Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (diptera) (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THÙY DƢƠNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS
THURINGIENSIS PHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN
TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số

: 9 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội – 2019


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
Thầy hƣớng dẫn 1: PGS.TS. Ngô Đình Bính
Thầy hƣớng dẫn 2: TS. Lê Đức Khánh

Phản biện 1: ……………………………
Phản biện 2:…………………………….

Phản biện 3:…………………………….

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp
nhà nƣớc họp tại:
……………………………………………………………………
……………………………………………………………………
Vào hồi
giờ
ngày
tháng
năm
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh
thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc
hại cho con ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Trong nhiều năm
qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã đƣợc nghiên
cứu và ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng nhƣ bảo vệ
sức khỏe cộng đồng. Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis
càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông
nghiệp sạch ngày càng cao.
Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với
số lƣợng và thành phần đa dạng. Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về
mặt sinh thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi
đục quả) hay cho con ngƣời nhƣ ruồi, muỗi. Chúng là tác nhân trung gian chủ

yếu truyền bệnh giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do
muỗi truyền có thể gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae là trung gian
truyền bệnh sốt rét cho ngƣời. Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết. Culex
tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bản còn ruồi là tác nhân truyền
khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau
mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae, lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu
khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus).
Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau
mà con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các
loại thuốc diệt ruồi, muỗi. Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có
giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng
và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc
mầm bệnh.
Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của
các chủng Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm
ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế
phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh.
Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế
phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)”

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả nãng sinh
protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện,
tinh sạch đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi
khuẩn phục vụ nghiên cứu chuyên sâu. Và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học

Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ
bã thải nhà máy bia .
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Sàng lọc và thu nhận đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các
mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa
protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định đƣợc trình tự
nucleotide của gen cry2A này.
- Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.coli BL
21 (DE3).
- Tìm ra đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi
khuẩn B. thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và
sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis khi sử dụng bã malt
bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời đánh giá
đƣợc sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn B.
thuringiensis
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus
thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh.
- Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự đƣợc gen cry2 của các chủng Bt
phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của chủng vi khuẩn B.
thuringiensis tuyển chọn.
- Nghiên biểu hiện gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng bộ hai cánh
của chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn.
- Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờngnuôi cấy
vi khuẩn B. thuringiensis. Hoàn thiện môi trƣờng lên men vi khuẩn B.
thuringiensis từ bã malt bia.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp
protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn khi sử dụng bã malt bia
làm môi trƣờngnuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng bộ hai cánh từ vi

khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn và đánh giá sƣ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ
hai cánh của chế phẩm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa.
2


4. Những đóng góp mới của luận án
- Phân lập và tuyển chọn đƣợc 7 chủng vi khuẩn B. Thuringiensis mang
gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh cao.
- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ
thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B. thuringiensis serovar kurstaki MSS
8.4 của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát
triển thuốc trừ sâu sinh học.
- Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen cry2A của các chủng B.
thuringiensis Việt Nam phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng về sau.
- Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm
nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dƣỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…)
cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn B. thuringiensis và đƣợc sử dụng nhƣ một
nguyên liệu thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất
thuốc trừ sâu sinh học BT.
.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ về gen cry2A là cơ sở khoa học
đáng tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn Bacillus thuringiensisnói
chung và gen cry2A nói riêng. Trên cơ sở đánh giá đƣợc tác động của gen cry2A
mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt đƣợc một số côn trùng bộ hai cánh nhƣ
ruồi nhà là một bƣớc đi mới để mở ra khả năng tạo ra đƣợc các chế phẩm sinh học
diệt các côn trùng này.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án góp phần khai thác có hiệu quả nguồn gen của vi sinh
vật nói chung và gen cry2A của vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói riêng để góp
phần tạo ra các chế phẩm sinh học diệt một số côn trùng bộ hai cánh. Mặt khác sử
dụng bã malt bia - một loại chất thải của ngành sản xuất công nghiệp đƣợc xử
lý thành nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất khác chế phẩm BT là rất cần
thiết. Đây là một hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị của bã malt bia, tạo ra
sản phẩm thân thiện môi trƣờng phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững.
6. CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án dày 149 trang (không kể phần Tài liệu tham khảo và Phụ lục) đánh
máy vi tính khổ A4 với 23 bảng, 43 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu (04
trang); Tổng quan tài liệu (40 trang); Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên
cứu (19 trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (60 trang); Kết luận và kiến
nghị (02 trang). Đã tham khảo 146 tài liệu tham khảo bao gồm 20 tài liệu tiếng
Việt và 126 tài liệu tiếng Anh.

3


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
Luận án đã tham khảo và tóm lƣợc các tài liệu tiếng Anh và tiếng Việt,
với 6 nội dung liên quan gồm: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis; Gen cry2; Hệ
biểu hiện E. coli; Côn trùng thử nghiệm; Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringiensis; Tổng quan về bã Malt bia;
Trong đó, Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) là vi khuẩn đất, gram
dƣơng. Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển B. thuringiensis có khả năng
sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt
(cytolysin) và Vip (vegetative insecticidal protein). Các gen cry2 mã hóa
protein tinh thể khoảng 65 – 71 kDa, đƣợc sản sinh bởi một số phân loài của B.

thuringiensisnhƣ: kurstaki (HD-1, HD-263, NRD-12 và 14 dòng khác),
thurigiensis, tolwwarthi, israelensis, kenyae… (Dwu và cộng sự, 1991; Ohba và
Aizawa, 1986; Yamamoto, 1983). Cho đến nay, hơn 80 gen cry2 đã đƣợc phát
hiện
( />thuringiensis/toxins2.html).
Ruồi và muỗi là loài động vật chân khớp ký sinh, thuộc lớp Côn trùng
(Insecta), bộ Hai cánh (Diptera). Chúng là tác nhân trung gian truyền nhiều
bệnh nguy hiểm giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Thêm nữa,
điều kiện thời tiết, khí hậu ở Việt Nam rất thuận lợi cho sự phát triển của chúng.
Có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà con ngƣời áp
dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt
ruồi, muỗi. Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có giá thành cao,
chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng
đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh.
Những điểm chính này đã đƣợc trình bày trong Chƣơng 1. Qua đó, có thể
thấy việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của
các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra
những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm
sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh.
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu đất, lá dùng để phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc
lấy từ các vùng Điện Biên, Hà Nội, Nghệ An, Nha Trang (Khánh Hòa), Lâm
Đồng, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang.
Bã malt bia đƣợc lấy từ nhà máy bia Sài Gòn- Hà Nội thuộc khu công
nghiệp vừa và nhỏ quận Bắc Từ Liêm.
4

Ấu trùng ruồi nhà tuổi 2; ruồi đục quả đƣợc nhận từ bộ môn Côn trùngViện Bảo vệ thực vật. Ấu trùng muỗi Anopheles minimus, Aedes aegypti, Culex
quinquefasciatus do Viện sốt rét ký sinh trùng Trung ƣơng cung cấp.
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α dùng cho tách dòng gen và chủng vi khuẩn
E.coli BL21 dùng để biểu hiện gen của hãng Invitrogen.
Chủng B.thuringiensis 4D4 có nguồn gốc từ Bộ sƣu tập Bacillus
thuringiensis của đại học Colombus, bang Ohio, Hoa Kỳ
Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A
Tên mồi

