(Luận văn thạc sĩ) Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa Leucoanthocyanidin Reductase ở cây chè

i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HẰNG

TẠO DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE
Ở CÂY CHÈ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 8 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2018


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ
nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể đều được ghi nhận
trong lời cảm ơn.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên.
Tác giả

Phạm Thị Hằng

iii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu
Yến - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học - người đã tận
tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ Khoa Công nghệ Sinh
học, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và
các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Huỳnh Thị Thu Huệ và Cử nhân
Phạm Thị Hằng - Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ dẫn và giúp
đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Dương
Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã
giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả

Phạm Thị Hằng


iv

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI ................................................................................ 1
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI...................................................................................... 2
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ ...................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây chè................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học chung của cây chè .............................................. 4
1.1.3. Thành phần hóa học của chè ............................................................. 9
1.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ...... 12
1.2.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới................................................ 12
1.2.2. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam ................................................ 13
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM . 14
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới ........................................... 14
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam............................................ 15
1.4. CATECHINS VÀ LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ.. 16
1.4.1. Catechins và công dụng của Catechins ........................................... 16
1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp catechins ở chè ............................................. 17
1.4.3. Leucoanthocyanidin reductase (LAR) ............................................ 19
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21
2.1. VẬT LIỆU................................................................................................ 21
2.1.1 Nguyên liệu ...................................................................................... 21
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ............................................................................. 21
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 22
2.2.1. Phương pháp thu mẫu lá chè ........................................................... 22
2.2.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ lá chè .............................. 22


v

2.2.3. Điện di RNA tổng số....................................................................... 23
2.2.4. Tổng hợp cDNA .............................................................................. 24
2.2.5. Nhân gen CsLAR1 bằng kỹ thuật RT –PCR ................................... 24
2.2.6. Tách dòng gen CsLAR1 .................................................................. 25
2.2.7. Xác định và phân tích trình tự......................................................... 29
2.2.8. Tạo vector biểu hiện gen CsLAR1 .................................................. 30
2.2.9. Biểu hiện gen CsLAR1 .................................................................... 31
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 32
3.1. KHUẾCH ĐẠI GEN CsLAR1 TỪ MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU ............. 32
3.2. TẠO DÒNG GEN, XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ
HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE ....................................... 33
3.2.1. Tạo dòng gen CsLAR1 .................................................................... 33
3.2.2. Xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1 ................................... 34
3.3. BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CsLAR1 TỪ CHÈ TRUNG DU XANH
TRONG VI KHUẨN E. COLI ........................................................................ 41
3.3.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E. coli
DH10B ...................................................................................................... 41
3.3.2. Biểu hiện gen CsLAR1 .................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 45
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 46


vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Nghĩa tiếng Việt

Từ viết tắt
C

Nghĩa tiếng Anh

Catechin

Catechin

cDNA

DNA bổ sung

Complementary DNA

CsLAR

Gen LAR của chè

Camellia sinensis LAR

DNA

Axit Deoxiribonucleic

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxide

Đồng tác giả

et al.

