tăng sinh trên mô hình bioassay . 26
4.2.3.1 Kết quả theo dõi độ dài rễ cây đậu xanh trên mô hình bioassay ........................... 27
4.2.3.2 Kết quả theo dõi chiều cao cây trên mô hình bioassay ......................................... 28
4.2.3.3 Kết quả theo dõi số lượng nốt sần trên mô hình bioassay ..................................... 29
4.2.4Kết quả đánh giá hiệu quả của chế phẩm ngoài vườn ươm....................................... 31
4.2.4.1Kết quả khảo sát số lượng nốt sần của cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm ........ 31
4.2.4.2 Kết quả khảo sát chiều cao cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm ......................... 33
4.2.4.3 Kết quả khảo sát trọng lượng trái tươi và hạt đậu khô trồng ngoài vườn ươm ..... 34
4.2.3.4 Kết quả kích thước đậu xanh trồng ngoài vườn ươm ............................................ 35
v

 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 38
5.1Kết luận......................................................................................................................... 38
5.2Đề nghị ......................................................................................................................... 38
Tài liệu tham khảo ............................................................................................................. 39
Phụ lục

vi

 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
YMA

Yeast Manitol Agar

YMB

Yeast Manitol Broth

CFU

Colony-forming unit( đơn vị hình thành khuẩn lạc)

ADP

Adenosine Diphosphate

ATP

Adenosine Triphosphate

STT

Số thứ tự

NT

Nghiệm thức

vii

 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa chỉ thu thập mẫu. ............................................................ 13
Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sau 24, 36, 48 và 60 giờ lắc tăng sinh...... 20
Bảng 4.2Mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức tại những nhiệt độ khác nhau .......... 21
Bảng 4.3Mật số vi khuẩn nuôi cấy trong các nguồn cacbohydrate khác nhau ............. 22
Bảng 4.4 Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường rỉ đường ....... 23
Bảng 4.5Mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức sau 15 ngày ..................................... 24
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn trong chất mang ...................................... 25
Bảng 4.7 Độ dài rễ qua các lần theo dõi trên bioassay ................................................ 27
Bảng 4.8 Chiều cao cây sau các lần theo dõi trên bioassay .......................................... 28
Bảng 4.9 Số lượng nốt sần sau các lần theo dõi trên bioassay ..................................... 29
Bảng 4.10 Chiều cao cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm theo thời gian .................. 33

viii

 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây đậu xanh. .................................................................................................. 3
Hình 2.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên. .......................................................................... 5
Hình 2.3 Vi khuẩn Bradyrhizobium và nốt sần trên rễ cây họ đậu................................. 8
Hình 2.4Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ Đậu. ................................................................. 9
Hình 3.1Phương pháp Drop plate Count (đếm sóng nhỏ giọt). .................................... 14
Hình 4.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Bradyrhizobium sau 24 giờ, 37oC trên môi trường YMA.. 21
Hình 4.2 Đậu xanh trồng trên mô hình bioassay. ......................................................... 28
Hình 4.3 Nốt sần trên rễ cây đậu xanh trồng trên bioassay .......................................... 30
Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện số lượng nốt sần trên cây đậu xanh trồng ngoài vườn........ 31
Hình 4.5Nốt sần trên rễ cây đậu xanhtrồng ngoài vườn ươm sau 10 ngày gieo. ......... 32
Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện kích thước nốt sần trên rễ đậu xanh tại vườn ươm. ............ 32
Hình 4.7Chiều cao cây đậu xanh trồng ngoài vườn...................................................... 34
Hình 4.8Biểu đồ biểu diễn trọng lượng trái tươi và hạt khô của đậu xanh .................. 34
Hình 4.9 Hiệu suất thu hồi hạt khô của cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm ............. 35
Hình 4.10Biểu đồ thể hiện trọng lượng trung bình 100 hạt của các nghiệm thức ........ 35
Hình 4.11Biểu đồ thể hiệnkích thước đậu xanh trong từng nghiệm thức..................... 36
Hình 4.12Sử dụng thước kẹp đo kích thước hạt đậu xanh ........................................... 37

