Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư (FULL TEXT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HỒ HOÀNG NHÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT PHA TIÊM
HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. Đại cƣơng về artesunat .......................................................................................... 2
1.1.1. Công thức ................................................................................................ 2
1.1.2. Tính chất vật lý ........................................................................................ 2
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat ................................... 2
1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat ..................................................... 4
1.1.5. Tác dụng ức chế tế bào ung thư................................................................. 5

1.1.6. Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư ................................................ 8
1.2. Tiểu phân nano polyme .......................................................................................... 9
1.2.1. Đặc điểm ................................................................................................. 9
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme ............................... 10
1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA bằng
chitosan hoặc PEG ................................................................................................. 11
1.2.4. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ............. 14
1.2.5. Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm ............................. 18
1.2.6. Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt bằng
cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa .................................................................. 19
1.3. Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thƣ ...................................25
1.3.1. Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc
nano ...................................................................................................................... 25
1.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano .................... 26
1.3.3. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ...................... 27


1.3.4. Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano
chứa dẫn chất của artemisinin................................................................................. 28
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 33
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 33
2.1.2. Tế bào và động vật thí nghiệm ................................................................ 34
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................ 34
2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................. 35
2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 36
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 36
2.4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat ............................................................ 36
2.4.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ............................. 41
2.4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ................. 46

2.4.4. Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat................................................................................................................ 47
2.4.5. Theo dõi độ ổn định ............................................................................... 52
2.4.6. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo ...................... 53
2.4.7. Xử lý số liệu .......................................................................................... 56
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................57
3.1. Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat......................................................... 57
3.1.1. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi
dung môi và hấp phụ vật lý .................................................................................... 57
3.1.2. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp phun điện
trường ................................................................................................................... 64
3.1.3. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ............................................... 69
3.2. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ..................... 80
3.2.1. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS .................................................. 80
3.2.2. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ................................................ 84
3.3. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat........88
3.3.1. Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat ............................... 88
3.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg ....... 93


3.4. Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân
nano artesunat..............................................................................................................95
3.4.1. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95
3.4.2. Hình thái của tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô .................. 96
3.4.3. Phổ nhiễu xạ tia X .................................................................................. 96
3.4.4. Phân tích phổ hồng ngoại ....................................................................... 97
3.4.5. Phân tích nhiệt vi sai .............................................................................. 98
3.4.6. Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro .................................................... 98
3.5. Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông khô pha tiêm
chứa tiểu phân nano artesunat ................................................................................... 99

3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat................................................................................................................ 99
3.5.2. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ..... 100
3.5.3. Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi phân tán lại

........................................................................................................................... 105
3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat ...........................................................106
3.6.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của tiểu phân nano
artesunat.............................................................................................................. 106
3.6.2. Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat ..... 110
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .........................................................................................113
4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat .....................................................................113
4.1.1. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan ..................................... 113
4.1.2. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG ........................................... 119
4.2. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ...........................124
4.2.1. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan ..................................... 124
4.2.2. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG ........................................... 126
4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ....................128
4.4. Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô ..................................133
4.5. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm .............................................................136
4.6. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và in vivo ..........................................138


4.6.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro ................................................. 138
4.6.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo.................................................. 141
4.7. Đóng góp mới của luận án .................................................................................146
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................147
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

AFM

Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy)

ART

Artesunat

ATN

Artemisinin

ATNs

Artemisinin và dẫn chất

C6

Coumarin 6

CD

Cyclodextrin

CS

Chitosan

DCM

Dicloromethan

DHA

Dihydroartemisinin

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO

Dimethylsulfoxid

DNA

Acid deoxyribonucleic

DSC

Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry)

EPR

Hiệu ứng tăng tính thấm và lưu giữ (Enhanced Permeability and
Retention effect)

FDA

Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug
Administration)

FT-IR

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared
Spectroscopy)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

i.p.

Đường tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection)

i.v.

Đường tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection)

KTTP

Kích thước tiểu phân trung bình theo cường độ (Z-Average,
Intensity Distribution)

LC-MS

Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)

LLC

Ung thư phổi Lewis ở chuột (Lewis Lung Cancer)


MPS

Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System)

NP/s

Tiểu phân nano (Nanoparticle/s)

PBS

Phosphat Buffer Salin

PDI

Hệ số đa phân tán (Polydispersity Index)

PEG

Poly ethylen glycol

PLGA

Acid poly(lactic-co-glycolic)

PL

Phụ lục

PM

Hỗn hợp vật lý (Physical mixture)

RES

Hệ lưới nội mô (Reticulo-Endothelial System)

ROS

Các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species)

SEM

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy)

SRB

Sulforhodamine B

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscopy)

TP nano

Tiểu phân nano

XRD

Phổ nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction)


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên chuột
của artemisinin và dẫn chất ............................................................................................. 6
Bảng 1.2. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ........................ 27
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng ..................................................... 33
Bảng 3.1. Ký hiệu và các mức của biến độc lập............................................................ 59
Bảng 3.2. Ký hiệu, các mức của biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa ..................... 60
Bảng 3.3. Các công thức thực nghiệm và đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS
.......................................................................................................................................60
Bảng 3.4. Công thức tối ưu của TP nano ART/PLGA-CS............................................63
Bảng 3.5. Kết quả một số đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo
công thức tối ưu (n=3) ...................................................................................................63
Bảng 3.6. Các mức và thông số thiết yếu của quá trình phun điện trường kép tạo TP
nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS .................................................................................... 64

