Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN

XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN
1301194

XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Nguyễn Phương Nhung
2. ThS. Vũ Ngân Bình

Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới ThS. Vũ Ngân Bình
và ThS. Nguyễn Phương Nhung đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết, tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ, định hướng và đặc biệt luôn cho tôi những ý kiến quý
báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên ở
Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã luôn tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn
thành đề tài này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè những người luôn sát
cánh bên tôi, động viên và khích lệ tôi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Trần Thị Khánh Huyền.


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về amoxicilin và acid clavulanic ............................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic ......................................................... 2

1.1.2. Các dạng bào chế ...................................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm dược động học ....................................................................................... 3
1.2. Một số phương pháp phân tích amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương ...4
1.3. Kỹ thuật HPLC .........................................................................................................4
1.4. Tổng quan về xử lý mẫu trong dịch sinh học ........................................................... 6
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 8
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................... 8
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................................... 8
2.2.1. Nguyên vật liệu ......................................................................................................8
2.2.2. Thiết bị ...................................................................................................................8
2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 10
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu .............................................................. 10
2.3.2. Thẩm định phương pháp ...................................................................................... 10
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 10
2.4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu .............................................................. 10
2.4.2. Thẩm định phương pháp ...................................................................................... 11
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................14
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu .................................................................14
3.1.1. Lựa chọn cột sắc ký ............................................................................................. 14
3.1.2. Lựa chọn chất chuẩn nội ...................................................................................... 15
3.1.3. Lựa chọn pha động .............................................................................................. 16
3.1.4. Lựa chọn bước sóng phát hiện.............................................................................20
3.1.5. Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương ......................................................... 21
3.1.6. Điều kiện sắc ký xây dựng được .........................................................................24


3.2. Thẩm định phương pháp ......................................................................................... 24
3.2.1. Độ phù hợp hệ thống ........................................................................................... 24
3.2.2. Độ chọn lọc ..........................................................................................................25
3.2.3. Đường chuẩn .......................................................................................................25

3.2.4. Độ chính xác, độ đúng trong ngày.......................................................................28
3.2.5. Độ ổn định dài ngày của các mẫu huyết tương ................................................... 29
BÀN LUẬN ................................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 33


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
ACN

Acetonitril

AMX

Amoxicilin

CEF

Cefadroxil

CLA

Acid clavulanic

HQC

High quality control
Mẫu chuẩn nồng độ cao

HTT

Huyết tương trắng

HT

Huyết tương

KS

Kháng sinh

IS

Internal standard
Chuẩn nội

LC – MS

Sắc ký lỏng khối phổ

LQC

Low quality control
Mẫu chuẩn nồng độ thấp

MeOH

Methanol

MQC

Medium quality control
Mẫu chuẩn nồng độ trung bình

Ppm

Part per million
Phần triệu

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation
Độ lệch chuẩn

TB

Giá trị trung bình

CV

Hệ số biến thiên


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic...................................................2
Bảng 1.2. Một số phương pháp định lượng AMX và CLA trong dịch sinh học .............5
Bảng 2.1. Bảng pha các dung dịch chuẩn ........................................................................9
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống .......................................................... 24
Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát đường chuẩn của CLA ..................................................... 26
Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát đường chuẩn của AMX ................................................... 27
Bảng 3.4. Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của acid clavulanic.................... 28
Bảng 3.5. Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của amoxicilin........................... 29
Bảng 3.6. Độ ổn định dài ngày của CLA trong mẫu huyết tương .................................30
Bảng 3.7. Độ ổn định dài ngày của AMX trong mẫu huyết tương ............................... 30


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 3.1. Sắc ký đồ AMX trên cột C8 ..........................................................................14
Hình 3.2. Sắc ký đồ AMX trên cột C18 ........................................................................14
Hình 3.3. Công thức cấu tạo của cefadroxil ..................................................................15
Hình 3.4. Sắc ký đồ huyết tương trắng với đệm phosphat 50 mM pH 3,5 ................... 16
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu AMX, CLA, CEF trong HT với đệm phosphat 50 mM pH 3,5
.......................................................................................................................................17
Hình 3.6. Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 50 mM, pH 2,5, tỷ lệ thể tích
93:7 ................................................................................................................................ 18
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu HT AMX, CLA, CEF với pha động đệm phosphat 50 mM, pH
2,5, tỷ lệ thể tích 93:7 ....................................................................................................18
Hình 3.8. Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 50 mM pH 2,5 ........................ 18
Hình 3.9. Sắc ký đồ AMX, CLA, CEF trong HT với pha động đệm phosphat 50 mM
pH 2,5 ............................................................................................................................ 19
Hình 3.10. Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 100 mM pH 2,5 .................... 19
Hình 3.11. Sắc ký đồ AMX, CLA, CEF trong HT với pha động đệm phosphat 100 mM
pH 2,5 ............................................................................................................................ 19
Hình 3.12. Phổ hấp thụ tử ngoại của AMOX ................................................................ 20

Hình 3.13. Phổ hấp thụ tử ngoại của CLA ....................................................................20
Hình 3.14. Phổ hấp thụ tử ngoại của CEF .....................................................................20
Hình 3. 15. Chồng phổ CLA trong dung dịch chuẩn CLA và trong mẫu huyết tương .22
Hình 3. 16. Hệ số chồng phổ của CLA..........................................................................22
Hình 3.17. Quy trình xử lý mẫu amoxicilin và acid claculanic trong huyết tương. ......23
Hình 3.18. Sắc ký đồ huyết tương trắng .......................................................................25
Hình 3.19. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn trong huyết tương ...............................................25
Hình 3.20. Đường chuẩn acid clavulanic theo chuẩn nội.............................................26
Hình 3.21. Đường chuẩn amoxicilin theo chuẩn nội..................................................... 27


