quy trình xác định hàm lượng vitamin E bằng sắc ký lỏng pha đảo HPLC

PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VITAMIN E
(ALPHATOCOPHERYLACETATE)B
ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO
HPLC
1. MỤC ĐÍCH, PHẠM VI VÀ NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP
1.1. Mục đích
Xác định vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) bằng sắc ký lỏng pha đảo (HPLCDAD) trên các sản phẩm
1.2. Phạm vi
- Dùng để xác định vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) có trong sản phẩm viên
nang mềm thành phần có chứa vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate).
1.3. Nguyên tắc
- Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò DAD để phát hiện vitamin E (dạng
alphatocopheryl acetate) dựa vào sắc đồ tính toán nồng độ các chất dựa vào phương
pháp đường chuẩn.
2. TÀI LIỆU THAM KHẢO
-

Dược điển Việt Nam IV.

3. QUY TRÌNH
3.1. Thuốc thử và thiết bị
3.1.1. Thuốc thử
3.1.1.1Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước có điện trở
suất không nhỏ hơn 18 MΩ cm.
3.1.1.2 Methanol (Merk)
3.1.1.3 Chloroform (độ tinh khiết ≥97%)
3.1.1.4 Ethanol tuyệt đối (Merk).
Chất chuẩn vitamin E (DL-alphatocopherol acetate
3.1.2. Thiết bị: Các thiết bị, dụng cụ sử dụng phải là thiết bị đang sử dụng bình
thường, còn hạn hiệu chuẩn, được kiểm tra hàng ngày.

3.1.2.1. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, đầu dò DAD.
3.1.2.2. Máy ly tâm
3.1.2.3. Máy lắc voltex
3.1.2.4. Máy rung siêu âm
3.1.2.5. Máy đo pH.
3.1.2.6. Cân phân tích (0, 0000g)
3.1.2.7. Bình định mức 100mL nâu class A


PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VITAMIN E
(ALPHATOCOPHERYLACETATE)B
ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO
HPLC
3.1.2.8. Bình định mức 50 mL, 20 mL nâu class A
3.1.2.9. Ống fancol 50ml (loại có chia vạch)
3.1.2.10. Pipet chính xác 2,4,8 mL class AS
3.1.2.11. Micropipet 100-1000µL
3.1.2.12. Ống kim tiêm nhựa 6mL, đầu lọc 0.45µm
3.1.2.13. Vial nâu 1.5 mL (nắp hở có lớp lót mềm), đã được làm sạch, sấy khô
3.1.2.14. Giấy lọc định lượng gấp quạt.
3.2. Điều kiện sắc ký
- Cột C18 (5µm, 250 x 4,6 mm).
- Pha động: Methanol (thêm H2O nếu cần khoảng 2%).
- Tốc độ dòng: 2,0 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.
- Detector DAD: 284 nm. Khoảng quét từ 200-400 nm.
- Dung môi pha mẫu: Ethanol (3.1.1.4)
3.3. Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
3.3.1. Dựng đường chuẩn.

3.3.1.1. Dung dịch chuẩn gốc .
• Cân chính xác 100 mg vitamin E chuẩn (3.1.1.5) vào bình định mức 100 mL, thêm
20 mL dung dịch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) lắc cho tan hết hoặc rung siêu âm từ
10-15 phút, thêm dung môi Ethanol (3.1.1.4) vừa đủ 100 mL, trộn đều. Dung dịch
chuẩn gốc đã pha có nồng độ 1 mg/mL. Dung dịch đã pha sử dụng trong 3 tháng
bảo quản ở nhiệt độ từ 2-80C.
3.3.1.2. Pha từ chuẩn gốc vitamin E để được dãy chuẩn làm việc vitamin E nồng độ
0,02; 0,04; 0,1; 0,2; 0,4 mg/mL.
•
Hút lần lượt 400 µL của dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL
định mức đến vạch bằng Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) được dung dịch chuẩn làm
việc có nồng độ 0,02 mg/mL. Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45
µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial). Dung dịch đã pha sử dụng trong ngày,
•

bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C.
Hút lần lượt 800 µL của dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL
định mức đến vạch bằng Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) được dung dịch chuẩn làm
việc có nồng độ 0,04 mg/mL. Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45


PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VITAMIN E
(ALPHATOCOPHERYLACETATE)B
ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO
HPLC
µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial). Dung dịch đã pha sử dụng trong ngày,
•

bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C.

Hút lần lượt 2 mL của dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL
định mức đến vạch bằng Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) được dung dịch chuẩn làm
việc có nồng độ 0,1 mg/mL. Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45
µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial). Dung dịch đã pha sử dụng trong ngày,

•

bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C.
Hút lần lượt 4 mL của dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL
định mức đến vạch bằng Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) được dung dịch chuẩn làm
việc có nồng độ 0,2 mg/mL. Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45
µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial). Dung dịch đã pha sử dụng trong ngày,