Bảng 3.7. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập ..................................................... 72
Bảng 3.8. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa ............................. 72
Bảng 3.9. Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG .................73
Bảng 3.10. Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 .......................................77
Bảng 3.11. Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ưu (n=3) ................... 78
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART ....................... 79
Bảng 3.13. So sánh một số đặc điểm của quá trình bào chế các TP nano PLGA bao CS
hay PEG ......................................................................................................................... 88
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô .......89
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thể tích đến hình thức sản phẩm đông khô ........................ 92
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm ................... 93
Bảng 3.17. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART ................95
Bảng 3.18. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART
.....................................................................................................................................100
Bảng 3.19. Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại của bột đông khô sau thời gian
bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ..........................101


Bảng 3.20. Hàm lượng nước, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân sau
khi phân tán lại của bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và
ở điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) (n=3)..................................................................102
Bảng 3.21. Phần trăm hàm lượng ART, giới hạn tạp chất và độ vô khuẩn trong bột
đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC ......................................................................103
Bảng 3.22. Độ ổn định của hỗn dịch chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong 4
giờ ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ...................................106
Bảng 3.23. Giá trị IC50 của các công thức bao PEG đối với tế bào LLC...................110
Bảng 3.24. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ....................................................................................................................110
Bảng 3.25. Sự phát triển của khối u khi tiêm tĩnh mạch đuôi .....................................111

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART ............................................................................2
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS ............................. 37
Hình 2.2. Minh họa quá trình phun điện trường kép trong bào chế TP nano dạng nhân
– sợi ............................................................................................................................... 38
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến ...........................................40
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG ...40
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm
chứa TP nano ART trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đường
tiêm tĩnh mạch đuôi .......................................................................................................56
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS và PLGA tới KTTP và thế zeta của TP nano ART
(n=3) .............................................................................................................................. 57
Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................58
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................59
Hình 3.4. Hình ảnh mặt đáp của KTTP ở các điều kiện khác nhau: khi nhiệt độ = 25oC
(A), khi pH của dung dịch CS = 4,0 (B), và khi tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6; và của thế
zeta của TP nano ART/PLGA-CS khi pH của dung dịch CS = 4,0. ............................. 62
Hình 3.5. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM1-FM4 ...................................................................................................................... 65
Hình 3.6. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM5-FM8 ...................................................................................................................... 66
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM9-FM12 .................................................................................................................... 67
Hình 3.8. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức:
FM13-FM16 ..................................................................................................................68
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................69

Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................70


Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................71
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/nước đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................71
Hình 3.13. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến KTTP của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................74
Hình 3.14. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến PDI của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................75
Hình 3.15. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến tỷ lệ nạp thuốc của
TP nano ART/PLGA-PEG ............................................................................................ 77
Hình 3.16. Hình ảnh TEM của TP nano ART/PLGA-CS .............................................80
Hình 3.17. Phổ hồng ngoại của ART, CS, PLGA, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-CS .............................................................................................................80
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA và
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................81
Hình 3.19. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột ART và TP nano
ART/PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) ..............................................83
Hình 3.20. Hình ảnh chụp SEM của TP nano ART/PLGA-PEG ..................................84
Hình 3.21. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-PEG (NPs) ................................................................................................ 84
Hình 3.22. Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP
nano ART/PLGA-PEG (NPs)........................................................................................ 85
Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của TP nano ART/PLGA-PEG trong CDCl3, D2O ..............86
Hình 3.24. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA-PEG và
TP nano ART/PLGA (n=3) ........................................................................................... 87
Hình 3.25. Ảnh hưởng của các tá dược tạo bánh đến sản phẩm sau đông khô (A) và

sau khi phân tán lại (B) ..................................................................................................89
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccarose và manitol đến KTTP và PDI trước và
sau khi đông khô (n=3) ..................................................................................................90
Hình 3.27. Ảnh hưởng kết hợp tá dược tạo bánh khác nhau đến chất lượng sản phẩm
đông khô (n=3) ..............................................................................................................91
Hình 3.28. Hình ảnh bánh bị phồng rộp (A) và bánh còn ướt đáy (B và C) .................92


Hình 3.29. Sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) với thời gian sấy sơ
cấp 48 giờ ...................................................................................................................... 93
Hình 3.30. Hình ảnh bột đông khô pha tiêm trước (A) và sau khi phân tán lại (B) ......95
Hình 3.31. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-PEG sau đông khô .................... 96
Hình 3.32. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý
(PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG (NPs_S) ............................ 96
Hình 3.33. Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose
(SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tương ứng (PM_S) ......................... 97
Hình 3.34. Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose
(SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tương ứng (PM_S) ......................... 98
Hình 3.35. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm chứa
TP nano ART sau khi phân tán lại trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 và pH 7,4
(n=3) .............................................................................................................................. 99
Hình 3.36. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý
(PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG ở các thời điểm và điều kiện
bảo quản khác nhau .....................................................................................................103
Hình 3.37. Hình ảnh SEM của TP nano ART trong bột đông khô sau 12 tháng bảo
quản ở điều kiện 5 ± 3 oC ............................................................................................104
Hình 3.38. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12
tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC (n=3) ...................................................................105
Hình 3.39. Khả năng thấm vào tế bào của TP nano C6-PLGA và C6/PLGA-CS trên tế
bào MCF-7 (A, B) và tế bào A549 (C, D) ...................................................................107

Hình 3.40. Tỷ lệ tế bào sống sót ở các dòng tế bào, (A) MCF-7, (B) A549 ...............108
Hình 3.41. Hình dáng nhân tế bào dưới kính hiển vi lase quét đồng tiêu cự sau khi xử
lý tế bào trong 24 giờ với ART nguyên liệu, TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS
trên tế bào MCF-7 (A) và tế bào A549 (B) .................................................................109
Hình 3.42. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ....................................................................................................................111
Hình 3.43. Sự phát triển của khối u ở chuột sử dụng đường tiêm tĩnh mạch đuôi .....112