ix

 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay tình hình thoái hóa đất nông nghiệp và nguồn nước ngày càng nghiêm
trọng do lạm dụng phân hóa học và thuốc bảo vệ thực vật. Đặc biệt là sự lạm dụng quá
mức phân đạm hóa học.
Cây họ đậu có một khả năng đặc biệt là sản xuất ra nitơ cho chính bản thân nó
thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số vi sinh vật đất hay vi khuẩn nốt sần. Chủ
yếu là vi khuẩn thuộc các chi Rhizobium và Bradyrhizobium(M Becana, 1995). Chúng
có thể cố định được trung bình từ 200 - 300kg/ha (Peoplesvà ctv, 1995). Ước tính mỗi
năm, trên toàn thế giới 70 triệu tấn nitơ được tạo ra từ quá trình cố định đạm cộng sinh
(Brockwell và ctv, 1995). Quan hệ cộng sinh này có vai trò vô cùng quan trọng trong
ổn định chu trình dinh dưỡng nitơ, bổ sung nguồn đạm cho đất và dinh dưỡng cho cây
trồng, ổn định năng suất mùa vụ, phát triển bền vững sinh thái. (Balasundaran, 1996)
Tuy nhiên, với số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn chế chưa đáp
ứng đủ đối với nhu cầu của cây.Vì thế, vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu sản xuất
các chế phẩm sinh học phù hợp dùng để thay phân đạm hóa học, nâng cao hiệu quả sản
xuất. Ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ,
giảm chi phí sản xuất, việc sử dụng phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc
bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững.
Mặc khác, các chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng cố định đạm khác nhau
và chuyên biệt đối với từng giống đậu khác nhau. Vì vậy tuỳ từng loài đậu mà ta sử
dụng các chủng vi khuẩn chuyên biệt được phân lập trên chính loài đậu đó.
Trong các loại cây họ đậu thì cây đậu xanh có vai trò kinh tế cao, giúp cải tạo đất
canh tác, thường được sử dụng thăm canh với các cây trồng khác ngoài ra đóng một
vai trò quan trọng trong đời sống vừa là thức ăn trực tiếp của con người và động vật,
cũng như một số chức năng chữa bệnh hữu hiệu mà nó mang lại.
Trên cơ sở đó,đề tài: “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm cố định đạm sinh học từ
các chủng Bradyhizobiumspp. sử dụng cho cây đậu xanh” được tiến hành.

1


1.2 Yêu cầu của đề tài
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men của vi khuẩn
Bradyrhizobium.
Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh từ các chủng Bradyrhizobiumtrên nền
chất mang than bùn và xơ dừa.
1.3 Nội dung thực hiện
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men của các chủng vi khuẩn
Bradyrhizobium như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, nguồn cacbohydrate và tỉ lệ
nguồn cacbohydrate thích hợp cho sự tăng sinh của các chủng vi khuẩn
Bradyrhizobium.
Khảo sát tỉ lệ phối trộn than bùn và xơ dừa tạo chất mang thích hợp cho các
chủng vi khuẩn Bradyrhizobium. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh vật từ các
chủng Bradyrhizobium. Tiến hành khảo sát mật số vi khuẩn Bradyrhizobium có trong
chế phẩm trong thời gian 3 tháng.Sử dụng mô hình bioassay thử nghiệm, so sánh hiệu
lực của chế phẩm và dịch tăng sinh của các chủng vi khuẩn Bradyrhizobiumtương ứng.
Thử nghiệm chế phẩm trên cây đậu xanh APN 208 ngoài vườn ươm.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu cây đậu xanh
2.1.1 Khóa phân loại
Bộ

: Fabales

Họ

: Fabaceae

Phân họ

: Faboideae

Tông

:Phaseoleae

Phân tông

: Phaseolinae

Chi

: Vigna

Tên khoa học

: Vigna radiate 

Tên đồng nghĩa: Phaeolus aureus Roxb. 
2.1.2 Đặc điểm cây đậu xanh

Hình 2.1: Cây đậu
xanh(Http://cropsdiversity.blogspot.com
)

Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Thái Lan,
Philippines, Indonesia, Myanmar, Bangladesh, Campuchia, Lào và Ấn Độ, mà còn ở
các vùng nóng và khô của miền Nam châu Âu và Nam Mỹ. Đậu xanh được sử dụng
như một loại thực phẩm trong các món ăn mặn và ngọt.
Đậu xanh thuộc loại cây thảo mọc đứng. Lá mọc kép 3 chia, có lông hai mặt. Hoa
màu vàng lục mọc ở kẽ lá. Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng số lượng nhiều, có lông,
trong chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng, có mầm
ở giữa hạt.
Một đặc trưng nổi bật của cây đậu xanhlà các loại cây ký chủ cho nhiều loài vi
khuẩn sống cộng sinh trên rễ của chúng. Các loại vi khuẩn này được biết đến như là vi
khuẩn nốt rễ, có khả năng hấp thụ khí nitơ (N2 ) trong không khí và chuyển hóa nó

thành các dạng đạm hữu cơ mà cây có thể hấp thụ được như (NO3- hay NH3). Hoạt
động này được gọi là cố định đạm. Cây đậu với vai trò là cây chủ cung cấp đường, còn
vi khuẩn nốt rễ với vai trò là nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ra một quan hệ cộng sinh.
2.1.3 Đặc điểm nốt sần trên cây đậu xanh
Giai đoạn hình thành: ở đậu xanh nốt sần được hình thành và phát triển trong thời
kỳ cây con (từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 40 sau khi gieo hạt).

3


Ở những nốt sần trưởng thành, người ta có thể thấy rõ ba vùng sau đây:
Vỏ nốt sần: Gồm vài lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm. Những tế bào này
thường có kích thước nhỏ hơn tế bào vỏ rễ. Sau khi hình thành vỏ nốt sần phần vỏ rễ
sẽ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần.
Vùng phân cắt mạnh mẽ: Vùng này gồm những tế bào không bị xâm nhiễm, nằm
bên dưới lớp vỏ nốt sần. Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phân hóa và tạo thành
các tế bào vỏ nốt sần, các tế bào chứa vi khuẩn và các tế bào mạch dẫn.

Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩn nằm xen lẫn
với các tế bào không chứa vi khuẩn. Thể tích của mỗi tế bào chứa vi khuẩn có thể lớn
đến gấp 8 lần so với tế bào không chứa vi khuẩn.
Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần bắt đầu phát triển, một số tế bào nằm
giữa phần vỏ nốt sần và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hóa và phân cắt thành các tế bào
mạch dẫn của nốt sần. Về sau các mạch dẫn này sẽ liên kết với hệ thống mạch dẫn của
rễ cây. Số bó mạch trong mỗi nốt sần tùy loại cây mà thay đổi trong khoảng 1-12.
2.2. Quá trình cố định nitơ
2.2.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật
Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển cũng như năng
suất cây trồng. Nitơ có trong thành phần của hầu hết các chất trong cây như protein,
enzyme, acid nucleotic, diệp lục, các chất dự trữ năng lượng: ADP, ATP, các chất điều
hòa sinh trưởng. Nitơ thường chiếm 1 - 5% khối lượng khô của thực vật. Tuy hàm
lượng trong cây thấp nhưng nó ảnh hưởng đến cả sinh lý và năng suất của cây. Cây
thiếu nitơ các hoạt động sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá
vàng, khả năng đẻ nhánh và phân cành kém, giảm khả năng quang hợp và tích lũy nên
năng suất giảm. Ngược lại nếu thừa nitơ và các điều kiện thuận lợi, protein được tổng
hợp nhiều làm giảm sự tích lũy ở tế bào sinh dưỡng, tạo nhiều chất nguyên sinh, kết
quả là cây mọng nước, thân lá vươn dài dễ gãy đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có
khi không có thu hoạch.
 

