Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm một số chủng vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum) tại Đắk Lắk

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG VĂN HIỂN

Tên đề tài:
TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum) TẠI
ĐẮK LẮK

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Ngành/chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Lớp
: K46 - CNSH
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2014 - 2018

Thái Nguyên - năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG VĂN HIỂN
Tên đề tài:
TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ CHỦNG

VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum) TẠI
ĐẮK LẮK

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành/chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Lớp
: K46 - CNSH
Khoa
Khóa học

: CNSH - CNTP
: 2014 - 2018

Người hướng dẫn

: 1. PGS. TS. Phí Quyết Tiến
2. ThS. Bùi Đình Lãm

Thái Nguyên - năm 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đề tài trong

luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu và nhiệt tình
của các thầy cô và cán bộ tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phí Quyết
Tiến Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ
lên men, Viện Công nghệ sinh học, người đã tạo điều kiện, tận tâm hướng
dẫn tôi trong nghiên cứu khoa học trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Bùi Đình Lãm, Khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình học tập để hoàn
thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động
viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp tốt nhất.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Dương Văn Hiển

i


ii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
Từ, thuật

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

ngữ viết tắt

Bp

Base pair (Đơn vị cặp base)

CMC

Cacboxy Methy Cellulose

DNA

Axit Deoxyribonucleic

IAA

β-indol-acetic acid (Auxin)

NCBI

National Center for Biotechnology Information
(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)

OD

Optical Density (Mật độ quang)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RI

Relative Inhibition (Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm)

RNA

Acid Ribonucleic

VKNS

Vi khuẩn nội sinh

VSV

Vi sinh vật

w/v

Đơn vị khối lượng trên thể tích

ii


3

DANH MỤC BẢNG
STT
1
2
3
4

5
6
7
8
9

Tên bảng

Trang

2.1. Một số nghiên cứu vi khuẩn nội sinh từ hồ tiêu trên thế

13

giới
3.1. Trình tự cặp mồi khuếch đại gen 16S rDNA

19

4.1. Khả năng kháng nấm gây bệnh của các chủng vi khuẩn

21

nội sinh phân lập trên cây hồ tiêu
4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi

25

khuẩn nội sinh
4.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu

29

tại Đắk Lắk
4.4. Đặc điểm hình thái của chủng HDL17 và chủng HDL34

30

4.5. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng

31

HDL17 và chủng HDL34
4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh

32

trưởng của chủng HDL17 và chủng HDL34
4.7. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng HDL17 và

34

chủng HDL34

iii


4

DANH MỤC HÌNH

STT
1
2
3
4

Tên hình
2.1. Cây hồ tiêu (Piper nigrum)
2.2. Cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh do bị nhiễm nấm
Phytophthora capsici
2.3. Cây hồ tiêu bị bệnh chết chậm do nhiễm nấm Fusarium
oxysporum
4.1. Khả năng kháng nấm gây bệnh của 36 chủng vi khuẩn nội
sinh trên cây hồ tiêu

Trang
8
9
11
23

4.2. Vi khuẩn nội sinh đối kháng nấm gây bệnh: (A), (B), (C)
đối chứng 3 loại nấm bệnh lần lượt là Rhizoctonia solani,
5

Phytophthora capsici và Fusarium oxysporum, (D): Chủng
HDL13 kháng nấm Rhizoctonia solani, (E): Chủng HDL10,

24

HDL21, HDL22, HDL34 kháng nấm Phytophthora capsici,
(F): Chủng HDL07 kháng nấm Fusarium oxysporum.
6
7
8
9
10

4.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh
trên cây hồ tiêu
4.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn
nội sinh. A: chitinase; B: protease; C: cellulase.
4.5. Hình thái khuẩn lạc chủng HDL17 (A) và chủng HDL34
(B) trên môi trường MPA
4.6. Ảnh nhuộm Gram của chủng HDL17 (A) và chủng
HDL34 (B).
4.7. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên
gel agarose 1,0%

27
28
30
30
33

iv


5

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. i
DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ........................................... ii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... iv
MỤC LỤC ..................................................................................................... v
Phần 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát................................................................................ 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................. 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................. 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
2.1. Vi khuẩn nội sinh trên thực vật ................................................................ 3
2.1.1. Khái niệm vi khuẩn nội sinh ................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại vi khuẩn.............................................. 3
2.1.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn ........................................................ 3
2.1.2.2. Phân loại vi khuẩn ............................................................................. 4
2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn nội sinh........................................... 6
2.2. Cây hồ tiêu và bệnh trên cây hồ tiêu ........................................................ 8
2.3. Tiềm năng phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu .......................... 11
2.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu tại Việt Nam... 13
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 15
3.1. Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................... 15
v