Đtg
EDTA

Axit etylene diamin tetraaxetic Ethylene Diamine Tetraacetic
Acid

EtBr

Ethidium Bromide

Ethidium Bromide

EtOH

Etanol

Ethanol

EGCG

Epigallocatechin-3-O-gallate

Epigallocatechin-3-O-gallate

Epicatechin

Epicatechin

ECG

Epicatechin-3-O-gallate

Epicatechin-3-O-gallate

EGC

Epigallocatechin

Epigallocatechin

Gallocatechin

Gallocatechin

Chất cảm ứng biểu hiện gen

Isopropyl- -D-thiogalactoside

EC

GC
IPTG

IPTG
Kilô bazơ

Kilo base

Leucoanthocyanidin reductase

Leucoanthocyanidin reductase

LB

Môi trường LB

Luria Bertani

mRNA

ARN thông tin

Mesenger Axit Ribonucleic

Trung tâm Thông tin Công

National Center for

nghệ Sinh học Quốc gia

Biotechnology Information

Nicotinamid adenine

Nicotinamid adenine

Kb
LAR

NCBI
NAD


vii

dinucleotide

dinucleotide

Nicotinamid adenine

Nicotinamid adenine

dinucleotide phosphate

dinucleotide phosphate

Khung đọc mở

Open reading frame

Proanthocyanidin

Proanthocyanidin

Phản ứng chuỗi trùng hợp

Polymerase Chain Reaction

Primer R

Mồi ngược

Primer reverse

Primer F

Mồi xuôi

Primer forward

RNA

Axit Ribonucleic

Ribonucleic Acid

RNase

Enzyme phân hủy RNA

Ribonuclease

RT

Enzyme phiên mã ngược

Reverse Transciptase

SSR

Chất chỉ thị phân tử

Simple sequence repeats

TAE

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Vi khuẩn chịu nhiệt

Thermus aquaticus

UTR

Vùng không dịch mã

Untranslated region

NADP
ORF
PA
PCR


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các dạng tán chè .............................................................................. 5
Hình 1.2. Mầm chè cắt dọc .............................................................................. 5
Hình 1.3. Búp chè ............................................................................................. 6
Hình 1.4. Sơ đồ đợt sinh trưởng ....................................................................... 6
Hình 1.5. Các loại lá trên cành chè .................................................................. 7
Hình 1.6. Rễ chè ............................................................................................... 8
Hình 1.7. Sơ đồ tổng hợp catechins ở chè ..................................................... 18
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 .................................................... 26
Hình 2.2. Sơ đồ vector biểu hiện pET32a(+) .................................................. 30
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................. 31
Hình 3.1. Hình ảnh điện di kết quả PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ chè Trung
Du xanh ........................................................................................................... 32
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm tách dòng gen CsLAR1 từ mẫu chè Trung
du xanh trong vector pJET1.2 ......................................................................... 33
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong
plasmid pJET 1.2 ............................................................................................. 34
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự gen CsLAR1 phân lập từ mẫu chè Trung du

xanh với một số trình tự trên Genbank ........................................................... 36
Hình 3.5. So sánh trình tự amino acid suy diễn của CsLAR1 từ giống chè
Trung Du xanh với các trình tự đã công bố .................................................... 38
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid ................................................................ 41
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid gắn gen CsLAR1 vào vector
pET32a(+) ....................................................................................................... 42
Hình 3.8. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_CsLAR1 bằng BamHI và
XhoI và PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ plamid............................................ 43
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm protein tổng số từ chủng Rosetta tạo
CsLAR1 tái tổ hợp ........................................................................................... 44


ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của chè tươi .................................................... 9
Bảng 1.2. Thành phần độ ẩm thay đổi theo tháng trong năm ........................ 11
Bảng 1.3. Diễn biến diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè
chính trên thế giới năm 2016........................................................................... 12
Bảng 1.4. Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong
những năm gần đây ......................................................................................... 14
Bảng 2.1. Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ............................... 22
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .......................................... 24
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA ..................... 24
Bảng 2.4. Trình tự các đoạn mồi sử dụng nhân gen CsLAR1 ......................... 25
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR nhân gen CsLAR1 ............................... 25
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng tạo đầu bằng sản phẩm PCR ....................... 26
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen CsLAR1 và vector
pJET 1.2 .......................................................................................................... 27
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid .................................................. 29

Bảng 3.1. Sự sai khác một số trình tự nucleotide gen CsLAR1 của chè Trung
du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank ......................................... 37
Bảng 3.2. Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa LAR ở giống chè
Trung du xanh với trình tự đã công bố trên Genbank. .................................... 39