Trình tự

Cry2AaF TAAGGATCCGATGAATAATGTATTGAATAGTGGAAGA
Cry2AaR ATTCTCGAGATAAAGTGGTGGAAGATTAGTTGG

Vị trí
Kích
nhận
thƣớc
biết
(bp)
BamHI 1902
XhoI

Hệ vector
Vector pET22b (+) của hãng Novagen, vector pGEM-T đƣợc đóng gói
kèm trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems của hãng Promega, TA
Cloning® Kit with pCR™2.1 vector (Thermosciencetific).
2.2. Địa điểm và thời gian thực tập
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Giống và
Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, phòng Vi sinh môi

trƣờng- Viện Công nghệ Môi trƣờng, Bộ môn Côn trùng – Viện Bảo vệ thực
vật, Phòng thí nghiệm của Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng-Trƣờng
Đại học Phƣơng Đông.
Thời gian thực hiện thí nghiệm từ tháng 6/2012-T12/2016.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh
Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Vi khuẩn B. thuringiensis đƣợc phân lập các mẫu đất, mẫu lá thu thập
đƣợc theo phƣơng pháp của Thiery và Frachon (1997).
Phân loại vi khuẩn B. thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn
dịch
2.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
Định lượng mật độ bào tử, tinh thể
Chủng B. thuringiensis phân lập đƣợc đƣợc đem cấy thảm trên đ a peptri
chứa môi trƣờng MPA. Số lƣợng bào tử đƣợc tính theo công thức (Ohba và
cộng sự, 1986)
Xác định LC50 đối với côn trùng thử nghiệm
Thử nghiệm khả năng diệt ấu trùng bộ Hai cánh trên đối tƣợng ấu trùng
ruồi nhà Musca domestica, ấu trùng ruồi đục quả tuổi hai, ấu trùng muỗi theo
phƣơng pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107 và 109 bào tử/ml với
5


ruồi nhà, ruồi đục quả và 108 và 106 bào tử/ml với muỗi. Mỗi nồng độ đƣợc thử
nghiệm với 3 cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng).
Tỉ lệ ấu trùng chết đƣợc tính theo công thức Abbott (Abbott, 1925).
2.3.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
DNA plasmid của vi khuẩn đƣợc tách chiết và tinh sạch Y bằng kit Gen
TM

JET Plasmid Miniprep (Fermentas).
Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A
Sinh tổng hợp DNA đƣợc tiến hành bằng kỹ thuật PCR (Polymerase
Chain Reaction) (Sambrook, 2001).
Phương pháp tách dòng gen cry2
Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Ghép nối DNA bằng T4 DNA ligase.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α.
Phương pháp điện di trên gel agarose
DNA đƣợc phát hiện và định lƣợng tƣơng đối bằng kỹ thuật điện di trên
gel agarose theo phƣơng pháp của Sambrook & Russel, 2001.
Tinh sạch DNA từ gel agarose
Sản phẩm DNA đƣợc tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kít GenJETTM Gel
Extraction (Fermentas) theo quy trình hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng
Trình tự DNA đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger và cộng sự.
Mẫu DNA đƣợc gửi đọc trình tự tại hãng Microgen, Hàn Quốc sử dụng cặp mồi
M13. Xử lý kết quả đọc trình tự bằng phần mềm Bioedit, so sánh trình tự gen
đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế tại địa
chỉ online: />Thiết kế vector biểu hiện
Sử dụng vector pET22 b(+) làm vector biểu hiện. Gen cry2A đƣợc đƣa
vào vector pET 22b(+) tại vị trí BamHI và XhoI. Trình tự amino acid của
protein tái tổ hợp gồm toàn bộ trình tự amino acid của gen cry2A tự nhiên thêm
6amino acid Histidine ở đầu C và 36 amino acid đầu N.
Phương pháp biểu hiện gen
Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trƣờng LB có bổ sung ampicilin với
nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở 370C qua đêm. Sau đó cấy chuyển 1% vào
20 ml môi trƣờng MPB có bổ sung kháng sinh ampicilin nồng độ là 50 g/ ml
và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-0,8. Cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi
ở 370C trong 4h. Điện di trên gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra sản phẩm
biểu hiện.

Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % theo phƣơng pháp
của Hoefer và cộng sự (1994).
6


Phương pháp Western blot
Mẫu protein sau khi kiểm tra bằng SDS-PAGE trên gel acryamide 12% sẽ
đƣợc chuyển lên màng PVDF. Mẫu protein sẽ đƣợc ủ với kháng thể đặc hiệu và
kháng thể phát hiện. Sau đó phát hiện bằng dung dịch chứa cơ chất cho
peroxidase (Sigma).
Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký Ni2+ agarose theo quy
trình hƣớng dẫn của hãng Invitrogen.
2.3.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt
Chuẩn bị dịch giống
Khuẩn lạc đƣợc nuôi trên môi trƣờng MTCS vô trùng. Nuôi lắc ở 30oC,
200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8-10 giờ. Dịch nuôi cấy (chứa các tế bào
đang ở giai đoạn sinh trƣởng) đƣợc sử dụng để làm giống cho các thí nghiệm
tiếp theo (Adjiable và cộng sự, 2009; Yezza và cộng sự, 2006).
Phương pháp lên men vi sinh vật
Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong bình tam giác
Lên men trong bình tam giác 500 ml ở nhiệt độ 30±0,1oC, tốc độ lắc 200
vòng/phút, thời gian nuôi 48h (Yezza và cộng sự, 2006).
Lên men trong thiết bị lên men 10 lít
Đƣa 10 lít môi trƣờng vào bình lên men, khử trùng ở 121oC, 1 at, trong
vòng 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng, lắp bình lên men vào thiết bị lên
men. Cài đặt các thông số lên men: nhiệt độ 30±0, 1oC, pH7±0,1, tốc độ khuấy
300 vòng/phút, DO>25 mg/l, tốc độ thổi khí 2-4 lít/phút (Lƣơng Đức Phẩm,
2008; Avigone và cộng sự, 1992)
Thủy phân bã bia

Bã bia sau khi lấy về phòng thí nghiệm đƣợc xay nhỏ và xử lý làm
nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật bằng phƣơng pháp nhiệt phân kết hợp thay đổi
pH (Nguyễn Thị Vân Trang và cộng sự, 2012; Valo và cộng sự, 2004).
Bố trí thí nghiệm
Dịch thủy phân bã bia sau xử lý đƣợc đƣa đi phân tích thành phần hóa
học theo các phƣơng pháp tiêu chuẩn. Trong đó TOC đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp SMEWW 5310B-2005; TN, TP đƣợc xác định bằng phƣơng pháp
EPA-352.1 và EPA-365.2, thành phần kim loại đƣợc xác định theo phƣơng
pháp SMEWW 3125-2005. (Adjiable và cộng sự, 2009)
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất rắn lên quá trình sinh trưởng
và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4
Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia
Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng
và sinh protein tinh thể
7


Tối ưu hóa thành phần môi trường bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
Tối ưu hóa thành phần môi trường bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
Tối ƣu thành phần môi trƣờng theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt đƣợc
mô tả đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Rajesh và cộng sự (2012). Sau khi
xác định đƣợc khoảng tác động của từng yếu tố đến sự sinh trƣởng và sinh tổng
hợp protein của MSS8.4, nhập dữ liệu vào phần mềm Design expert 10.1.
Xử lý số liệu
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ
các chủng Bacillus thuringiensis
3.1.1. Phân lập các chủng Bacillus
Để phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B. thuringiensis có hoạt tính diệt

côn trùng bộ 2 cánh (Diptera), 317 mẫu đất, lá đã đƣợc thu thập tại 7 tỉnh thành
từ 7 vùng địa lý của Việt Nam. Các địa điểm này trƣớc đó chƣa từng sử dụng
các chế phẩm sinh học.
Trong 317 mẫu đất, lá thí nghiệm có 198 mẫu mang vi khuẩn Bacillus và
119 mẫu không phân lập đƣợc B. thuringiensis. Nhƣ vậy tần suất xuất hiện của
Bacillus là 62,4%. Những khu vực có tỉ lệ Bacillus cao trong mẫu: Kiên Giang
(75,0%), Điện Biên (72,8%) và Hà Nội (72,8%); thấp nhất là Nghệ An (33,3%).
Trong số 1.020 khuẩn lạc với các đặc điểm thuộc chi Bacillus, có 440
khuẩn lạc thuộc nhóm B. thuringiensis dựa trên khả năng hình thành tinh thể
(chiếm 43%). Tỉ lệ này phụ thuộc vào số mẫu lấy đƣợc ở các tỉnh, cao nhất ở
các mẫu đƣợc thu thập ở Hà Nội (54%) và thành phố Hồ Chí Minh (53%), thấp
nhất ở mẫu thu thập ở Lâm Đồng (25%), các tỉnh Điện Biên và Kiên Giang cho
tỉ lệ tƣơng đƣơng nhau (42% và 44%).
Các mẫu đất đƣợc thu thập tại 7 vùng địa lý của Việt Nam có tần suất Bt
cao hơn so với những công bố trƣớc đây (Martin và Travers, 1989; Binh và cộng
sự, 2005). Tần suất Bt trong nghiên cứu này là 62,4% điều này hoàn toàn phù
hợp với các công bố trƣớc đây của Martin và Travers (1989), trong mẫu đất của
New Zealand (Chilcott và Wigley, 1993), trong mẫu đất của Hàn Quốc ( Lee và
cộng sự, 1995) và trong mẫu đất của nhật Bản (Ohba và Aizawa, 1986).
Sự xuất hiện của Bt hầu nhƣ khắp nơi trong môi trƣờng sống, bao gồm: đất
nông nghiệp, đất rừng, đất đô thị, đất ngập mặn, thậm chí cả sa mạc (Dulmage và
Aizawa,1982; Martin và Travers, 1989; Zhang và cộng sự, 2000; Uribe và cộng
sự, 2003). Trong nghiên cứu này, sự xuất hiện của Bt tập trung chủ yếu ở Hà Nội
thuộc đất thành thị và có mật độ dân số cao. Kết quả này cao hơn nhiều so với
nghiên cứu của Quesada-Moraga (Quesada-Moraga và cộng sự, 2004), phù hợp
với kết quả của Ayyasamy (2012). Theo Ayyasamy, tỉ lệ Bt ở đất thành thị là
80%, tuy nhiên tần suất xuất hiện cao nhất ở đất nông nghiệp (Ayyasamy và
8