6

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 15
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 15
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu........................................................................... 15
3.1.4. Thời gian nghiên cứu .......................................................................... 15
3.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ................................................................ 15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 16
3.3.1. Đánh giá hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh với nấm
gây bệnh ....................................................................................................... 16
3.3.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào ......................................... 17
3.3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn ......................... 17
3.3.3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc ............................................................ 17
3.3.3.2. Phương pháp nhuộm Gram .............................................................. 17
3.3.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................... 18
3.3.4. Phân loại chủng vi khuẩn được tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự
gen 16S rDNA.............................................................................................. 19
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 20
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 21
4.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu có khả năng
kháng nấm gây bệnh..................................................................................... 21
4.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào......................................................................................... 25
4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại chủng HDL17 và chủng
HDL34......................................................................................................... 29
4.3.1. Đặc điểm hình thái.............................................................................. 29
4.3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.................................................................. 31
4.3.3. Phân loại chủng HDL17 và chủng HDL34 dựa trên phân tích trình tự
gen 16S rDNA.............................................................................................. 33
vi

vii

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 36
5.1. Kết luận ................................................................................................. 36
5.2. Kiến nghị............................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 37
I. Tiếng Việt ................................................................................................. 37
II. Tiếng Anh................................................................................................ 37
III. Ngôn ngữ khác ....................................................................................... 43
IV. Trang Web ............................................................................................. 43
PHỤ LỤC

vii


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây hồ tiêu có tên khoa học là Piper nigrum, thuộc họ hồ tiêu. Cây hồ
tiêu được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp
quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2014, Đắk Lắk trở thành tỉnh có diện tích
hồ tiêu lớn nhất cả nước với 16,1 nghìn ha, chiếm 36,7% diện tích vùng Tây
Nguyên và 18,8% diện tích hồ tiêu cả nước [1]. Tuy nhiên, Chi cục Bảo vệ
thực vật tỉnh Đắk Lắk cho biết, tính đến hết tháng 9 năm 2016 trên địa bàn
toàn tỉnh có hơn 1,822 ha hồ tiêu bị nhiễm bệnh. Trong đó, diện tích tiêu bị
nhiễm bệnh vàng lá chết nhanh là hơn 507 ha; vàng lá chết chậm: 1,038 ha;
rệp sáp hại rễ: 73,6 ha, tuyến trùng: 191,4 ha [55]. Bệnh chết nhanh do sự tấn

công đồng loạt của 5 đến 7 loài nấm, chủ yếu là nấm Phytophthora spp. gây
ra. Bệnh chết chậm do sự kết hợp gây hại của tuyến trùng và nấm trong đất,
chủ yếu là 2 loài tuyến trùng Meloidogyne spp. và Radopholus similis gây ra.
Các bệnh kể trên làm giảm năng suất hồ tiêu, thậm chí gây chết cây.
Trước thực trạng đó, biện pháp sinh học được thay thế để diệt trừ bệnh
hại cũng như để hạn chế các tác động tiêu cực do thuốc hóa học gây ra. Biện
pháp sinh học là sử dụng các chủng vi sinh vật (VSV) đối kháng với các
nguồn gây bệnh tạo ra chế phẩm sinh học nhằm phòng chống bệnh và giảm
các tác động xấu từ thuốc bảo vệ có nguồn gốc hóa học. Đặc biệt, vi khuẩn
nội sinh (VKNS) trong cây thực vật là những VSV có thể sống trong các mô
thực vật và không gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quá trình phát triển bình
thường của cây. VKNS còn được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về khả năng
ức chế và kiểm soát bệnh thực vật, khả năng sinh enzyme, chất kích thích sinh
trưởng thực vật, chất diệt cỏ [7]. Ngoài giá trị kinh tế từ cây hồ tiêu mang lại,
loại cây trồng này còn là môi trường sinh sống của VKNS.


Xuất phát từ những cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn đó, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm một số chủng vi
khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum) tại Đắk Lắk”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
- Nghiên cứu các chủng VKNS trên cây hồ tiêu có khả năng kháng nấm
gây bệnh tại Đắk Lắk.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Tuyển chọn các chủng VKNS trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk có khả
năng diệt nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng VKNS được
tuyển chọn.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Đề tài có giá trị khoa học lớn vì nội dung của đề tài là cơ sở để chọn
lọc các chủng VKNS có lợi. Bên cạnh đó chưa có nhiều nghiên cứu về VKNS
trên đối tượng cây hồ tiêu tại Việt Nam.
- Đề tài tiếp nối các nghiên cứu khoa học về nấm và bệnh trên cây hồ
tiêu tại Tây Nguyên, Việt Nam.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Đề tài dự kiến tuyển chọn được một số chủng có khả năng kháng nấm
gây bệnh trên cây hồ tiêu.
- Đề tài có tính cấp thiết góp phần ngăn chặn bệnh hại trên cây hồ tiêu
giúp nâng cao năng suất và sản lượng của cây hồ tiêu.


Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn nội sinh trên thực vật
2.1.1. Khái niệm vi khuẩn nội sinh
Khái niệm VKNS được định nghĩa và sửa đổi theo nhiều nghiên cứu
khác nhau. Năm 1948, Tervet và Hollis định nghĩa VKNS là VSV có khả
năng sống bên trong thực vật mà không gây ra các triệu chứng bệnh cho cây
chủ [8]. Năm 1992, Kado định nghĩa VKNS là quần thể vi khuẩn cư trú bên
trong sinh vật sống mà không gây tổn hại hoặc nhận được một số lợi ích từ
cây chủ [9]. Năm 2006, Theo Schulz & Boyle VKNS được định nghĩa là vi
khuẩn xâm nhập vào mô bên trong của thực vật và không biểu hiện nhiễm
trùng ngoài hoặc tác động tiêu cực lên cây chủ [10]. Trong số các định nghĩa
được đưa ra, định nghĩa của Hallmann và cộng sự là phù hợp nhất. Theo
Hallmann, VKNS là tất cả các vi khuẩn cư trú trong nội mô của thực vật,
chúng không biểu hiện ra bên ngoài và không tác động xấu đến cây chủ [11].
VKNS thực vật được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, chúng cư
trú ở trong mô của thực vật và giữa chúng hình thành các mối quan hệ khác

nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh [12]. Hầu hết
các VKNS bắt đầu xuất hiện ở vùng rễ hay lá, một số loại vi khuẩn có thể nội
sinh trên hạt. Nhiều VKNS thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và
đóng vai trò là một tác nhân kiểm soát sinh học [13]. VKNS sản xuất các sản
phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật từ đó có thể khai thác những sản phẩm này
để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp [14].
2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại vi khuẩn
2.1.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn
* Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử
Vi khuẩn là nhóm VSV đã có cấu tạo tế bào. Đa số vi khuẩn không có
tiên mao, khả năng di chuyển rất hạn chế. Kích thước đường kính (0,2 ÷ 2,2


µ m) x chiều dài (2,0÷8,0 µ m). Vi khuẩn đa số có hình que, hình cầu, hay
hình xoắn, những vi khuẩn có hình dạng như vậy được gọi là trực khuẩn
(bacillus), cầu khuẩn (coccus) và xoắn khuẩn (spirillum). Một nhóm khác nữa
là phẩy khuẩn (vibrio) có hình dấu phẩy. Hình dạng không còn được coi là
một tiêu chuẩn định danh vi khuẩn, tuy nhiên có rất nhiều chi được đặt tên
theo hình dạng (ví dụ: Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus) và là đặc
điểm quan trọng để nhận dạng các chi này. Dựa theo hình thái bên ngoài có
thể chia vi khuẩn thành 5 loại hình khác nhau: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu
trực khuẩn, xoắn khuẩn và phẩy khuẩn [15].
* Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
sử dụng các nguồn nitơ, nhu cầu về các chất kích thích sinh trưởng, khả năng
biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về
oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của
môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác
nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo
thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ

khuẩn. Về nhu cầu sử dụng oxy, vi khuẩn được chia thành 3 loại chính là: hô
hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí và hô hấp hiếu khí kỵ khí tùy tiện.
Ngoài ra đặc điểm sinh lý sinh hóa còn biểu thị về các mối quan hệ
giữa vi khuẩn với các chất kìm hãm sinh trưởng khác nhau, tính chất đối
kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh
và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của vi khuẩn.
2.1.2.2. Phân loại vi khuẩn
* Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy:
Vi khuẩn được phân loại tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và
tính chất nuôi cấy, sắc tố tan, hình dạng của khuẩn lạc, hình dạng và kết cấu
bề mặt bào tử. Trong đó, khuẩn lạc của vi khuẩn có hình dạng, kích thước,
màu