1

MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Chè (Camellia sinensis (L) O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu,
được trồng khá phổ biến trên thế giới.
Chè là nước uống thông dụng và được mọi người ưa thích không chỉ
bởi hương vị độc đáo của nó, mà còn do nước chè rất có lợi cho sức khỏe.
Nước chè có tác dụng giải khát, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ bắp và hệ
thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng
khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc và
chân tay, ngăn chặn sự phát triển và tiến triển của bệnh Alzheimer [22]. Hơn
nữa, uống chè còn kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì; chống viêm; chống
sâu răng, hôi miệng và ung thư vòm họng; phòng ngừa ung thư [18], [36];
phòng ngừa bệnh tăng huyết áp [41]; tiểu đường [20] và ngăn ngừa
cholesteron tăng cao [17]. Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác
hại của tia cực tím [21]. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê
ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè.
Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải
quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, cải
thiện đời sống nhân dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa
nông thôn [11]. Theo đánh giá của Unal (2011) có khoảng 2,5 triệu tấn chè
khô được sản xuất mỗi năm, trong đó chè đen chiếm khoảng 78%, chè xanh

chiếm 20% và chè Olong chiếm 2% [26]. Thành phần hóa học, đặc biệt hàm
lượng polyphenol, chất hòa tan sẽ quyết định đến chất lượng sản phẩm chè
[3]. Trong đó, catechins chiếm khoảng 30% thành phần polyphenol ở chè.
Catechins được chia thành 2 nhóm: catechins được epimer hóa còn gọi là
epicatechin (EGCG, ECG, EGC và EC) và catechins không được epimer hóa
(GC và C) [27], [30]. Hiện nay, hoạt tính sinh học và cơ chế tổng hợp


2

polyphenol nói chung và catechins nói riêng ở mức độ phân tử được các nhà
khoa học tập trung nghiên cứu [16], [33], [35]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng,
leucoanthocyanidin reductase (LAR) là một enzyme đóng một vai trò quan
trọng trong sinh tổng hợp C và GC ở cây chè [29].
Ở nước ta, nhìn chung việc nghiên cứu về thành phần sinh hóa chè,
hàm lượng polyphenol, thành phần catechins còn ít được quan tâm, cập nhật.
Trong khi các thành phần này thay đổi rất lớn theo giống và chất lượng
nguyên liệu. Bên cạnh đó, sự hiểu biết ở mức độ phân tử của các gen mã hóa
enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp polyphenol nói riêng,
catechins nói chung hầu như chưa được nghiên cứu cấu trúc và chức năng.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng
và phân tích trình tự gen mã leucoanthocyanidin reductase ở cây chè”.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ cây
chè trồng tại Thái Nguyên.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
+ Khuếch đại gen CsLAR1 mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ
cây chè.
+ Tạo dòng, xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1 thu được.
+ Thiết kế vector biểu hiện và tạo leucoanthocyanidin reductase tái

tổ

hợp.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây chè
Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O. Kumtze và thuộc
hệ thống phân loại như sau:
Ngành: Hạt kín (Angiospermae)
Lớp: Song tử diệp (Dicotyledonae)
Bộ: Chè (Theaseae)
Họ: Chè (Theaceae)
Chi: Chè (Camelia hoặc Thea)
Loài: Camellia sinensis
Cây chè là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao,
được trồng ở hơn 58 quốc gia. Ngày nay, ở Việt Nam hầu hết các tỉnh có điều
kiện thuận lợi đều trồng chè, song ba vùng trồng nhiều nhất là [33]:
• Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái)
chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc.
• Vùng trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên). Đây là
vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy
sản xuất lớn.
• Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ
yếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô long.
Những công trình nghiên cứu của Đjêmukhatze (1961 - 1976) về phức
catechins của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các

chất catechins giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lên
luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè và trên cơ sở đó xác minh
nguồn gốc cây chè. Đjêmukhatze kết luận rằng: những cây chè mọc hoang


4

dại, tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin và (-) - epicatechin galat, ở chúng
phát triển chậm khả năng tổng hợp (-) epigalo catechin và các galat của nó để
tạo thành (+) galocatechin. Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy
chúng cũng tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin và (-) - epicatechin galat
(chiếm 70% tổng số các loại catechins. Điều này có nghĩa là sự trao đổi chất ở
đây hướng về phía tăng cường quá trình hiđroxin hóa và galin hóa. Từ những
biến đổi sinh hóa này của lá các cây chè mọc hoang dại và cây chè được trồng
trọt chăm sóc, cho phép đi tới một kết luận mới “Nguồn gốc của cây chè
chính là ở Việt Nam” [45].
Hiện nay chè được phân bố khá rộng trong những điều kiện tự nhiên rất
khác nhau từ 30 độ vĩ nam (Natan - Nam Phi) đến 45 độ vĩ bắc (Gruzia - Liên
Xô) là những nơi có điều kiện tự nhiên khác rất xa vùng nguyên sản.
1.1.2. Đặc điểm sinh học chung của cây chè
Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặc
thân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và
mang một số đặc điểm sinh học sau đây [10]:
Hình thái
Thân và cành: Cây chè sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là đơn trục,
nghĩa là chỉ có một thân chính, thân thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành
một hệ thống cành và chồi. Sự phân cành của thân bụi khác nhau nên tạo cho
cây chè có các dạng tán: tán đứng thẳng, tán trung gian và tán ngang [42].