cộng sự, 2012).
Nhƣ vậy, so với số liệu công bố của các tác giả trên thì tần suất xuất hiện
Bt và chỉ số Bt mà đề tài phân lập đƣợc là khá cao. Chứng tỏ số lƣợng vi khuẩn
Bt ở Việt Nam rất phong phú, có thể cung cấp nhiều nguồn gen quý.
3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể
440 chủng B. thuringiensis đã phân lập thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam,
đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng MPA. Sau 3 ngày quan sát trực tiếp
trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm bằng thuốc
nhuộm fushin để xác định hình dạng tinh thể của các chủng vi khuẩn.
Kết quả thu đƣợc cho thấy tất cả các chủng phân lập có khả năng sinh tinh
thể ở tất cả các hình dạng. Có những chủng có khả năng sinh từ 1-3 loại tinh
thể. Cụ thể, 186/440 chủng sinh tinh thể hình lƣỡng tháp chiếm 42,2%; 193/440
chủng sinh tinh thể hình cầu chiếm 43,8%; 46/440 chủng sinh tinh thể hình lập
phƣơng chiếm 10,5%; 15/440 chủng sinh tinh thể hình không xác định chiếm
3,5%.
Nghiên cứu về hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập tại tỉnh
Thành Đô - Trung Quốc có dạng hình tháp lƣỡng cực và hình cầu, chiếm tới
91,8% (Yu và cộng sự, 2015). Tuy nhiên, phần lớn cấu trúc tinh thể của các
chủng Bt thu thập tại bang Tamil Nadu - Ấn Độ có dạng hình lập phƣơng
(26,9%) và hình tháp lƣỡng cực (21,2%) (Ramalakshmi và Udayasuriyan,
2010). Kết quả quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt thu thập ở Saudi
Arabia kết luận, cấu trúc tinh thể dạng cầu chiếm tỉ lệ lớn (54%), sau đến là
dạng không định hình (27%) và tháp lƣỡng cực (16%) (El-kresh và cộng sự,
2014). Sự đa dạng và khác biệt về hình dạng tinh thể của các chủng phân lập
đƣợc trong nghiên cứu này cũng nhƣ trong các nghiên cứu khác có thể do sự
khác nhau về đặc điểm sinh học của các chủng Bt cũng nhƣ đặc điểm protein
Cry của các chủng thu thập đƣợc.
Theo các tài liệu công bố trên thế giới, các chủng mang Gen cry2A rất đa
dạng chúng có thể sinh ra từ các dƣới loài Bt. serovar kurstaki, Bt. serovar sotto,
Bt.serovar israelensis, Bt.serovar kenyae có hình dạng tinh thể chủ yếu là hình

cầu và hình lƣỡng tháp. Vì vậy, các chủng có khả năng sinh ra tinh thể hình cầu
và hình lƣỡng tháp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu phân loại và sàng lọc gen
cry2A bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch.
Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis b ng kit huyết thanh miễn
dịch
Thông qua phản ứng ngƣng kết với các typ huyết thanh, xác định đƣợc 32
chủng Bt (chiếm 71%), trong đó có 5 chủng thuộc dƣới loài Bt. serovar.
kurstaki, 2 chủng Bt. serovar israelensis (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Kết quả phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis b ng
phƣơng pháp huyết thanh
9


ST
T
1

Dƣới loài Bacillus thuringiensis

Typ
huyết
thanh
thuringiensisserovar 14

Bacillus
israelensis
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki
Bacillus
thuringiensisserovar
sumiyoshiensis

Bacillus
thuringiensisserovar
coreanensis
Bacillus
thuringiensis
serovar
neoleonensis
Bacillus thuringiensis serovar aizawai
Bacillus
thuringiensis
serovar
yunnanensis
Bacillus thuringiensisserovar pakistani
Bacillus
thuringiensis
serovar
oswaldocruzi

2
3
4
5
6
7
8
9

Số chủng Tỷ lệ
ngƣng kết (%)
2

6,25

3a,3b
3d

5
9

15,62
28,13

25

4

12,5

24a, 24b

2

6,25

7
20a, 20b

5
1

15,63
3,13

13
38

3
1

9,38
1,39

32

100

Tổng

Nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2005) cho thấy, gen cry2 xuất hiện
ở tất cả các chủng B. thuringiensisserovar kurstaki. Ngoài ra, chủng B.
thuringiensisserovar israelensis cũng đƣợc tìm thấy phổ biến ở các môi trƣờng
sống của muỗi (Martinez và Caballero, 2002). Do đó, các chủng thuộc nhóm
này sẽ đƣợc đề tài lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3.Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập
Để thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) của các chủng Bt
thuộc dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar
israelensis pha loãng nồng độ bào tử đến mức 109 bào tử/ml và thử nghiệm với
ấu trùng ruồi nhà tuổi hai, ấu trùng muỗi và ấu trùng ruồi đục quả.
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng Bt
sau 3 và 5 ngày thử nghiệm

Thử nghiệm với
Thử nghiệm với
ấu trùng ruồi
Tên chủng ấu trùng muỗi
nhà
Bacillus
Tỉ
lệ Tỉ
lệ Tỉ
lệ Tỉ
lệ
thuringiensis
chết sau chết sau chết sau chết sau
3 ngày 5 ngày 3 ngày 5 ngày
10

Thử nghiệm với
ấu trùng ruồi đục
quả
Tỉ
lệ Tỉ
lệ
chết sau chết sau
5 ngày 7 ngày


LD 2.21
LNT 7.12
LNT 16.6
MSS 1.1

MSS 4.2
MSS 6.3
MSS 8.4
4D4

(%)

(%)

(%)

(%)

66,67
66,67
73,33
50
46,67
63,33
80
6,67

90,33
96,67
83,33
100
78,67
98,33
100
30

83,33
83,33
86,67
66,67
60
80
93,33
16,67

100
100
100
83,33
76,67
100
100
30

(%)
-

16,67
13,33
3,33
0
13,33
20
0

(%)
-

33,33
16,67
10
10
20
33,33
0

-

Kết quả thử ấu trùng cho ta thấy, các chủng B. thuringiensis đƣợc tuyển
chọn có khả năng diệt ấu trùng khá cao. T lệ ấu trùng chết tăng dần theo thời
gian thí nghiệm. nồng độ 109 bào tử/ml các chủng đƣợc lựa chọn có t lệ ấu
trùng chết đạt 76,67 - 100 % sau 5 ngày. Tuy nhiên, khả năng diệt ấu trùng ruồi
đục quả là tƣơng đối thấp, chỉ đạt 0 – 33,33% sau 7 ngày thử nghiệm.
-

-

3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng
bộ hai cánh ở các chủng phân lập
3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại
huyết thanh b ng phƣơng pháp PCR
Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phƣơng pháp PCR cho thấy, 7 chủng
thuộc 2 dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar
israelensis đều cho sản phẩm PCR có 1 băng với kích thƣớc khoảng 1,9 kb.
3.2.2. Tách d ng và đọc trình tự gen cry2A