sắc, đặc thù bề mặt, độ láng bóng... khác nhau, đặc trưng cho các nhóm, các
loài vi khuẩn khác nhau. Có thể phân biệt ba dạng khuẩn lạc chủ yếu như sau:
Dạng S: khuẩn lạc nhẵn, bề mặt bóng, rìa nhẵn; Dạng R: khuẩn lạc xù xì,
bề mặt trong mờ không nhẵn bóng, rìa nhăn; Dạng M: khuẩn lạc nhớt.
Trong quá trình sinh trưởng phát triển, vi khuẩn có khả năng tạo thành
các sắc tố tùy theo loài vi khuẩn có vai trò bảo vệ, chống tác động có hại của
ánh sáng tia tím hoặc có vai trò như một chất có hoạt tính kháng sinh, đối
kháng. Có nhiều loại sắc tố có màu khác nhau: màu xanh lục, màu xanh lơ,
màu đỏ, màu vàng, màu đen. Trong số này, có loại sắc tố thẩm thấu khuếch tán
vào môi trường làm biến đổi màu môi trường nhân tạo khi nuôi cấy vi khuẩn.
Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việc nghiên cứu
phân loại bằng sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [16].
* Phân loại vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA:
Từ những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học
phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là
phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có

độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản
phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại vi khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3
phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen 16S rDNA
[17]. Hiện nay, việc nghiên cứu gen 16S rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất
để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì gen này có mặt
trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [17].
Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự
16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp
hơn 70% sẽ là 99% [18]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S
rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng
có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.


2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn nội sinh
Nghiên cứu và ứng dụng VKNS ngày càng nhận được nhiều sự quan
tâm trong phát triển các ngành nông nghiệp, công nghiệp, dược phẩm như
kích thích sinh trưởng thực vật, kháng bệnh hại, tăng cường khả năng khử độc
môi trường, sản xuất nhiên liệu sinh học, thuốc kháng sinh....
Kiểm soát tác nhân gây bệnh: Một số VKNS giữ vai trò quan trọng
trong vòng đời của cây trồng. Một số vi khuẩn không gây bệnh như: Bacillus
subtilis, Bacillus mycoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia,
Pimelobacter sp., Agrobacterium radiobacter k84 và một số loại vi khuẩn đối
kháng khác đã và đang được sử dụng hiệu quả trong phòng trừ bệnh hại cây
trồng [19]. Các chủng VKNS thuộc chi Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus
cũng được quan tâm bởi chúng tổng hợp một số chất trao đổi ngoại bào có
khả năng ngăn cản sự phát triển hệ sợi nấm của Pythium sp., F. oxysporum và
Rhizoctonia solani. Pseudomonas tổng hợp các hợp chất ngoại bào
syringomycin, syringostatin, syringotoxin, cepacin A, cepacin B, phenazine
và pyrrolnitrin. Burkholderia tổng hợp các hợp chất cepacin và pyrrolnitrin,
trong khi đó Bacillus tổng hợp các hợp chất surfacin, bacilysin, bacillomycin,

mycobacillin. Những hợp chất này có hoạt tính kháng nấm chống lại R.solani
và F.oxysporum [20]. Năm 1999, Miss Yuparet Puangmali đã phân lập được
657 loài vi khuẩn từ những cây thân thảo để sản xuất ra L-sparaginase. Trong
đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn có hiệu lực mạnh để thử nghiệm. Nhóm
vi khuẩn CMU-HB-63 cho thấy tạo ra chất kháng sinh lớn nhất. Các thử
nghiệm của ông với 2 cây là cà chua và cây dưa chuột đã đem lại hiệu quả ức
chế một số loại mầm bệnh và giảm mức độ bị bệnh. Mầm bệnh ông sử dụng
trong nghiên cứu bao gồm: Pythium ultimum, Rhizoctonia, Fusarium
oxysporum, Pseuodomonas syringe, Colletotrichum orbiculore, Erwinia
teracheiphila và thể khảm do virus ở cây dưa chuột [21].
Kích thích tăng trưởng của thực vật: VKNS thúc đẩy sự phát triển của


cây trồng bằng cách làm giàu các chất dinh dưỡng và các khoáng chất như
nitơ, phốt pho bằng một số cơ chế như hoà tan phosphat, VKNS cũng cung
cấp các vitamin thiết yếu cho cây trồng [22]. Ngoài ra, VKNS còn đẩy mạnh
tốc độ nảy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất
lợi [23] và nâng cao khả năng tăng trưởng thực vật [24].
Khả năng sinh chất kháng sinh, kháng viêm, kháng ung thư: VKNS tạo
ra nhiều chất chuyển hóa thứ sinh. Trong những năm gần đây, việc khám phá
các sản phẩm tự nhiên từ VKNS ngày càng được quan tâm. Năm 1998, Miller
và cộng sự đã phân lập chủng Pseudomonas viridiflava trong các mô của
nhiều loại cỏ và cho rằng sản xuất hợp chất kháng khuẩn ecomycin có khả
năng ức chế các VSV gây bệnh như Cryptococcus neoformans và Candida
albicans [25]. Năm 2003, Aldor và Keasling chỉ ra rằng poly-3hydroxyalkanoate (PHA) và PHB thuộc nhóm PHA là sản phẩm sinh học từ
VSV được sản xuất rộng rãi nhất [26].
Cải thiện môi trường: Trong phục hồi sinh thái môi trường, VKNS có
thể hỗ trợ hệ VSV bản địa với các loài xâm lấn, phục hồi vùng đất cằn cỗi hay
các hệ sinh thái bị ô nhiễm bởi các chất ô nhiễm, loại bỏ các chất gây ô nhiễm
trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc qua thực vật và làm cho đất