4


2.2.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên

Hình 2.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên
( />
Chu trình nitơ trong tự nhiên có 2 giai đoạn là cố định nitơ và khoáng hóa nitơ. Giai

đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ như Bradyrhizobium và Rhizobiumsống
cộng sinh trong rễ cây họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N2 trong không khí
thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và
đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Ở giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các
chủng vi khuẩn nitrat hóa nhưNitrosomomas và Nitrobacter để chuyển NH3 thành nitrat
(NO3-) dạng thích hợp nhất để cây trồng hấp thu (B. Carroll và D. Salt, 2004).
2.2.3 Quá trình cố định nitơ
Quá trình cố định nitơ sinh học là một quá trình khử N2 thành NH3 dưới tác dụng
của enzyme nitrogenase sinh ra bởi vi sinh vật.
Nitrogenase
2NH4 + 12ADP + 12P + 4H+

N2 + 6e + 12ATP + 12H2O

Nitrogenase được sinh ra bởi vi khuẩn Azotobacter, một loài vi khuẩn cố định nitơ
sống tự do trong đất. Nitrogenase bao gồm hai thành phần khác nhau, một thành phần
gồm protein và Fe, một thành phần gồm protein, Fe, Mo. Electron của các chất khử sẽ đi
vào thành phần thứ nhất của nitrogenase, sau đó được chuyển sang thành phần thứ hai,
qua đó electron được hoạt hóa. Hydro được hoạt hóa nhờ các enzyme của hệ thống

5


hydrogenase. Năng lượng dùng cho quá trình này là ATP của tế bào. Cuối cùng NH3 được
hình thành. NH3 được hình thành đến mức độ nào đó sẽ kiềm hãm sự hoạt động của
nitrogenase, nó chính là yếu tố điều hòa hoạt tính của enzyme (Bulen và LeComte, 1996)
Ở vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh với cây họ đậu, cơ chế cố định nitơ có
phần phức tạp hơn ở vi khuẩn cố định nitơ tự do vì nó liên quan đến thực vật. Vai trò
của thực vật ở đây chính là sự hình thành Leghemoglobin, chất này đóng vai trò chuỗi
chuyền điện tử từ quá trình quang hợp của cây vào nitrogenase của vi khuẩn. Enzyme

nitrogenase của vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với cây đậu cũng có cấu trúc giống như
nitrogenase của vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất (Lê Xuân Phương, 2005).
2.3. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ
2.3.1 Phân loại vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ được chia làm 3 nhóm: vi khuẩn cố định nitơ sống tự do,
vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh và vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật
ký chủ. Tuy nhiên, giữa nhóm vi khuẩn sống tự do và vi khuẩn cộng sinh vẫn chưa
được mô tả rõ ràng nên một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm.
Giới

: Bacteria

Ngành : Proteobacteria
Lớp

: Alphaproteobacteria

Bộ

: Rhizobiales

2.3.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do là những vi khuẩn tương tác với thực vật để cố
định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây nhất định mà theo hướng cộng sinh
chuyên biệt. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter,
Psedomonas và Lostridium.
Vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh là những vi sinh vật sống cộng sinh với thực
vật kí chủ theo kiểu đôi bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi
chất dinh dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định
cư, điển hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ cây họ đậu. Hiện tượng cộng sinh giữa vi

khuẩn và thực vật được xem là sự tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó vi
khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn
Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ đậu. Ban đầu những vi khuẩn
cộng sinh ở cây họ đậu được phân loại thành chi Rhizobium, do đó những vi khuẩn này
6


thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ (Rhizobia). Ngày nay, những vi sinh
vật sống cộng sinh ở rễ cây họ đậu được phân loại thành nhiều chi, trong đó hầu hết các
loài thuộc chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium và Sinorhizobium.
Vi khuẩn cố định nitơ tương tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình trao
đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật.
Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả thực vật và vi khuẩn cố định nitơ
đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác
bắt buộc. Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa quá trình
cố định nitơ cộng sinh và tự do.Vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi
khuẩn sống tự do trong vùng lân cận rễ cây đến những vi khuẩn sống nội sinh bên
trong mô tế bào thực vật. Một số vi khuẩn tham gia cố định nitơ tương tác điển hình
như: Azosprium, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbaspirillum và
Klebsiella (Gnamanickam, 2006).
2.3.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Trong môi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, từ phân tử dạng
khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động vật, thực vật và con
người. Trong cơ thể sinh vật, nitơ tồn tại chủ yếu dưới dạng các hợp chất đạm hữu cơ
như protein, axit amin. Khi cơ thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu cơ này tồn tại ở
trong đất. Dưới tác dụng của các nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải
thành NH3 hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amon hóa. Và quá trình này được gọi là sự
khoáng hóa chất hữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng.
Dạng NH4+ sẽ được chuyển thành dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa. Khí nitơ
sẽ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hóa thành dạng