Gen cry2A từ hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao nhất đƣợc khuếch đại
và gắn vào vector tách dòng pCR2.1, biến nạp vào tế bào E. Coli DH5α.
Sau 14 - 16 giờ cấy trải lên môi trƣờng chọn lọc LB, Ampicilin 50 g/ml,
o
ở 37 C, tiến hành sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Từ 4
dòng tế bào mang gen của mỗi chủng sàng lọc bằng cặp mồi đặc hiệu, đều thu
đƣợc đoạn kích thƣớc đúng nhƣ tính toán (khoảng 1,9 kb).
Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid của 3 dòng tế bào cũng cho 1
băng có kích thƣớc 3,9 kb và 1 băng có kích thƣớc 1,9 kb, đúng nhƣ kích thƣớc
tính toán. Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,9 kb đã đƣợc tách dòng thành công.
DNA plasmid của các dòng đƣợc gửi đi đọc trình tự gen bằng máy đọc trình
tự tự động (Macrogen, Hàn Quốc) sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Trình tự nucleotide
sau khi đọc trình tự đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit ver 7.0.9. Các trình tự
DNA này sau đó đƣợc so sánh và xác định mối quan hệ với các trình tự gen cry2A
khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế.
Kết quả xây dựng cây phả hệ cho thấy trình tự thu đƣợc mã hoá cho gene
11


thuộc nhóm cry2A, phân nhóm cry2Aa. Nhóm độc tố cry2Aa và cry4 đã đƣợc
chứng minh có khả năng gây độc lên côn trùng thuộc bộ 2 cánh (Bravo, 1997).
Trình tự DNA của của các gen cry2Aa này đƣợc căn đa chuỗi so sánh với
các trình tự gen thuộc phân nhóm cry2Aa trên Ngân hàng Gen Quốc tế. Kết quả
cho thấy trình tự đoạn gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 có chiều dài 1902 bp và có
độ tƣơng đồng là 99% với trình tự tƣơng ứng đã công bố trƣớc đây trên ngân
hàng genvới 6 điểm sai khác: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G),
1303 (G-A), 1575 (C-T), chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng
công bố.Trình tự nucleotide của gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 đƣợc đƣa lên
Genbank với mã số là KM588296.1.
So sánh trình tự amino axit (aa) suy diễn của 2 gen trên bằng công cụ so

sánh BLAST trên NCBI cho thấy,trình tự axit amin của chủng LNT7.12 có độ
tƣơng đồng hoàn toàn với chủng công bố, chủng MSS8.4 có độ tƣơng đồng
99% với các trình tự axit amin của Cry2A từ Bt với 5 vị trí sai khác (102 (S-N),
167 (R-Q), 261 (F-L), 352 (W-G), 435 (D-N)), đột biến nu ở vị trí 1575 (C-T)
không làm thay thế axit amin. Điều này chứng tỏ rằng 2 gen cry đƣợc nhân
dòng từ 2 chủng vi khuẩn MSS8.4 và LNT7.12 đều là gen mã hóa cho độc tố
Cry2A, phân nhóm Cry2Aa.
Cấu trúc của độc tố Cry2A từ chủng MSS8.4 đƣợc so sánh với những
trình tự của Cry2Aa từ những chủng B. thuringiensis đã biết trƣớc đó cho thấy,
có độ tƣơng đồng cao (99%) so với Cry2Aa từ chủng Bacillus thuringiensis
serovar kurstaki (Pdb_id 1: 1I5P_A) đƣợc Morse và cộng sự xác định bằng sự
nhiễu xạ tia X (Morse, 2001). Cry2Aa từ MSS8.4 đƣợc chia làm 3 vùng cấu
trúc: Endotoxin đầu N gồm 210 a.a (Val-53 đến Lys-263); tiếp theo là
Endotoxin vùng giữa gồm 205 a.a (Leu-267 đến Asn-472); cuối cùng là vùng
Endotoxin đầu C gồm 224 a.a (Từ Phe-494 đến Asn-628). Kết quả này một lần
nữa khẳng định gen tách dòng là gen mã hóa cho protein độc tố Cry2A, phân
nhóm Cry2Aa.
3.2.3. Biểu hiện gen
3.2.3.1. Tạo chủng tái tổ hợp mang gen cry2A trong vi khuẩn E. coli BL21
(DE3)
Để khẳng định xem khả năng diệt côn trùng có phải đƣợc quy định bởi
gen cry2A hay không, gen cry2A từ chủng MSS8.4 tiếp tục đƣợc sử dụng để
biểu hiện ra protein độc tố Cry2A và kiểm tra khả năng diệt côn trùng của
protein tái tổ hợp.
5 khuẩn lạc ngẫu nhiên đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ
khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả cho thấy 4 dòng xuất hiện băng DNA
có kích thƣớc khoảng 1,9 kb.
Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt mở vòng với 2 enzym BamHI và
XhoI cũng thể hiện đã tạo thành công chủng E. coli tái tổ hợp mang gen cry2A.
12

3.2.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong E. coli BL21
Biểu hiện sơ bộ gen cry2A
Kết quả điện di protein tổng số trên gel SDS-PAGE cho thấy, dòng tế bào
E. coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiện pET-22b(+)-cry2A khi đƣợc cảm ứng
cho phép tạo một vạch protein đậm có kích thƣớc khoảng 70 kDa, hoàn toàn
trùng khớp với tính toán lý thuyết về kích thƣớc của protein Cry2A ở dạng dung
hợp. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng quá trình biểu hiện gen cry2A đã thành công.
Kiểm tra Cry2A tái tổ hợp b ng Western blot
Kết quả hình 3.17 cho thấy, protein dung hợp đƣợc thể hiện qua 1 băng
với kích thƣớc đúng nhƣ tính toán (khoảng 70 kDa). Điều này có thể khẳng
định, protein Cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong hệ vector pET22b(+).

Hình 3.17. Phân tích sự biểu hiện của protein Cry2A b ng kỹ thuật
Western blot.M: Thang chuẩn protein (Biobasic); 1: Đối chứng dƣơng
(Sigma); 2-4: Mẫu sau cảm ứng thu ở 1h, 2h, 5h; 5: Mẫu không mang gen.
Để có thể tạo ra sản phẩm Cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ Hai cánh,
sản phẩm protein cần đƣợc tiếp tục xử lý và kiểm tra diệt côn trùng trên côn
trùng thử nghiệm.
Bảng 3.3. Thử hoạt tính sinh học của rCry2A và protein tinh thể từ B.
thuringiensis với ấu trùng M. domestica
Giới hạn LC50 tin cậy
Côn trùng
Protein
LC50 (g)
Thấp nhất Cao nhất
M.
4D4
442,5

11,3
56,5
domestica
MSS8.4
283,5
17,6
100
rCry2A
264,7
28,3
66,1
MSS8.4+rCry2A 268,6
27,8
59,3
Kết quả thử nghiệm hoạt tính ghi nhận sau 72 giờ cho thấy, protein tái tổ
hợp có hoạt tính cao với côn trùng thử nghiệm (LC50 = 264,7 g). Đồng thời
hoạt tính của protein Cry2A tự nhiên của chủng MSS8.4 (LC 50 = 283,5 µg)
cũng cao hơn của chủng chuẩn 4D4 (LC50 = 442,5 g). Sự sai khác về khả
năng diệt côn trùng có thể ở chủng MSS8.4 ngoài khả năng hình thành độc tố
Cry2A còn có sự xuất hiện của độc tố Cry1A.
3.2.4. Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu hiện gen
13


3.2.4.1. Nghiên cứu tối ưu nhiệt độ biểu hiện gen cry2A
Tế bào E. coli BL21 đƣợc cấy lắc ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là:
28, 30, 37, 40 oC. Sau 4 giờ nuôi cấy, thu tế bào, điện di kiểm tra trên gel 12,6
% polyacrylamide. Kết quả cho thấy, ở nhiệt độ 37oC, tế bào biểu hiện cho băng
protein đậm nhất. Do đó lựa nhiệt độ 37oC cho sự biểu hiện của rCry2A.
3.2.4.2. Nghiên cứu tối ưu nồng độ chất cảm ứng biểu hiện gen cry2A