trở nên màu mỡ nhờ chu trình photphat và cố định đạm. Năm 2005, Berg và
cộng sự đã nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy
sinh học các chất gây ô nhiễm trong đất, nghiên cứu này tập trung vào hầu hết
các VKNS ở rễ [27]. Bên cạnh đó, VKNS cũng có thể lưu trữ, phá hủy hay
kích thích VSV trong đất để phân hủy một số chất gây ô nhiễm nhất định [28]
Trong các tiềm năng ứng dụng của VKNS đem lại, việc sử dụng VKNS
để phòng trừ bệnh cây ở trên thế giới đã nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất
đạt hiệu quả cao. Đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về VKNS
trong mô của thực vật. Các nhà khoa học đã tìm thấy một số loài VKNS có
hoạt tính sinh học cao, tạo ra chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn sự xâm


nhập của sinh vật gây bệnh gây ra đối với cây chủ, trong đó có cây trồng nông
nghiệp và cây ăn quả. Bằng phương pháp sinh học này đã làm giảm bớt tác
động xấu đến môi trường, bởi hiện nay con người đang sử dụng rất nhiều chất
hóa học để phòng trừ bệnh cây và côn trùng gây hại.
2.2. Cây hồ tiêu và bệnh trên cây hồ tiêu
Hồ tiêu (danh pháp hoa học: Piper nigrum), thuộc họ Piperaceae là
một cây thuốc có giá trị (Hình 2.1). Hạt và quả hồ tiêu được coi là "vua của
các loại gia vị" do được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới. Hồ tiêu là một
loại dây leo, thân dài, nhẵn không mang lông, bám vào các cây khác bằng rễ.
Hồ tiêu cho thu hoạch quả, quả có một hạt duy nhất, từ quả tiêu có thể thu
được hồ tiêu trắng, hồ tiêu đỏ, hồ tiêu xanh và hồ tiêu đen. Hồ tiêu được trồng
ở các vùng nhiệt đới khác nhau trên thế giới như: Việt Nam, Ấn Độ,
Indonesia, Brazil.

Hình 2.1. Cây hồ tiêu (Piper nigrum)
(Nguồn: />Bệnh trên cây hồ tiêu
Hồ tiêu được trồng không có quy hoạch dẫn đến tình trạng phát sinh
các loại dịch bệnh trên loại cây trồng này, gây thiệt hại nặng nề cho người dân

trồng hồ tiêu cũng như cho ngành hồ tiêu. Dưới đây là hai loại dịch bệnh được
coi là cặp song sát trên cây hồ tiêu.


* Bệnh chết nhanh
Nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chết nhanh: Bệnh do nấm Phytophthora
capsici gây hại (Hình 2.2). Nấm Phytophthora capsici là nấm thủy sinh thuộc
họ Pythiaceae, bộ Peronosporales, lớp Oomycetes. Nhiễm Phytophthora
capsici trong tiêu đen phụ thuộc vào thời tiết. Sự lây lan qua không khí là rất
nhanh khi điều kiện thời tiết thuận lợi. Nhiệt độ 23 - 29°C, độ ẩm tương đối
81 - 99%, lượng mưa hàng ngày 15,8 - 23,0 mm [29], [30]. Các chồi bị nhiễm
trùng lây lan sang các phần khác của cây và đến các cây tiêu lân cận khi có sự
xuất hiện của mưa [31], [29]. Hoạt động của nấm được giới hạn trong thời kỳ
gió mùa Tây Nam khi có độ ẩm tương đối cao, độ ẩm đất cao, nhiệt độ thấp,
và giảm giờ nắng. Nấm gây bệnh ngừng hoạt động và đây là lúc các bào tử
nằm trong các mảnh vụn của cây trồng bị nhiễm bệnh hình thành ổ nhiễm
trùng trong các bộ phận của cây. Ngay khi có gió mùa, cây tiêu bắt đầu sản
sinh rễ, lá và chồi, đây là điều kiện lý tưởng cho sự nhân lên của mầm bệnh
và khá khó khăn để kiểm soát dịch bệnh [32].