5

Hình 1.1. Các dạng tán chè [45]
1. Đứng thẳng 2. Trung gian 3. Nằm ngang
Cành chè do mầm dinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia làm
nhiều đốt. Từ thân chính, cành chè được phân ra nhiều cấp: cành cấp 1, cấp 2,
cấp 3...
Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh
dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả.
Mầm dinh dưỡng gồm có: Mầm đỉnh, mầm nách, mầm ngủ, mầm bất
định (mầm ở cổ rễ).

Hình 1.2. Mầm chè cắt dọc [46]
Phía trái: (1. Lá vẩy ốc, 2. Mầm lá cá, 3. Mầm lá thật,4. Mầm nách, 5. Điểm
sinh trưởng); Phía phải: (1. Lá vẩy ốc, 2. Mầm lá cá, 3. Mầm lá thật, 4. Mầm
nách thứ 4, 5. Mầm nách thứ 5, 6. Điểm sinh trưởng)
Búp chè: Búp chè là đoạn non của một cành chè. Búp được hình thành
từ các mầm dinh dưỡng, gồm có tôm (phần lá non ở trên đỉnh của cành chưa
xòe ra) và hai hoặc ba lá non.


6

Hình 1.3. Búp chè [45]
a. Búp bình thường

b. Búp mù

Búp chè gồm có hai loại: búp bình thường và búp mù. Có thể tóm tắt
hoạt động sinh trưởng búp theo tuần tự như sau:

Hình 1.4. Sơ đồ đợt sinh trưởng [45]
Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, mọc cách trên cành, mỗi đốt có
một lá. Lá chè có gân rất rõ, những gân chính của lá chè thường không phát
triển ra đến tận rìa lá. Trên một cành chè thường có các loại lá như sau:


7

Hình 1.5. Các loại lá trên cành chè [45]
Hoa: Cây chè 2, 3 tuổi đã có thể ra hoa, kết quả lần đầu, hoa chè mọc
ra từ mầm sinh thực ở nách lá chè. Hoa chè là hoa lưỡng tính, trong đó có 5-8
cánh màu trắng, có khi phớt hồng.
Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1-4 hạt. Quả chè có dạng hình
tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt. Khi còn non quả chè có màu xanh, khi
chín chuyển sang màu xanh đậm hoặc nâu. Khi vỏ chín vỏ quả nứt ra.
Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu nâu,
cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng. Kích thước hạt chè to nhỏ phụ thuộc vào kỹ
thuật chăm sóc. Hạt chè có khối lượng từ 0,6-2 gam, thường là từ 1-1,6 gam.
Hệ rễ: Hệ rễ chè gồm có: rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu
nâu hay nâu đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà.


8

Hình 1.6. Rễ chè [45]
Sự phân bố của rễ chè trong đất phụ thuộc vào giống, tuổi của cây, điều
kiện đất đai và chế độ canh tác. Lượng dinh dưỡng trong đất có ảnh hưởng
lớn đến sự phát triển của bộ rễ, nhất là lượng đạm.
Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè

Chè là một cây mọc trong những điều kiện ẩm ướt, râm mát của vùng
khí hậu cận nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á. Về nhu cầu ánh sáng, cây chè là
cây trung tính trong giai đoạn cây con, lớn lên ưa sáng hoàn toàn. Dưới bóng
râm, là chè xanh đậm, lóng dài, búp non lâu, hàm lượng nước cao nhưng búp
thưa, sản lượng thấp vì quang hợp yếu. Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự
sinh trưởng và phát triển của chè là 22-28oC, búp chè sinh trưởng chậm ở 1518oC, dưới 10oC mọc rất chậm. Trên 30oC chè mọc chậm, trên 40oC chè bị
khô xém nắng lá non. Độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80-85% [46].
Sinh trưởng và phát triển của cây chè
Thời vụ của cây chè:


9

– Vụ Xuân (tháng 3-4): Hái chừa 2 lá và lá cá, tạo tán bằng những búp
cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
– Vụ Hè Thu (tháng 5-10): Hái chừa 1 lá và lá cá, tạo tán bằng những
búp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
– Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá, tháng 12 hái cả lá cá.
Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trưởng đỉnh đều có thể hái
kéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động.
Chu kỳ sinh trưởng và phát triển:
Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn và phát triển lặp lại
nhiều lần trong một năm: Giai đoạn đầu tiên là giai đoạn cây non hay giai
đoạn thiết kế cơ bản. Sau đó là giai đoạn cây lớn là giai đoạn chè lớn kéo dài
20-30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dưỡng và khai thác. Đây là giai
đoạn chè cho năng suất cao nhất. Giai đoạn chè già cỗi, cây chè suy yếu dần,
lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm hương nhiều, chồi gốc
mọc nhiều.
1.1.3. Thành phần hóa học của chè
Chất lượng sản phẩm chè được đánh giá chủ yếu dựa trên cơ sở nghiên

cứu thành phần hóa học có trong chè [2]. Thành phần hóa học của chè được
xác định thường phụ thuộc loại chè và cách pha chế. Trong đó, các polyphenol
có vai trò rất quan trọng, quyết định đến màu sắc và hượng vị của chè [42].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của chè tươi [2]
Thành phần
Catechins
(-)-Epigallocatechin gallate
(-)-Epicatechin gallate
(-)-Epigallo catechin
(-)-Epicatechin

% khối lượng chất khô
25 – 30
8 – 12
3–6
3–6
1–3


10

(+)-Catechin
(+)-Gallocatechin
Flavonol và flavonol glucoside
Poliphenolic acid và dẫn xuất
Leucoanthocyamin
Chlorophyll và các chất màu khác
Khoáng
Cafeine
Theobromine

Theophylline
Amino acid
Acid hữu cơ
Monosaccharide
Polysaccharide
Cellulose và hemicellulose
Pectin
Lignin
Protein
Lipid
Các hợp chất dê bay hơi

1–2
3–4
3–4
3–4
2–3
0,5 – 0,6
5–6
3–4
0,2
0,5
4–5
0,5 – 0,6
4–5
14 – 22
4–7
5–6
5–6
14 – 17

3–5
0,01 – 0,02

Nước là thành phần quan trọng và chủ yếu trong búp chè, chiếm 7582% khối lượng lá chè [45], hàm lượng nước phụ thuộc vào giống chè, thời
vụ và độ non già của lá chè. Lượng mưa trung bình năm thích hợp cho sinh
trưởng cây chè trên thế giới là 1.500-2.000mm. Độ ẩm tương đối không khí từ
80-85% có lợi cho sinh trưởng của chè. Loại đất thích hợp cho trồng chè dày
60-100cm; mực nước ngầm dưới 100cm; độ chua pH: 4,5-5,5; tỷ lệ mùn 34%. Xét thành phần khối lượng, nước là thành phần chủ yếu của lá chè. Theo
số liệu của Phòng nghiên cứu chè và các cây trồng á nhiệt đới Liên bang về
hàm lượng nước trong búp chè gồm một tôm ba lá trong các tháng bằng %
được thể hiện ở bảng 1.2:


11

Bảng 1.2. Thành phần độ ẩm thay đổi theo tháng trong năm [44]
Tháng
Độ âm
(%)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

