Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lumivudin zidovudin và nevirapin trong chế phẩm viên nén bằng MEKC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG LAN HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN,
ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG
CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI, 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG LAN HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN,
ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG
CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
GV hướng dẫn:

Nguyễn Thị Thùy Linh

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI, 2013


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích Độc chất trường Đại học dược Hà Nội.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thị Thùy
Linh, người đã tận tâm dìu dắt, chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật
viên bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong
quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã
hết lòng giúp đỡ và động viên em hoàn thành khóa luận này
Hà Nội, tháng 02 năm 2013
Sinh viên
Vương Lan Hương

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1
PHẦN I: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
1.1 Tổng quan về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin .................................... 3
1.1.1 Tổng quan chung ................................................................................... 3
1.1.2 Dược động học ...................................................................................... 4
1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV ........ 6
1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản .............................................................. 8
1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản ....................................... 8
1.2.2 Các kiểu điện di mao quản ................................................................... 10
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di ........................................ 12
1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC) ...................................................... 12
1.2.5 Ưu - nhược điểm của MEKC ................................................................ 17
1.3 Một số nghiên cứu gần đây về tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT
& NVP ............................................................................................................... 18
1.3.1 Phương pháp HPLC ............................................................................. 18
1.3.2 Phương pháp CE .................................................................................. 20
PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 21
2.1 Điều kiện nghiên cứu ............................................................................... 21
2.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu ..................................................................... 21
2.1.2 Hóa chất ............................................................................................... 21
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ ............................................................................... 23

2.2 Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 23
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu .................................................... 24
2.3.1 Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 24
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24
3.1 Lựa chọn điều kiện điện di tối ưu ............................................................ 27
3.1.1 Lựa chọn bước sóng ............................................................................. 27
3.1.2 Điều kiện điện di................................................................................... 28
3.1.3 Lựa chọn phương pháp bơm mẫu ........................................................ 29
3.1.4 Lựa chọn kiểu điện di ........................................................................... 30
3.1.5 Lựa chọn dung dịch điện ly nền ........................................................... 31
3.1.6 Khảo sát điều kiện pH của dung dịch điện ly nền ................................ 32


3.1.7 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền .............................................. 35
3.1.8 Khảo sát nồng độ chất tạo micelle SDS ............................................... 37
3.1.9 Khảo sát thế đặt vào hai đầu mao quản ............................................... 39
3.1.10 Khảo sát áp suất tiêm mẫu ................................................................ 41
3.1.11 Định tính Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin trong điều kiện điện
di đã được thiết lập ........................................................................................ 43
3.1.12 Kết luận ............................................................................................. 45
3.2 Thẩm định phương pháp.......................................................................... 45
3.2.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống ...................................................... 45
3.2.2 Tính đặc hiệu ........................................................................................ 46
3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính .................................................................. 48
3.2.4 Độ lặp lại của phương pháp................................................................. 52
3.2.5 Độ đúng của phương pháp ................................................................... 54
3.3 Ứng dụng định lượng trong chế phẩm .................................................... 56
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 58
4.1
4.2

Kết luận.................................................................................................... 58
Đề xuất ..................................................................................................... 59


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS
AZT
C
CE

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người ( Acquired
immunodeficiency syndrome)
Zidovudin
Nồng độ
Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

CEC

Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)

CGE

Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)

CZE

Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

Cmax

Nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết tương

DAD

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

EOF

Dòng điện thẩm (Electro – osmotic Flow)

HPLC

HIV
NVP
MEKC
RSD %

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Virus gây bệnh suy giảm miễn dịch ở người ( Human
Immunodeficiency Virus)

Nevirapin
Sắc ký điện động micelle (Micellar Electrokinetic
chromatography)
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

Spic

Diện tích pic

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)


STT

Số thứ tự

T1/2

Thời gian bán thải

Tmax

Thời gian để đạt Cmax

Tm

Thời gian di chuyển

Tnc

Nhiệt độ chảy

UV – VIS Bước sóng tử ngoại - khả kiến (Ultra Violet – Visiable)
WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World Heal Organization)

3TC

Lamivudin

ddC

Zalcitabine

ddI

Didanosine


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT bảng

Tên bảng

1

Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

2

Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

3

Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của phương pháp

4
(n=6)
5

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng

6

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng

7

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng

8

9

10

11

12

13
14

Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định
lượng 3TC
Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định
lượng AZT
Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định
lượng NVP
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Lamivudin
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Zidovudin
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Nevirapin
Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N