Lựa chọn nghiên cứu nồng độ chất cảm ứng IPTG lần lƣợt ở 0,1; 0,2; 0,5;
1; 1,5 mM. Kết quả biểu hiện cho thấy sự tổng hợp protein Cry2A tối ƣu nhất
khi đƣợc cảm ứng ở 1mM.
3.2.4.3. Nghiên cứu tối ưu thời gian biểu hiện gen cry2A
Cố định nhiệt độ cảm ứng là 37oC, nồng độ IPTG cảm ứng là 1 mM và
khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ hợp theo thời gian (1, 2, 3, 4, 5 giờ). Mẫu
đƣợc xử lý và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6%. Kết quả, lƣợng
protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian, cao nhất tại thời điểm 4 và 5
giờ. Do đó, lựa chọn thời điểm 4 giờ để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lƣợng sản
phẩm và chi phí lên men.
3.2.5. Tinh chế protein tái tổ hợp b ng cột sắc kí ái lực Probond Nikel
Resin
Chủng tái tổ hợp đƣợc biểu hiện ở 37 oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1
mM, thu sau 4 giờ. Sau đấy sinh khối tế bào đƣợc thu lại bằng ly tâm, xử lý và
tinh sạch .
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy protein Cry2A tái tổ hợp đã đƣợc
thu lại ở dạng tinh sạch, có kích thƣớc 70 kDa tƣơng đƣơng với kích thƣớc tính
toán lý thuyết.
3.2.6. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8.4
Bảng 3.4. Hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể từ chủng MSS8.4 và
protein tái tổ hợp rCry2A
Côn
trùng
thử Protein LC50 (g)* Giới hạn LC50tin cậy
nghiệm
Thấp nhất
Cao nhất
M. domestica
4D4
442.5

11.3
56.5
MSS8.4 283.5
17.6
100
rCry2A 264.7
28.3
66.1
A. minimus
4D4
9.42
53.33
70
MSS8.4 7.34
56.67
83.33
rCry2A 7.03
70
93.33
A. aedes
4D4
19.05
6.67
63.33
MSS8.4 14.52
56.67
73.33
rCry2A 13.33
63.33
80

Cx. quinquefasciatus 4D4
19.05
36.67
46.67
14


Côn
trùng
nghiệm

thử Protein

LC50 (g)* Giới hạn LC50tin cậy
Thấp nhất
Cao nhất
MSS8.4 17.6
70
90
rCry2A 14.52
56.67
86.67
Hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể đƣợc xác định dựa trên khả
năng diệt ấu trùng của ấu trùng thử nghiệm bộ hai cánh gồm: M. domestica, A.
minimus, A. aedes, Cx. quinquefasciatus. Thử nghiệm ở các nồng độ thay đổi từ
0,5 – 500 g/g, kết quả đƣợc xác định và phân tích bởi chƣơng trình Probit
analysis. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ghi nhận tại Bảng 3.4.
Nhƣ vậy, protein tái tổ hợp Cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong E.
coli và protein tái tổ hợp có hoạt tính diệt ấu trùng bộ Hai cánh cao hơn protein
tự nhiên, cũng nhƣ chủng chuẩn. Kết quả này cao hơn rất nhiều so với nghiên

cứu của Misra và cộng sự, các phân đoạn protein Cry2Aa4 sau tinh sạch bằng
sắc ký ái lực có LC50 trong khoảng 100-500 mg (Misra và cộng sự, 2002);
Yilmaz và cộng sự (2017), tác giả chỉ ra rằng, Cry2Aa18 đƣợc biểu hiện có
nguồn gốc từ cry2A của chủng B. thuringiensis SY49-1 có khả năng diệt ấu
trùng C. pipiens (LC50= 630 g/ml). So với kết quả nghiên cứu của Reyaz và
Arulsel (2016), protein tái tổ hợp sau tinh sạch Cry2AI1 có hoạt tính đối với
Spodoptera litura và Helicoverpa armigera (LC50= 2,448 µg/ml) và Helicoverpa
armigera (LC50= 3,374μg/ml) thì hoạt tính của protein rCry2A thấp hơn khá
nhiều.
3.3. Lựa chọn môi trƣờng và tối ƣu lên men làm tăng khả năng hình thành
protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia
3.3.1. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4
3.3.1.1. Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý bã bia làm nguyên liệu lên
men vi khuẩn MSS8.4
Khi sử dụng làm nguyên liệu lên men vi khuẩn MSS8.4, bã bia đƣợc
nghiền nhỏ và đƣa về nồng độ chất rắn 2%. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong
bình tam giác ở 30oC, thời gian 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút, kết quả phân
tích đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Kết quả phân tíchcho thấy, sử dụng dịch thủy phân bằng phƣơng pháp
axit cho mật độ TCC, SC và protein tinh thể cao nhất, mật độ tế bào đếm đƣợc
đạt 4,9x108 CFU/ml; trong khi đó, thí nghiệm sử dụng bã bia vô trùng (TN3),
TCC chỉ đạt 107 CFU/ml. Nhƣ vậy, tiền xử lý bã bia bằng phƣơng pháp axít
nhiệt và kiềm nhiệt đã làm tăng hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng trong môi
trƣờng giúp vi khuẩn MSS8.4 sinh trƣởng tốt hơn.Kết quả nghiên cứu này cũng
phù hợp với nhận định của Brar và các cộng sự, khi thủy phân các hợp chất hữu
cơ ở nhiệt độ cao sẽ làm tăng giá trị dinh dƣỡng trong môi trƣờng. Do đó, mật
độ tế bào, bào tử của vi khuẩn MSS8.4trên môi trƣờng bã bia thủy phân bằng
15

phƣơng pháp axit nhiệt cao hơn so với trên các môi trƣờng khác (Brar và cộng
sự, 2005).
Khả năng sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4 cũng có sự khác biệt rõ
rệt ở các thí nghiệm khác nhau. thí nghiệm sử dụng bã bia vô trùng, sau 48
giờ lên men vi khuẩn MSS8.4, nồng độ delta-endotoxin đạt 319 mg/l. Trong khi
đó, thí nghiệm sử dụng bã bia tiền xử lý bằng phƣơng pháp axít nhiệt nồng độ
delta-endotoxin đạt 428 mg/l, cao gấp 1,3 lần so với thí nghiệm sử dụng bã bia
vô trùng. Do đó, phƣơng pháp axit nhiệt đƣợc lựa chọn là phƣơng pháp tiền xử
lý bã bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4.
3.3.1.2. Phân tích thành phần của dịch thủy phân bã bia bằng phương pháp axit
nhiệt
Để đánh giá hàm lƣợng các chất có trong dịch thủy phân bã bia, dịch thủy
phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt đƣợc gửi đi phân tích tại Phòng Phân
tích chất lƣợng môi trƣờng - Viện Công nghệ môi trƣờng.
Kết quả phân tích cho thấy, trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp
axit nhiệt hàm lƣợng C, N (hai nguồn cơ chất quan trọng nhất trong sinh trƣởng
của vi khuẩn) cao hơn hẳn so với dịch bã bia thủy phân bằng phƣơng pháp kiềm
nhiệt hoặc chỉ vô trùng.Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nhận định ở trên, khi
cho rằng tác nhân axit ở điều kiện nhiệt độ cao đã giúp tăng khả năng phân hủy
các hợp chất cao phân tử, làm tăng hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ dễ hấp thu
trong dịch thủy phân.
Các nguyên tố khoáng là nhân tố không thể thiếu trong quá trình sinh
trƣởng, phát triển của vi khuẩn nói chung và các chủng thuộc gen Bt nói riêng.
Trong đó, các ion kim loại nhƣ Mg, Mn, Fe, Zn, Ca, v.v... có tác dụng điều tiết
quan trọng đến sinh trƣởng, hình thành bào tử cũng nhƣ sinh tổng hợp protein
tinh thể diệt côn trùng. Do vậy, trong môi trƣờng tổng hợp lên men vi khuẩn
thƣờng đƣợc bổ sung thêm một số muối khoáng với nồng độ nhƣ sau: 0,3%
MgSO4.7H2O; 0,02%o MnSO4.7H2O; 0,02%o FeSO4.7H2O; 0,2%o
ZnSO4.7H2O và 1,0%o CaCO3(Ngô Đình Bính, 2000). Xét theo nhu cầu khoáng
này của vi khuẩn Bt thì không có nguyên tố nào ở cả ba thí nghiệp đáp ứng đủ