ĐẶT VẤN ĐỀ
Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá
trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L..
Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác
dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26].
Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các
yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo
quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể
được áp dụng. Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại
đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế
bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể
người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là
một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu.
Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử
dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm
soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều
mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có
thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là
TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt
hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời
gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều

chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44].
Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu
phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm:
1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở
quy mô phòng thí nghiệm;
2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;
3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha
tiêm chứa tiểu phân nano artesunat;
4. Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu
phân nano artesunat.
1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về artesunat
1.1.1. Công thức
-

Công thức cấu tạo
CH3
H

H3C
O

O

H

O

H

O

CH3
OCOCH2 CH2 COOH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART
- Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano (4,3 – j) - 1,2 - benzodioxepin - 10 ol, hydrogen sucinat.
- Tên khác: Dihydroartemisinin-12-alpha-succinat; Succinyl dihydroartemisinin; Quinghaosu reduced succinat este.
- Công thức phân tử: C19H28O8
- Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [1].
1.1.2. Tính chất vật lý
Bột kết tinh trắng mịn. Tan được trong nước (khoảng 56,2 mg/l ở 25oC), tan
tốt trong dicloromethan (DCM), ethanol và aceton. ART là một acid yếu có pKa
bằng 4,6, có hệ số phân bố dầu/nước thay đổi theo các giá trị pH khác nhau, ngoài
ra, ART có khả năng tan một phần trong nước ở pH=7,4 do logD7,4 nhỏ nên có thể
thích hợp với dạng thuốc tiêm khi chuyển qua dạng muối (như dạng muối kiềm
natri). Ở dạng thuốc tiêm, acid artesunic được dùng kết hợp với natri hydrocarbonat
để tạo dạng muối natri artesunat ngay trước khi tiêm [1], [20].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm
Là dẫn chất este của ATN, ART kém ổn định ở nhiệt độ cao và sự có mặt của
ẩm.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ART kém ổn định khi tăng nhiệt độ; ví dụ trong

2

dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) khi bảo quản ở 9oC, 23oC, 36,5oC thì thời gian ổn
định của ART lần lượt là 130 giờ, 10,6 giờ và 1,6 giờ [24]. Độ ổn định của ART đạt
được tối đa khi bảo quản thuốc ở 2-8oC [12].
Đồng thời, độ ổn định của ART bị ảnh hưởng mạnh khi có độ ẩm cao. Hàm
lượng ART giảm nhanh trên 2%/năm khi bảo bảo quản nguyên liệu ART ở nhiệt độ
30-35oC và độ ẩm tương đối (gọi tắt là độ ẩm) 80-90% [6]. Quá trình phân hủy của
thuốc được chứng tỏ có liên quan nhiều đến độ ẩm hơn, ví dụ khi bảo quản ở nhiệt
độ 50oC và độ ẩm 60%, thuốc ít bị phân hủy hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ
40oC và độ ẩm 75% [12].
Khi nghiên cứu sự ổn định của ART trong môi trường huyết tương, nhiệt độ cao
cũng làm ART kém ổn định. Ví dụ, khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC, ART có thể ổn
định đến 6 ngày so với 5 giờ ở nhiệt độ phòng (24oC), ở -25oC cho thấy không có sự
phân hủy sau 8 tháng [24]. Thời gian bảo quản càng lâu càng dẫn đến sự phân hủy
ART, ví dụ ở nhiệt độ 4oC, sau 2, 3, 6 tháng bảo quản thì hàm lượng dược chất lần
lượt giảm đến 6-18%, 25-37% và 59-80%; ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ giữa ART và
dihydroartemisinin (DHA) càng giảm khi thời gian bảo quản càng kéo dài [102].
Do đó, bột khô là dạng thích hợp nhất để bảo quản như đối với công thức bào
chế thuốc tiêm chứa ART để hạn chế sự không ổn định hoặc công thức chỉ được
phối trộn với nước ngay trước khi sử dụng. Ngoài ra công thức cần được bào chế
trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và độ ổn định cần được kiểm tra trong quá trình
sản xuất dưới điều kiện kiểm soát độ ẩm và bao gói trong các bao bì tránh ẩm [12].
1.1.3.2. Ảnh hưởng của pH và xúc tác acid-base nói chung
Một số thuốc chịu sự phân hủy trong dung dịch khi cho thêm acid hay base. Phụ
thuộc vào pKa, hầu hết các thuốc thường tồn tại ở dạng muối của acid hay base yếu.
Do đó, trong dung dịch nước, các phân tử thuốc sẽ phân ly một phần hay hoàn toàn.
Mặc dù các hệ đệm thường được dùng trong các dung dịch dược phẩm để điều
chỉnh pH của dung dịch nhưng một vài hệ sẽ xúc tác quá trình phân hủy.
Các thuốc có nhóm este succinat trong cấu trúc phân tử như ART có thể bị thủy
phân khi có mặt nước. Đặc biệt quá trình thủy phân sẽ được thúc đẩy bởi sự hiện

diện nhiều hơn của nồng độ ion hydro hoặc hydroxyl hoặc bởi xúc tác acid-base nói
chung của hệ đệm.

