Nghiên cứu tách chiết và tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh có nguồn gốc từ một số chủng xạ khuẩn phân lập tại thái nguyên

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Chất kháng sinh (Antibiotic) là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các
sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học. Chúng có khả năng
tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của vi sinh vật, tế bào ung thư ở ngay
nồng độ thấp [7]. Các kháng sinh là một nhóm thuốc thiết yếu trong y học
hiện đại. Nhờ các kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các bệnh
nhiễm trùng. Ngoài ra, chất kháng sinh còn đóng vai trò rất quan trọng trong
một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo quản thực phẩm,… và đặc biệt là
trong bảo vệ thực vật.
Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ
sinh học cũng được coi là một trong những ngành hàng đầu thế giới. Trong
đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh phục vụ đời
sống con người đang có những phát triển vượt bậc. Từ những phương pháp
sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh
tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Cho đến nay đã phát hiện được 17.000
chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật và khoảng 30.000 chất kháng
sinh bán tổng hợp, nhưng chỉ có 1-2% chất kháng sinh tổng số này là có đủ
tiêu chuẩn sử dụng trong y học [21]. Trong số các vi sinh vật có khả năng
sinh chất kháng sinh thì xạ khuẩn là nhóm có tiềm năng lớn chiếm tới 80%
số chất kháng sinh đã được mô tả. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng
minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Trong
tương lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ được tìm
ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã được
nghiên cứu cho tới nay đều thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus.
Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu đối với các nhà nghiên cứu đó là sự
xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh. Pseudomonas aeruginosa và
Staphylococcus aureus là 2 trong số các vi khuẩn nguy hiểm nhất hiện nay.
1

Chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các bệnh nhiễm
khuẩn: viêm phổi, viêm phế quản, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết,
nhiễm khuẩn vết mổ… Đồng thời, tỷ lệ kháng kháng sinh của 2 chủng này
ngày càng tăng cao. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng
thuốc và sự thiếu hụt các kháng sinh mới làm cho chúng ta đang phải đối
mặt với “thời kì hậu kháng sinh”. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành
công nghiệp sản xuất chất kháng sinh là: một mặt cải biến các chất kháng
sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu
để tìm ra các chất kháng sinh mới.
Thái Nguyên là một trong những vùng đất có nguồn vi sinh vật phong
phú, đặc biệt có nhiều nhóm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh. Xuất phát từ
những yêu cầu thực tế trên, từ những chủng xạ khuẩn đã được phân lập ở
Thái Nguyên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và tìm
hiểu tính chất của chất kháng sinh có nguồn gốc từ một số chủng xạ
khuẩn phân lập ở Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm dung môi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng sinh từ hai
chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28.
- Xác định một số tính chất của chất kháng sinh từ hai chủng HT17.8
và HT28.
3. Nội dung nghiên cứu
- Kiểm tra mức độ ổn định về HTKS của các chủng nghiên cứu.
- Xác định môi trường lên men kháng sinh thích hợp cho chủng HT17.8.
- Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối và dịch ngoại bào bằng các
dung môi hữu cơ.
- Xác định khả năng bền trong pH của chất kháng sinh.
- Xác định khả năng bền với nhiệt độ của chất kháng sinh.
2

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay thì xạ khuẩn thuộc ngành
Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn
chuẩn (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Procaryota).
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10
dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài đã được công bố
thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được
xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, và trong các hợp
chất hữu cơ có sẵn, thậm chí trong cả những cơ chất mà vi khuẩn và nấm không
phát triển được. Nhưng chủ yếu phân bố nhiều ở trong đất. Xạ khuẩn có vai trò
quan trọng trong tự nhiên, chúng tham gia vào các quá trình phân hủy, chuyển
hóa các chất trong đất. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:
độ ẩm, thành phần của đất, mức độ canh tác và thảm thực vật… Đất giàu hữu cơ,
khoáng và lớp bề mặt có nhiều mùn thường có nhiều xạ khuẩn hơn. Xạ khuẩn
sinh trưởng và phát triển tốt là 25- 280C, độ ẩm thích hợp đối với xạ khuẩn
khoảng 40- 55%, pH trung tính hoặc kiềm yếu, axit yếu, giới hạn pH trong
khoảng 6,8- 7,5. Ở những nơi có pH axit hoặc kiềm thường có rất ít xạ khuẩn,
đặc biệt ở những nơi quá kiềm thì XK càng hiếm. Theo Waksman, trong 1gam đất
có khoảng 29.000- 2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9- 45% tổng số vi sinh vật [26].
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh. Theo nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng
60- 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng này và chủ yếu thuộc chi
Streptomyces [2, 6]. Trong số đó đã có rất nhiều chất kháng sinh đã và đang
được sử dụng trong y học để điều tra các bệnh nhiễm trùng.