ĐẶT VẤN ĐỀ
Amoxicilin là kháng sinh nhóm β-lactam có phổ diệt khuẩn rộng đối với nhiều vi
khuẩn Gram âm và Gram dương. Amoxicilin kém bền với β-lactamase, do đó thường
được phối hợp với acid clavulanic là một chất ức chế β-lactamase để tăng khả năng
kháng khuẩn. Amoxicilin và acid clavulanic có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt
Nam, danh mục thuốc chủ yếu sử dụng tại các cơ sở khám chữa bệnh được quỹ bảo
hiểm y tế thanh toán và được sử dụng rộng rãi trong điều trị…[3]. Mô hình dược động
học của thuốc trên từng cá thể bệnh nhân đặc biệt là bệnh nhân nặng như bệnh nhân suy
giảm chức năng gan, thận có sự dao động lớn. Đặc biệt khi sử dụng thuốc với liều cao
có thể có hiện tượng kết tủa cặn tinh thể trong nước tiểu [6]. Vì vậy việc theo dõi nồng
độ thuốc trong máu trên bệnh nhân sử dụng thuốc amoxicilin và acid clavulanic ở nồng
độ cao quan trọng trong việc giám sát hiệu quả điều trị, hạn chế tác dụng không mong
muốn trong quá trình sử dụng thuốc.
Amoxicilin là một kháng sinh được sản xuất phổ biến ở Việt Nam. Tính từ năm
2010 đến năm 2015 đã có 182 số đăng ký trong nước được cấp phép để sản xuất
amoxicilin. Để nâng cao chất lượng và khả năng cạnh tranh của các chế phẩm, một số
nhà sản xuất hướng tới đánh giá tương đương sinh học giữa thuốc sản xuất trong nước
và thuốc generic. Như vậy, trong sản xuất và trên lâm sàng đều cần một phương pháp
xác định được nồng độ của amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương.

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong
huyết tương đã được công bố, phần lớn sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết
nối detector tử ngoại khả kiến sau khi tạo dẫn xuất với imidazol [5] hoặc phân tích trực
tiếp bằng sắc ký lỏng khối phổ sau khi chiết pha rắn [14]. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ
đắt tiền và chưa phổ biến, việc dẫn xuất hóa làm cho quá trình xử lý mẫu phức tạp hơn.
Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng và thẩm định phương pháp định
lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương” với những mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng trực tiếp amoxiclin và acid clavulanic trong
huyết tương người bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Thẩm định phương pháp trên theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích
trong dịch sinh học của FDA.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về amoxicilin và acid clavulanic
1.1.1. Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic
• Công thức cấu tạo và một số đặc điểm của amoxicillin (AMX) (dưới dạng trihydrat)
và acid clavulanic (CLA) được tổng hợp trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic
Amoxicilin trihydrat

Acid clavulanic

C16H19N3O5S. 3H2O

C8H8NO5

Acid(2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2 amino-

(2R,3Z,5R)-3-(2-

2-(4-hydroxyphenyl) acetyl]

hydroxyethyliden)-7-oxo-4-

amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-

oxa-1-azabicyclo[3.2.0] heptan-

1-azabicyclo [3.2.0 ]heptan-2-

2-carboxylic [17].

Công thức
cấu tạo

Công thức
phân tử
Danh pháp

carboxylic trihydrat [15].
Tính chất lý

• Bột kết tinh trắng hoặc gần như • Bột kết tinh màu trắng hoặc

hóa

trắng. Khó tan trong nước và ethanol gần như trắng, dễ hút ẩm. Dễ tan

96%, thực tế không tan trong trong nước, khó tan trong
cloroform. Tan trong các dung dịch ethanol 96%, rất khó tan trong

Độ ổn định

acid và kiềm loãng [2].

aceton [4].

• pka1=3,2 và pka2= 11,7 [15]

• pka= 3,2 [16].

• lgP =0,87 [15]

• lgP= -1,5 [17].

• Bị phân hủy nhanh ở độ ẩm cao và • Dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ và
nhiệt độ trên 37oC [2].

độ ẩm [10].

• Ổn định nhất trong môi trường pH • Acid clavulanic ổn định nhất ở
5,8- 6,5. Kém bền trong môi trường khoảng pH trung tính [9]. Kém
đệm phosphat và citrat [19][20].

bền trong dung dịch đệm
phosphat, acetat và borat [11].