3


Nói chung, ART kém ổn định ở pH acid. ART thủy phân đáng kể khi pha loãng
với dung dịch glucose 5% kl/tt với pH thấp khoảng bằng 5 [24]. Đồng thời, mặc dù
tan được trong dung dịch kiềm tuy nhiên lại dễ thủy phân tạo DHA, ví dụ hàm
lượng ART giảm còn 92-93% khi đông khô dung dịch ART có pH 9,1-9,5 [2].
Do vậy, các nghiên cứu chỉ ra rằng, giá trị pH để duy trì ổn định của ART nên
nằm trong khoảng từ 7,5-8,5 như ở pH 8,2 khi đông khô dung dịch ART, hàm lượng
ART vẫn duy trì bằng 98,4% gần như ban đầu [2], thuốc ổn định nhất tại đệm
phosphat pH 8 trong điều kiện nhiệt độ 2-8oC và 25oC với hàm lượng còn lại sau 1
tuần lần lượt là 94,5 ± 0,2% và 94,6 ± 0,8% [12].
1.1.3.3. Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau
Các nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các dung môi khan nước đến sự ổn
định của ART như ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO), PEG 400,…
Việc sử dụng ethanol có thể giảm tốc độ phân hủy của ART như quá trình phân
hủy chỉ xảy ra sau 3 tháng ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên tạo nhiều sản phẩm khác
nhau [71].
Đối với PEG 400, quá trình phân hủy xảy ra chỉ sau 1 tháng tuy nhiên DHA là
chất phân hủy duy nhất, đồng thời là chất chống sốt rét khá hiệu quả. Do đó, PEG
400 là tá dược có thể đáng quan tâm do chỉ tạo mỗi DHA [71].
Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ dung môi khác nhau đến sự phân hủy
của ART trong quá trình bào chế thuốc tiêm đông khô ART. Các dung môi được sử
dụng trong khảo sát bao gồm dung môi số 1, nước cất, ethanol, DMSO, hoặc hỗn
hợp các dung môi. Kết quả hỗn hợp dung môi số 1 và nước cất được lựa chọn để
tiếp tục nghiên cứu vì có khả năng hòa tan các thành phần trong công thức và đảm
bảo tránh sự phân hủy dược chất [2].

1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat
- Phương pháp quang phổ UV-Vis: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng thủy
phân trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 50  1 oC trong 60 phút tạo ra sản phẩm
phân hủy có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 289  1 nm [1].
- Phương pháp quang phổ huỳnh quang: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng
tạo chất huỳnh quang màu nâu xanh với hỗn hợp acid acetic và acid sulfuric (tỉ lệ
2:1) ở nhiệt độ cao 100oC trong 5 phút. Bước sóng kích thích là 303 nm và bước
sóng phát xạ tương ứng của ART trong methanol là 609 nm [138].
4


- Phương pháp acid – base: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng acid – base
với dung dịch NaOH 0,05 M, dùng 2 giọt phenolphthalein/ethanol làm chất chỉ thị
[166].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Với nguyên tắc sắc ký
sử dụng hệ pha động bao gồm acetonitril và đệm phosphat pH 3, với cột sắc ký pha
đảo C18, detector: UV 216 nm [156].
- Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS/MS): Với nguyên tắc định
lượng ART và DHA trong huyết tương người dựa trên quá trình kết tủa protein
bằng acetonitril, sử dụng ATN làm chất chuẩn nội, sau đó tiến hành phương pháp
sắc ký lỏng qua cột C18 trước khi vào bộ phận khối phổ tứ cực chập ba [72].
1.1.5. Tác dụng ức chế tế bào ung thư
1.1.5.1. In vitro
Artemisinin và các dẫn chất của nó (ATNs), trong đó bao gồm cả ART có tác
dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư như: Tế bào ung thư xương (dòng có tình
trạng đột biến p53 khác nhau, HOS) [43]; Tế bào u não hình sao (U373MG) [124];
Tế bào ung thư thần kinh chưa trưởng thành (UKF-NB-3, UKF-NB-6, IMR-32)
[114]; Tế bào ung thư sắc tố da (A375P, A375M, G361, LOX); Tế bào mô liên kết
(HT-1080); Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung (Hela); Tế bào bị bất diệt/chuyển
dạng bởi Human papillomavirus; Tế bào ung thư biểu mô màng trong dạ con (HEC1B); Tế bào ung thư tuyến tụy (BxPC3, MiaPaCa-2), Tế bào ung thư trực tràng

(CLY, HT29) [43].
1.1.5.2. In vivo
Các mô hình thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vivo của các ATNs
đã được tiến hành và có thể tóm tắt một số kết quả như ở bảng 1.1:

5


Bảng 1.1. Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên
chuột của artemisinin và dẫn chất
Thiết kế nghiên cứu
(Mô hình: Tế bào sử dụng/thời điểm bắt
đầu/Nhóm thử/Nhóm chứng dƣơng)
Xenograft: tế bào ung thư vú MDAMB231/khối u đạt d=5-6mm/ART (200
hay
400mg/kg/ngày),
5
ngày,
i.p./doxorubicin (8mg/kg, i.v., tuần 1 lần/2
tuần)
Xenograft: tế bào ung thư tụy Panc-1/khối
u đạt 130mm3/ART (20, 50,
100mg/kg/ngày), 20 ngày, i.p./Gemcitabin
(100mg/kg, i.p., ba ngày một lần)
Xenograft tế bào ung thư đại trực tràng
CLY/khối u đạt 100mm3, dừng khi đạt
1000mm3/ART (100, 300mg/kg, mỗi ba
ngày, i.v.)/Cyclophosphamid (100mg/kg,
i.v., mỗi 7 ngày)
Xenograft: tế bào ung thư phổi không tế

bào nhỏ A549/khối u đạt 100mm3/ART
(60mg, 120mg/kg/ngày), p.o., hai tuần

Kết quả
Ức chế yếu ở liều 400mg/kg (khối u
khoảng 60% so với chứng),
doxorubicin có hiệu quả hơn