3


1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty rất phát triển giống như hệ sợi của nấm.
Đường kính khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2- 1,0 µm đến 2- 3 µm.
Khuẩn ty của xạ khuẩn phân nhánh, không có vách ngăn và không bị đứt
đoạn. Màu sắc của khuẩn ty rất phong phú, có thể gặp các màu: trắng, vàng,
nâu, đỏ, lục, lam, tím,…
Khi nuôi cấy trên môi trường đặc, khuẩn ty của xạ khuẩn phát triển
thành hai loại: Một loại cắm sâu vào môi trường để lấy nước và thức ăn gọi
là khuẩn ty cơ chất với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển
trên bề mặt thạch gọi là khuẩn ty khí sinh có chức năng chính là sinh sản.
Người ta còn gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với
khuẩn ty sơ cấp là loại khuẩn ty bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm.
Khuẩn ty khí sinh thường có dạng vôi, lông tơ hay bột mịn với rất nhiều màu
sắc và hình dạng khác nhau, có loại màu lục, nâu, trắng, đen,… Ở đa số xạ
khuẩn, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng
tròn đồng tâm, vì thế loại vi sinh vật này có tên gọi là xạ khuẩn [5, 11].
Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, làm cho
bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh
thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường [23].
Khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đặc biệt, không trơn ướt như khuẩn lạc của
vi khuẩn và nấm men mà thường chắc, xù xì có dạng thô ráp, dạng phấn
hoặc vôi, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc
xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…
Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loại xạ khuẩn và tuỳ vào điều kiện
nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc trung bình từ 0,5 – 2 mm [20]. Khuẩn lạc
có ba lớp: Lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp,
lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh

học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất
4


kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ,… có thể được tích lũy
trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường
lên men [8].
Tế bào xạ khuẩn có cấu tạo tương tự như tế bào vi khuẩn. Dưới kính
hiển vi điện tử có thể thấy rõ các thành phần của tế bào: thành tế bào, màng
nguyên sinh chất, tế bào chất, chất nhân và các hạt dự trữ.
Thành tế bào xạ khuẩn có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20 nm.
Thành phần chủ yếu là peptidoglycan tạo nên một lớp vách tế bào tương đối
vững chắc giúp duy trì khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Đây là thành phần quan trọng
để phân biệt với vi khuẩn Gram (-). Thành tế bào có cấu tạo gồm 3 lớp, lớp
ngoài dày từ 60 – 120A0, lớp giữa rắn và chắc hơn dày khoảng 50A0, lớp trong
dày khoảng 50A0. Thành tế bào cho phép các chất kháng sinh, axit amin, nhiều
hợp chất khác kể cả những hợp chất có kích thước lớn như protein, dextran đi
qua một cách dễ dàng. Bên cạnh đó thành tế bào còn cho phép các chất dinh
dưỡng từ môi trường ngoài cũng được thẩm thấu có chọn lọc qua màng. Bên
ngoài thành tế bào còn có lớp vỏ nhày (capsule) được cấu tạo từ polixacarit và
thường rất mỏng, ở một số xạ khuẩn lớp vỏ nhày được tạo thành trong quá
trình hình thành bào tử [8, 11].
Màng sinh chất có độ dày từ 7-9 nm được cấu tạo bởi 2 lớp
photpholipit (PL), chiếm khoảng 30-40% khối lượng và các protein nằm
phía trong, phía ngoài hay xuyên qua màng chiếm 60-70% khối lượng. Mỗi
phân tử PL chứa một đầu tích điện phân cực (đầu photphat) và một đuôi
không tích điện, không phân cực (đầu hidrocacbon). Đầu phân cực tan trong
nước nằm phía trong. Đầu photphat còn gọi là đầu ưa nước còn đầu
hidrocacbon còn gọi là đầu kị nước. Các PL trong màng làm màng hóa lỏng
và cho phép các protein di động tự do. Sự hóa lỏng động học này là cần thiết