3,6

3,6

2,9

7,3

7,5

7,5

8,5

7,8

7,2

5.6

3,5

0,3

Hiện nay, xác định được độ ẩm của chè tăng lên trong thời gian bảo
quản là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến làm giảm chất lượng của chè. Như vậy
muốn giữ được chất lượng chè khô ít biến đổi trong thời gian bảo quản phải
quan tâm đến độ ẩm của chè lúc bao gói, đóng thùng [47].
Chất khô: Chiếm 25-30% khối lượng lá chè, gồm có các polyphenol,
pectin, chất xơ (xenlulo), protein, amino acid, các alcoloit (cafein, theofilin,
theobromin), các enzyme (enzyme oxi hóa và enzyme thủy phân) và chất tro.
Hợp chất polyphenol (tannin): Thành phần hóa học chính trong chất rắn
chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, thường chiếm 20-30% chất khô trong chè.
Tanin của cây chè là một phức hợp của nhiều hợp chất hữu cơ tự nhiên có bản
chất phenol. Hợp chất phenol giữ vai trò chủ yếu trong quá trình tạo màu sắc,
hương vị của chè đặc biệt là chè đen. Tanin có đặc tính dễ bị oxi hóa dưới tác
dụng của enzym và được cung cấp oxi đầy đủ. Flavanoids là thành phần quan
trọng của tanin, trong đó catechins và flavanoids chiếm tỷ lệ lớn.
Hợp chất Caffeine: Ankaloid chính của chè là caffeine. Caffeine là dẫn
xuất của purine có tên gọi theo cấu tạo là 1,3,5- trimethylxanthine, chiếm
khoảng 3-4% tổng lượng chất khô trong lá chè tươi. Và điều đặc biệt là hàm
lượng caffeine trong lá chè cao hơn trong cà phê từ 2-3 lần. Caffeine có khả
năng liên kết với tanin và các sản phẩm oxy hóa của tanin để tạo nên các muối
tanat caffeine. Các muối này tan trong nước nóng, không tan trong nước lạnh
và tạo nên hương thơm và sắc nước chè xanh và nâng cao chất lượng chè
thành phẩm.

12

Protein và amino acid: là hợp chất phức tạp có chứa N có khoảng 15%
bao gồm caffein (khoảng 2-5%), protein (6%) và các amino acid (5%), điều
kiện canh tác và các yếu tố khác. Điều đặc biệt là ngoài các amino acid. Ngoài
ra, trong chè còn có axit hữu cơ, các vitamin, muối khoáng, các sắc tố như
chlorophyll, caroten… đặc biệt là tinh dầu và các hợp chất dễ bay hơi liên
quan đến tạo hương vị trong chế biến chè chỉ chiếm một phần rất nhỏ.
1.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.2.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới
Theo Đỗ Ngọc Quỹ [9], quốc gia đầu tiên trên thế giới phát triển sản
xuất chè là Trung Quốc, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào những năm
805 sau Công nguyên. Đến nay, chè đã được trồng ở 58 quốc gia với quy mô
khác nhau, phân bố ở khắp 5 Châu như sau:
- Châu Á: Chấu Á có 20 nước trồng chè bao gồm: Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonexia, Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ, Lào, Thái Lan, Việt Nam, Nepan, Triều
Tiên, Iran, Myama…
- Châu Phi có 21 nước bao gồm: Kenia, Malavi, Uganda, Tanzania, Ai
Cập, Công Gô, Nam Phi, Maroc…
- Châu Mĩ có 12 nước bao gồm: Argentina, Braxin, Peru, Colombia,
Ecuador, Guatemala, Paraguay, Jamaica, Mexico, Bolivia, Guyana và Mĩ.
- Châu Đại Dương có 3 nước sản xuất chè đó là các nước: Papua
Tanghine, Fiji và Australia.
- Châu Âu chỉ có ở Liên Xô cũ (Grudia) và Bồ Đào Nha.
Bảng 1.3. Diễn biến diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè
chính trên thế giới năm 2016
Nước
Trung Quốc

Diện tích (ha)

Năng suất (Tạ/ha)

Sản lượng (Tấn)

