Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ÁNH TUYẾT

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC
MANG KHUNG 5-PHENYL-1,3,4THIADIAZOL-2-YL
HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON
DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ÁNH TUYẾT

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC
MANG KHUNG 5-PHENYL-1,3,4THIADIAZOL-2-YL
HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON
DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM
VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ

: 607301

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS.Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI 2012


Lời cảm ơn
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn người thầy đáng kính của tôi,
trưởng bộ môn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội PGS.TS. Nguyễn Hải
Nam. Thầy đã không chỉ tạo những điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận
văn mà luôn có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những lúc tôi gặp khó
khăn, luôn ở bên động viên tôi, cho tôi niềm động lực tinh thần, niềm tin lớn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên của bộ môn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội trong suốt thời
gian qua đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại bộ môn, đến những cô
chú anh chị cán bộ giúp đỡ tôi trong quá trình kiểm tra, đo đạc các loại phổ tại
viện Hóa Học Việt Nam, viện Hóa Học các hợp chất tự nhiên và bộ môn Hóa
vật liệu trường Đại học Khoa học tự nhiên.
Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các
bạn và các em trong nhóm thực nghiệm tại bộ môn Hóa Dược, những người
đã chia sẻ vui buồn, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội ngày tháng năm 2012
Người viết

Đỗ Thị Ánh Tuyết


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………….1
PHẦN I - TỔNG QUAN………………………………………………… ..2
1.1 Histon deacetylas………........................................................................ 2
1.1.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể……………………………………………….. 2
1.1.2. Histon deacetylase…………………………………………………… 3
1.1.3. Cơ chế hoạt động của histon deacetylase ……………………………..4
1.1.4. Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư………………………………… 5
1.2. Các chất ức chế HDAC………………………………………………… 7
1.2.1. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC………………………… 7
1.2.2. Phân loại chất ức chế HDAC……………………………………………. …10
1.2.3. Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC................................ .... 15
1.2.4. Liên quan cấu trúc-tác dụng của các chất ức chế HDAC……………. 16
1.3. Phản ứng hóa học……………………………………………………… 21
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 25
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 25
2.1.1. Hóa chất chính. ................................................................................... 26
2.1.1. Dung môi và hóa chất khác................................................................. 26
2.2. Thiết bị, dụng cụ.................................................................................... 26

2.3. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................ 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu. ...................................................................... 27
2.4.1. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết ....................................... 27
2.4.2. Xác định cấu trúc ............................................................................... 27
2.4.3. Thử tác dụng ức chế enzym HDAC..................................................... 27
2.4.4. Thử độc tính tế bào invitro .................................................................. .27

2.4.5 Nghiên cứu docking của các chất………………………………………28
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ ........................................... ..29
3.1. Tổng hợp hóa học. ................................................................................. 31
3.1.1. Tổng hợp ”N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid”
(5a)…………………………………………………………………………..32
3.1.2. Tổng hợp ”N1-hydroxy-N8-(5-(2clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2yl)octandiamid” (5b). ................................................................................... 33
3.1.3. Tổng hợp “N1-hydroxy-N8-(5-(3clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2yl)octandiamid(5c). ...................................................................................... 35
3.1.4. Tổng hợp “N1-hydroxy-N8-(5-(4clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2yl)octandiamid(5d). ...................................................................................... 37
3.1.5. Tổng hợp “N1-hydroxy-N8-(5-(methoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2yl)octandiamid(5e). ...................................................................................... 39
3.1.6. Kiểm tra độ tinh khiết. ........................................................................ 40
3.2. Xác định cấu trúc................................................................................... 42
3.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................ 42
3.2.2. Phổ khối lượng (MS). ......................................................................... 45
3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR. ............................................... 46


3.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR…………………………. ……47
3.3. Hoạt tính sinh học.................................................................................. 49
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN. .......................................................................... 51
4.1. Hóa học. ................................................................................................ 51
4.2. Hoạt tính sinh học.................................................................................. 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALL

: Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính

AML

: Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính

APL

: Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính

CD

: Receptor gây chết nội tại

CLL

: Bệnh ung thư bạch cầu mãn tính

CTCL
MDS

: U lympho tế bào T dưới da
: Hội chứng loạn sản tuỷ

DMF

: Dimethyl formamid

DMSO

: Dimethyl sulfoxid

EtOH

: Ethanol

HAT

: Histon acetyltranferase

HDAC

: Enzym histon deacetylase

HDACi

: Chất ức chế enzym histon deacetylase

IC50

: Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa

IR

: Phương pháp phổ tử ngoại

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng

NMR

: Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

RA

: Acid retonic

RAR

: Receptor của acid retonic

SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic

TLC

: Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA

: Trichostatin A


DANH MỤC CÁC BẢNG
Stt

Tên bảng

Bảng 1.1

Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng

13

Bảng 1.2

Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC

15

Bảng 3.1

Giá trị Rf và T0nc của các chất 5a-e

39

Bảng 3.2

Số liệu phân tích phổ IR của các chất 3a-d

40

Bảng 3.3

Số liệu phân tích phổ IR của các chất 4a-d

40

Bảng 3.4

Số liệu phân tích phổ IR của các chất 5a-e

41

Bảng 3.5

Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất

42

Bảng 3.6

Số liệu phân tích phổ 1H-NMR của các chất 5a-e

43

Bảng 3.7

Số liệu phân tích phổ 13C-NMR của các chất 5a-e

45

Bảng 3.8

Kết quả thử hoạt tính của chất 5a-e và SAHA

46

Bảng 4.1

Kết quả thử độc tính tế bào in vitro của một số dẫn chất

Trang

50

phenyltriazolylhydroxamat
Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất
Bảng 4.2

benzothiazol trong luận văn thạc sỹ của Trần Văn

50

Nam
Kết quả thử độc tính tế bào in vitro của một số dẫn chất
Bảng 4.3

51
phenythiazolyllhydroxamat

Bảng 4.4

Tương đồng cấu tạo của các chất đích và SAHA

52


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT

Tên hình

Trang
2

Hình 1.1

Cấu trúc histon trong nucleosom.

Hình 1.2

Cấu trúc 3D của một HDAC gắn với một chất ức chế HDAC 5

Hình 1.3

Tác động của các HDAC với tế bào ung thư

6

Hình 1.4

Cơ chế hoạt động của các chất ức chế HDAC

7

Hình 1.5.

Công thức của một số chất ức chế enzyme HDAC

14

Hình 1.6

Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC

17

Liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất ức chế

18

Hình 1.7

HDAC dẫn chất acid hydroxamic


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

STT

Tên sơ đồ

Trang

Sơ đồ 3.1

Quy trình tổng hợp chung

26

Sơ đồ 3.2

Quy trình tổng hợp chất 5a

27

Sơ đồ 3.3

Quy trình tổng hợp chất 5b

31

Sơ đồ 3.4

Quy trình tổng hợp chất 5c

33

Sơ đồ 3.5

Quy trình tổng hợp chất 5d

35

Sơ đồ 3.6

Quy trình tổng hợp chất 5e

37


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cho đến nay, ung thư vẫn được coi là căn bệnh khó chữa nhất. Trong
khoảng năm thập kỷ trở lại đây, trong cuộc chiến chống lại căn bệnh ung thư, các
nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triển nhiều loại thuốc mới để điều trị ung
thư. Cho đến nay, có khoảng 200 thuốc đã được cấp phép sử dụng trong lâm
sàng và hàng trăm thuốc vẫn đang được nghiên cứu. Những thuốc này đã đạt
được một số thành tựu như cải thiện được tình trạng bệnh và kéo dài tuổi thọ
bệnh nhân tuy nhiên việc sử dụng chúng có nhiều hạn chế do độc tính cao, thiếu
tính chọn lọc trên các khối u và hiệu lực điều trị thấp. Ngày nay nhờ các tiến bộ
về sinh học phân tử, di truyền học, người ta đã có những hiểu biết ngày càng sâu
sắc về các tiến trình sinh học trong ung thư: sự tăng trưởng tế bào, các gen điều
hòa chu trình tế bào, sự chết tế bào theo chương trình, sự tạo mạch… Điều này
đã tạo điều kiện thuận lợi để các nhà khoa học phát triển một liệu pháp mới: liệu
pháp nhắm trúng đích (targeted therapy) nhờ vào các hiểu biết về ung thư ở mức
độ phân tử.

Một trong những mục tiêu phân tử đang được chú ý hiện nay là các enzym
histon deacetylase (HDAC) [1]. Nghiên cứu về các HDAC, người ta đã chứng
minh được rằng hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh
ung thư. Trong những năm gần đây, các chất ức chế HDAC đang trở thành các
tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamic
(Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong
điều trị u lympho tế bào T da [13]. Vorinostat là một chất ức chế HDAC có chứa
nhóm hydroxamic trong phân tử. Đây là một trong những chất được nghiên cứu
phát triển từ TSA - là một chất ức chế HDAC tự nhiên có chứa nhóm
hydroxamic trong phân tử. Điều này cho thấy các chất ức chế HDAC có chứa
nhóm chức hydroxamic rất có triển vọng trong điều trị ung thư. Vì vậy chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài:
“Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4thiadiazol-2-yl hướng ức chế enzyme histon deacetylase” với 2 mục tiêu chính:
1,
Tổng
hợp
N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2yl)octandiamid” và một số dẫn chất.
2, Thử tác dụng ức chế enzyme HDAC và độc tính tế bào ung thư (in vitro
của các chất tổng hợp được.