15

Kết quả định lượng viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin
300mg


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT hình

Tên hình

1

Sơ đồ nguyên tắc hoạt động của CE

2

Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản

3

Thứ tự rửa giải trên điện di đồ

4

Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC

5

Micell hình cầu

6

Phổ hấp thụ của Lamivudin

7

Phổ hấp thụ của Zidovudin

8

Phổ hấp thụ của Nevirapin

9

10

11

12

13

Điện di đồ chuẩn Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin ở ba dung
dịch điện ly nền khác nhau
Điện di đồ hỗn hợp ba chuẩn với dung dịch điện ly nền Na2B4O7
10mM/ SDS 50mM ở các pH khác nhau
Điện di đồ hỗn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền ở các nồng
độ borat khác nhau
Điện di đồ hỗn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền ở các nồng
độ SDS khác nhau
Điện di đồ hốn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền borat
10mM/SDS 50mM ở các thế khác nhau

14

Điện di đồ hỗn hợp chuẩn với thời gian tiêm mẫu khác nhau

15

Điện di đồ hỗn hợp thử


16

Điện di đồ mẫu thử thêm Lamivudin chuẩn

17

Điện di đồ mẫu thử thêm Zidovudin chuẩn

18

Điện di đồ mẫu thử thêm Nevirapin chuẩn

19

Điện di đồ hỗn hợp chuẩn ở diều kiện điện di tối ưu

20

Điện di đồ mẫu trắng

21

Điện di đồ hỗn hợp chuẩn Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin

22

Điện di đồ hỗn hợp chế phẩm làm việc

23

Điện di đồ hỗn hợp chế phẩm thêm chuẩn

24

25

26
27
28

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ 3TC
tương ứng
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ AZT
tương ứng
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ NVP
tương ứng
Điện di đồ chế phẩm viên nén Avocomb-N
Điện di đồ chế phẩm viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin
300mg


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vào tháng 6 năm 2011, tại Hội nghị cấp cao về HIV/AIDS ở New
York, Mỹ, Việt Nam đã khẳng định lại quyết tâm của mình trong công cuộc
phòng, chống HIV/AIDS và cam kết thực hiện những mục tiêu mới thông qua
việc ký Tuyên bố Chính trị năm 2011 về HIV/AIDS: Tăng cường nỗ lực để
loại trừ HIV/AIDS. Để có thể thực hiện mục tiêu đó, ngoài những biện pháp
xã hội cần được thực hiện thì việc kiểm soát chất lượng thuốc dùng trong điều
trị cũng góp phần quan trọng không kém. [10]
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều thuốc dùng để điều trị HIV. Tuy

nhiên, theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới WHO, để điều trị HIV nên
dùng phối hợp hai thuốc NRTIs hoặc cùng phối hợp với một thuốc NNRTIs
mà không nên đơn trị liệu vì có thể dẫn đến kháng thuốc, làm giảm hiệu quả
điều trị. [3], [11], [13]
Xuất phát từ nhu cầu đó, trên thị trường bắt đầu xuất hiện những thuốc
ở dạng hỗn hợp đa thành phần. Chế phẩm chúng tôi dùng nghiên cứu cũng là
một trong số đó. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng cũng như xác định các
thành phần trong chế phẩm hỗn hợp đóng một vai trò hết sức quan trọng trong
việc đảm bảo chất lượng thuốc, đem lại sự an toàn, hiệu quả cho người sử
dụng.
Hiện nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích
được đa số các Dược điển quốc tế lựa chọn trong kiểm nghiệm thuốc điều trị
HIV. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính xác cao,
khả năng tách tốt, độ nhạy cao và giới hạn phát hiện nhỏ. Tuy nhiên, phương
pháp này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn dung môi tinh khiết, đắt tiền,
nhiều loại dung môi có thể gây độc với người phân tích và ô nhiễm môi
trường. Đồng thời phương pháp này tương đối hạn chế trong việc phân tích