2

• Amoxicilin là kháng sinh aminopenicilin phổ rộng, bán tổng hợp có hoạt tính diệt
khuẩn, cả vi khuẩn Gram (-), (+). Amoxicilin liên kết và khử hoạt tính protein gắn
kết penicilin (PBP) 1A nằm trên màng trong của thành tế bào vi khuẩn, làm gián đoạn
quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn và làm suy yếu thành tế bào vi khuẩn và phân
hủy tế bào [3].
• Acid clavulanic là chất ức chế β-lactamase, được bán tổng hợp từ Streptomyces. Acid
clavulanic chứa một vòng β -lactam và liên kết mạnh với β-lactamase tại hoặc gần vị trí
hoạt động của nó, do đó làm giảm hoạt động của enzym β-lactamase, bảo vệ các kháng
sinh β-lactam khác khỏi phản ứng xúc tác β-lactamase, qua đó tăng cường tác dụng
kháng khuẩn của chúng [3][9].
• Amoxicilin rất dễ bị phá hủy bởi β-lactamase, acid clavulanic có khả năng kháng
khuẩn yếu do đó phối hợp amoxicilin và acid clavulanic giúp cho amoxicilin không bị
β-lactamase phá hủy và mở rộng phổ kháng khuẩn của amoxicilin (đối với nhiều loại vi
khuẩn thông thường đã kháng amoxicilin, penicilin khác và cephalosporin) [3][9].
1.1.2. Các dạng bào chế
Amoxicilin và acid clavulanic được phối hợp trong một số dạng chế phẩm sau:
• Bột pha hỗn dịch uống hàm lượng amoxicilin/acid clavulanic 250/31,25 mg; 500/62,5
mg.
• Viên nén hàm lượng amoxicilin/acid clavulanic 250/125 mg; 500/125 mg hoặc
875/125 mg.
• Bột pha tiêm hoặc truyền tĩnh mạch hàm lượng amoxicilin/acid clavulanic 500/100
mg hoặc 1000/200 mg.
1.1.3. Đặc điểm dược động học
• Amoxicilin và acid clavulanic đều hấp thu nhanh và tốt qua đường uống. Sau khi uống,
amoxicilin và acid clavulanic đạt khoảng 70% sinh khả dụng. Nồng độ hai chất này
trong huyết hương đạt đỉnh khoảng 1-2 giờ sau khi uống thuốc [3][9].
• 55 - 70% amoxicilin và 30 - 40% acid clavulanic được thải qua nước tiểu dưới dạng
hoạt động [3].

• Với viên nén có hàm lượng amoxicilin/acid clavulanic 875/125 mg sử dụng 2 lần/
ngày có thể đạt Cmax là 11,64 µg/mL (amoxicilin) và 2,18 µg/mL (acid clavulanic). Thời
gian bán thải trong huyết tương của amoxicilin là 1,19 giờ và của acid clavulancic là
0,96 giờ [9].
3


• Chế phẩm tiêm tĩnh mạch có hàm lượng 1000/200 mg/mL có Cmax của amoxicilin là
105,4 µg/mL và acid clavulanic là 28,5 µg/mL. Thời gian bán thải trong huyết tương
của amoxicilin là 0,9 giờ và acid clavulanic là 0,9 giờ [9].
1.2. Một số phương pháp phân tích amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương
Ở Việt Nam và trên thế giới đã có nhiều công bố về phương pháp phân tích
amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương người. Mẫu huyết tương thường được
xử lý loại bỏ protein bằng nhiều tác nhân như acetonitril (ACN), methanol (MeOH),
acid perclorid, hoặc chiết pha rắn [8][14]. Acid clavulanic thường được tạo dẫn xuất với
imidazol trước khi phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết nối với detector
tử ngoại khả kiến (UV-VIS) [5]. Đối với các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng
khối phổ (LC-MS) thì mẫu có thể phân tích trực tiếp sau khi loại bỏ protein bằng chiết
pha rắn. Điều này đã được giải thích do sự chuyển dạng của acid clavulanic thành methyl
8-hydroxy-6-oxo-4-aza-2-octenoat trong các dung môi methanol, acetonitril [11].
Những nghiên cứu sử dụng chiết pha rắn và rửa giửa giải bằng nước thì acid clavulanic
không bị chuyển dạng và có thể tiến hành phân tích acid clavulanic mà không cần dẫn
xuất hóa.
Hầu hết các phương pháp định lượng trong huyết tương đều dùng chất chuẩn nội,
thường là các kháng sinh trong cùng nhóm, có cấu trúc phân tử tương tự chất phân tích.
Một số phương pháp định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong dịch sinh học
được trình bày trong bảng 1.2.
1.3. Kỹ thuật HPLC
HPLC là kỹ thuật tách các chất dựa trên tương tác khác nhau của các chất phân
tích với pha tĩnh và pha động. Chất phân tích được lưu giữ trên cột nhồi các hạt pha tĩnh

theo các tương tác phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh và chất phân tích, sau đó được
rửa giải ra ngoài theo dòng pha động. Kỹ thuật hay gặp là sắc ký lỏng phân bố, sử dụng
pha động là hỗn hợp các dung môi và pha tĩnh là silica được dẫn xuất hoá. Sắc ký phân
bố được chia làm hai loại sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo. Sắc ký
phân bố pha đảo sử dụng pha tĩnh kém phân cực như C18, C8 và hỗn hợp dung môi
phân cực như acetonitril, methanol, nước, dung dịch đệm pha trong nước. Kỹ thuật sắc
ký này thường áp dụng với những chất kém phân cực hoặc phân cực trung bình và có
phân tử lượng dưới 2000. Các nghiên cứu xác định AMX và CLA được liệt kê trong
bảng 1.2 đều sử dụng sắc ký phân bố pha đảo.
4


Bảng 1.2. Một số phương pháp định lượng AMX và CLA trong dịch sinh học
Tài liệu

Pha tĩnh

[5]

Zorbax SB C8 (150 Kết tủa bằng ACN,
x 4,6 mm, 5 μm);

Xử lý mẫu

Dẫn

xuất

Chuẩn nội

Pha động

Terbutalin

MeOH: dung dịch đệm 200 nm (AMX)

LOQ

phosphat pH 3,5= 9:1

AMX= 0,5 µg/mL;

bằng

imidazol
[12]

C18 (250 x 4,6 mm) CLA tạo dẫn xuất
imidazol

[18]

Detector

322 nm (CLA)

LOD, LOQ

2 ml/phút

CLA= 0,125 µg/mL

MeOH: dung dịch đệm 227 nm

LOD

phosphat pH 3,2

AMX= 0,5 µg/mL

2,5 mL/phút.