\


2

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN
1.1. Histon deacetylase
1.1.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể
Tất cả bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức
hợp đại phân tử protein-ADN. NST có cấu trúc động, được tổ chức cao, bao gồm

ADN, các protein histon và protein không phải histon. Đơn vị cấu trúc cơ bản
của NST là nucleosom [1,15,25]. Một nucleosom bao gồm 146 cặp base của
ADN quấn quanh một lõi histon octamer. Histon octamer bao gồm từng cặp của
mỗi H2A, H2B, H3 và H4 (hình 1.1). Những protein này là những protein cơ bản
và được bảo tồn cao qua quá trình tiến hóa. Tất cả 4 lõi của histon đều có một
đuôi tận cùng là nhóm amino [1,18]. Việc kéo dài nucleosom là do những đuôi
amino mang điện của các histon. Đuôi của histon H4 dường như kéo dài đến sát
ngay nucleosom kế tiếp để kết hợp với phức hợp H2A-H2B, cho thấy phần đuôi
của các histon có thể quyết định cấu trúc bậc cao hơn của sợi nhiễm sắc [1].
Thực tế là, những đuôi histon đặc biệt là H3 và H4 là đích đến cho nhiều sự biến
đổi khác nhau sau phiên mã bao gồm: sự acetyl hóa, sự methyl hóa và sự
phosphoryl hóa. Những thay đổi cộng hóa trị của những đuôi histon được tạo
thành bởi những enzym như histon acetyltransferase (HAT), methyltransferase,
kinase và đặc biệt là những histon deacetylase (HDAC) đã được biết đến là quyết
định sự biểu hiện gen [1,15].

Hình 1.1: Cấu trúc histon trong nucleosom.
a/ Các lõi protein của nucleosom gồm H2A (histon 2A), H2B (histon 2B),
H3 (histon 3) và H4 (histon 4). ADN (màu đen) quấn quanh một octamer của các
histon. b/ Các đuôi amino của các lõi histon. Các lysin (K) trong các đuôi amino


3

của các histon H2A, H2B, H3 và H4 là những vị trí có khả năng bị
acetyl/decacetyl hóa bởi các histon acetyltransferase (HAT) và histon
deacetylase (HDAC). Sự acetyl hóa làm trung hòa điện tích trên các lysin. A,
acetyl; C, nhóm carboxyl; E, acid glutamic; M, methyl; N, nhóm amino; P,
phosphat; S, serin; Ub, ubiquitin.
1.1.2. Histon deacetylase

HDAC là enzym xúc tác cho sự di chuyển làm giảm bớt nhóm acetyl
trên phần đuôi lysin của những protein histon H2A, H2B, H3 và H4 trong lõi
nucleosom [26]. Sự giảm acetyl hóa các histon có liên quan đến cấu trúc của
NST ở trạng thái đóng xoắn dẫn đến ức chế quá trình phiên mã gen, ngược lại
những histon được acetyl hóa có liên hệ với một cấu trúc NST ở trạng thái
giãn rộng hơn và sự hoạt hóa quá trình phiên mã. Ngoài ra, các HDAC còn có
chức năng quan trọng khác là kiểm soát trạng thái acetyl hóa và chức năng
của nhiều protein trong tế bào chất và những nhân tố phiên mã. Hiện nay
người ta đã biết đến 18 HDAC, chia làm 4 nhóm [14,24]:
- Nhóm I gồm: HDAC1, 2, 3 và 8, có ở phần nhân của nhiều loại tế
bào.
- Nhóm II gồm: HDAC4, 5, 7, 9, 6 và 10. Các enzyme này biểu thị mô
đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân.
- Nhóm III gồm những sirtuin, có ở bào tương, ty thể và nhân.
- Nhóm IV gồm HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào.
Nhóm I, II và IV gồm 11 thành viên và được coi là những HDAC “kinh
điển”. Những HDAC “kinh điển” và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau.
Những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ thuộc Zn2+, vị trí xúc tác của
chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy của túi. Những enzym này có thể bị
ức chế bởi các hợp chất tạo chelate với Zn2+ như các acid hydroxamic. Ngược
lại, những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất này vì chúng có cơ chế
hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ như một cofactor cơ bản [29]. Thuật
ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những hợp chất nhằm


4

mục tiêu vào những HDAC “cổ điển” thuộc nhóm I, II và IV và những hợp
chất này hiện nay đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng.
1.1.3. Cơ chế hoạt động của các HDAC