2

các chất có khả năng ion hóa, nhất là sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo RP –
HPLC (Reversed – phase liquid chromatography). [16], [17]
Nhằm mục đích xây dựng một phương pháp nghiên cứu phân tích ít tốn
kém và ít độc hại hơn, chúng tôi hướng đến phương pháp điện di mao quản.
Đã có nhiều nghiên cứu phân tích 3TC, AZT & NVP bằng phương pháp
HPLC. Tuy nhiên, chưa thấy một nghiên cứu nào phân tích định lượng đồng
thời ba chất đó bằng phương pháp CE. Mặt khác, CE tuy không còn mới lạ
trên thế giới, nhưng ở Việt Nam, việc ứng dụng CE vào trong kiểm nghiệm
dược phẩm vẫn còn rất hạn chế. Với những mục đích trên, đồng thời nhằm

nâng cao chất lượng việc xây dựng tiêu chuẩn và quản lý các thuốc điều trị
HIV đang được sử dụng tại Việt Nam; giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều
lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện nơi làm
việc nhất, chúng tôi đã tiến hành khóa luận “Xây dựng phương pháp định
lượng đồng thời Lamivudin, Nevirapin & Zidovudin bằng MEKC” nhằm
hai mục tiêu
- Xây dựng phương pháp phù hợp và ổn định để tách và định lượng
đồng thời Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin.
- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để kiểm tra một số chế
phẩm chứa Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin được dùng trong
phác đồ điều trị HIV/AIDS.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
3

PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1

Tổng quan về Lamivudin, Nevirapin và Zidovudin
1.1.1 Tổng quan chung [4], [5], [12]
Bảng 1: Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

Đặc điểm

Lamivudin

Zidovudin

Nevirapin

CTHH

CTPT

C8H11N3O3S

C10H13N5O4

C15H14N4O

PTK

229,3 g / mol

267,2 g/mol

266,3 g/mol

4-Amino-1[(2R,5S)-2Tên KH

(hydroxymethyl)1,3-oxathiolan-5yl]pyrimidin-2(1H)one.
Bột kết tinh màu

Tính chất trắng hoặc gần như
trắng
Tnc

160 – 162 0C
Dễ tan trong nước,

Độ tan

tan trong cồn, khó
tan trong các dung

1-(3-Azido-2,3dideoxy-b-D-erythropentofuranosyl)-5methylpyrimidine2,4(1H,3H)-dione.

Tinh thể trắng hoặc
hơi nâu.
120 – 122 0C
Khó tan trong nước,
EtOH

11-Cyclopropyl-4methyl-5,11dihydro-6H-dipyrido
[3,2-b:2’,3’e][1,4]diazepin-6one.
Bột kết tinh màu
trắng hoặc gần như
trắng
242 – 246 0C
Thực tế không tan
trong nước, ít tan
trong CH3Cl.

4

môi hữu cơ không
phân cực
4,3

pKa

9,68

2,8

+ 60,50 → + 63,00 ( C

Năng
suất quay
cực

- 1350 (C = 0,38%

= 1% trong EtOH)

trong MeOH)

+ 990 (C = 0,5%
trong nước)

λmax

270nm

264,5 nm

268,5 nm

1.1.2 Dược động học [3], [6], [11]
Bảng 2: Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin
Đặc điểm

Sinh khả
dụng

Tmax

Cmax

Lamivudin

Zidovudin

~ 80%, không bị

60 – 70 %, bị ảnh

ảnh hưởng bởi thức

hưởng khi ăn nhiều

ăn

chất béo

Nevirapin
>90%, không bị ảnh
hưởng bởi thức ăn
hoặc thuốc kháng
acid

0,5 – 1h sau khi

4h sau khi dùng liều

uống

duy nhất

1,5 µg/ml (liều

1,2 mg/l ( liều

5,74 µg/ml (liều

150mg)

250mg )

200mg)

1h sau khi uống

Nevirapin đi qua
được nhau thai và
hàng rào não tủy,
Phân bố

Vd = 1,3 ± 0,4
lit/kg

Vd = 1,6 ± 0,6 lit/kg

phân bố trong dịch
não tủy và sữa mẹ.
Vd = 1,21
lit/kg

0,09


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
5

Liên kết
protein

huyết

<36% (thấp)

34 – 38%

60%

tương
Chuyển hóa tại gan

Chuyển
hóa

5 -6% thuốc được
chuyển hóa thành
trans – sulfoxyd.