Hình 2.2. Cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh do bị nhiễm nấm
Phytophthora capsici
(Nguồn: />

10

Cách nhận biết bệnh tiêu chết nhanh: Nấm Phytophthora capsici nhiễm
vào tất cả các phần của cây tiêu. Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc
vào vị trí của cây bị ảnh hưởng và mức độ thiệt hại [31]. Tuy nhiên, nếu
nhiễm trùng chỉ tập trung vào gốc rễ, nó sẽ dẫn đến suy giảm chậm [33]. Bệnh

xuất hiện trên tất cả các bộ phận và ở các giai đoạn sinh trưởng của cây tiêu,
nhưng phổ biến nhất là ở phần thân nằm trong đất và nơi tiếp giáp với mặt
đất, khi nấm bệnh tấn công vào phần thân ngầm sẽ làm cây tiêu chết đột ngột
và gọi là bệnh chết nhanh. Dây tiêu bị bệnh có triệu chứng lá bị héo nhưng
vẫn còn xanh. Thân ngầm cây tiêu bị thối do nấm Phytophthora capsici tấn
công, sau đó lá úa vàng, héo rũ, chết khô cùng với dây trên cây. Thời gian từ
khi lá bắt đầu héo đến khi dây tiêu bị chết rất nhanh, thường chỉ trong vòng 5
- 15 ngày [33].
* Bệnh chết chậm
Nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chết chậm: Tác nhân gây nên bệnh chết
chậm là tuyến trùng Meloidogyne incognita và nấm Fusarium oxysporum
(Hình 2.3). Ban đầu tuyến trùng tấn công vào bộ rễ gây ra những vết thương
tổn trên rễ, tạo điều kiện cho nấm Fusarium oxysporum tấn công. Nấm
Fusarium oxysporum thuộc Ngành Ascomycota, Lớp Deuteromycetes, Họ
Tuberaulariaceae, Bộ Monniliales. Nấm Fusarium oxysporum gây ức chế các
bó mạch gây hoại tử và không cho hấp thu nước và các chất dinh dưỡng.
Nước mang các bào tử nấm bệnh lây lan sang các cây bên cạnh và từ đó lan
rộng ra, đây là nguyên nhân vì sao bệnh chết chậm thường xuất hiện vào mùa
mưa. Khi một số rễ bị nhiễm bệnh, rễ tiêu nhiễm nấm bị yếu dần, việc cung
cấp nước và dinh dưỡng cho phần cành lá bên trên không hiệu quả [54].


11

Hình 2.3. Cây hồ tiêu bị bệnh chết chậm do nhiễm nấm
Fusarium oxysporum
(Nguồn: />Cách nhận biết bệnh tiêu chết chậm: Bước đầu cây sinh trưởng và phát
triển chậm, các lá già thường bị vàng, sau đó héo và rụng, tiếp theo là các đốt
bị rụng, cây ra hoa và đậu quả kém dẫn đến năng suất và chất lượng giảm.
Nếu cành bị cắt, các mạch hoại tử của cây có thể được nhìn thấy ngay dưới

lớp biểu bì. Hiện tượng cây sinh trưởng kém, vàng lá thường xuất hiện
thành từng vùng cục bộ sau đó lan rộng ra thành nhiều trụ tiêu và nhiều
vùng, triệu chứng vàng và rụng lá, rụng đốt thường phát triển chậm và kéo
dài, rễ của cây phát triển kém và xuất hiện nốt sần, đầu rễ bị thối, khi bị
nặng thì các rễ chính và phụ đều bị thối [2].
2.3. Tiềm năng phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu
Có thể phân lập VKNS trên hầu hết các bộ phận của cây hồ tiêu từ
thân, lá, rễ, cành và hạt. Trong đó ở rễ có số lượng VKNS nhiều hơn so với
các mô ở bên trên mặt đất. VKNS trong cây hồ tiêu không bị hạn chế một loài
mà bao gồm nhiều loài. VKNS từ vùng rễ xâm nhập vào cây thông qua khí
khổng, bì khổng và các vết thương, các vùng xuất hiện rễ bên và rễ mầm [34].