Cơ chế hoạt động của các enzym HDAC liên quan đến sự loại bỏ nhóm
acetyl từ các histon trong nucleosom. Sự giảm acetyl hóa gây ra sự giảm
khoảng trống giữa nucleosom và ADN quấn quanh nó. ADN quấn chặt hơn
làm các nhân tố phiên mã khó tiếp cận hơn, dẫn đến ức chế quá trình phiên
mã. Vùng xúc tác của HDAC được tạo thành bởi gần 390 aminoacid được bảo
tồn. Vị trí hoạt động này có một túi hình ống hơi cong với phần đáy rộng hơn.
Sự di chuyển của một nhóm acetyl xảy ra thông qua một hệ thống rơ-le điện
(a charge-relay system) bao gồm hai đuôi histidin, hai đuôi aspartic (cách
những histidin khoảng gần 30 aminoacid), và một đuôi tyrosin (ở cùng phía
và cách những đuôi aspartic khoảng 123 aminoacid) ở gần kề nhau. Ion Zn2+
là cần thiết cho hoạt động của hệ thống này. Nguyên tử này được liên kết với
vị trí liên kết với kẽm ở đáy của túi. Các chất ức chế HDAC thực hiện chức
năng bằng cách chiếm chỗ ion kẽm và do đó làm cho hệ thống rơ-le điện hoạt
động bất thường [25]. Trichosanthin A với nhóm hydroxamic của nó và dây
nối 5 nguyên tử Cacbon tới nhóm phenyl là cấu trúc tối ưu để lắp vừa vào vị
trí hoạt động. Việc xác định cấu trúc của HDAC là rất cần thiết để xác định cơ
chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công
thức cho các chất ức chế HDAC. Bằng các kỹ thuật kết tinh tạo tinh thể và
chụp tia X người ta đã xác định được cấu trúc 3D của nhiều HDAC khác nhau
(Hình 1.2), đồng thời nghiên cứu được các trung tâm xúc tác phản ứng
deacetyl hóa của các enzym này, qua đó ứng dụng trong nghiên cứu liên kết
giữa HDAC và một số chất ức chế. Các kết quả này được sử dụng trong thiết
kế cấu trúc của nhiều dãy dẫn chất ức chế HDAC mới.


5

Hình 1.2. Cấu trúc 3D của một HDAC gắn với một chất ức chế HDAC (A).
Chi tiết các đặc điểm cấu tạo tại trung tâm liên kết (B) và mô hình tối
giản trung tâm liên kết (C).

1.1.4. Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư
Mặc dù đã có sự ứng dụng rộng rãi các chất ức chế HDAC trong nuôi
cấy tế bào, các mô hình động vật, hay các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu,
tuy nhiên chúng ta vẫn còn biết một cách mơ hồ về các mục tiêu của chúng
trong các mô ung thư. Điều này là do hiểu biết của chúng ta về các chức năng
của các HDAC trong một mô hình khối u nhất định còn chưa được đầy đủ.
HDAC có thể liên quan tới việc trung gian điều hòa chức năng của các
sản phẩm hoán vị gây ung thư trong một số loại bệnh bạch cầu và u lympho
nhất định. Mối liên quan giữa hoạt động của HDAC và sự hình thành khối u
được thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính
(APL). RARα, receptor của acid retonic (RA), là một chất điều hòa phiên mã
quan trọng trong sự biệt hóa của tế bào tủy. RARα và RXR (chất đồng trùng
hợp ngoại lai của RARα) liên kết với các yếu tố đáp ứng RA (RAREs) và
trong điều kiện vắng mặt yếu tố dạng lưới, có thể ức chế sự phiên mã bằng
cách thu nạp SIN3/HDAC thông qua N-CoR và SMRT [19]. Một ví dụ khác,


6

các protein liên hợp AML1-ETO và TEL-AML1 xuất hiện trong bệnh ung thư
bạch cầu dạng tủy cấp tính (AML) và ung thư nguyên bào lympho cấp tính
(ALL). Các protein này có thể làm cho yếu tố phiên mã AML1, từ chỗ là một
chất hoạt hóa trở thành một chất ức chế, bằng cách thu nạp HDAC thông qua
ETO và TEL [31].
Tuy nhiên, những thay đổi trong biểu hiện gen được mô tả ở trên không
cho thấy một cách rõ ràng sự thay đổi các loại HDAC cụ thể. Do đó chưa thể
có dữ liệu kết luận chung của sự thay đổi các HDAC biểu hiện trong các loại
ung thư ở người. Gần đây một số nghiên cứu về sự thay đổi của một số loại
HDAC trong các mô hình khối u đã được công bố. Ví dụ, có một sự gia tăng
của HDAC1 biểu hiện trong bệnh ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt [13],

ung thư đại tràng [32], ung thư vú [33] hay ung thư da. Một ví dụ khác, sự gia
tăng quá mức của HDAC2 được tìm thấy trong ung thư cổ tử cung [15] và
ung thư dạ dày [27]. Một số nghiên cứu khác cũng đã có báo cáo về sự gia
tăng không kiểm soát của HDAC3 và HDAC6 trong các mẫu xét nghiệm ở
ung thư đại tràng và ung thư vú [36].