Chuyển hóa tại gan

thành dẫn xuất

thành dẫn xuất

glucuronid không

glucuronid không

hoạt tính

hoạt tính

Thuốc gây cảm ứng
enzyme gan

1,1 ± 0,2h
Thời gian
bán thải

Người bệnh bị ure
2,5h

huyết cao: 1,4 – 2,1h 25 – 30h
Bệnh nhân xơ gan:
2,4h
70% liều uống (4060% liều tiêm
truyền) được thải trừ

70% thải trừ dưới
Thải trừ

dạng còn nguyên
vẹn qua nước tiểu

dưới dạng chuyển

>70% thải trừ qua

hóa qua nước tiểu

nước tiểu dưới dạng

10 -20% liều uống

chuyển hóa.

(15 – 30% liều tiêm
truyền) được thải trừ
dưới dạng không đổi
qua nước tiểu

Độ thanh 0,37 ± 0,05
thải Cl

lit/giờ/kg

0,2 – 0,3 lit/giờ/kg

0,017 – 0,032
lit/giờ/kg


6

1.1.3

Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV

1.1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị HIV
- Nhóm 1: Thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleoside

(nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs)
VD: Zidovudin; Didanosin; Zalcitabin; Stavudine; Lamivudin; Abacavir;
Tenofovir disoproxil fumarate.
- Nhóm 2: Thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleoside
(non-nucleoside reverse transcriptase ninhibitors =NNRTIs)
VD: Nevirapin; Delavirdin; Effavirenz
- Nhóm 3: Thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs)
VD: Indinavir; Ritonavir; Saquinavir; Nelfinavir; Amprenavir; Lopinavir.
Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối
hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc
nhóm 3 để đạt được hiệu quả điều trị cao và tránh kháng thuốc.
1.1.3.2 Phác đồ phối hợp trong điều trị HIV [3], [11], [13], [20]
Trong liệu pháp kháng retrovirus, thuốc được chọn lọc là những thuốc
tương tự nucleoside. Hiện nay chưa biết rõ lúc nào là thời điểm tốt nhất để bắt
đầu điều trị với thuốc kháng retrovirus. Liệu pháp kháng retrovirus cũng làm
tăng thời gian sống sót ở người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong
1mm3. Liệu pháp này cũng có thể dùng cho người bệnh có mật độ HIV trên
30.000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng CD4, vì mật độ HIV là
một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh. Mật độ virus cao hơn dẫn đến
giảm tế bào CD4 nhanh hơn. Mục tiêu điều trị là đạt mật độ HIV ở mức
không thể phát hiện được.
Liệu pháp chuẩn hiện nay gồm 2 thuốc tương tự nucleoside kháng
retrovirus, cùng với một thuốc ức chế protease.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien

mien phi
phi
7

Người bệnh điều trị không có kết quả (tăng gấp 3 lần mật độ virus, hoặc
giảm số lượng tế bào CD4, hoặc tiến triển thành bệnh AIDS) phải chuyển
sang dùng kết hợp với một thuốc kháng retrovirus khác. Lựa chọn thuốc sao
cho nguy cơ kháng chéo với những thuốc đã dùng là tối thiểu. Khi liệu pháp
cũ không có tác dụng cần thêm thuốc mới, nguyên tắc là cho thêm không chỉ
một thuốc mà kết hợp 2 thuốc mới.
Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleoside có tác dụng
kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzyme phiên mã
ngược của virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng
retrovirus để điều trị HIV.
Nevirapin là chất ức chế enzyme phiên mã ngược non-nucleosid có hoạt
tính kháng retrovirus HIV-1.
Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin là ba thuốc phối hợp được tổ chức Y
tế thế giới WHO khuyến cáo dùng trong điều trị HIV.
Liều dùng:
- Nevirapin 200mg/lần/ngày (trong hai tuần đầu), sau đó 200mg/2 lần/ngày
- Zidovudin 300mg/ 2 lần/ngày. Bệnh nhân bị suy giảm chức năng thận
hoặc phải điều chỉnh liều do bị nhiễm độc tố không được sử dụng viên
phối hợp.
- Lamivudin 150mg/2 lần/ngày
Nevirapin được khuyến cáo nên dùng nửa liều trong vòng 14 ngày đầu để
làm giảm nguy cơ phát ban. Theo lưu ý trên, trong suốt thời kì này, không nên
sử dụng viên nén phối hợp 3 thành phần trên. Không nên cố gắng sử dụng
một viên/ ngày, vì điều đó có thể dẫn đến việc kháng Lamivudin và điều trị
thất bại. Thay vì đó, nên sử dụng những viên riêng biệt. Sau 14 ngày, liều của
Nevirapin nên được tăng lên 200mg/2 lần/ ngày hoặc có thể sử dụng viên

thuốc phối hợp.