Khối u bị ức chế phụ thuộc liều; liều
100mg/kg tương tự gemcitabin, tuy
nhiên sự giảm cân ghi nhận ở nhóm
gemcitabin mà không có ở nhóm ART
ART ức chế lần lượt 35,4% và 50,5%
lần lượt với liều 100mg/kg và
300mg/kg; cyclophosphamid ức chế
67,1% (cùng với sự sụt cân và hai
chuột chết)
ART ở liều 120mg/kg giảm đáng kể
sự phát triển khối u (còn liều 60mg/kg
thì không), khối u đạt 56% so với
nhóm chứng ở ngày 14
Allograft: mảnh khối u từ tế bào LLC
DHA và thuốc hóa trị làm giảm kích
(Lewis lung cancer)/Sau khi cấy/DHA (50, thước khối u. Việc kết hợp thuốc cho
100, 200 mg/kg/ngày, p.o., 25 ngày)/
hiệu quả tốt hơn từng thuốc riêng lẻ.
Cyclophosphamid (50mg/kg/ngày, i.p.,
Sự di căn phổi tự phát được ức chế
cách ngày x 5 lần) và với DHA
hoàn toàn khi dùng dạng kết hợp

Xenograft: mảnh khối u từ tế bào ung thư
phổi A549/Khối u đạt 80-100mm3/như
trên/cisplatin (2mg/kg, i.p.)
Xenograft: tế bào ung thư gan HepGART và dạng liposome đều ức chế sự
2/Khối u đạt 300mm3/ART và liposome
phát triển của khối u (lần lượt là
(45mg/kg/ngày), s.c., 14 ngày
20,5% và 32,7%).
Allograft: tế bào LLC/Khối u đạt 100150mm3 và kết thúc khi đạt 5cm3 (hoặc >6
tuần)/DHA và phức hợp nano với PEG và
transferrin (10mg/kg/ngày), i.v., hằng
ngày

DHA và phức hợp nano ức chế sự phát
triển khối u và tăng tỉ lệ sống sót của
chuột, trong đó phức hợp với
transferrin cho hiệu quả cao nhất.

TLTK
[22]

[56]

[104]

[109]

[176]

[89]

[107]

i.p.: đường tiêm màng bụng; p.o.: đường uống, i.v.: đường tiêm tĩnh mạch; s.c.: đường tiêm dưới
da

1.1.5.3. Một số thử nghiệm và báo cáo lâm sàng có liên quan
Mặc dù đã có rất nhiều các thử nghiệm in vitro và in vivo đã minh chứng tác
dụng ức chế tế bào ung thư của các ATNs, mới chỉ có một lượng ít các thử nghiệm

6


lâm sàng và các ca lâm sàng riêng lẻ được báo cáo cho đến nay. ART đã được sử
dụng trong các liệu pháp điều trị ung thư cho các kết quả tốt và ít có tác dụng phụ.
Hiện các nghiên cứu lâm sàng vẫn đang tiếp tục như một nghiên cứu pha I ở
Đức nhằm đánh giá hiệu quả và khả năng dung nạp của liệu pháp sử dụng ART kết
hợp ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn muộn. Sau 4 tuần sử dụng ART đường uống,
không thấy có bất kỳ một độc tính nào đối với thính giác liên quan liều sử dụng.
Ngoài ra, việc theo dõi thính lực trong các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo với thời
gian sử dụng ART đường uống kéo dài hơn với liều lên đến 200mg/ngày đã được
chứng nhận trong nghiên cứu ARTIC-M33/2 ở châu Âu với số đăng ký 2007004432-23 và ở Mỹ với số đăng ký NCT00764036 [78]. Các kết quả đã được công
bố từ nghiên cứu này cho thấy liều 200 mg/ngày (2,2-3,9 mg/kg/ngày) ART dùng
đường uống là an toàn và dung nạp tốt vì vậy liều 200 mg/ngày được khuyến cáo sử
dụng cho thử nghiệm pha II/III [59], [95], [160].
Một nghiên cứu lâm sàng pha I về tính an toàn và khả năng dung nạp của ART
đường tiêm tĩnh mạch ở bệnh nhân với các khối u rắn đã được tiến hành ở Mỹ với
số đăng ký NCT02353026. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đã được dùng các
liều tăng dần từ 8-45mg/kg vào ngày thứ nhất và ngày thứ tám theo chu kỳ 3 tuần
một lần nhằm xác định liều gây độc, có thể kéo dài đến 11 chu kỳ/bệnh nhân [73].

Công bố ban đầu từ nghiên cứu này cho thấy liều tối đa của ART theo đường tiêm
có khả năng dung nạp tốt (MTD – Maximum Tolerated Dose) là 18mg/kg [51].
Một nghiên cứu khác về pha I đã hoàn thành ở Anh đã đánh giá hoạt tính
chống ung thư và khả năng dung nạp của ART ở bệnh ung thư đại trực tràng [53].
Nghiên cứu được thực hiện ở 20 bệnh nhân trước khi được phẫu thuật với việc sử
dụng ART 200mg bằng đường uống hằng ngày trong 14 ngày. Kết quả cho thấy
ART có hiệu quả trên bệnh ung thư trực tràng (với khả năng tự chết ở hơn 7% tế
bào được tìm thấy lần lượt ở 67% và 55% số bệnh nhân ở nhóm ART và nhóm giả
dược) và có khả năng dung nạp tốt [97].
Bệnh viện TW Quân đội 108 phối hợp với Viện Y học nhiệt đới, Đại học
Tuebingen, Đức cũng đang tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ an toàn và hiệu
quả pha II của ART dùng đường uống liều 200 mg ngày một lần trong 14 ngày đối
với bệnh nhân bị ung thư đại tràng giai đoạn II/III đang chờ phẫu thuật, hiện tại