CLA= 0,1 µg/mL

Cột C8 (250 × 4,6 Kết tủa protein bằng

ACN: dung dịch đệm

mm, 5 μm)

phosphat chứa

AMX= 0,05 mg/L,

tetramethylamoni clorid

CLA= 0,08 mg/L

=93:7

LOQ

1 ml/phút

AMX= 0,625 mg/L,

MeOH

220 nm

LOD

CLA= 0,3125 mg/L
[7]

Cột C8 (150 x 4,6 Kết tủa protein bằng Amoxicilin
mm, 5 μm)

MeOH

và ACN: dd đệm phosphat

acid clavulanic

205 nm

pH 3= 95:5
0.8 mL/phút

[13]

C18 (250 x 4,6 mm, Cột chiết pha rắn Ampicilin
5 µm)

Oasis HLB, rửa giải amoxicilin D4

và ACN: amoni acetat 2 MS
mM= 80:20

bằng nước
[14]

LLOQ
AMX=50,43 ng/mL,
CLA=25,28 ng/mL

Acquity HSS T3 Cột chiết pha rắn Ampicilin

Hỗn hợp acid formic MS

LLOQ

(2,1 x 100 mm, 1,8 Oasis HLB, rửa giải

0,2% trong ACN và acid

AMX= 0,05 µg/mL

formic 0,2% trong nước.

CLA= 0,025 µg/mL

µm)

bằng nước

5


Sau khi các chất phân tích được tách ra bằng cột sắc ký, chúng được phát hiện bởi
một bộ phân phát hiện phù hợp. Hai loại detector hay được sử dụng là UV-VIS và khối
phổ MS. Detector UV- VIS thông dụng hiện nay là detector mảng iod (DAD) cho phép
định lượng đồng thời tại nhiều bước sóng do đó có thể chọn các bước sóng tối ưu cho
các chất phân tích. Detector MS có độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn do đó có thể định
lượng được ở nồng độ thấp hơn. Tuy nhiên thiết bị LC-MS kém phổ biến và đắt tiền hơn
so với HPLC.
Các chất phân tích được định lượng dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất cần
phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của chất đó. Dựa trên nguyên tắc này, ta có
các kỹ thuật định lượng hay dùng trong phân tích dịch sinh học:
• Phương pháp ngoại chuẩn: Là phương pháp định lượng dựa trên cơ sở so sánh
diện tích (hoặc chiều cao) pic của một hoặc nhiều mẫu chuẩn đối chiếu và mẫu thử được
phân tích trong cùng điều kiện sắc ký. Chất chuẩn ngoại là chất có bản chất là chính chất
phân tích, độ tinh khiết cao và đạt yêu cầu của chất chuẩn theo quy định. Khi phân tích
các chất trong dịch sinh học, nồng độ của các chất dao động lớn do đó phương pháp hay
được sử dụng là phương pháp đường chuẩn. Tuy nhiên phương pháp ngoại chuẩn chỉ
được sử dụng khi hiệu suất xử lý mẫu có độ lặp lại cao.
• Phương pháp nội chuẩn: thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng như nhau
của một chất chuẩn thứ hai được gọi là chuẩn nội. Các chất được định lượng dựa trên so
sánh tỷ lệ diện tích giữa chất phân tích và chất chuẩn nội (Sx/SIS) với tỷ lệ diện tích pic
chất chuẩn ngoại và chất chuẩn nội (SES/SIS). Chất chuẩn nội thường có cấu trúc, tính

chất gần giống với chất cần phân tích và đảm bảo yêu cầu của một chất chuẩn. Việc
thêm chất chuẩn nội vào sẽ làm giảm sai số của quá trình xử lý mẫu trải qua nhiều bước,
hiệu suất không lặp lại. Các chất được định lượng theo đường chuẩn thiết lập dựa trên
mối liên hệ giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn ngoại có nồng độ khác nhau và chuẩn nội với
nồng độ của chất chuẩn ngoại [1].
1.4. Tổng quan về xử lý mẫu trong dịch sinh học
Dịch sinh học thường có nền mẫu rất phức tạp và các chất phân tích thường tồn tại
ở nồng độ rất thấp. Các bước của quá trình phân tích trong dịch sinh học bao gồm: lấy
mẫu, chuẩn bị mẫu, tách, phát hiện, định tính và định lượng. Mẫu huyết tương thường
được sử dụng nhiều trong nghiên cứu HPLC.