cho các chức năng của màng. Cách sắp xếp của PL và protein như vậy gọi là
mô hình khảm lỏng [5].
Tế bào chất của xạ khuẩn có chứa một số thành phần chủ yếu như
5


meroxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat và
polixacarit. Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển hình, chỉ là
những NST không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1 NST sau
đó thành những hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty [23].
Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử. Bào tử được hình thành trên sợi khuẩn
ty khí sinh chuyên hóa gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của xạ
khuẩn có nhiều loại hình dáng và kích thước khác nhau: Thẳng, lượn sóng,
xoắn, mọc đơn, mọc vòng. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn là một trong
những đặc điểm rất quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Hình dạng của bào tử
xạ khuẩn rất khác nhau, có thể gặp các dạng hình tròn, hình ô van, hình que,
hình trụ,… Trên mỗi cuống sinh bào tử thường mang từ 30 – 100 bào tử có
khi nhiều hơn, hoặc chỉ mang 1 – 2 bào tử.
Bề mặt của bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai,
có lông. Nhìn chung trong cùng một loài, hình dạng bảo tử xạ khuẩn tương
đối ổn định. Vì vậy có thể xem đây là một trong những đặc điểm quan trọng
để phân loại xạ khuẩn.
1.2. Đại cương về chất kháng sinh
1.2.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ là bất kì sản phẩm vi sinh nào mà
ngay ở nồng độ thấp (µm/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh
vật khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…) một cách chọn lọc [25]. Thuật
ngữ antibiotic bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, còn “bios” là sự
sống. Tuy nhiên, thuật ngữ này đã không phản ánh đúng tính chất của chất
kháng sinh. Đã có rất nhiều định nghĩa khác nhau về chất kháng sinh. Theo

Waksman, chất kháng sinh là các chất hóa học do vi sinh vật sinh ra, có khả
năng ức chế hoặc phân hủy các tế bào vi khuẩn và các vi sinh vật khác.
Ngày nay, chất kháng sinh được coi là những chất đặc hiệu do sinh vật sinh
ra trong quá trình sống mà ngay ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế
hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác một cách có chọn lọc. Tuy nhiên, hiện nay
6


do việc sử dụng các hợp chất quinolon – là các hợp chất hóa học không có
nguồn gốc từ vi sinh vật để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đã mở rộng định
nghĩa về chất kháng sinh trong y học hiện đại. Các chất kháng sinh không
chỉ bao gồm các chất có nguồn gốc từ vi sinh vật mà còn bao gồm cả các
chất kháng sinh bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần.
Năm 1928, Alexander Fleming (1881 – 1955) phát hiện ra penixillin –
một chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium có khả năng ức chế sự
phát triển của tụ cầu vàng – Staphylococcus aureus. Nhưng phải hơn 10 năm
sau, vào năm 1940, một nhóm các nhà khoa học mới tách chiết thành công
được chế phẩm Penicillin. Kể từ đó, Penicillin mới chính thức được dùng
làm thuốc đi chữa bệnh cho người, đẩy lùi được nhiều bệnh nhiễm trùng
nguy hiểm. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của thế kỷ XX.
Cùng với việc phát hiện ra Penicillin, thập kỷ 40, 50 của thế kỷ XX
cũng ghi nhận những bước tiến vượt bậc trong việc khám phá ra hàng loạt
chất kháng sinh mới có giá trị trong y học như Streptomycin (Waksman,
1940), Cloramphenicol (Erhlich, 1947), Chlotetraxyclin (Dugar, 1948),…
Tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh.
Nhiều Trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp
tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các chất
kháng sinh mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn. Năm 1945 phát hiện
được 30 CKS, năm 1949 con số này là 150 CKS, năm 1953 xấp xỉ 450 CKS,
năm 1980 có 5.500 chất và đến nay số lượng chất kháng sinh được phát hiện

lên tới 17.000 chất và khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp [8,16].
Tuy nhiên, trong số đó chỉ có 1- 2% chất kháng sinh là có đủ tiêu chuẩn để
được sử dụng trong y học.
Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu chất kháng sinh là GS. Đặng
Văn Ngữ. Ông đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium và xạ khuẩn Streptomyces
griseus để rửa các vết thương cho thương binh trong chiến dịch Đông Xuân
1951 – 1952.
7