7


nghiên cứu đang lựa chọn đối tượng nghiên cứu [150], tương tự như nghiên cứu của
St George ‗s, Đại học London, Anh trên bệnh nhân ở Anh [146].
Về các ca lâm sàng, có thể liệt kê các trường hợp được báo cáo như sau: một
bệnh nhân nam 72 tuổi bị ung thư tế bào vảy thanh quản, ART tiêm và uống được
sử dụng trong khoảng thời gian 9 tháng. Khối u đã giảm khoảng 70% sau hai tháng
điều trị. Ngoài ra, ART đã có hiệu quả trong việc tăng khả năng sống sót ở hai bệnh
nhân với ung thư sắc tố mắt di căn trong liệu pháp điều trị kết hợp với hóa trị liệu
chuẩn. Một bệnh nhân đã có đáp ứng nhất thời sau khi phối hợp ART với
fotemusine và bệnh nhân thứ hai có tình trạng ổn định sau khi phối hợp ART với
dacarbazine, kèm theo sự giảm tình trạng di căn đáng kể. Bệnh nhân này đã sống
thêm được 47 tháng sau khi được chẩn đoán giai đoạn IV của ung thư sắc tố mắt
[26].
Một thử nghiệm lâm sàng trên 120 bệnh nhân bị bệnh ung thư phổi không tế

bào nhỏ giai đoạn muộn đã cho thấy sự cải thiện đáng kể về việc kiểm soát bệnh và
thời gian tiến triển sau khi sử dụng ART kết hợp với các thuốc hóa trị liệu truyền
thống. ART kết hợp với vinorelbin và cisplatin đã tăng tỉ lệ sống sót lên 13% so với
liệu pháp dùng vinorelbin hoặc cisplatin chuẩn mà không có tác dụng phụ nào do
ART gây ra [26].
Năm 2015, trong một nghiên cứu trên bệnh nhân 81 tuổi bị ung thư tiền liệt
tuyến ở Đức, việc sử dụng bột cây thanh cao hoa vàng Artemisia annua dưới dạng
đóng vào viên nang (thành phần gồm 50mg cao đậm đặc kết hợp với tri calci
phosphat, cellulose vi tinh thể, silic dioxid và magnesi stearat) phối hợp với hoạt
chất bacalitumid đã làm giảm đáng kể ung thư tiền liệt tuyến di căn cấp dựa trên
khả năng giảm lượng kháng nguyên đặc hiệu của bệnh ung thư này là PSA [115].
1.1.6. Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư
Sự phá vỡ cầu nối peroxid nội phân tử và hình thành các gốc tự do là cơ chế
thiết yếu dẫn đến tác dụng chống bệnh sốt rét cũng như tác dụng ức chế tế bào ung
thư của ATNs [26].
Mặc dù trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào cơ chế
ức chế tế bào ung thư của ATNs, cơ chế phân tử vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ.
ATNs gây ra tác dụng ức chế tế bào ung thư bằng cách ngăn cản nhiều quá trình tín
hiệu tế bào. Các chất này có khả năng ngăn cản quá trình nhân lên, thúc đẩy chu
8


trình tự chết, chống di căn, chống tăng sinh của tế bào ung thư [43]. Cơ chế đa
phương thức này có thể giải thích tính hiệu quả của ATNs trong các loại ung thư đề
kháng với nhiều thuốc. Một thuận lợi nữa của ATNs trong liệu pháp điều trị ung thư
là tác dụng hiệp đồng khi kết hợp với các thuốc hóa trị liệu truyền thống, từ đó có
thể giảm liều và tác dụng phụ của các thuốc này [11], [26], [43].
1.2. Tiểu phân nano polyme
1.2.1. Đặc điểm
TP nano polyme là các tiểu phân có kích thước nano sử dụng polyme làm giá

mang dược chất, có cấu trúc dạng siêu vi nang hay siêu vi cầu. Cấu trúc siêu vi nang
là cấu trúc nhân vỏ, cấu trúc siêu vi cầu là cấu trúc dạng cốt, trong đó dược chất
phân tán đều trong siêu vi cầu. Thực tế khó phân biệt siêu vi nang hoặc siêu vi cầu.
Các polyme sử dụng bào chế TP nano polyme gồm các polyme tự nhiên hay tổng
hợp. Trong đó có cả các loại phân hủy sinh học, tương hợp với cơ thể sống.
Trong các loại polyme, acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) là một trong
những polyme tổng hợp được sử dụng phổ biến do có khả năng phân hủy sinh học
hoàn toàn dưới dạng các sản phẩm chuyển hóa là CO2 và nước thông qua chu trình
Krebs hoặc bài tiết qua thận dưới dạng các monome ban đầu đồng thời có khả năng
kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với
nhiều mô và tế bào [116].
Do đó, PLGA dưới dạng các hệ mang thuốc nano hoặc micro đã và đang được
nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau thuộc ngành Y Dược như
chẩn đoán và điều trị các bệnh tim mạch, miễn dịch học và vaccin, các bệnh viêm
nhiễm,… đặc biệt trong điều trị bệnh ung thư [44].
Tuy nhiên, TP nano polyme PLGA vẫn có hạn chế như khả năng bị opsonin hóa
và bắt giữ bởi hệ lưới nội mô (reticulo-endothelial system - RES) hay hệ thực bào
đơn nhân (mononuclear phagocytic system - MPS) của gan và lách, tương tác
không đặc hiệu với protein và tế bào [116]. Do đó, các polyme thân nước đã được
sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các TP nano PLGA giúp làm giảm sự
hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài

9


thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và
điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44].
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme
Dựa vào quy trình bào chế có thể phân chia các phương pháp bào chế TP nano
polyme thành 2 nhóm [4], [74], [119]:

-

Nhóm các phương pháp kết tủa

-

Nhóm các phương pháp nhũ hóa

Trong đó, có thể liệt kê các phương pháp bao gồm: Kết tủa do thay đổi dung
môi, nhũ hóa và bốc hơi dung môi, tự nhũ hóa hay nhũ hóa và khuếch tán dung môi,
keo tụ hay gel ion hóa, muối hóa, sử dụng dung môi siêu tới hạn, phun sấy, phun
điện trường...
Sau đây là tóm tắt một số phương pháp thường được sử dụng:
 Nhũ hóa và bốc hơi dung môi
Nhũ tương có thể được sử dụng để tạo TP nano bằng cách hòa tan dược chất và
polyme vào pha dầu, sau đó cho nhỏ giọt hỗn hợp vào pha nước có chứa chất diện
hoạt. Quá trình đồng nhất hóa hay siêu âm có thể áp dụng để giảm kích thước của
tiểu phân đến cỡ nano. Tiếp theo, bốc hơi dung môi hữu cơ và thu TP nano bằng kỹ
thuật đông khô.
Trong phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương, đặc tính của TP nano tạo
thành bị ảnh hưởng bởi các thông số như thời gian và cường độ của quá trình đồng
nhất hóa, loại và lượng chất diện hoạt, tỉ lệ polyme và hoạt chất, tốc độ bốc hơi
dung môi [119].
 Nhũ hóa và khuếch tán dung môi
Đối với phương pháp này, quá trình tạo thành TP nano đòi hỏi việc sử dụng ba
pha là pha dầu, pha nước, pha pha loãng. Đối với dược chất thân dầu, pha dầu sẽ
bao gồm polyme, dược chất và dung môi thân dầu được nhũ hoá vào một dung dịch
chứa chất ổn định đã được bão hoà trước đó bằng dung môi thân dầu. Nhũ tương
được phối hợp với một thể tích nước lớn hơn và được khuấy trộn nhẹ nhàng, dung
môi khuếch tán từ giọt pha dầu vào môi trường, hình thành các TP nano polyme

[119].
 Kết tủa do thay đổi dung môi
Dược chất thân dầu và polyme có thể được hòa tan trong dung môi thích hợp
10


(thường đồng tan với nước như aceton), sau đó phối hợp vào môi trường nước có
chứa chất ổn định trong điều kiện thích hợp để polyme kết tủa và bao gói dược chất,
hình thành hỗn dịch nano sau khi bốc hơi dung môi [119].
 Phun điện trường "electrospraying"
Kỹ thuật phun điện trường "electrospraying" là phương pháp phun hình thành
dạng giọt mịn đối với một chất lỏng chứa dược chất và polyme dưới tác động của
một lực điện trường.
Một thiết bị phun điện trường "electrospraying" cơ bản gồm các bộ phận như
đầu súng phun dạng mao quản được nối với nguồn điện cao thế, còn bộ phận thu
mẫu được nối đất. Một lực điện trường mạnh sẽ được tạo thành ngoài đầu súng
phun. Pha lỏng được phun ra khỏi đầu súng phun có dạng mao quản dưới dạng mặt
khum "meniscus" và sẽ bị kéo dài ra, sau đó phân tán thành những giọt nhỏ dưới tác
động của lực điện trường. Dung môi sẽ bốc hơi tạo thành các TP nano polyme rắn
[74], [129].
1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA bằng
chitosan hoặc PEG
Dựa vào các đặc điểm sinh học của khối u bao gồm hiệu ứng tăng tính thấm và
lưu giữ (EPR - Enhanced Permeability and Retention) do cấu trúc bất thường của
lớp lót nội mạc của các mạch máu quanh khối u, pH acid ngoại bào của khối u và
các kháng nguyên đặc hiệu của khối u, các chiến lược trong kỹ thuật bào chế TP
nano đã được đưa ra nhằm tăng cường tính hướng đích và lưu giữ của TP nano.
Dựa vào hiệu ứng EPR, các dạng thuốc nano truyền thống có thể lưu giữ tại
khối u do khả năng thấm cao của các mạch máu khối u. Đồng thời, do sự dẫn lưu hệ
bạch huyết bị bất thường ở khối u nên các TP nano có thể lưu tại khối u đủ lâu cho

phép quá trình rã của TP nano và phóng thích thuốc xảy ra tại vị trí khối u [162].
Tuy nhiên, các dạng thuốc nano truyền thống dễ bị bắt giữ bởi hệ thống thực
bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào [116]. Do đó, để có thể dẫn
thuốc tới đích và tránh thanh thải của hệ thực bào, cần tiến hành đa chức năng hóa
(hay biến tính bề mặt) TP nano PLGA bằng cách thay đổi điện thế bề mặt của TP
nano PLGA từ âm sang dương; ―ngụy trang‖ tiểu phân; hoặc gắn với các phối tử
hướng đích các thụ thể ở bề mặt tế bào khối u [4], [112].