6


Chuẩn bị mẫu là giai đoạn rất quan trọng nhằm loại bỏ các thành phần tạp không
mong muốn và làm nhiễu nền phân tích. Nếu protein trong huyết tương được tiêm vào
cột sắc ký thì có thể bị tủa bởi pha động gây tắc đường dẫn, tăng áp suất hệ thống.
Phương pháp phổ biến để loại protein huyết tương là kết tủa protein bằng acid pecloric
hoặc dung môi hữu cơ tan trong nước như acetonitril và methanol. Sau đó có thể chiết
ngược bằng dung môi hữu cơ kém phân cực hơn như dicloromethan hoặc cloroform để
thu lớp chứa chất phân tích ở trên. Cô nitơ dịch chiết có thể làm tăng tỷ lệ thu hồi các
chất phân tích trong quá trình phân tích [5][7],..Ngoài ra các phương pháp chiết lỏng
lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) trong LC-MS [13][14] cũng được dùng để làm sạch mẫu,
làm giàu chất phân tích.

7


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dùng trong nghiên cứu là mẫu tự tạo của amoxicilin, acid clavulanic và
cefadroxil trong huyết tương trắng.
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.2.1. Nguyên vật liệu
• Amoxicilin trihydrat: Chuẩn đối chiếu (Viện kiểm thuốc Trung ương), hàm
lượng 87,17%.
• Cefadroxil monohydrat: Chuẩn đối chiếu (Viện kiểm thuốc Trung ương), hàm
lượng 94,37%.
• Acid clavulanic: Chuẩn nguyên liệu, hàm lượng 40,9%.
• Huyết tương trắng (Viện Huyết học và truyền máu Trung ương).
• Kali dihydrophotphat (Merck).
• Natri hydroxyd (Merck).
• Acid phosphoric (Merck).
• Acetonitril (Fisher).
• Methanol (Fisher).
• Cloroform (Labscan- Thái Lan).
• Nước cất hai lần.
• Khí nitơ.
2.2.2. Thiết bị
• Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Algilent 1100
• Cột sắc ký Inersil C18 ODS-3 (250 x 4,6 mm; 5µm)
• Cột sắc ký Supelco C8 (150 x 4,6 mm; 5µm) (Sigma-Aldrich)
• Máy ly tâm Kubota 6500
• Cân phân tích Satorius d= 0,1 mg
• Tủ lạnh âm sâu - 80oC Model panasonic MDF-594-PB
• Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H
• Máy lắc xoáy Labinco L46
• Máy đo pH Cyberscan Eutech Instruments
• Micropipet 10-100 µL ABMATE pro, 100-1000 µL Nichipet EX
8

• Ống ly tâm Eppendorf 2 mL
• Máy cô nitơ Hanon HN 200
• Bình khí nitơ
• Bình định mức 5 mL, 10 mL (Merck)
• Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,45µm (Satorius stedim).
2.2.3. Cách chuẩn bị mẫu
Dung dịch đệm phosphat 100 mM pH 2,5: Cân chính xác khoảng 13,6 g KH2PO4
vào cốc có mỏ thể tích 1 L với khoảng 980 mL nước cất hai lần. Chuẩn dung dịch trên
bằng H3PO4 đặc đến pH 2,5, thêm nước vừa đủ bình định mức 1 L. Lọc qua màng lọc
0,45 µm.
• Pha các dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn đơn amoxicilin, acid clavulanic và cefadroxil: Cân chính xác
khoảng 10 mg amoxicillin, 20 mg acid clavulanic và 10 mg cefadroxilvào 3 bình định
mức 10 mL. để được các dung dịch gốc amoxicilin 1000 ppm, acid clavulanic 818 ppm,
và cefadroxil 1000 ppm. Với dung dịch gốc acid clavulanic cần lọc qua giấy lọc để loại
avicel.
Từ dung dịch gốc của amoxicilin và acid clavulanic dùng micropipet pha loãng
với nước để thu được hỗn hợp amoxicilin/acid clavulanic có nồng độ 9/2,454 ppm;
15/4,09 ppm; 30/8,18 ppm; 60/16,36 ppm; 180/49,08 ppm; 300/81,8 ppm (bảng 2.1)
Pha dung dịch chuẩn nội: Từ dung dịch gốc cefadroxil 1000 ppm sử dụng
micropipet pha loãng với nước để được dụng dịch nồng độ 30 ppm (dung dịch A).
Bảng 2.1. Bảng pha các dung dịch chuẩn
Nồng độ

V dung dịch AMX

V dung dịch CLA V nước

AMX/CLA (ppm)

1000 ppm (µL)

818 ppm (µL)

(µL)

ống cho 50

9/2,5

45

15

4940

µL dung dịch

15/4,09

30

10

1960

hỗn hợp và

30/8,18

30

10

960

100 µL dung

60/16,36

60

20

920

dịch A và 250

180/49,08

180

60

760

µL huyết

300/81,8

300

100

600

tương trắng

9

Sau đó mỗi


2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu
• Lựa chọn cột sắc ký
• Lựa chọn pha động
• Lựa chọn chất chuẩn nội
• Lựa chọn bước sóng phát hiện
• Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương
2.3.2. Thẩm định phương pháp
Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn thẩm định các phương pháp phân
tích trong dịch sinh học của Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) theo
các tiêu chí sau:
• Độ phù hợp hệ thống
• Độ chọn lọc
• Tính tuyến tính
• Độ chính xác