nitơ hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố định nitơ. Như vậy vòng tuần hoàn nitơ được khép kín.
Trong hầu hết các khâu chuyển hóa của vòng tuần hoàn đều có sự hiện diện của của các
nhóm vi sinh vật khác nhau. Nếu sự hoạt động của một nhóm nào đó bị ngừng lại, toàn bộ
sự chuyển hóa của vòng tuần hoàn cũng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.

7


2.4.

Sơ lược về vi khuẩn Bradyrhizobium

2.4.1 Phân loại khoa học
Giới

: Bacteria

Ngành

:Proteobacteria

Lớp

: Alphaproteobacteria

Bộ

: Rhizobiales

Họ

: Bradyrhizobiaceae

Chi

: Bradyrhizobium

Một số loài đã được định danh:
B. betae (2004, Rivas) ; B. canariense (2005, Vinuesa ) ; B. elkanii (1992,
Kuykendall ) ; B. iriomotense (2010, Islam) ; B. japonicum (1896, Kirchner) ; B.
jicamae (2009, Ramírez-Bahena) ; B. liaoningense(1995, Xu) ; B. pachyrhizi (2009,
Ramírez-Bahena) ; B. yuanmingense (2002, Yao); B. denitrificans (2006, van Berkum)
2.4.2 Đặc điểmcủa vi khuẩn Bradyrhizobium
Đặc điểm của chi Bradyrhizobium spp. Là loài vi khuẩn đất Gram âm, có vai trò
quan trọng trong chu trình cố định Nitơ. Là những loài mọc chậm, sản sinh chất kiềm.
Nuôi cấy trên môi trường YMA ở điều kiện nhiệt độ phòng, khuẩn lạc sẽ hình thành
sau 3 - 5 ngày, có kích thước tế bào 0,3 - 1,2 x 2,2 - 3,2 μm, có từ 1 - 2 tiên mao, có
khả năng di động.

a)

b)

Hình 2.3 Vi khuẩn Bradyrhizobium và nốt sần trên rễ cây họ đậu. a)Vi khuẩn
Bradyrhizobium (McDermott và Graham); b) Nốt sần trên rễ cây họ đậu
( />
 

8

2.4.3 Cơ chế tạo thành nốt sần
Vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua lông hút đôi khi thông
qua vết thương. Một số cây họ đậu tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích
thích những vi khuẩn tương ứng với mình phát triển mạnh hơn (để có thể nhiễm vào
thực vật, vi khuẩn phải đạt mật số tế bào 104tế bào/g đất).
Vi khuẩn sau khi tiếp xúc với lông hút của thực vật, tạo thành dãy xâm nhập đi
dần vào bên trong của rễ và xâm nhập vào nhu mô kích thích tế bào thực vật bị phân
chia nhanh chóng thành tế bào mới. Vi khuẩn đi vào tế bào chất và phân chia chuyển
thành thể giả khuẩn. Giả khuẩn không phân chia được nhưng phát triển mạnh tăng
nhiều ribosome, nốt sần xuất hiện.

Hình 2.4 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ đậu
(Deakin và Broughton, 2009)
Những cây đậu có đời sống 1 năm và lâu năm cũng có sự khác biệt về tính chất
nốt sần. Ở đậu phộng, đậu xanh nốt sần có khả năng cố định nitơ thường có màu hồng,
kích thước lớn, thường nằm trên rễ chính trong khi nốt sần vô hiệu có màu lục, kích
thước nhỏ thường nằm trên rễ phụ. Tuy nhiên ở một số cây đậu lâu năm thì không theo
quy luật đó. Ví dụ như cây keo tai tượng dùng để trồng rừng, nốt sần hữu hiệu có cả ở
rễ phụ và không có màu hồng (Lê Xuân Phương,2005).
Nốt sần thích hợp ở các điều kiện: Độ ẩm của đất: 60 - 70%, độ thoáng khí: càng
nhiều càng tốt, điều này cho thấy rễ càng sâu lượng nốt sần càng kém, pH thích hợp từ
4,6 - 8,0. Phân đạm thường ức chế tạo thành nốt sần, phân lân, kali có tác dụng tích cực,
phân canxi, magiê và các muối khác cũng có tác dụng tốt đến quá trình tạothành nốt sần.
Chất dinh dưỡng cacbohydratenhư nước đường, rơm, rạ làm tăng khả năng xâm nhập và
khả năng cố định nitơ, ngược lại những vi sinh vật cho kháng sinh sẽ gây ức chế vi