Hình 1.3: Tác động của các HDAC với tế bào ung thư


7

Những nghiên cứu được nhắc tới ở trên cho thấy rằng sự ức chế phiên
mã do HDAC là một cơ chế phân tử phổ biến của nhiều loại ung thư trong cả
giai đoạn khởi phát và tiến triển. Trong các ví dụ này, sự ức chế phiên mã
dường như được điều hòa bởi sự thu nạp HDAC và cung cấp một cơ sở hợp lý
cho phương pháp điều trị bệnh bạch cầu với các chất ức chế HDAC. Sự mất
cân bằng trong quá trình acetyl hóa histone có thể dẫn tới những thay đổi
trong cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào
điều khiển chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào.
1.2. Các chất ức chế HDAC
1.2.1. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
Khi HDAC bị ức chế bởi các chất ức chế HDAC (butyrat, TSA,
depsipeptid, oxamflatin, MS-275 và SAHA), những histon sẽ bị acetyl hóa,
ADN đang quấn quanh histon đó sẽ giãn ra. Một vị trí đặc biệt trong vùng
hoạt hóa của một nhóm nhỏ gen (ví dụ các vị trí SP1) được cho là gắn phức
hợp yếu tố phiên mã (TFC) với HDAC và sự tích tụ những histon bị acetyl
hóa trong nucleosom dẫn đến sự phiên mã của nhóm nhỏ gen này tăng lên (ví
dụ, CDKN1A (còn gọi là p21), gen này mã hóa chất ức chế phụ thuộc cyclin
(CDK) là WAF1), và dẫn đến tác dụng hiệp đồng là gây ra sự ngừng phát
triển, sự biệt hóa và/hoặc sự chết tế bào theo chương trình, kết quả là ức chế

sự phát triển khối u [18].

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế HDAC


8

Các chất ức chế HDAC tác động lên tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ
yếu [15]:
* Sự biệt hóa gây ra bởi các chất ức chế HDAC: Các chất ức chế
HDAC tác động lên các tế bào ung thư gây ra sự ngừng tế bào ở pha G1, kết
quả là gây ra sự biệt hóa tế bào ung thư.
* Các chất ức chế HDAC gián tiếp gây ra sự chết tế bào theo chương
trình: Các chất ức chế HDAC tác động lên những tế bào bình thường và tế
bào ung thư với cùng mức độ gây ra G2 checkpoint (vị trí mà tại đó chu trình
tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu
trình lại tiếp tục). Những tế bào bình thường trải qua G2 checkpoint và tiếp
tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thư tái tạo ADN tạo thành dạng
4nADN và chuyển sang giai đoạn gây chết tế bào theo chương trình.
* Các chất ức chế HDAC còn có những tác dụng gián tiếp đến sự phát
triển khối u. Bằng cách làm tăng các phản ứng miễn dịch chủ thể và ức chế sự
tạo mạch của khối u để có thể ngăn cản rõ rệt sự phát triển khối u ban đầu và
sự di căn.
1.2.1.1.

Các chất HDACi gây ra sự biệt hóa

Khi là 1 tác nhân riêng lẻ, các HDACi có thể khiến cho nhiều loại tế
bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện đặc tính biệt hóa và
ngừng tăng sinh. Sự ức chế chu trình tế bào là cần thiết cho sự biệt hóa của tế

bào, và tác dụng kìm tế bào của HDACi là rất quan trọng cho hoạt động
chống ung thư của chúng. Phân tích các số liệu về chu trình tế bào của các tế
bào ung thư đã được điều trị với HDACi cho thấy các tế bào thường dừng ở
pha G1, nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình.
Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của
RARα và protein gây ung thư PLZF-RARα làm ngắt quãng chương trình biệt
hóa bình thường. HDACi có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào
APL kháng hóa trị liệu PLZF-RARα cả in vivo và in vitro [19].Trường hợp