nhu cầu khoáng. Do vậy, phải bổ sung thêm khoáng vào dịch thủy phân bã bia
để cải thiện chất lƣợng môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4.
Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Ozkan và các cộng sự: ở nồng độ 10 -6M,
Mn là yếu tố chủ chốt tác động đến sự sinh tổng hợp độc tính của vi khuẩn Bt
mà không ảnh hƣởng tới quá trình khác của tế bào. Trong dịch thủy phân bã bia
bằng phƣơng pháp axit nhiệt, Mn có nồng độ 0,136 mg/l (2,7x10 -6M/l) là nồng
độ nằm trong khoảng nông độ phù hợp cho lên men vi khuẩn Bt thu độc tố delta
endotoxin(Ozkan và cộng sự, 2003).
Theo nghiên cứu của Içgen và các cộng sự, sự sinh trƣởng, hình thành bào
tử và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Btk không chỉ phụ thuộc vào
16


các yếu tố dinh dƣỡng cacbon, nito mà còn chịu tác động rất lớn từ các nhân tố
khoáng. Cụ thể, khi bổ sung Mg ở nồng độ từ 8x10 -5M đến 4x10-3M mật độ tế
bào và nồng độ protein tinh thể tăng mạnh (Içgen và cộng sự, 2002). Theo kết
quả phân tích, nồng độ của Mg trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp
axit nhiệt là 12 mg/l (2,9x10-3M), đây là nồng độ Mg nằm trong khoảng thích
hợp cho sự phát triển và sinh độc tố của vi khuẩn Bt theo nhƣ nghiên cứu của
Içgen.
3.3.1.3.Xác định nồng độ bã bia phù hợp làm môi trường lên men vi khuẩn
MSS8.4
Các thí nghiệm lên men vi khuẩn MSS8.4 sử dụng bã bia đƣợc thực hiện ở
các nồng độ nhƣ sau: 1%TS; 1,5%TS; 2%TS; 2,5%TS; 3%TS; 3,5%TS.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy: t lệ % chất khô của bã bia nằm trong
khoảng từ 2 – 3là phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Bt. nồng độ thấp
(1%TS) mật độ vi khuẩn trong mẫu sau 48 giờ lên men chỉ đạt 2,9x10 7CFU/ml,
trong khi đó ở nồng độ 2,0 – 3,0%TS mật độ tế bào sau 48 giờ lên men đạt trên
108CFU/ml. Trong thí nghiệm 6 khi tăng nồng độ bã bia lên 3,5%, mật độ tế
bào thu đƣợc sau 48 giờ lên men không cao chỉ đạt 107CFU/ml.

Protein tinh thể đƣợc sinh ra đồng thời với quá trình hình thành bào tử và
là sản phẩm mong muốn trong quá trình lên men vi khuẩn MSS8.4. Do vậy, đây
là một chỉ tiêu quyết định đến chất lƣợng sản phẩm. Kết quả thí nghiệm trong
bảng 3.6 cho thấy ở nồng độ bã bia 2,5% nồng độ protein tinh thể đạt đƣợc là
cao nhất. Nhƣ vậy, xét về mặt tổng thể nồng độ 2,5%TS là phù hợp nhất cho lên
men MSS8.4 thu độc tố diệt ấu trùng ruồi. Nồng độ 2,5%TS sẽ đƣợc sử dụng
cho tất cả các nghiên cứu về sau.
3.3.2. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào
dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn
MSS8.4.
3.3.2.1. Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào môi trường bã bia
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác, thời gian lên men 48 giờ,
tốc độ lắc 200 vòng/phút. Xác định mật độ tế bào, bào tử và nồng độ protein
tinh thể sau 48 giờ lên men.
Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các hợp chất hữu cơ bổ sung vào dịch
thủy phân bã bia cho thấy cám gạo và bột đậu tƣơng là hai yếu tố có tác động
tích cực đến sinh trƣởng cũng nhƣ sự tạo thành tinh thể độc của chủng vi khuẩn
MSS8.4. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoài Trâm và các cộng sự thì bột
đậu tƣơng là nguồn dinh dƣỡng tốt nhất cho sinh trƣởng của vi khuẩn Bt sinh
độc tố diệt sâu (Nguyễn Hoài Trâm, 2004). Kết quả này cũng phù hợp với kết
quả công bố của Nguyễn Thị Hòa và các cộng sự thì khi bổ sung cám gạo và
bột đậu tƣơng vào dịch thủy phân bùn thải sinh học làm môi trƣờng lên men vi
khuẩn Btk thu độc tố diệt trừ sâu (Hoa và cộng sự, 2014). Trong hai nguồn dinh
17


dƣỡng cám gạo và bột đậu tƣơng thì bột đậu tƣơng có khả năng tan tốt hơn, do
vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy
phân bã bia.
Khi xem xét hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men MSS8.4 sau 48

giờ nuôi cấy cho thấy: có một sự khác biệt rõ rệt khi bổ sung thêm muối
MgSO4.7H2O và MnSO4 vào dịch thủy phân bã bia. hai thí nghiệm có bổ
sung 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 0,05 g/l MnSO4 hàm lƣợng protein tinh thể thu
đƣợc sau 48 giờ lên men tăng khoảng 10% so với thí nghiệm đối chứng là dịch
thủy phân bã bia, hàm lƣợng deta endotoxin lần lƣợt đạt 469 mg/lít và 461
mg/lít. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của
Braun năm 2000, Icgen và các cộng sự khi nghiên cứu về vai trò của Mg2+ trong
sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể. Các tác giả này đã chỉ ra rằng sự
thiếu hụt của Mg2+ trong môi trƣờng lên men sẽ làm giảm khả năng sinh trƣởng,
hình thành bào tử trong dịch lên men, nhƣng ảnh hƣởng lớn nhất phát hiện đƣợc
là giảm khả năng tổng hợp độc tố protein tinh thể. Mg 2+ là trung tâm điều khiển
hoạt động của enzym, sự có mặt của Mg sẽ tác động đến quá trình hình thành
bào tử và sinh tổng hợp protein tinh thể (Braun S, 2000; Icgenvà cộng sự,
2002).
Kết quả nghiên cứu trên bảng 3.9 cho thấy Mn2+ là một trong hai yếu tố
ảnh hƣởng mạnh đến khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể. Kết quả này cũng
phù hợp với nhận định của Ozkan và các công sự khi cho rằng Mn là yếu tố chủ
trốt tác động đến quá trình sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Bt mà
không ảnh hƣởng tới quá trình khác của tế bào (Ozkan và cộng sự, 2003). Theo
nghiên cứu của Subbiah và các cộng sự khi nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt
muỗi từ vi khuẩn B. thuringiensis subsp. israelensis việc bổ sung Mn2+ vào môi
trƣờng dinh dƣỡng làm từ lông vũ đã làm tăng đáng kể hàm lƣợng protein tinh
thể trong dịch canh trƣờng lên men Bti (Subbiah và cộng sự, 2012).
Dựa vào các kết quả nghiên cứu ở trên, bột đậu tƣơng, MgSO 4.7H2O và
MnSO4 là các nhân tố đƣợc lựu chọn làm nhân tố dinh dƣỡng để hoàn thiện môi
trƣờng lên men vi khuẩn MSS8.4 trên nền môi trƣờng cơ sở từ dịch thủy phân
bã bia.
3.3.2.2. Đánh giá tác động độc lập của yếu tố đã chọn đến sinh trưởng và sinh
tổng hợp detlta endotoxin của MSS8.4
Sau khi đánh giá tác động độc lập của các yếu tố lựa chọn đến sinh trƣởng,

hình thành bào tử và sinh tổng hợp protein tinh thể cho thấy, nồng độ mangan
từ 0 – 0,1 g/l, magie từ 0 – 1,0 g/l; bột đậu tƣơng từ 0 - 5 g/l có ảnh hƣởng
mạnh đến sinh trƣởng, sinh tổng hợp tinh thể protein tinh thể của MSS8.4 khi
bổ sung vào dịch thủy phân bã bia.
3.3.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã
bia
18