8

Viên phối hợp Zidovudin/Lamivudin không phù hợp với những người bị
suy thận hoặc những bệnh nhân sử dụng liều Zidovudin thấp hơn do tác dụng
phụ

1.2

Cơ sở lý thuyết điện di mao quản [1], [2], [9], [14], [15]

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hóa từ thuật
ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.
1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản
Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100 cm,
đường kính trong 25 - 100 µm, đường kính ngoài 300 - 400 µm. Sử dụng áp
suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản. Điện thế một
chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tách. Dưới tác dụng của lực
điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (ElectroOsmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau
và tách ra khỏi nhau do điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác
nhau. Các chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di
chuyển về một đầu mao quản.
Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diod DAD. Vị trí
phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”.

Hình 1: Sơ đồ hệ thống điện di

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
9

 Dòng điện thẩm (EOF)
Trong CE, dòng điện thẩm (EOF: electro-osmotic flow) là một thành phần
cơ bản, tạo nên sự di chuyển của toàn bộ dung dịch trong mao quản bắt nguồn
từ điện tích bề mặt trong của thành mao quản.
 Nguồn gốc EOF
Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành
trong của mao quản sẽ giải phóng ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao
quản sẽ mang điện tích âm. Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số
cân bằng K, nhưng thực nghiệm chỉ rõ rằng dòng EOF có giá trị đáng kể khi
pH dung dịch trên 4.
Do bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm, nên đối ion (chủ yếu
là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng điện
tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta.
Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di
chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo theo cả
khối dung dịch trong mao quản đi về catod. Sự di chuyển của khối dung dịch
trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường được gọi là dòng điện
thẩm EOF.
 Hai đặc điểm của EOF
- Đặc điểm đầu tiên của EOF là tạo nên một dòng chuyển khối phẳng trong
mao quản. Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc

theo mao quản, cho nên không có sự sụt áp trong mao quản: dòng đồng
nhất từ đầu đến cuối (mao quản).
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện di chỉ
xuất hiện khi đường kính trong mao quản (di) dưới 200µm. Nếu di ≫ 200µm,
sức căng bề mặt không đủ tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng
ở giữa và ở gần thành mao quản.


10

- Đặc điểm thứ hai của EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung
dịch điện di, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng hướng.
Với điều kiện điện di thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng
này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc
độ EOF thường lớn hơn rất nhiều lần so với tốc độ điện di.

Hình 2: Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
Cation di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo
sau là các chất không mang điện tích (trên hình vẽ là N) di chuyển theo EOF
nhưng không tách khỏi nhau được. Cuối cùng là anion. Trên điện di đồ thứ tự
rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước
nhất, anion có điện tích lớn kích thước nhỏ ra sau cùng.
Các chất
trung hòa
Cation

Anion

Điện tích lớn
kích thước

nhỏ

Điện tích lớn
kích thước nhỏ
Thời gian
Hình 3: Thứ tự rửa giải trên điện di đồ

1.2.2 Các kiểu điện di mao quản


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
11

Điện di mao quản khá đa dạng, có thể thực hiện theo nhiều kiểu khác
nhau. Mỗi kiểu có cơ chế tách riêng của nó. Bảng dưới đây tóm tắt bốn kiểu
điện di.
Bảng 3: Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng
STT

Kiểu điện di

Cơ chế tách

Ứng dụng

-Sinh học: phân tích các

Dựa trên linh

1

peptid, protein, dặc biệt là

Điện di mao quản vùng độ khác nhau

glucoprotein

(Capillary zone

của các ion

-Xác định dược chất và các

electrophoresis: CZE)

trong dung dịch chất chuyển hóa của chúng
tự do

-Phân tích các chất ô nhiễm
môi trường

Sắc kí điện động
micelle (Micellar
2

electrokinetic
chromatography:
MEKC)

3

Dựa trên sự
tương tác
nước/ion với
hạt micelle
trong dung

Là kỹ thuật bổ sung cho
CZE để tách các ion và
phân tử trung hòa về điện

dịch.