• Độ đúng
• Độ ổn định của mẫu
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu
Dựa trên đặc điểm về độ phân cực của AMX và CLA, một số tài liệu tham khảo
trong và ngoài nước tôi quyết định sử dụng sắc ký lỏng pha đảo để phân tích hai chất
này trong huyết tương. Tôi tiến hành khảo sát các điều kiện xử lý mẫu và sắc ký sau:
• Lựa chọn cột sắc ký: Dựa trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm và tham
khảo các tài liệu [5][12], chúng tôi tiến hành khảo sát trên hai loại cột sắc ký pha đảo
hay được sử dụng dụng là cột Supelco C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm) và cột Inertsil® ODS3 C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). Xác định cột có khả năng lưu giữ AMX và CLA với thời
gian phù hợp, khả năng tách các chất phân tích ra khỏi nhau và độ cân xứng của pic sắc
ký.
• Lựa chọn chất chuẩn nội: Dựa vào đặc điểm độ phân cực của AMX và CLA và
dựa trên các chất sẵn có trong phòng thí nghiệm, các kháng sinh cùng nhóm với AMX
có độ phân cực trung bình được khảo sát (cefepim, cefadroxil, ceftazidim). Bên cạnh đó
một số chất phân cực khác (nicotinamid, metformin, pyridoxin) cũng được khảo sát. Các
10


chất được lựa chọn khi tách hoàn toàn khỏi nền huyết tương trắng, tách hoàn toàn với
AMX và CLA, có thời gian lưu gần với các chất phân tích.
• Lựa chọn pha động: Dựa trên tài liệu tham khảo [18] tôi lựa chọn hỗn hợp dung
dịch đệm phosphat và ACN làm dung môi pha động và cố định tốc độ dòng pha động
1ml/phút. Khảo sát pH pha động (2,5; 3; 3,5; 6,8) và các nồng độ đệm 10 mM, 50 mM,
100 mM, tỷ lệ thể tích dung dịch đệm phosphat: ACN (97:3, 96:4, 95:5, 93:7). Căn cứ
lựa chọn pha động là khả năng tách AMX và CLA hoàn toàn ra khỏi nhau và tách hoàn
toàn ra khỏi nền huyết tương.
• Lựa chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV-VIS tại vị trí pic của các chất phân
tích và chuẩn nội, tìm bước sóng phù hợp để có thể phát hiện được các chất ở nồng độ
thấp và tách được khỏi nền huyết tương.

• Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương: Dựa trên các nghiên cứu trước
[5][18], tôi xử lý mẫu bằng dung môi MeOH hoặc ACN để loại bỏ protein huyết tương.
Mẫu huyết tương sau đó được chiết ngược bằng dung môi kém phân cực như cloroform.
Để khắc phục việc CLA bị chuyển dạng trong các dung môi hữu cơ tôi tiến hành cô mẫu
đến cắn và hoà tan lại bằng nước.
2.4.2. Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng theo hướng dẫn của FDA trên
các tiêu chí tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc của phương pháp, tính tuyến tính, độ
đúng, độ chính xác và độ ổn định [17].
Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsofl Excel 2016.
2.4.2.1. Độ chọn lọc, độ đặc hiệu
Đánh giá khả năng phương pháp phân tích nhận diện và phân biệt được chất phân
tích và các thành phần có trong mẫu.
Phân tích trên các mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn,
chuẩn nội và hỗn hợp, so sánh các sắc ký đồ thu được. Ghi lại sắc đồ, đáp ứng pic và
các thông số pic của các mẫu trắng và mẫu chuẩn. Phương pháp HPLC được coi là chọn
lọc đối với chất phân tích và chuẩn nội (IS) khi:
- Trên SKĐ của mẫu chuẩn, các pic của chất phân tích và IS phải được nhận diện rõ
ràng và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác (S/N ≥ 3).
- Tại thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất
5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng, tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS,
11


đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng
tương ứng.
2.4.2.2. Tính tuyến tính
Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của thiết bị
và nồng độ chất phân tích trong mẫu.
Các điều kiện đường chuẩn xây dựng cần đáp ứng:

• Đường chuẩn xây dựng bao gồm từ 6 đến 8 mẫu chuẩn bao phủ khoảng nồng độ
tuyến tính, bao gồm LLOQ. Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r ≥ 0,98 (xác định
bằng phương pháp bình phương tối thiểu)
• Độ lệch so với nồng độ định lượng phải nhỏ hơn 20% ở LLOQ và nhỏ hơn 15%
ở các nồng độ khác.
• Ít nhất 4 trên 6 điểm chuẩn phải thỏa mãn tiêu chí trên, bao gồm điểm thấp nhất
và cao nhất của đường chuẩn.
2.4.2.3. Độ đúng, độ chính xác, tỷ lệ thu hồi
• Độ đúng là giá trị phản ánh độ gần sát của nồng độ chất phân tích định lượng
được so với giá trị thực, độ đúng được xác định trên tối thiểu 3 mức nồng độ trong
khoảng nồng độ làm việc dự kiến, mỗi nồng độ thực hiện trên ít nhất 5 mẫu. Độ đúng
phải nằm trong khoảng 85- 115% so với giá trị thực, riêng với LLOQ yêu cầu trong
khoảng 80- 120%.
• Độ chính xác của phương pháp phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả
riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất, được
biểu thị bằng giá trị hệ số biến thiên CV (%). Yêu cầu giá trị CV ≤ 15%, riêng với LLOQ
yêu cầu CV ≤ 20%.
Độ chính xác có thể đánh giá trên độ chính xác trong ngày, độ chính xác khác ngày
và độ tái lặp.
• Tỷ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá
trình xử lý mẫu. Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của các mẫu
chuẩn thêm vào nền mẫu và xử lý mẫu với nồng độ thực của chất chuẩn tinh khiết không
qua xử lý mẫu. Tiến hành trên 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ 3 mẫu
riêng biệt.
Tỷ lệ thu hồi không nhất thiết phải đạt 100% nhưng phải chính xác, ổn định và lặp
lại.
12