2.240.594

10,778

2.414.802


13

Ấn Độ

585.907

21,372

1.252.174

Kenya

218.500

21,648

473.000

Srilanka

231,628

15,081

349.308

Thổ Nhĩ Kỳ

76.361

31,823

243.000

Indonesia

117.268

12,281

144.015

Việt Nam

118.824

20,198

240.000

Nhật Bản

44.078

18,195

80.200

Iran

20.403

36,759

75.000

Argentina

37.720

23,757

89.609

Nguồn: http:// FAOSTAT.FAO.ORG (21/3/2018)
Số liệu thống kê (Bảng 1.3) cho thấy: Trung Quốc là quốc gia đứng đầu

về diện tích đạt 2,240 triệu ha, chiếm 54,66% diện tích chè thế giới, sản lượng
chè của Trung Quốc cũng đứng đầu thế giới với 2,414 triệu tấn. Tuy nhiên,
năng suất chè của Trung Quốc không cao, chỉ đạt 10,778 tạ/ha. Sau Trung là
Ấn Độ với diện tích 585,9 nghìn ha, năng suất đạt 21,372 tạ/ha và là nước có
sản lượng chè thứ 2 thế giới, đạt 1,2 triệu tấn. Trong khi đó, Iran là nước có
năng suất chè cao nhất, đạt 36,759 tạ/ha; sản lượng 119,38 nghìn tấn, đứng
thứ 10 thế giới về sản lượng. Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích, thứ 6 về năng
suất và sản lượng.
1.2.2. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam
Việt Nam có diện tích trồng chè dao động khoảng 126.000 – 133.000ha
và thu hút khoảng 2 triệu lao động. Cả nước có khoảng 300 cơ sở chế biến
chè có công suất 900 nghìn tấn búp tươi/năm, trong đó có khoảng 31 nhà máy
có quy mô sản xuất lớn 30 tấn búp tươi/ngày chiếm 47% công suất chế biến;
103 nhà máy có quy mô vừa công suất chế biến 10 đến 28 tấn búp tươi/ngày
chiếm 43%; còn lại là cơ sở chế biến nhỏ công suất từ 3 đến 5 hoặc 6 tấn búp


14

tươi/ngày và các hộ chế biến nhỏ lẻ chiếm khoảng 10% tổng cộng suất chế
biến [44].
Hiện nay, Việt Nam là một trong 10 quốc gia đứng đầu thế giới về diện
tích và sản lượng chè, đứng thứ 7 trong tổng số 58 quốc gia sản xuất chè trên
thế giới. Cả nước có 32 tỉnh thành sản xuất chè với tổng diện tích là
120.000ha, tổng sản phẩm chế biến hàng năm trên 120 nghìn tấn. Trong đó
khoảng 70% là chè đen, còn lại 30% là chè xanh và các loại chè khác.
Bảng 1.4. Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong
những năm gần đây
Diện tích

Năng suất

Sản lượng

Xuất khẩu

(nghìn ha)

(Tạ/ha)

(Nghìn tấn)

(Nghìn tấn)

2011

127,8

77,4

878,9

133,91

2012

128,3

79,7

909,8

146,70

2013

129,8

79,5

936,3

141,44

2014

132,1

83,4

981,9

133,00

2015

133,6

86,0

1.010

132,50

2016

131,5

86,9

1.020

124,57

Năm

Nguồn: http:// FAOSTAT.FAO.ORG (21/3/2018)
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới
Ấn Độ là quốc gia chỉ đứng thứ hai trên thế giới về diện tích chè nhưng
lại đứng đầu thế giới về sản lượng chè. Đạt được thành tích trên là do Ấn Độ
rất quan tâm nghiên cứu phát triển khai thác các giống tốt vào sản xuất. Từ
những năm 50 của thế kỷ 20 Ấn Độ đã thành công trong việc chọn ra 110
giống chè tốt, trong đó có 102 giống chè được nhân bằng phương pháp vô


15

tính [9].
Theo Đỗ Ngọc Quỹ (2000) Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Srilanca,