3.3.3.1. Xây dựng mô hình tối ưu theo phương pháp đáp ứng bề mặt
Thành phần các chất bổ sung đƣợc xác định theo phƣơng pháp đáp ứng bề
mặt với các miền khảo sát của các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ sau: nồng độ Mn (A)
0,0 – 0,1 g/l; nồng độ Mg (B) 0 – 0,8 g/l; nồng độ bột đậu tƣơng (C) 0 – 5 g/l.
Bằng phần mềm phần mềm Design expert 10.1 thu đƣợc ma trận gồm 20 thí
nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hƣởng. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần lấy
kết quả trung bình của các lần lặp lại đƣa vào xử lý thống kê bởi phần mềm
phần mềm Design expert 10.1.
Kết quả phân tích hồi quy của mô hình cho thấy: giá trị p của mô hình
<0,0001 cho thấy mô hình hoàn toàn có ý ngh a thống kê với độ tin cậy
99,99%. Sự có ý ngh a của các hệ số hồi quy đƣợc kiểm định bởi chuẩn F, các
giá trị P lớn hơn F ít hơn 0,05 cho biết mô hình có ngh a. Trong trƣờng hợp này
các yếu tố A, B, C đều có p<0,05 nên cả ba yếu tố này đều thể hiện là các yếu
tố có tác động đến hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men. Trong Bảng
3.11 cũng cho thấy sự kết hợp của AB, BC không thể hiện rơ sự tác động biểu
hiện ở giá trị P>0,1 tuy nhiên các yếu tố nàyvẫn đƣợc giữ trong mô hình để tiến
hành tối ƣu hóa.
Chuẩn F của sự không tƣơng thích mô hình là 2,38 cho thấy: sự không
tƣơng thích của mô hình là không có ý ngh a, chỉ có 18,12% cơ hội xuất hiện
lỗi do độ nhiễu gây nên. Sự không có ý ngh a của giá trị không tƣơng thích của
mô hình cho thấy mô hình hoàn toàn tƣơng thích với thực nghiệm (Box and

Wilson, 1951; Li và cộng sự, 2007).
Phƣơng trình tính toán nồng độ protein tinh thể dự kiến của mô hình:
Nồng độ protein tinh thể = 308,51+44,25*A+1256,53*B+173,96*C +
21,125*A*B – 9,053*A*C +27,857*B*C – 7,227 *A2 – 10343,76*B2 –
146,87*C2
Nghiên cứu ảnh hƣởng của từng yếu tố (khi các yếu tố khác giữ ở mức
trung tâm) đến sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Bt cho thấy: cả ba
yếu tố này đều ảnh hƣởng mạnh đến sinh tổng hợp độc tố delta edotoxin của vi
khuẩn MSS8.4. Trong đó, đứng đầu là bột đậu tƣơng sau đó đến magie và
mangan.
3.3.3.2.Kiểm tra sự tương thích của mô hình và thực nghiệm
Để đánh giá kết quả của phƣơng pháp, tiến hành kiểm chứng tại 5 phƣơng
án bất kỳ. Các phƣơng án đƣợc chọn ngẫu nhiên ở đây là phƣơng án 2, 16, 38,
47, 90, trong đó, phƣơng án 16 và 47 là 2 phƣơng án nằm ngoàivùng tối ƣu,
phƣơng án 2, 38, 90 là các phƣơng án nằm trong vùng tối ƣu.
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở Bảng 3.12.
Bảng 3.12.Hàm lƣợng protein tinh thể tính theo mô hình và thực nghiệm
Phương Nồng độ bổ sung (g/l) Mật độ (CFU/ml) Nồng độ protein tinh
19


án theo
thể (mg/l)
mô
Thực
MnSO4 MgSO4 BĐT TCC
SC
Mô hình
hình
nghiệm

2
0,05
0,45
3,00 4,5x108 4,3x108 529,11±11 525
16
0,076 0,221 3,47 2,8x108 1,3x108 509,24±10 513
38
0,051 0,337 2,292 3,3x108 3,1x108 515,2±10 519
47
0,009 0,237 1,487 1,25x107 1,07x107 457±11
471
8
8
90
0,056 0,581 3,093 4,15x10 3,8x10
527,93±10 526
8
8
ĐC (MT bã bia thủy phân)
1,7x10
1,5x10
431±10
8
8
Môi trƣờng MTCS
5,10x10 4,5x10
530,14±12 Kết quả phân tích hàm lƣợng protein ở các thí nghiệm cho thấy không có
sự khác biệt lớn giữa kết quả dự đoán của mô hình và thực nghiệm.
Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.12 cũng cho thấy: Sau khi môi trƣờng đƣợc
tối ƣu hóa bằng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt, hiệu suất lên men tăng lên đáng

kể đặc biệt là nồng độ protein tinh thể. Mật độ tổng tế bào, bào tử và nồng độ
protein tinh thểở dịch canh trƣờng lên men sau khi môi trƣờng đã đƣợc tối ƣu
lần lƣợt đạt 4,5x108CFU/ml, 4,3x108CFU/ml và 529,11 mg/l so với trƣớc tối ƣu
là 1,7x108 CFU/ml, 1,5x108 CFU/ml và 431 mg/l. Nhƣ vậy, sau khi tối ƣu môi
trƣờng lên men bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng với sự tƣơng tác của ba yếu
tố bổ sung thêm là MnSO4, MgSO4.7H2O và bột đậu tƣơng đã làm tăng 22,7%
hiệu suất thu hồi protein tinh thể trong dịch lên men.
Ngày nay, phƣơng pháp tối ƣu môi trƣờng lên men cho vi sinh vật đã và
đang đƣợc ứng dụng rất rộng rãi do tính đơn giản, hiệu quả của phƣơng pháp.
Năm 2013 tác giả Lee và các cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng
để tối ƣu thành phần môi trƣờng lên men vi khuẩn Bacillussp. LX-1 và đã tìm
ra điểm tối ƣu giúp nâng hiệu suất thu hồi α-galactosidase 1 lên 6,3 lần so với
khi lên men ở điều kiện cơ bản (Lee và cộng sự, 2013). Tác giả Gao và các
cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng cũng đã giúp làm tăng hiệu
suất thu hồi laccase lên 59,68 lần khi lên men Trichoderma harzianum ZF-2
(Gao và cộng sự, 2013). Tác giả Linna và các cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp
đáp ứng bề mặt để tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng lên men cho Paecilomyces
tenuipes N45đã làm tăng hiệu suất thu hồi sinh khối, adenosine, polysaccharide
và axít cordycep lần lƣợt 8,20; 3,58; 23,17 và 31,51% (Linna và cộng sự, 2012).
Nhƣ vậy, môi trƣờng lên men cho vi khuẩn Bt từ bã bia có thành phần cụ
thể nhƣ sau: dịch thủy phân bã bia (2,5%TS)+ 0,45 g/l MgSO4.7H2O + 0,05 g/l
MnSO4+ 3 g/l bột đậu tƣơng.
3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm
3.4.1. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men đến sinh trƣởng,hình thành bào
tử và sinh tinh thể độc của chủng MSS8.4
20


3.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh trưởng, sinh
tổng hợp deltaendotoxin của chủng MSS8.4

Để xác định pH thích hợp cho sinh trƣởng của Bt, các thí nghiệm đƣợc
tiến hành nhƣ sau: dịch thủy phân bã bia có pH 2, đƣợc điều chỉnh về các độ
pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Tiến hành các thí nghiệm trong bình nón
500 ml với dung tích môi trƣờng 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên
men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở
Bảng 3.13.
Về mặt sinh trƣởng: kết quả nghiên cứu cho thấy MSS8.4 sinh trƣởng tốt
trên môi trƣờng trung tính.
Về khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể: protein tinh thể đƣợc hình
thành cùng với quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn MSS8.4, do đó, các thí
nghiệm có mật độ bào tử cao cũng là các thí nghiệm có nồng độ delta endotoxin
cao. thí nghiệm có pH ban đầu là 6,5 – 7,5 nồng độ delta endotoxin tƣơng
đƣơng nhau và đạt trên 520 mg/l sau 48 giờ lên men.
Quá trình lên men của vi sinh vật sẽ sản sinh ra một số sản phẩm phụ làm
thay đổi pH của môi trƣờng, tiến hành kiểm tra pH của dịch canh trƣờng sau 48
giờ lên men cho thấy sau quá trình lên men pH của môi trƣờng có tăng nhẹ.
Theo số liệu phân tích cho thấy: sau 48 lên men pH của môi trƣờng lên
men đều thay đổi.
Nhƣ vậy, pH ban đầu 6,5 - 7,5 là phù hợp cho sinh trƣởng cũng nhƣ sinh
tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn MSS8.4.
3.4.1.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, sinh tổng hợp
deltaendotoxin của chủng MSS8.4
Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC,
45oC.
Kết quả cho thấy: nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến sinh trƣởng của chủng
MSS8.4. Chủng MSS8.4 sinh trƣởng mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ từ 25 –
35oC, ở nhiệt độ này mật độ tế bào, bào tử đạt 4,39x108 CFU/ml, mật độ bào tử
đạt 4,14x108 CFU/ml.
Tƣơng tự nhƣ khả năng sinh trƣởng, nồng độ protein tinh thể của MSS8.4
cũng chịu tác động mạnh mẽ từ nhiệt độ môi trƣờng lên men, nồng độ protein