2.4.2.4. Độ ổn định

Các mẫu phân tích trong dịch sinh học trải qua quá trình lấy mẫu, xử lý mẫu, bảo
quản mẫu (ngắn hạn, dài ngày), qua chu kỳ đông lạnh - rã đông và quá trình phân tích
mẫu nên cần đánh giá độ ổn định của chất phân tích. Độ ổn định được đánh giá bằng
cách so sánh kết quả phân tích các mẫu sau bảo quản với các mẫu mới chuẩn bị ít nhất
3 lần lặp lại ở mỗi mức nồng độ khác nhau (LQC, MQC và HQC). Trong thẩm định
phương pháp cần đánh giá các loại độ ổn định sau:
• Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc sau thời gian
ngắn và/hoặc thời gian dài.
Yêu cầu: Nồng độ của dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới
pha không quá 2%.
• Độ ổn định qua ba chu kỳ đông rã
Được tiến hành ở các nồng độ LQC, MQC, HQC, mỗi nồng độ ít nhất ba mẫu. Các
mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ đự kiến bảo quản trong 24 giờ và để tự rã đông ở nhiệt độ
phòng. Khi hoàn toàn rã đông, các mẫu được tái đông ở cùng điều kiện trong 12- 24 giờ.
Các mẫu được xử lý và phân tích ở chu kỳ thứ ba.
• Độ ổn định ngắn hạn
Được xác định ở 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ tiến hành 3 mẫu,
được rã đông hoàn toàn và giữ ở nhiệt độ này từ 4-24 giờ và phân tích.
• Độ ổn định dài hạn
Thời gian đánh giá độ ổn định dài hạn nằm ngoài khoảng thời gian từ ngày thu
thập mẫu đầu tiên đến ngày phân tích mẫu cuối cùng. Ít nhất 3 mẫu của mỗi nồng độ
LQC, MQC, HQC phải được đánh giá. Độ ổn định dài ngày so sánh với nồng độ mẫu
chuẩn phân tích ngày đầu tiên.

13


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu
3.1.1. Lựa chọn cột sắc ký

Kết quả khảo sát khả năng tách hai chất chuẩn AMX và CLA trong nước trên hai
cột C8 (Supelco, kích thước 150 x 4,6 mm; 5 µm) và C18 (Inertsil® ODS-3, kích thước
250 x 4,6 mm; 5 µm), sử dụng pha động là hỗn hợp dung dịch đệm phosphat 50 mM pH
6,8 và ACN theo tỷ lệ thể tích là 95:5 cho thấy cột C8 cho khả năng tách tốt, lưu giữ
CLA tốt hơn, tuy nhiên pic sắc ký không cân xứng. Cột C18 cũng tách được hai chất
trên, thời gian phân tích tương đương và pic cân xứng hơn so với cột C8. Do đó tôi chọn
cột C18 (Inertsil, kích thước 250 x 4,6 mm; 5 µm) cho các khảo sát tiếp theo.

Hình 3.1. Sắc ký đồ AMX trên cột C8

Hình 3.2. Sắc ký đồ AMX trên cột C18

14


3.1.2. Lựa chọn chất chuẩn nội
Do acid clavulanic có lgP= -1,5 phân cực hơn so với amoxicilin lgP= 0,87, tôi dự
kiến tìm một chất phân cực làm chuẩn nội cho CLA và một chất kém phân cực hơn để
làm chuẩn nội cho AMX. Dựa trên các chất sẵn có trong phòng thí nghiệm, tôi khảo sát
các chất cùng nhóm với AMX và có độ phân cực trung bình gồm: cefepim, cefadroxil,
ceftazidim để làm chuẩn nội cho AMX. Bên cạnh đó một số chất phân cực khác
(nicotinamid, metformin, pyridoxin) cũng được khảo sát để làm chuẩn nội cho CLA.
Phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký khảo sát ở trên cho kết quả pic của vitamin
B6, metformin được rửa giải ra gần vị trí pic của CLA, nhưng thời gian lưu quá ngắn,
chưa thể tách ra khỏi pic huyết tương. Nicotinamid có thời gian lưu trùng với AMX. Do
đó các chất trên không thể sử dụng làm chuẩn nội cho CLA.
Cefatazidim có thời gian lưu dài dẫn đến kéo dài thời gian phân tích mẫu, không
thích hợp làm chuẩn nội trong phương pháp này. Pic của cefepim không tách được ra
khỏi nền huyết tương. Pic của cefadroxil (CEF) xuất hiện sau pic của AMX, pic tách
hoàn toàn và không trùng với các pic khác, không ảnh hưởng đến thời gian phân tích

mẫu do sau đó còn pic của nền huyết tương. Dựa trên các yêu cầu về chuẩn nội chúng
tôi quyết định sử dụng cefadroxil (CEF) làm chuẩn nội do nó là một kháng sinh nhóm
cephalosporin thế hệ 1, có cấu trúc phân tử tương tự với amoxicilin. Sau đó chúng tôi
khảo sát và thấy CEF có thể sử dụng làm chuẩn nội cho CLA về tỷ lệ diện tích pic của
CLA và CEF được lặp lại trong các lần phân tích.
CEF có công thức cấu tạo như hình sau:

Hình 3.3. Công thức cấu tạo của cefadroxil
So sánh với yêu cầu cho một chất chuẩn nội cho thấy chất chuẩn đối chiếu CEF
phù hợp để làm chuẩn nội cho AMX và CLA:
• CEF có tính chất hóa học, vật lý tương đồng với AMX do đều là kháng sinh nhóm βlactam. Mặc dù CEF có cấu trúc hóa học không giống với CLA nhưng cho đáp ứng tỷ

15


lệ diện tích pic SCLA/SCEF lặp lại, do đó CEF có thể được sử dụng làm chuẩn nội cho cả
hai chất.
• CEF đáp ứng yêu cầu của một chất chuẩn đối chiếu, bền vững, có độ tinh khiết cao
• Được phát hiện bởi detector DAD
• Được tách hoàn toàn ra khỏi nền mẫu và các chất phân tích, có thời gian lưu gần với
AMX.
Như vậy CEF được lựa chọn làm chuẩn nội cho AMX và CLA. Nồng độ CEF được
cố định là 30 ppm cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.3. Lựa chọn pha động
Để lựa chọn pha động chúng tôi cố định phương pháp xử lý mẫu như sau: thêm
vào 250 µL huyết tương trắng 50 µL hỗn hợp chuẩn AMX, CLA và 100 µL CEF. Mẫu
phân tích sau đó được tủa protein huyết tương bằng 500 µL MeOH, chiết ngược bằng
500 µL cloroform. Lấy 500 µL dịch chiết cô nitơ đến cắn, hoàn tan lại bằng 200 µL
nước và tiến hành chạy sắc ký. Chạy song song với mẫu huyết tương trắng trong cùng
điều kiện. Chúng tôi cố định tốc độ dòng là 1 mL/phút và tiến hành khảo sát pha động

gồm hỗn hợp dung dịch đệm phosphat và ACN như sau:
• Cố định tỷ lệ thể tích của dung dịch đệm phosphat và ACN trong pha động là
95:5, cố định nồng độ đệm 50 mM, khảo sát pH của đệm phosphat tại các pH 2,5; 3;
3,5; 6,8. Kết quả cho thấy khi sử dụng các dung dịch đệm phosphat pH 3; 3,5; 6,8 đều
xuất hiện pic nền trùng với thời gian lưu pic của acid clavulanic. Tại pH 2,5 pic của thời
gian lưu của CLA dài hơn, có khả năng tách tốt nhất ra khỏi nền huyết tương, pic của
AMX có thời gian lưu phù hợp, tách với các pic nền. Do đó tôi lựa chọn dung dịch đệm
phosphat có pH = 2,5 cho các khảo sát tiếp theo. Kết quả khảo sát pH của đệm phosphat
được thể hiện trên hình 3.4, 3.5 và 3.8, 3.9.

Hình 3.4. Sắc ký đồ huyết tương trắng với đệm phosphat pH 3,5
16


Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu AMX, CLA, CEF trong HT với đệm phosphat pH 3,5
Từ các giá trị pka, ta có thể sơ bộ giải thích thời gian lưu của AMX và CLA khi
thay đổi pH. CLA có nhóm chức –COOH và có pka = 3, khi tăng pH từ 2,5 đến 6,8 thì
CLA tồn tại ở dạng muối nhiều hơn và trở nên phân cực hơn. Trong sắc ký lỏng pha
đảo, chất phân cực hơn sẽ được rửa giải ra sớm hơn, do đó khi tăng pH của dung môi
pha động, pic của CLA sẽ được rửa giải ra nhanh hơn. AMX có nhóm chức –COOH có
pka1= 3,2 và nhóm –NH2 có pka2= 11,7. Tại pH= 6,8 nằm giữa hai giá trị pka, AMX tồn
tại ở dạng lưỡng cực, ít phân cực hơn, do đó thời gian lưu được kéo dài ra. Ở các pH
thấp thì AMX tồn tại chủ yếu ở dạng NH3+ phân cực hơn nên thời gian lưu ngắn hơn.
• Khảo sát tỷ lệ pha động: Sau khi chọn hệ pha động hỗn hợp dung dịch đệm
phosphat (100 mM, pH 2,5) và ACN chúng tôi khảo sát các tỷ lệ thể tích pha động khác
nhau: 93:7; 95: 5, 96:4 và 97:3.
Kết quả cho thấy khi sử dụng hỗn hợp gồm dung môi đệm phosphat và ACN ở các
tỷ lệ 95:5, 96:4, 93:7, pic của CLA chưa tách hoàn toàn pic huyết tương trắng. Khi sử
dụng hỗn hợp pha động theo tỷ lệ 97:3, kết quả cho thấy hệ này có khả năng tách tốt
nhất, các pic tách rời nhau, có độ chọc lọc cao, thời gian lưu đủ để tách hoàn toàn ra

khỏi tạp huyết tương. Do tổng thời gian phân tích đã là 30 phút, chúng tôi không tiến
hành khảo sát ở các tỷ lệ thể tích dung dịch đệm lớn hơn do thời gian phân tích mẫu sẽ
dài hơn.
Sắc ký đồ của mẫu HTT và mẫu AMX, CLA, CEF phân tích theo tỷ lệ thể tích pha
động 93:7 và 97:3 được thể hiện ở hình 3.6, 3.7 và hình 3.8, 3.9.

17