9

tương tự cũng có thể xảy ra ở AML, trong đó chức năng ức chế của các
protein AML1-ETO và TEL-AML1 bị kìm hãm bởi các HDACi, và sự nhạy
cảm của tế bào ác tính với RA vẫn được bảo toàn. Trong hai trường hợp này,
mục tiêu phân tử của HDACi đã được xác định rõ, và chu trình dẫn đến sự
biệt hoá cũng đã được nghiên cứu tỉ mỉ. Tuy nhiên HDACi có thể gây ra sự
biệt hóa ở rất nhiều loại tế bào khác, và các hiện tượng phân tử có liên quan
tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn chưa được sáng tỏ [7].
1.2.1.2. Các chất HDACi điều hòa sự gây chết tế bào theo chương trình
Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDACi có thể dẫn đến sự gây
chết tế bào theo chương trình. Sự gây chết tế bào theo chương trình là một
chương trình gây chết tế bào sinh lý với mục đích là kiểm soát số lượng tế bào
bình thường trong quá trình phát triển hoặc trong các loại bệnh. Người ta đã
xác định hai con đường chết nội bào với chức năng riêng biệt nhưng có mối
liên hệ phân tử với nhau. Cả hai con đường này đều đòi hỏi sự có mặt của
Caspases- một họ cystein protease. Con đường thứ nhất được hoạt hóa bởi các
yếu tố nội là “death-receptor” như CD95, TNF, TRAIL. Các yếu tố này sau
khi liên kết với phối tử của chúng sẽ hoạt hóa các capase cạnh màng tế bào
như caspase-8 và -10. Các caspase này sau đó sẽ tiếp tục hoạt hóa các capases

kích thích như caspase-3 và -7. Con đường thứ hai lại cần thiết phải có sự
rách màng ty thể nhằm điều hòa sự giải phóng của cytochrome c và các
protein hỗ trợ sự chết tế bào theo chu trình (như SMAC, AIF) và sự hoạt hóa
của capaes-9 thông qua yếu tố APAF1. Sự toàn vẹn của màng tế bào ty thể
được quyết định bởi các protein trong họ protein BCL2 (bao gồm các protein
pro-apoptic (BAX, BAK) và các protein anti-apoptic (BCL2, BCL-XL).
HDACi đã được ghi nhận là hoạt hóa cả chu trình gây chết receptor và chết tế
bào nội sinh [22]. Ví dụ apicidin và CBHA có thể kích thích sự biểu hiện của
CD95 và phối tử CD95 (CD95L), và sự ức chế sự phát tín hiệu của CD95 sẽ
kháng lại sự gây chết tế bào do apidicin gây ra. Tuy nhiên, việc điều trị với


10

butyrat sẽ làm cho các tế bào nhạy cảm với sự gây chết tế bào được điều hòa
bởi CD95 mà không cần sự mã hóa của phối tử hay receptor. Sự biểu hiện quá
mức của BCL2 có thể ngăn chặn chu trình chết tế bào nội sinh nhưng không
ảnh hưởng tới con đường gây chết receptor, ức chế gây chết tế bào theo chu
trình do HDACi, chỉ ra tầm quan trọng của chu trình nội sinh đối với chức
năng của các HDACi. Các dữ liệu này được củng cố bởi các phát hiện rằng sự
gây chết tế bào theo chu trình do HDACi trùng hợp với sự tăng cường điều
chỉnh các protein BCL2 pro-apoptic và sự giảm điều chỉnh các BCL2 antiapoptic [18].
1.2.1.3. Các tác dụng khác lên ung thư của các chất HDACi
Ngoài việc trực tiếp tác động lên sự tồn tại và phát triển của khối u,
HDACi còn có thể có các hoạt động khác gián tiếp ảnh hưởng lên sự phát
triển của khối u. HDACi có thể hoạt hóa phiên mã các protein MHC (major
histo-compatibility complex) nhóm I và II, các phân tử đồng kích thích CD40,
CD80, và CD86, phân tử kết dính gian bào ICAM1 và interferon loại I và II,
nhằm làm tăng mạnh sự nhận biết và hoạt hóa các tế bào miễn dịch. Thêm vào
đó, sự tồn tại và phát triển của các khối u rắn phát triển rộng và nhanh cần

cung cấp oxy và chất dinh dưỡng một cách liên tục để duy trì hệ mạch của
khối u. TSA có thể ức chế sự gây giảm oxy huyết của yếu tố gây phát triển
màng trong mao mạch (VEGF) và triệt tiêu sự hình thành mạch cả in vivo và
in vitro. Do đó, sự kích thích đáp ứng miễn dịch chính và sự ức chế hình
thành mạch khối u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn
cản sự di căn [11].
1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC:
Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng
trong điều trị ung thư có thể được chia làm 4 nhóm dựa trên cấu trúc [18]:
Các acid hydroxamic: SAHA, pyroxamid, TSA, oxamflatin và
các CHAP.