tinh thể đạt đƣợc cao nhất ở 30oC (541 mg/l). nhiệt độ thấp (20oC), sau 48 giờ
lên men nồng độ delta endotoxin chỉ đạt 445 mg/l bằng 75% so với khi lên men
ở 30oC. nhiệt độ trên 40oC vi khuẩn MSS8.4 sinh trƣởng chậm, mật độ bào tủ
tạo ra trong dịch canh trƣờng lên men thấp và nồng độ protein tính thể trong
dịch canh trƣờng chỉ đạt 214 mg/l sau 48 giờ lên men ở 45oC.
Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của
Ngô Đình Bính và các cộng sự về ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của
Bt. Theo đó, nhiệt độ sinh trƣởng tốt nhất của vi khuẩn Bt là 28±1oC (Ngô Đình
21


Bính,2011; Tien và cộng sự, 2013; Nguyễn Thị Vân Trang và cộng sự, 2012).
nhiệt độ dƣới 20oC vi khuẩn B. thuringiensis sinh trƣởng chậm, trên 40oC bắt
đầu ức chế sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của MSS8.4. nhiệt độ 45oC,
vi khuẩn MSS8.4vẫn sinh trƣởng đƣợc nhƣng sau 48 giờ lên mật độ bào tử và tế
bào chỉ đạt 107CFU/ml.
3.4.2. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà
3.4.2.1. Thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của chế phẩm
BT trong phòng thí nghiệm
Để đánh giá hoạt tính sinh học của chủng vi khuẩn MSS8.4 nuôi cấy trên
môi trƣờng làm từ dịch thủy phân bã bia đối với ấu trùng ruồi nhà chúng tôi đã
tiến hành thí nghiệm với ấu trùng ruồi nhà tuổi 2.
Quá quá trình thử hoạt tính cho thấy, những ấu trùng chết do ăn chế phẩm
Bt có biểu hiện toàn thân có màu đen. Đối với những ấu trùng đã đóng kén mà
trƣớc đó có ăn chế phẩm thì kén có màu đen đặc, theo dõi những kén này không
có hiện tƣợng nở thành ruồi, điều này chứng tỏ chế phẩm Bt có hoạt tính gây
chết ngay cả khi ấu trùng đã đóng kén.
3.4.2.2. Mô hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dòi ruồi nhà quy mô pilot
Sinh khối chủng MSS8.4 sau khi lên men đƣợc thu hồi bằng cách kết tủa,
bổ sung phụ gia rồi tiến hành đông khô ở nhiệt độ thấp, áp suất cao thu đƣợc

chế phẩm diệt dòi ruồi nhà dạng bột (chỉ tiêu kỹ thuật đạt 4000AI/mg).
Các công thức thử nghiệm nhƣ sau:
Công thức 1: 1g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50
ấu trùng dòi tuổi 2.
Công thức 2: 1,5 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia +
50 ấu trùng dòi tuổi 2.
Công thức 3: 2 g bột chế phẩm +100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50
ấu trùng dòi tuổi 2.
Công thức ĐC: 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.
T lệ ấu trùng ruồi nhà chết đƣợc xác định 5 ngày thử nghiệm, thí nghiệm
đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả thử nghiệm cho thấy, hoạt tính diệt ấu trùng ruồi của
chế phẩm sinh học BT tƣơng đối cao đạt 53,33 – 84,67% sau 5 ngày thử
nghiệm. Kết quả đạt cao nhất (84,67%) khi bổ sung lƣợng chế phẩm là 2 g vào
500 g bã bia. Vì vậy, công thức 3 có thể ứng dụng để thử nghiệm ngoài hiện
trƣờng.
3.4.2.3. Chế tạo công thức cho chế phẩm diệt dòi ruồi nhà ngoài thực địa
Từ kết quả nghiên cứu của phần 3.4.3.1 (thử nghiệm chế phẩm Bt diệt dòi
ruồi nhà qui mô pilot) thu đƣợc công thức 3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc
vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng dòi tuổi 2 hoặc 3 cho hoạt tính cao nhất.
Tiến hành thử nghiệm công thức 3 ngoài thực địa với 3 loại giá thể khác nhau
phù hợp với điều kiện thực tế:
22


Công thức 3.1: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia +
50 ấu trùng dòi tuổi 2.
Công thức 3.2: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g phân ủ
+ 50 ấu trùng dòi tuổi 2.
Công thức 3.3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g rác thải
hữu cơ + 50 ấu trùng dòi tuổi 2.

Công thức đối chứng: 100 ml nƣớc vô trùng + 500 g bã bia + 50 ấu trùng
dòi tuổi 2.
Kết quả cho thấy, công thức 3: 2 g bột chế phẩm + 100 ml nƣớc vô trùng
+ 500 g giá thể + 50 ấu trùng dòi cho t lệ chết tƣơng đƣơng nhau khi thử trên
các giá thể khác nhau (phân ủ, rác thải hữu cơ, phế thải nông nghiệp), điều này
phù hợp với điều kiện tự nhiên (ấu trùng ruồi có trên nhiều giá thể khác nhau).
Vì vậy, công thức 3 thích hợp để ứng dụng ngoài hiện trƣờng.
3.4.2.4. Mô hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt dòi ruồi nhà ngoài thực địa
Qua khảo sát sự xuất hiện và phát triển các ổ bọ dòi tại các xã thuộc Phủ
Lý–Nam Hà. Chúng tôi tiến hành bố trí mô hình thử nghiệm chế phẩm BT diệt
dòi tại 2 xã Đinh Xá và Phù Vân – Phủ Lý – Hà Nam theo mô hình nhƣ sau:
- Xã Đinh Xá thử nghiệm tại khu vực nƣớc thải của chuồng nuôi lợn, bố trí
thí nghiệm 1 (TN1) và đối chứng 1 (ĐC1).
- Xã Phù Vân có 2 khu vực thử nghiệm là bể phân ủ của 2 hộ dân: TN2,
TN3, ĐC 2, ĐC 3).
Theo dõi hiệu quả của chế phẩm sau 30 ngày. Đối chứng để tự nhiên
không dùng chế phẩm. Kết quả thử nghiệm đƣợc ghi lại sau mỗi 24 h xử lý cho
thấy, t lệ ấu trùng dòi chết tăng theo từng ngày và sau 3 ngày thử nghiệm hiệu
quả của chế phẩm đạt 53,3-85,2%, sau 7 ngày t lệ chết đạt 83,7-89%.
KẾT LUẬN
1. Trong số 440 chủng Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt nam, đã sàng
lọc và tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4,
chủng này có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà Musca dometisca và ấu trùng
muỗi cao. T lệ chết sau 5 ngày đạt 100% với nồng độ 109 CFU/ml.
2. Gen cry2A từ chủng Btk MSS 8.4 đã đƣợc tách dòng, xác định trình tự
nucleotide và đăng ký trên GenBank với mã số KM588296.1
3. Khả năng diệt ấu trùng của chủng MSS8.4 có liên quan đến gen cry2A.
Gen cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3).
Xác định đƣợc các thông số tối ƣu cho quá trình cảm ứng là: nồng độ IPTG
1mM, nhiệt độ 370C và thời gian là 4 giờ. Tinh sạch đƣợc protein Cry2A tái tổ

hợp bằng cột sắc ký ái lực Probond Nikel Resin.
4. Bã malt bia đƣợc tiền xử lý bằng phƣơng pháp axit nhiệt cho hàm lƣợng
các bon, nitơ cao làm nguyên liệu nuôi cấy chủng vi khuẩn Btk MSS8.4 với mật
độ tế bào đếm đƣợc đạt 4,9 x 108 CFU/ml.
23