Liên Xô cũ. đã sử dụng Công nghệ Sinh học trong chọn giống chè tốt, dùng
phôi non bồi dưỡng thành cây chè hoàn chỉnh. Sử dụng phương pháp lai, sử
dụng ưu thế lai để tạo giống chất lượng cao phục vụ cho sản xuất.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam
Theo Đỗ Ngọc Quỹ thống kê (1991) đến năm 1923 Việt Nam đã trồng
được 10.368ha chè đầu tiên với các giống chè thuộc giống chè Trung Quốc lá
to, chè Shan và chè Ấn Độ, đã thu thập gồm: 43 giống chè trong đó chủ yếu là
giống chè Trung Quốc lá to [10].
Ở Việt Nam qua nhiều năm nghiên cứu, Viện nghiên cứu chè đã ứng
dụng thống kê sinh học qua phân tích tương quan dựa vào các đặc trưng hình
thái để lựa chọn nhanh các loại hình chè có triển vọng khi cây chè 2-3 tuổi.
Ngoài ra các chỉ tiêu cần kết hợp xem xét các đặc điểm phát triển bộ rễ, màu
sắc lá. Các nghiên cứu về các quá trình sinh học ở chè và genome chè vẫn
chưa được nghiên cứu nhiều. Năm 2004, nhóm tác giả Nguyễn Minh Hùng,
Đinh Thị Phòng đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình của
một số dòng chè đột biến [4]. Năm 2010, Nguyễn Thị Thu Hương và đtg đã
sử dụng kỹ thuật này để phân tích sự đa dạng trình tự genome ở các dòng chè
Shan [7]. Một số giống chè trồng ở xã Tân Cương - vùng chè đặc sản chè nổi
tiếng của tỉnh Thái Nguyên cũng được phân tích bằng kỹ thuật RAPD bởi
Hoàng Thị Thu Yến và đtg [5]. Năm 2014, Hoàng Thị Thu Yến và đtg đã sử
dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đánh giá một số giống / dòng chè trồng tại
Thái Nguyên [15]. Các nghiên cứu về cấu trúc phân tử và sự biểu hiện của
gen liên quan đến sự sinh trưởng, phát triển, quá trình trao đổi chất, sự tổng
hợp polyphenol…ở chè chưa được nghiên cứu nhiều.


16

1.4. CATECHINS VÀ LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ
1.4.1. Catechins và công dụng của Catechins

Theo thống kê của Harbowy (1997), thành phần hóa học chính trong
chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, thành phần các chất hóa học
trong chè đen giống với chè xanh. Vai trò của polyphenol là chất chống oxy
hóa được biết đến và đang được nghiên cứu như các tác nhân có thể làm giảm
yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh ung thư và bệnh tim. Có rất nhiều các hợp
chất polyphenol được tìm thấy ở chè. Ở chè xanh chứa cả polyphenol đơn
giản và phức tạp. Hàm lượng catechins (30%) và flavonoid (0,2-5%) là các
hợp chất chủ yếu của polyphenol. Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu
sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè. Hầu hết các đặc
tính có lợi cho sức khỏe của chè đã được chứng minh là do các hợp chất
polyphenol [8].
Catechins là một hợp chất không màu, tan trong nước, có vị đắng chát
ở mức độ khác nhau và có khả năng chống oxi hóa. Thành phần của catechins
trong lá chè xanh bao gồm Epicatechin (EC), ECG (Epicatechin-3-O-gallate),
EGC (Epigallocatechin), EGCG (Epigallocatechin-3-O-gallate), C (catechin)
và GC (Gallocatechin) [15]. Trong đó, EC và các dẫn xuất gallolyl của nó
EGC, ECG, EGCG chiếm khoảng 90% catechins tổng số trong lá chè và đã
được chứng minh là có nhiều hoạt tính dược lý bao gồm hoạt tính chống oxy
hóa và triệt tiêu [34], [38], [42]. Do đó, vấn đề cải thiện hàm lượng và thành
phần catechins ngày càng trở nên quan trọng trong các chương trình nhân
giống cây chè.
Công dụng của C:
Trong chè xanh chứa polyphenol và catechins là các chất dinh dưỡng tự
nhiên, có khả năng chống oxy hóa. Catechins có hoạt tính của vitamin P,
nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và giảm tính thấm, củng cố tính bền
thành mạch máu. Catechins thường dùng phối hợp với vitamin E trong dự