Điện di mao quản gel

Dựa trên kích

Dùng để phân tích các

(Capillary gel

thước và điện

phân đoạn AND, tách

electrophoresis: CGE)

tích

protein
-Phân tích dược: dùng phân

4

Điện sắc kí mao quản

Dựa trên sự

tích dược chất thuộc nhiều

(Capilarry

phân bố và linh

nhóm khác nhau

electrochromatography: độ khác nhau

-Phân tích các phân tử sinh

CEC)

học, các đồng phân quang

của các chất.

học


12

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di
1.2.3.1

Điện thế

Thời gian phân tích tỉ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao quản. Tuy
nhiên, nếu điện thế quá cao có thể gây ra hiệu ứng June, tạo ra nhiệt trong
mao quản, làm thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong mao quản, khiến cho các
phân tử chất tan di chuyển không đồng nhất, dẫn đến sự khuếch tán khác nhau
và làm mở rộng vùng mẫu.
1.2.3.2

Nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện của dung dịch
điện ly nền. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ mao quản tăng là nguyên
nhân thay đổi cấu trúc protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu quả phân
tích.
1.2.3.3

Dung dịch điện ly

- Loại dung dịch điện ly và nồng độ: dung dịch điện ly thích hợp cho CE khi
có tác dụng tốt nhất trong dãy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt

trong dung dịch ấy
- pH: pH của dung dịch điện ly có thể tác dụng lên khả năng phân tích và
làm thay đổi EOF.
1.2.3.4

Cột mao quản

Kích thước cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng đến thời
gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều dài hiệu dụng
và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng thời gian phân
tích.
1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC)
MEKC có khi còn được viết tắt là MECC (micellar electrokinetic capillary
chromatography) là một kỹ thuật bổ sung cho CZE: tách được ion và cả phân
tử trung hòa điện bằng cách thêm các chất hoạt động bề mặt vào dung dịch


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
13

điện di ở nồng độ trên nồng độ micelle tới hạn (critical micelle concentration
– CMC). Chất hoạt động bề mặt thường dùng là natri dodecylsulfat (SDS) có
CMC = 9mM. Và đây cũng là chất diện hoạt chúng tôi sử dụng trong nghiên
cứu này.

Phương pháp MEKC là một kiểu kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di
có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản và sắc ký lỏng
có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký của kỹ thuật CE được ứng
dụng rộng rãi trong sinh học y học và dược. MEKC là một phương pháp tách
có hiệu quả cao, chủ yếu phù hợp để phân tích các hợp chất trung hòa nhỏ. Cơ
chế tách của kỹ thuật này dựa trên sự khác biệt của cân bằng phân phối của
các hợp chất mẫu giữa pha động là dung dịch nước và pha tĩnh giả là các
micelle. Ưu điểm của MEKC là khả năng dễ dàng thay đổi các thành phần
của hệ thống,và đặc biệt có thể thay đổi pha tĩnh giả micelle. Theo đó, có thể
dễ dàng và nhanh chóng kiểm soát được pha động và tối ưu hóa độ phân giải.
Vì vậy nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử
Micell ( tiểu phân Micell – pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân
này sẽ dẫn dắt và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các
chất trên nền của dung dịch đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách
sắc ký của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật MEKC được điều
chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện ly nền.
Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và cả
trung hòa. Đối với các chất có điện tích, các micelle loại này chuyển động
hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tùy thuộc vào điện
tích của chất hoạt động bề mặt và cấu trúc của micelle. Các chất hoạt động bề
mặt anion hóa, ví dụ SDS, sẽ di chuyển về anod (cực dương), nghĩa là di
chuyển ngược chiều với hướng của dòng EOF. Trong dung dịch đệm điện di


14

có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ của
micelle, thì sự điện di thực (net movement) của micelle là theo hướng của
dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các micelle có thể tương tác với các

phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (RLC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để
tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá
trình điện di.

Hình 4 : Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC
Đối với các phân tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan
vào trong micelle và ở ngoài micelle (pha động điện di) theo một cân bằng
động học có hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự
phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau của các
chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký của các chất phân tích theo kiểu micelle. Vì
thế các micelle trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh
giả. Nhiều chất tương tác với micelle khá bền, nó tồn tại trong micelle dài hơn
sự di chuyển của nó, khi các micelle mang nó một phần di chuyển ngược
chiều dòng EOF.