9

khuẩn Bradyrhizobium. Thường nốt sần chỉ hình thành ở phần rễ nông, phần rễ sâu rất ít
nốt sần. Nguyên nhân là do tính hiếu khí của vi khuẩn, thiếu oxi sẽ làm giảm cường độ
trao đổi năng lượng và khả năng xâm nhập vào rễ cây. Nhiệt độ thích hợp nhất với hoạt
động của vi khuẩn là 24oC, dưới 10oC nốt sần vẫn có thể hình thành nhưng hiệu quả cố
định nitơ giảm. Ở nhiệt độ 36oC cây đậu phát triển tốt nhưng cường độ cố định nitơ lại
kém. Giá trị pH cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần, có loại vi
khuẩn chỉ hình thành nốt sần ở pH từ 6,8 đến 7,4; có loại vi khuẩn có khả năng hình
thành nốt sần ở pH rộng hơn từ 4,6 đến 7,5 (Nguyễn Lân Dũng, 2003).
Tính đặc hiệu là một đặc điểm quan trọng trong quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn
nốt sần và cây họ đậu. Một loài vi khuẩn chỉ có khả năng cộng sinh với một hoặc vài
loài đậu. Cũng có một số loài vi khuẩn có khả năng hình thành nốt sần ở câyD đậu
không đặc biệt với nó nhưng số lượng nốt sần ít và khả năng cố định nitơ kém. Tuy
nhiên đặc tính này giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại ở những nơi không có cậy đậu đặc
biệt với nó. Tính đặc hiệu giữa cây đậu và vi khuẩn được quyết định bởi hệ gene
củachúng. Bởi vậy người ta có thể cải biến tính đặc hiệu này bằng các tác nhân đột
biến hoặc có thể dùng kỹ thuật di truyền để cải biến hệ gene quy định đặc hiệu cộng
sinh (Lê Xuân Phương, 2001).
2.5. Sơ lược về chất mang than bùn
2.5.1 Các tính chất cần thiết của chất mang
Chất mang đóng vai trò rất quan trọng trong sản xuất chế phẩm trên nền cứng.
Các tính chất của một chất mang tốt là:Bảo đảm cho Bradyrhizobium sinh trưởng và
tồn tại, có khả năng hấp thu ẩm tốt, dễ dàng sản xuất, khử trùng bởi autoclave hoặc là
chiếu xạ gramma 19. Sẵn có với số lượng đủ giá thành thấp, khả năng bám dính tốt
vào hạt và khả năng đệm pH tốt.
Than mùn được nghiên cứu nhiều nhất và được sử dụng nhiều nhất như là chất
mang cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần. Hầu hết chế phẩm vi khuẩn nốt sần được
sản xuất trên nền chất mang than bùn sau khi đã được xây nhuyễn và trung hoà pH.
2.5.2 Sơ lược về than mùn
Than mùn là một loại mùn mà ở đó các vật thể hữu cơ đã bị phân giải nhưng
chưa hết, môi trường thường chứa nước, đồng thời môi trường đất thường rất chua, rất

nghèo Ca2+ và Mg2+ làm cho các vật thể hữu cơ biến đổi không hoàn toàn, có màu đen,
thường tơi xốp, đôi khi khô, hàm lượng các bon rất cao.
10