Tiếp theo, năm 1968, một đơn vị nghiên cứu về chất kháng sinh ở trường
Đại học Dược Khoa Hà Nội đã được thành lập do GS. Trương Công Quyền
phụ trách. Tại đây đã phân lập được hàng nghìn chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất
khác nhau. Đáng chú ý là đã tuyển chọn được một chủng thuộc nhóm Hồng
có khả năng chống vi khuẩn gram âm, có hiệu quả tốt đối với vi khuẩn gây
bệnh mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa). Kháng sinh này lấy tên là
Dekamycin và sau này được xác định là Neomycin.
Từ năm 1974, tại Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam) đã có một nhóm nghiên cứu về chất kháng sinh.
Nhiều chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh có hoạt tính mạnh đã được ứng
dụng trong bảo vệ thực vật. Một số chế phẩm kháng sinh như: tetravit,
biovit, baxitraxin,… đã được sản xuất và đưa vào sử dụng trong chăn nuôi.
Năm 2004, Tổng công ty Hóa chất và Tổng công ty Dược đã có dự án
hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất cephalosporin nguyên liệu với công
suất 300 tấn/năm (thay thế dự án xây dựng nhà máy sản xuất penixilin
nguyên liệu 1000 tấn/năm) [18].
1.2.2. Đặc tính chung của các chất kháng sinh
Chất kháng sinh do vi sinh vật sinh ra nên có đặc tính trước hết là
chống vi khuẩn. Có loại kháng sinh được vi sinh vật tiết ra môi trường xung
quanh như Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin, loại khác lại được tích lũy

ở trong tế bào vi sinh vật và chỉ được giải phóng ra sau khi phá vỡ tế bào
như Gramycidin, Prodigiozin.
Các chất kháng sinh rất đa dạng về thành phần hóa học, chúng có thể
có cấu tạo mạch vòng, dị vòng, vòng thơm, có thể là axit, kiềm, polypeptit.
Nghiên cứu bản chất hóa học của chất kháng sinh là rất cần thiết vì có thể
hiểu rõ được cơ chế tác dụng của chất kháng sinh, biết được con đường tổng
hợp chúng.
Khi ở điều kiện phát triển tối ưu thì các chủng vi sinh vật tích lũy
8


chất kháng sinh là cực đại. Như vậy, trong công nghiệp sản xuất chất kháng
sinh, muốn tạo được nhiều sản phẩm thì phải tạo môi trường tối ưu.
Các chất kháng sinh khác nhau có tính chất lý hóa khác nhau, như: độ
hòa tan trong dung môi, khả năng bền vững với axit, kiềm, nhiệt độ,…
Nghiên cứu những tính chất này có ý nghĩa trong việc xác định được phương
pháp tách chiết, cô đặc, tinh sạch các chất kháng sinh. Độ hòa tan của các
chất kháng sinh rất khác nhau trong các dung môi, có loại hòa tan tốt trong
nước, trong cồn, trong dung môi lipit, có loại chỉ hòa tan trong một số dung
môi nhất định.
Khả năng bền vững với nhiệt độ của các chất kháng sinh cũng rất
khác nhau, có loại bị phân hủy nhanh ở nhiệt độ phòng như penicillin.
Nhưng cũng có loại rất bền với nhiệt độ, ở 60 0C thậm chí 1000C vẫn không
bị mất hoạt tính như streptomixin, tetracyclin, chloramphenicol. Tính chất
này được ứng dụng trong sản xuất các chất kháng sinh.
Các chất kháng sinh hòa tan trong huyết thanh và trong dịch mô mà vẫn
không bị mất hoạt tính. Đặc tính này của chất kháng sinh rất có ý nghĩa trong y học.
Độ độc của chất kháng sinh đối với cơ thể bậc cao cũng rất khác nhau.
Đa số các chất kháng sinh từ vi sinh vật thì ngoài tính kháng khuẩn còn gây
độc cho cơ thể bậc cao. Ví dụ: chloramphenicol dùng nhiều và lâu sẽ gây suy

tủy, tetracyclin dùng nhiều và lâu sẽ gây ảnh hưởng đến gan. Một số chất
kháng sinh khác có độ độc trung bình, cho nên chỉ được dùng để điều trị các
vết thương tại chỗ.
Một trong những đặc tính nổi bật của chất kháng sinh là có tác động
chọn lọc đối với vi sinh vật. Vì vậy không thể có chất kháng sinh nào có thể
tác động lên tất cả các vi sinh vật.
1.2.3. Cơ chế tác động của chất kháng sinh
Cơ chế tác động của chất kháng sinh là những cách thức mà chất
kháng sinh tác động lên các vị trí đích khác nhau trong tế bào qua đó ảnh
9


hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Cơ chế tác động của chất kháng
sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học và nồng độ của chất kháng sinh.
Không thể có một cơ chế chung cho sự tác động của chất kháng sinh lên
tế bào vi sinh vật. Nhìn chung cơ chế tác động của chất kháng sinh được
biểu hiện theo các hướng cơ bản sau:
* Ức chế tổng hợp thành tế bào
Thành tế bào được cấu trúc chủ yếu bởi thành phần peptidoglycan
(PG), có chức năng giữ hình dạng đặc trưng cho tế bào, bảo vệ cho tế bào
khỏi vỡ dưới áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào. PG là một đại phân
tử cấu tạo bởi các chuỗi polisaccarit bao gồm các đơn phân là hai loại dẫn
xuất của glucoza nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAG –
NAM). Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị
PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào. Phần
lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức
chế quá trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptit của tiểu phần
NAM. Nổi bật nhất giữa các chất này là các kháng sinh ß-lactam mà đại diện
là penixillin và cephalosporin. Đây là các chất có vùng chức năng là các
vòng ß-lactam. Các kháng sinh ß-lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng

cách gắn với transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết
chéo giữa các chuỗi PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn
sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn. Các penixillin không thấm qua được
màng ngoài của vi khuẩn Gr (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất
thấp. Tuy nhiên các penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp
có thể vượt qua màng ngoài vi khuẩn Gr (-).
Một số chất kháng sinh khác như vancomycin ức chế sự hình thành
thành tế bào theo cách cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-Dalanin liên kết tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gr (+).
* Phá hủy màng sinh chất
Thuộc nhóm này bao gồm có các kháng sinh: colistin, polymyxin,
10


amphotericin. Các kháng sinh này phá hủy màng sinh chất bằng cách gắn
với ergosterol hay cholesterol là thành phần của màng sinh chất, tạo nên các
lỗ trên màng và làm thất thoát nội chất ra ngoài dẫn tới gây chết tế bào.
Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng
đề kháng với amphoterixin B. Tuy nhiên chúng có thể bị phá hủy bởi
polymixin. Kháng sinh này gắn vào thành phần photpholipit màng, làm thay
đổi cấu trúc màng, dẫn tới làm rò rỉ một số chất của tế bào [7].

• Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Thuộc nhóm này có khoảng gần 70 chất kháng sinh đã được nghiên
cứu. Trong số đó có: streptomycin. gentamycin, neomycin, các tetracyclin,
cloramphenicol, erythromycin,… Các kháng sinh nhóm aminoglycoside gắn
vào tiểu phần 30s của riboxom làm biến dạng tiểu phần này và gây ra quá
trình dịch mã không chính xác dẫn đến tổng hợp nên những protein bất
thường. Các kháng sinh nhóm tetracyclin gắn vào tiểu phần 30s ngăn cản sự
gắn các axit amin vào chuỗi polypeptit đang được kéo dài. Chloramphenicol
gắn với tiểu phần 50s của ribosom ức chế enzim peptidyltransferase, ngăn

cản việc gắn kết các axit amin mới vào chuỗi peptit mới. Các kháng sinh
nhóm macrolide gắn với tiểu phần 50s của ribosom, ngăn cản sự dịch
chuyển của ribosom từ codon này tới codon kế tiếp, kết quả là quá trình dịch
mã bị cản trở và sự tổng hợp protein bị dừng lại.
* Ức chế tổng hợp axit nucleic
Axit nucleic (ADN, ARN) là các đại phân tử sinh học không thể
thiếu đối với sự sống của tế bào. Một số chất kháng sinh đã cản trở quá
trình tổng hợp axit nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức
chế sao chép hoặc dừng phiên mã [10]. Do không thể tổng hợp vật chất di
truyền nên các vi sinh vật gây bệnh không thể sinh sản và duy trì nòi
giống được.
Hiện nay người ta đã biết rõ khoảng 20 chất phá hủy trao đổi chất và
ức chế tổng hợp ARN, 26 chất ức chế trao đổi hoặc tổng hợp ADN [10].
11