11


Vì vậy, áp dụng đối với TP nano polyme truyền thống như TP nano PLGA, có
thể biến tính bề mặt tiểu phân bằng các polyme thân nước chẳng hạn như thay đổi
điện tích bề mặt của TP nano từ âm sang dương bằng chitosan (CS) [57], hoặc
―ngụy trang‖ tiểu phân bằng PEG (hay còn gọi là PEG hóa) [135].
1.2.3.1. Kết hợp với chitosan
CS là sản phẩm deacetyl hóa (DA) của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài
của N – acetylglucosamin và dẫn xuất đường glucose.
Tính chất tích điện dương giúp cho CS hoạt động như một chất bám dính sinh
học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy. CS tăng vận
chuyển các thuốc phân cực qua bề mặt biểu mô, có tính tương thích sinh học và khả
năng phân hủy sinh học. Ngoài ra nhiều nghiên cứu cho thấy CS có tác dụng độc
tính in vitro kháng lại nhiều dòng tế bào ung thư người [38], [164].
* Phƣơng pháp tiến hành
- Hấp phụ
Nguyên t c: Trong môi trường có pH thích hợp, nhóm NH2 của CS và COOH
của PLGA điện ly tạo thành các ion trái dấu tương ứng -NH3+ và -COO-. CS hấp
phụ lên tiểu phân nano PLGA chủ yếu theo tương tác tĩnh điện giữa các nhóm NH3+ và các nhóm –COO-. CS có thể được phối hợp ngay trong quá trình bào chế
TP nano PLGA [130] hoặc được hấp phụ lên bề mặt TP nano PLGA đã hình thành
sẵn [35]. Trong đó, tỷ lệ CS:PLGA, pH dung dịch CS là những yếu tố quyết định

các đặc tính TP nano PLGA-CS tạo thành như KTTP và phân bố KTTP, thế zeta,
hiệu suất mang thuốc,….
Ưu điểm của phương pháp là cách tiến hành đơn giản, thời gian hấp phụ nhanh
do đó giảm nguy cơ thủy phân, cắt mạch polyme làm phá vỡ cấu trúc TP nano
polyme phân hủy sinh học. Tuy nhiên, các polyme hấp phụ có thể bị phản hấp phụ
trong môi trường in vivo do sự thay thế bởi các thành phần của máu có ái lực cao
hơn với bề mặt tiểu phân nano, màng bao CS có tính ổn định tương đối tùy thuộc
vào độ bền của tương tác tĩnh điện [35].
- Gắn kết hóa học
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên phản ứng hóa học giữa các nhóm
NH2 của CS và nhóm –COOH của PLGA tạo thành liên kết đồng hóa trị. TP nano
polyme PLGA sau khi bào chế bằng phương pháp thích hợp được phân tán vào các
12


dung dịch đệm như đệm phosphat pH 5,0, pH 6,0, đệm 2-(N-morpholino)
ethansulfonic (MES) pH 5,5. N-hydroxy succinimid (NHS) và N-(3-dimethyl
aminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid hydroclorid (EDC.HCl) là tác nhân hoạt hóa và
loại nước được thêm vào hỗn hợp trên để hoạt hóa nhóm carboxyl trên PLGA. TP
nano PLGA có nhóm carboxyl hoạt hóa trên bề mặt cho phản ứng với nhóm amino
của CS trong 24 giờ để tạo liên kết carbodiimid [35], [38].
Ưu điểm của phương pháp hóa học là tạo liên kết bền vững giữa CS và PLGA
[35]. Nhược điểm là quy trình phức tạp và thời gian phản ứng kéo dài gây giảm hiệu
suất mang thuốc, tăng nguy cơ phá vỡ cấu trúc TP nano sử dụng polyme phân hủy
sinh học [38], [164].
1.2.3.2. PEG hóa
PEG hóa là quá trình liên quan đến việc thay đổi bề mặt của các TP nano bằng
cách liên kết cộng hóa trị, bao gói hoặc hấp phụ các chuỗi PEG.
Mục đích của các chuỗi PEG này là tạo ra lớp hàng rào để ngăn cản sự kết dính
của các opsonin trong huyết tương, từ đó các tiểu phân có thể ―ngụy trang‖ hoặc

―ẩn‖ đối với các thực bào. Các nghiên cứu thực nghiệm sử dụng phương pháp kính
hiển vi điện tử truyền qua tách mẫu kết đông (freeze-fracture transmission electron
microscopy) đã cho thấy khả năng ―chống lại‖ các protein opsonin của các bề mặt
được PEG hóa [127].
* Phƣơng pháp tiến hành
-

Hấp phụ

Trong các tác nhân PEG hóa trên, poloxame và poloxamin là các đồng polyme
lưỡng tính hay dùng. Poloxame và poloxamin bao gồm các dãy đơn vị monome
ethylen oxid (EO) và propylen oxid (PO), trong đó, càng nhiều đơn vị PO thì tính
thân dầu của polyme càng tăng. Do đó, phần thân dầu của các polyme với các đơn
vị PO có thể được sử dụng để hấp phụ và giữ các phân tử chất diện hoạt ở bề mặt
của TP nano, trong khi đó, các polyme chứa phần EO thân nước hoặc phần PEG có
thể hướng về phía dung dịch và bảo vệ bề mặt của tiểu phân.
Phương pháp này có thuận lợi là dễ thực hiện và có thể tạo đặc tính tránh quá
trình thực bào cho các tiểu phân. Ngược lại, nó cũng có nhược điểm là các polyme
PEG được hấp phụ ở bề mặt có thể bị phản hấp phụ, tạo ra các lỗ trên lớp bao phủ
bề mặt nơi các opsonin có thể gắn vào. Tình huống thậm chí xấu hơn nếu các
13