Theo số liệu điều tra của các nhà khoa học, trên thế giới trữ lượng than bùn có
khoảng 300 tỷ tấn, chiếm 1,5% diện tích bề mặt quả đất. Than bùn được hình thành do
sự tích tụ và phân huỷ không hoàn toàn tàn dư thực vật trong điều kiện yếm khí xảy ra
liên tục.Quá trình này diễn ra tại các vùng trũng ngập nước. Các vùngđất ngập nướclà
những vùng có năng suất sinh học cao, điều kiện phát triển của thực vật rất thuận lợi.
Tuy nhiên, lớpthổ nhưỡngtại các vùng này luôn trong điều kiện yếm khí.Do đó, mặc
dù sinh khối các loài cỏ sống trên mặt nước tăng nhanh, nhưng quá trình phân giải xác
thực vật lại xảy ra chậm và không đạt tới giai đoạn vô cơ hoá dẫn đến tích luỹ hữu cơ.
Tiếp theo cỏ là lau, lách, cây bụi, cây thân gỗ thay thế, kết hợp với quá trình kiến tạo
địa chất, quá trình bồi tụ, lắng đọng phù sa đã chôn vùi kể cả cây thân gỗ, làm cho hữu
cơ tích tụ thành các lớp và tạo thành than bùn.Hàm lượng các chất dinh dưỡng trong
than bùn thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần các loài thực vật và quá trình phân huỷ các
chất hữu cơ.
Than bùn đã qua sàng và nghiền phân loại, đáp ứng cho tiêu chuẩn sản xuất phân
bón hữu cơ vi sinh với các tiêu chuẩn như sau:
Than bùn loại 1: hàm lượng hữu cơ từ 30%đến35%, có màu đen than, độ mịn qua
sàng là 3,5mm, độ ẩm từ 20% đến30%.Than bùn loại 2: hàm lượng hữu cơ từ 17%
đến25%, có màu đen nhạt lẫn nâu, độ mịn qua sàng là 3,5mm, độ ẩm từ 20% đến
30%.Than bùn loại 3: hàm lượng hữu cơ nhỏ hơn 16%, có màu nâu đen, độ mịn qua
sàng là 5mm, độ ẩm từ 20% đến 35%.
Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Bradyrhizobium thì được bảo vệ và tồn tại tốt
trên than bùn. Tuy nhiên, tính chất lý hoá học của than bùn không phải là chỉ tiêu duy
nhất để xác định chúng có phù hợp cho sản xuất hay không. Ngoài các tính chất của
than bùn như là độ mặn, sét, lượng hữu cơ và sự tạp nhiễm bới các kim loại thì còn có
các yếu tố không xác định được ảnh hưởng đến sự phù hợp của than bùn như là một

chất mang. Than bùn từ các nguồn khác nhau cần thiết phải kiểm tra sau khi đưa về
cùng kích thước hạt và ẩm độ (nếu có thể).
Than bùn có hợp chất bitumic rất khó phân giải. Nếu bón trực tiếp cho cây không
những không có tác dụng tốt mà còn làm giảm năng suất cây trồng. Vì vậy, than bùn
muốn dùng làm phân bón phải khử hết bitumic.Có thể dùng tác động của nhiệt để khử
bitumic trong than bùn hoặc phơi nắng một thời gian để oxy hoá bitumic hoặc đun
nóng than bùn ở nhiệt độ 70oC(Cuctrongtrot.Gov.Vn). Trong than bùn có axit humic,
11


có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây. Hàm lượng đạm tổng số trong than bùn
cao hơn trong phân chuồng gấp 2 - 7 lần, nhưng chủ yếu ở dưới dạng hữu cơ. Các chất
đạm này cần được phân huỷ thành đạm vô cơ cây mới sử dụng được.
pH chất mang rất quan trọng và tính acid của than bùncần được trung hoà với
calcium hay magnesium carbonate. pH thích hợp là 6,8-7,0. Vôi mịn dùng trong nông
nghiệp thì thích hợp cho việc trung hoà than bùn.Điều chỉnh pH của than bùn cần phải
thực hiện thật cẩn thận, chờ thời gian cân bằng. Phảnứng giữa vôi và H+ trong than bùn
phụ thuộc kích thước của cả vôi và than bùn. Hạtcàng nhỏ thì phản ứng càng nhanh. Số
lượngvôi để trung hoà cũng phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ, sét và khả năng đệm của
thanbùn. Sau khi trộn lẫn than bùn và vôi thì cần thiết cho phép phản ứng xảy ra trong
vàituần trước khi đo pH. Cũng cần thiết đo pH theo thời gian. Vôi mịn dùng trong
nôngnghiệp (Aglime, calcium carbonate qua rây 150 μm mesh) là vôi tốt nhất sử dụng
đểtrung hoà than bùn. Vôi xây dựng thì quá mạnh còn các vôi khác thì lại nhẹ.
Ẩm độ của than bùn cũng quan trọng. Ẩm độ 40 đến 50% thì thuận lợi nhất cho sự
tăng trưởng và tồn tại của nhiều chủngBradyrhizobium. Cải thiện ẩm độ than bùn hoặc là
hỗn hợp của than bùn và các chất mangkhác thì cần chú ý. Trước khi trộn than bùn với
dịch sinh khối, than bùn cần được khửtrùng ở ẩm độ 20% (Trần Thị Yến Thảo, 2010).