•

bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C.
Hút lần lượt 8 mL của dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL
định mức đến vạch bằng Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) được dung dịch chuẩn làm
việc có nồng độ 0,4 mg/mL. Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45
µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial). Dung dịch đã pha sử dụng trong ngày,

bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C.
3.3.2. Dung dịch thử
- Chế phẩm là dạng viên nang mềm:
•
Cân và xác định khối lượng của 20 viên nang. Dùng một dao nhọn hay phương
tiện khác mở các nang ra sao cho không bị thất thoát các mảnh vỏ nang. Chuyển
toàn bộ lượng thuốc trong nang vào cốc có mỏ 100 mL. Rửa vỏ nang bằng
clorofoc (3.1.1.3) làm khô vỏ nang trong tủ hút cho tới khi không còn ngửi thấy
mùi dung môi. Cân và xác định khối lượng của 20 vỏ nang, tính khối lượng trung

bình thuốc trong 1 viên nang.
•
Với mẫu thử đã biết hàm lượng vitamin E (hàm lượng ghi nhãn).
Cân chính xác (đến 0.01g) 1 lượng mẫu thử(*) vào ống fancol 50 mL, thêm 1-2 mL
clorofoc (3.1.1.3) để phân tán dầu, lắc voltex 5 phút, thêm 10ml Ethanol (3.1.1.4),
lắc voltex 5 phút, cho ly tâm 3000v/ 5 phút, gạn lớp trong vào bình 50mL, lăp lại
quá trình tối thiểu 3 lần. Dịch thu được cho vào bình định mức 50 mL, định mức
đến vạch, trộn đều.
Lọc qua giấy lọc (3.2.2.13) đã thấm ướt bằng Ethanol (nếu cần). Bỏ 5-10 mL dịch
lọc ban đầu .
o

o


PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VITAMIN E
(ALPHATOCOPHERYLACETATE)B
ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO
HPLC
o

•
o

o

o

Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm (3.2.2.11) vào vial khoảng

2/3 vial (3.2.2.12)
Với mẫu chưa biết hàm lượng vitamin E ghi nhãn
Cân chính xác 3,0 g mẫu thử cho vào ống fancol 50 mL, thêm 1-2 mL clorofoc
(3.1.1.3) để phân tán dầu, lắc voltex 5 phút thêm 10 mL Ethanol (3.1.1.4), lắc
voltex 5 phút, cho ly tâm 3000v/5 phút, gạn lớp trong vào bình 50 mL, lăp lại quá
trình tối thiểu 3 lần. Dịch thu được cho vào bình định mức 50 mL, định mức đến
vạch.
Lọc qua giấy lọc (3.2.2.13) đã thấm ướt bằng Ethanol (nếu cần). Bỏ 5-10 mL dịch
lọc ban đầu .
Sử dụng bộ dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm (3.2.2.11) vào vial khoảng

2/3 vial (3.2.2.12)
Nếu hàm lượng tìm thấy không nằm trong đường chuẩn, pha loãng với tỷ lệ thích
hợp
3.4. Quy trình thao tác
3.4.1 Với những mẫu đã biết hàm lượng alphatocopheryl acetate ghi nhãn.
- Tiêm dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 200µg/mL vào hệ thống sắc ký.
- Tiêm dung dịch thử đã chuẩn bị ở trên (mẫu đã biết hàm lượng) có nồng độ khoảng
200µg/mL vào hệ thống sắc ký
- Tính toán dựa trên diện tích peak thu được từ chuẩn và thử.
3.4.2 Với những mẫu chưa biết hàm lượng alphatocopheryl acetate.
Tiêm lần lượt các chuẩn làm việc có nồng độ 20; 40; 100; 200; 400 µg/mL (3.2.1.2)
vào hệ thống sắc ký. Từ diện tích peak sắc ký thu được, dựng đường chuẩn y=ax+b.
Tiêm dung dịch thử đã lọc vào hệ thống sắc ký thu được diện tích peak y 1 thay vào
đường chuẩn tìm được x1. (x1 chính là nồng độ của alphatocopheryl acetate có trong
dung dịch thử)
3.5. Kiểm soát chất lượng.
Lặp lại tối thiểu 2 lần thử, gía trị báo cáo là trung bình của 2 lần thử nghiệm sao cho
gía trị RSD thu được thỏa mãn yêu cầu (Xem bảng 1).
o

STT
1
2

Hàm lượng %
100
10

Tỷ lệ chất
1
10-1

Đơn vị
100%
10%

RSD%
1.3
1.8


PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VITAMIN E
(ALPHATOCOPHERYLACETATE)B
ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO
HPLC
3
4
5

6
7
8
9
10

1
10-2
1%
-3
0.1
10
0.1%
0.01
10-4
100 ppm
0.001
10-5
10 ppm
-6
0.0001
10
1 ppm
-7
0.00001
10
100 ppb
-8
0.000001
10

10 ppb
-9
0.0000001
10
1 ppb
Bảng 1: RSD (%) yêu cầu theo AOAC

2.7
3.7
5.3
7.3
11
15
21
30

4. BÁO CÁO KẾT QUẢ
Định tính:
Phổ đồ của dung dich chuẩn vitamin .....
Phổ đồ của dung dich thử
Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử trong phần định lượng cho các peak có
cùng/không cùng thời gian lưu với peak trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
- Định lượng:
Điều kiện sắc ký:
-

- Cột:
(Cột số …)
- Pha động:
- Tốc độ dòng:

- Thể tích tiêm:
- Detector:
- Dung dịch chuẩn:
- Dung dịch thử:
Công thức tính:
- Hàm lượng của vitamin E trong thực phẩm chức năng dạng cốm, viên nang được tính
theo công thức:
Ct×Kt
X(mg/ống/chai)=

×mtb×HLc×(100-HLH2O)
mt

Trong đó:
kT: Hệ số pha loãng của dung dịch thử
mT: Khối lượng chế phẩm đã cân(g)
HLC: Hàm lượng chuẩn (vitamin E)


PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VITAMIN E
(ALPHATOCOPHERYLACETATE)B
ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO
HPLC
HLHOH: Hàm nước có trong chuẩn (vitamin E)
mTB: Khối lượng trung bình viên (đã bỏ vỏ bao, vỏ nang)