12

Hiện nay trên thế giới, do sự gia tăng các loại bệnh hại tại các khu vực
trồng tiêu đã dẫn đến thiệt hại lớn cho ngành hồ tiêu thế giới. Từ đó những
yêu cầu cấp thiết về việc tạo ra các sản phẩm có tác dụng tiêu diệt mầm bệnh
trên cây hồ tiêu những vẫn đảm bảo sức khỏe của cây lâu dài cần sớm được
đáp ứng. Trong đó việc phân lập các VKNS trên cây hồ tiêu để tạo ra các sản
phẩm có khả năng kháng các mầm bệnh đã nhận được sự quan tâm lớn của
các nhà khoa học. Năm 2008, Aravind và cộng sự đã phân lập được 74 chủng
VKNS từ các mô của rễ và thân từ các giống tiêu đen (10 giống) thu thập
được từ các vùng trồng tiêu đen lớn của Ấn Độ như Calicut, Idukki và
Wyanad ở Kerala State và Kodagu District thuộc bang Karnataka. Trong số
các chủng VKNS được phân lập, có 6 chi thuộc Pseudomonas spp. (20
chủng), Serratia spp. (1 chủng), Bacillus spp. (22 chủng), Arthrobacter spp.
(15 chủng), Micrococcus spp. (7 chủng), Curtobacterium sp. (1 chủng) và 8
chủng không xác định đã được phân lập từ các mô của rễ và thân. Trong đó,
ba chủng IISRBP 35, IISRBP 25 và IISRBP 1 thể hiện khả năng ức chế nấm

Phytophthora capsici. Dựa trên trình tự 16S rDNA, IISRBP 35 được định
danh là Pseudomonas aeruginosa IISRBP 35, IISRBP 25 được định danh là
P. putida IISRBP 25, và IISRBP 17 được định danh là Bacillus megaterium
IISRBP 17 [35]. Gần đây, năm 2015, Nascimento và nhóm nghiên cứu đã
phân lập được 23 chủng VKNS thuộc 13 chi: Bacillus, Paenibacillus,
Pseudomonas, Enterobacter, Rhizobium, Sinorhizobium, Agrobacterium,
Ralstonia, Serratia, Cupriavidus, Mitsuaria, Pantoea và Staphylococcus. Kết
quả cho thấy 56,52% số chủng thuộc nhóm vi khuẩn Proteus gồm các lớp α,
β, và γ. Các vi khuẩn khác gần gũi với loài Firmicutes sp.. Bacillus là chi xuất
hiện nhiều nhất trong số tất cả các vi khuẩn được phân lập. Thử nghiệm đối
kháng cho thấy chủng Pseudomonas putida Pt12 có khả năng ức chế F.
solani. Trong số 23 chủng VKNS có 2 loài Pseudomonas sp. có khả năng


13

kiểm soát mầm bệnh thối rễ trong tiêu đen ở vùng Amazon [36]. Tiềm năng
phân lập VKNS được thể hiện qua Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Một số nghiên cứu vi khuẩn nội sinh từ hồ tiêu trên thế giới
Quốc gia

Loài hồ tiêu

Số chủng

Tài liệu

phân lập

tham khảo

Hàn Quốc

Tiêu (Capsicum annuum L.)

110

[37]

Ấn Độ

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

35

[38]

Ấn Độ

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

110

[39]

Ấn Độ

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

74

[29]

Indonesia

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

8

[40]

Ấn độ

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

12

[41]

Brazil

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

23

[36]

Malaysia

Tiêu đen (Piper nigrum L.)

129

[42]

Tiềm năng khai thác VKNS là rất lớn, ngoài những giá trị mang lại
trong nông nghiệp đã nêu trên, VKNS vẫn còn chưa được khai thác tối đa
trong các lĩnh vực như môi trường, y dược, sản xuất các chất tự nhiên có
lợi cho con người.
2.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu tại Việt Nam
Hàng năm tại Việt Nam, diện tích trồng và sản lượng hồ tiêu bị giảm
nghiêm trọng do các loại bệnh hại trên loại cây trồng này gây ra. Các nguồn
bệnh trên cây hồ tiêu chủ yếu có nguồn gốc từ nấm, tuyến trùng và vi khuẩn
như: Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani,
Meloidogyne incognita, Radopholus similis,.... Để đối phó với các loại dịch
bệnh trên hồ tiêu, chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ VKNS trên cây hồ tiêu
được đánh giá rất cao do tiềm năng của VKNS đem lại. Do đó việc nghiên


14

cứu phân lập VKNS trên cây hồ tiêu để tạo ra các chế phẩm sinh học này đã
và đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu tại Việt Nam.
Năm 2012 - 2013, Phạm Thị Thúy Hoài, Viện Hóa sinh biển, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam phân lập được 155 chủng VKNS
từ các mẫu đất, rễ, thân được lấy ở vùng dịch bệnh nặng trên cây hồ tiêu ở 3
huyện Gio Linh, Cam Lộ, Vĩnh Linh. Trong đó, xác định tác nhân chính gây
bệnh cho cây tiêu Quảng Trị là Fusarium oxysporum; Rhizoctonia solani và
Phytophthora sp.. Kết quả nghiên cứu lựa chọn 7 chủng vi khuẩn có hoạt
tính kháng nấm gây bệnh tốt nhất. Xây dựng quy trình lên men sản xuất chế