12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013. Tại viện nghiên
cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh, khu phố 6, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Giống đậu xanh APN 208 của Công ty TNHH An Phú Nông.
4 chủng vi khuẩn cố định đạm chi Bradyrhizobium đã được xác định bằng sinh
hóa và phân tử từ trước và được kí hiệu trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa chỉ thu thập mẫu
Stt

Tên mẫu

Nơi lấy mẫu

Loại đậu

1

X4

Thủ Đức-TP.Hồ Chí Minh

Đậu xanh

2

A3.2.I

Đăk Lăk

Đậu xanh

3

H1

Hóc Môn-TP. Hồ Chí Minh

Đậu xanh

4

H3

Hóc Môn-TP. Hồ Chí Minh

Đậu xanh

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp, hệ thống bioassay, máy nước cất, máy
lắc có điều chỉnh nhiệt độ.
Ống nghiệm, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại ống đong, đĩa petri.
Micropipette, cân, kính hiển vi, bịch polyme, kính lúp, thước kẹp.
Que cấy: que cấy thẳng, que cấy vòng.
3.2.3 Hóa chất
Hóa chất dùng để nuôi cấy vi khuẩn: môi trường YMA,môi trường YMB,

Ethanol 96o, Ethanol 70o, rỉ đường, glucose, saccharose.
Hóa chất dùng để nhuộm rễ đậu xanh: dung dịch axit Fuchsin, dung dịch
Glycerol làm chua bằng axit HCl, axit acetic 1%. Nước tẩy Javen. 
Hóa chất dùng làm chất mang: than bùn, xơ dừa, rỉ đường,calcium carbonate.

13


3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men các chủng vi khuẩn
Bradyrhizobium
3.3.1.1Nguyên tắc đếm mật số vi khuẩn bằng phương pháp Drop plate Count (đếm
sóng nhỏ giọt)
Dựa trên nguyên tắc của phương pháp đếm gián tiếp số lượng của vi sinh vật trên
môi trường thạch đĩa, việc đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc trên môi trường
thạch đĩa sau thời gian nuôi cấy xác định. Nguyên tắc căn bản đó là xem một khuẩn lạc
được tính như là một tế bào vi sinh vật có trong mẫu ban đầu. Cụ thể sử dụng phương
pháp Drop plate Count.
10-n
10-(n-1)
10-(n-2)

Cùng độ pha loãng
Hình 3.1 Phương pháp Drop plate Count
Công thức tính số lượng vi khuẩn trong 1 ml dịch mẫu ở một độ pha loãng:
A(cfu/ml) = a x B x h
Trong đó :
a=

∑

: số khuẩn lạc trung bình có trên một hàng ngang ở một độ pha loãng

ai: tổng số khuẩn lạc trên một hàng ngang ở một độ pha loãng
n: số lần lặp lại cho mỗi độ pha loãng
h: hệ số pha loãng
B= : hệ số thể tích quy ra 1 ml
Tính số lượng vi khuẩn trong 1 ml dịch mẫu nguyên: lấy trung bình của số lượng
vi sinh vật có trong 1 ml dịch mẫu ở n độ pha loãng khác nhau (A1, A2, A3).
Atb =
Ưu điểm: Dễ thực hiện, chính xác và nhanh chóng.

14