11

Các acid béo chuỗi ngắn: 4-phenylbutyrat, acid valproic
Các tetrapeptid vòng: trapoxin, apicidin và depsipeptid (cũng
được gọi là FK-228 hay FR901228).
Các benzamid: MS-275, CI-994.
1.2.2.1. Các hydroxamat
Trichostatin A (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên được
phát hiện có tác dụng ức chế HDAC. TSA là một sản phẩm lên men của
Streptomyces. Ban đầu, TSA được sử dụng làm chất chống nấm, nhưng sau
đó người ta đã phát hiện ra khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh các tế bào ung
thư của nó. TSA có tác dụng in vitro ngay ở mức nồng độ nanomol. Do việc
sản xuất TSA rất tốn kém và hiệu suất thấp (20 giai đoạn, với hiệu suất chỉ là
2%) nên việc tìm kiếm một HDACi thay thế nó đang được tiến hành và rất
quan trọng. Ngày nay, TSA được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc
tìm kiếm các các HDACi mới. Rất nhiều hợp chất tương tự TSA thuộc nhóm
hydroxamat đã được tìm ra, nhưng trong đó chỉ có oxamflatin là có tác dụng

in vitro tương tự TSA [22].
Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) có cấu trúc tương tự TSA và
là chất ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol. Cả SAHA và TSA
đều không ức chế HDAC nhóm III. M-carboxycinnamic acid bishydroxamid
(CBHA) là một chất ức chế HDAC mạnh khác, nó là cơ sở cấu trúc của nhiều
dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và 1 dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai
chất này đều ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol.
Các HDACi có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng
tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, do đó chúng ngăn không cho cơ chất
tiếp xúc với ion Zn2+ tại vị trí của nó. Nhược điểm của các hydroxamat là bị
chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [30].
1.2.2.2. Các acid béo mạch ngắn


12

Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat và các dẫn chất và
acid valproic có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, có tác dụng ở khoảng
nồng độ micromol và ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen với các chức
năng tế bào khác nhau. Những tác nhân này đã được đánh giá trong lâm sàng,
nhưng có chu kỳ bán hủy ngắn trong huyết tương và cần phải có nồng độ
tương đối cao (cỡ milimol) cho các hoạt động của chúng. Gần đây, một hợp
chất có cấu trúc ghép giữa phenyl butyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận
là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp. Cả valproic acid và
phenylbutyrat đều đã được sử dụng làm thuốc trên thị trường từ lâu, không
phải với tác dụng chống ung thư. Cho đến gần đây chúng mới được phát hiện
là có khả năng ức chế HDAC [32].
1.2.2.3. Các peptid vòng
Nhóm các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các
HDACi, bao gồm: depsipeptid tự nhiên (FK228), apicidin và các phần tử khác

thuộc nhóm các CHAP (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng).
Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nấm, thì
apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid
vòng. Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng
độ nanomol [22].
Apicidin là chất được chiết xuất từ các thử nghiệm với ký sinh trùng,
chất này gây ra sự acetyl hóa quá mức histon trong ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum và ức chế histon deacetylase của nhiều loại ký sinh
trùng như Eimeria tenella (IC50 = 0,7 nM) đồng thời cũng có tác dụng ngăn
chặn sự phát triển của các tế bào ung thư bạch cầu. Trong khi đó, các chất dẫn
xuất như 9-hydroxy- hoặc 9-acyloxyapicidin đã được cấp bằng sáng chế
nhưng chưa có báo cáo về hoạt tính sinh học nào.
Depsipeptid là một tiền chất của 1 tác nhân hoạt động: red FK.
Depsipeptid (FR901228) có hoạt tính chống ung thư có hiệu quả với các loại


13

ung thư phổi và ung thư tuyến vú, những kiểu ghép dị chủng u melanin, ngoài
ra có tác dụng với ung thư bạch cầu cùng loại ở chuột và u melanin.
Depsipeptide được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng vì hoạt tính chống ung
thư của nó có khởi đầu ấn tượng khi nó được phát hiện là một tác nhân ức chế
HDAC ở mức nMol. Kết quả đầu tiên cho thấy tác dụng điều trị trong bệnh
giảm tiểu cầu đột ngột có hồi phục như một tác dụng phụ ở mức liều tới hạn.
Các tetrapeptid vòng có chứa các nhóm chức năng trifluoroethyl và
pentafluoroethyl ceton, liên kết với kẽm đã được tổng hợp và là những chất
ức chế HDAC mạnh [12].
1.2.2.4. Các benzamid
Nhóm HDACi thứ tư bao gồm tập hợp các tác nhân trong cấu trúc có
chứa nhóm chức benzamid. Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm

nhập vào vị trí xúc tác và liên kết với ion kẽm hoạt động. Các chất thuộc
nhóm này gồm: MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ
micromol) và CI-994 (N-acetyldinalin) có tác dụng ức chế HDAC theo cơ chế
chưa được xác định.
Một nhóm các benzamid được phát hiện có hoạt tính ức chế HDAC ở
mức micromol thấp. Một chức 2’- hydroxy hoặc amino được chỉ ra là cần
thiết cho hoạt tính của chúng và giá trị IC50 của những chất này là từ 2 đến 10
µM. Hợp chất 2’-amino MS-275 (thường được gọi là MS-27-275 trong những
báo cáo đầu tiên) là tác nhân ức chế HDAC đầu tiên được chứng minh có hoạt
tính chống ung thư ở miệng trong các loại động vật. Thêm vào đó, người ta
chưa nhận thấy tác dụng bất lợi nào của chất này.
Bảng 1.1. Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng
Nhóm chất
Acid carboxylic
Acid

Hợp chất

Pha

Loại ung thư

Phenyl butyrat

I

AML/MDS

acid valproic

I, II

AML, MDS, u trung biểu mô.

SAHA

I, II

CTCL


14

hydroxamic

Các benzamid
peptid vòng

LAQ824

I

ung thư máu

PXD101

II

ung thư máu

LBH589

II, III

ung thư máu

CRA 024781

I

u lympho Hodgkin

SB-939

I

MDS

MS275

I, II

MGCD0103

II

ung thư bạch cầu, MDS

Depsipeptid

I, II

AML, CTCL, u đa tuỷ xương.

u lympho, AML, u hắc sắc tố
ác tính di căn tiến triển.

O

O

H
N

O

NHOH

NHOH

O

SAHA

N

Trichostatin (TSA)

O
H

N

N

O
NHOH

O
H
N

HOHN

O

O

Pyroxamid

CBHA

OH

N

NHOH
O

O
S

O

Oxamflatin

O

O

H
N
H
N

NHOH

H
N

LVB-LAQ-824

HN

O

O
H
N

HN

NHOH

NHOH
O

O
S

H
N
NHOH
O

LBH-589

PXD-101

O
H
N

O

NHOH
O

O

NH

O

HN
N
O

NHOH

O

DÉn chÊt cña
tetrapeptid vßng
(CHAP)

O

NEt2

N
H

ITF-2357

Hình 1.5. Công thức của một số chất ức chế enzyme HDAC


15

1.2.3. Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC
Người ta đã đưa ra các bằng chứng rằng một chất ức chế HDAC nhất

định có thể có tác dụng ức chế chọn lọc trên các HDAC khác nhau. Một số ví
dụ, TSA là tác nhân ức chế mạnh HDAC1, 3 và 8, trong khi đó MS-275 ức
chế chọn lọc hơn trên HDAC1 với IC50 là 0,3 µM so với HDAC3 là 8 µM và
không có tác dụng ức chế với HDAC8. Hai hợp chất mới được tổng hợp và đã
được xác định là HDACi là: SK 7041 và SK 7046 có tác dụng chọn lọc hơn
trên HDAC1 và 2 [33].
Nghiên cứu về tính chọn lọc của các chất ức chế enzym histon
deacetylase (HDACi) đối với từng loại HDAC là bước rất quan trọng giúp lựa
chọn chính xác các phác đồ điều trị bằng liệu pháp dùng HDACi (cả đơn trị
liệu và kết hợp) trong mỗi loại bệnh cụ thể có liên quan đến HDAC. Vì vậy đi
đôi với các công trình nghiên cứu ra thuốc mới, thì việc nghiên cứu về đích
tác dụng của thuốc trong mỗi loại ung thư cụ thể cũng rất được chú trọng. Ở
đây chúng tôi tổng kết một số nghiên cứu về một số loại thuốc ức chế HDAC
đang được dùng phổ biến hiện nay (bảng 1.2).
Bảng 1.2: Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC
Loại enzym HDAC
Nhóm I
HDAC 1 2 3 8
Vorinostat (SAHA)
↓ ↓ ↓ ↓
(hydroxamat)
Trichostatin
A
↓
↓
(TSA)
(hydroxamat)
Panobinostat (LBH↓ ↓ ↓ ↓
589)
(hydroxamat)

Belinostat
(PXD↓ ↓ ↓
101)
(hydroxamat)
Tên chất
(nhóm)

và nhóm tương ứng
II
IV
4 5 6 7 9 10 11
×
↓

↓

×

↓
↓

↓

↓

↓

×
↓

↓

↓ ↓

↓