phẩm vi sinh đối kháng phù hợp với cây hồ tiêu. Cơ chất là cám gạo và các
chủng VSV đối kháng bao gồm 2 chủng vi khuẩn B. subtilis và B. Flexus.
Hiệu lực phòng trừ của các chế phẩm đối với tỷ lệ bệnh đạt từ 22,49% đến trên
72,45% [3]. Tiếp đến là nghiên cứu của Vi Thị Mai Trâm và cộng sự vào năm
2015, đã phân lập được 65 dòng VKNS thuộc chi Pasteuria từ các mẫu rễ hồ
tiêu thu được tại 30 điểm thuộc địa bàn các tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu, Đồng Nai,
Bình Dương, Bình Phước. Trong đó, 28 dòng VKNS được phân lập từ tỉnh Bà
Rịa-Vũng Tàu, 11 dòng từ tỉnh Đồng Nai, 10 dòng từ tỉnh Bình Dương và 16
dòng từ tỉnh Bình Phước. Nhóm tác giả cũng đã nhân giống thành công vi
khuẩn này trên mô hình vi khuẩn- tuyến trùng-cây hồ tiêu trong phòng thí
nghiệm mở ra nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng
dòng VKNS này vào phòng trừ sinh học bệnh tuyến trùng hại rễ hồ tiêu [4].
Như vậy có thể thấy, tình hình nghiên cứu về VKNS trên cây hồ tiêu tại
Việt Nam đang nhận được sự quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu. Bên cạnh
đó cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để đáp ứng được nhu cầu cấp thiết
cho ngành trồng tiêu trong thách thức phải ứng phó dịch hại tiêu.


15

Phần 3
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tổng số 36 chủng VKNS (được phân lập từ các mẫu cây hồ tiêu thu
thập tại huyện Cư Kuin, Đắk Lắk tại các tọa độ 12°35’18’’B; 108°11’7’’Đ,
12°35’19’’B; 108°11’8’’Đ, 12°35’24’’B; 108°11’5’’Đ vào tháng 7/2017)
được nhận từ Bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Ba chủng nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu gồm Fusarium oxysporum,

Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani được nhận từ Viện Nghiên cứu
khoa học Tây Nguyên.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng kháng nấm gây bệnh và sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào của 36 chủng VKNS trên cây hồ tiêu tại Đắk Lắk.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng VKNS tuyển chọn.
Phân loại một số chủng VKNS tuyển chọn.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
Từ 20/12/2017 đến 30/05/2018.
3.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất: Cao malt (Himedia, Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia, Ấn
Độ); Cao thịt (Himedia, Ấn Độ); Casein, NaCl (Sigma, Mỹ); Pepton
(Fermentas, Mỹ); Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol (Trung Quốc), Isoamylalcohol
(Trung Quốc), Glycerol (Trung Quốc), Ethanol (Trung Quốc), Chloroform


16

(Trung Quốc), Agarose (Merck, Đức); Agar (Việt Nam); d-NTPs (Fermentas,
Mỹ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose của Thermo scientific (Mỹ)...
Enzyme: Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ).
Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700,
Applied Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Biofuge fresco, Kendro, Đức);
máy điện di DNA (Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy UV (PowerPac
Basic, Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (BSI-25R CPT, Mỹ); máy đo PH
(Thermo scientific, Mỹ) và một số thiết bị nghiên cứu khác.
3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Đánh giá hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh với
nấm gây bệnh
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh được mô tả theo
Živković và cộng sự (2010) [43]. Tổng số VKNS được cấy vệt trên môi
trường thạch PDA, khoảng cách vệt cấy xấp xỉ 1cm với mép đĩa petri. Nấm
gây bệnh được cắt khoảng 1cm2 và đặt đối diện với vệt cấy VKNS. Các mẫu
thử nghiệm được ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3 - 5 ngày. Tỷ lệ phần trăm sự ức
chế tăng trưởng xuyên tâm (RI%) được tính như sau:
RI (%) =
D1: Sự tăng trưởng xuyên tâm của nấm gây bệnh
D2: Sự tăng trưởng xuyên tâm của nấm gây bệnh đối với VKNS đối
kháng. Tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng xuyên tâm được phân loại từ
khả năng
chống nấm từ thấp đến rất cao, được đánh giá như sau:
30% = hoạt động kháng nấm thấp
30 - 50% = hoạt động kháng nấm vừa phải
50 - 70% = hoạt tính kháng nấm cao
≥70% = hoạt động kháng nấm rất cao