* Ức chế trao đổi chất
Các chất kháng sinh theo cơ chế này có cấu trúc gần giống với các
chất trao đổi bình thường nên được coi là các chất kháng trao đổi. Chúng
sẽ cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzym với các chất trao đổi bình
thường làm cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bị ức chế.
Các kháng sinh thuộc nhóm này có: sunfonamit, trimethoprim… có cơ
chế hoạt động như một chất kháng trao đổi. Các chất kháng trao đổi rất có
giá trị trong y học vì chúng chỉ có tác dụng ức chế lên tế bào vi sinh vật mà
không có tác dụng lên tế bào của người.
1.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh. Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế
giới, có hơn 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [4]. Hầu hết các chất kháng
sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Trong số đó đã

có rất nhiều chất đã và đang được sử dụng trong y học để điều trị các bệnh
nhiễm trùng.
Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn
gốc từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các vi khuẩn
Gr (-) khá mạnh. Streptomycin được sử dụng rất có hiệu quả để điều trị
các bệnh dịch hạch, ho gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chứa
các bệnh lao [5].
12


Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ
khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả các vi
khuẩn Gr (-) và Gr (+). Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng
lại với penixilin và streptomycin [5].
Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea,
có phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả vi khuẩn Gr (+) như tụ cầu,
phế cầu đã kháng lại penixilin và vi khuẩn Gr (-) như màng não cầu, lậu cầu.
Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [5].
Tetracyclin: Là các kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số
chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ
kháng sinh rộng, chống được cả các vi khuẩn Gr (+), Gr (-), ricketsia và một
vài loài vi rút lớn. Ngoài sử dụng trong y học, tetracyclin còn được sử dụng
trong chăn nuôi - thú y [2, 5].
Chloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces
venezuelae, được phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống lại được nhiều
loài vi khuẩn Gr (+), Gr (-). Ngoài sử dụng trong y học, chất kháng sinh này
còn được dùng trong chăn nuôi – thú y và thủy sản [17].
Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus, là

13

chất kháng sinh có phổ rộng đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử
dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do mycoplasma và viêm họng
do liên cầu khuẩn [4,17].
Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và
Streptomyces niveus, có hoạt tính mạnh đối với vi khuẩn Gr (+). Đặc biệt có
khả năng chống các tụ cầu đã kháng với penixilin và một số CKS khác [14].
Vancomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces orientaliss,
được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, đặc
biệt là các liên cầu, tụ cầu và phế cầu [17].
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
• Điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển và khả
năng tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn. Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt ở
28- 300C, nhiệt độ tối ưu cho tổng hợp CKS nằm trong khoảng 18- 300C [18].
* pH môi trường: Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất lớn vào
pH môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là pH
trung tính, pH axit hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [9].
* Độ thông khí: Xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu cầu thông khí
cao hơn so với các sinh vật khác nhất là trong giai đoạn nhân giống
(khoảng từ giờ thứ 6- 12 của quá trình nuôi cấy). Do đó yếu tố thông khí có
ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh [9].
* Tuổi giống: Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh còn phụ thuộc
14


vào tuổi sinh lý và chất lượng bào tử của xạ khuẩn. Tuổi của xạ khuẩn cho
hiệu suất cao nhất là 24 giờ. Lượng giống cấy truyền khoảng 2-10%.
• Thành phần môi trường lên men

* Nguồn cacbon: Cacbon là nguyên tố có mặt ở hầu hết các chất
trong cơ thể xạ khuẩn cũng như trong các sản phẩm trao đổi chất, do vậy
các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành
chất kháng sinh. Đối với xạ khuẩn nguồn cacbon thích hợp nhất thường
là tinh bột, ngoài ra còn sử dụng các loại đường như: glucose, fructose,
maltose,…[13].
* Nguồn nitơ: Nitơ là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được
trong quá trình sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh của xạ khuẩn.
Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là các hợp chất từ thực vật như bột đậu
tương. Nguồn nitơ vô cơ là các muối amoni, muối nitrat.
* Nguồn photpho vô cơ: Photpho là yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp
chất kháng sinh. Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic
trong tế bào, rút ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dưỡng [24].
* Các nguyên tố vi lượng: Là một trong các thành phần không thể
thiếu được trong môi trường lên men làm thay đổi đáng kể khả năng tổng
hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn.
1.2.6. Tách chiết chất kháng sinh
Phần lớn các chủng sản sinh kháng sinh và tiết ra môi trường xung
quanh, nhưng có một số chủng chỉ tiết một phần vào môi trường còn chủ yếu
là vẫn nằm trong sinh khối. Tuy nhiên cũng có những chủng, chất kháng
sinh chỉ được tích tụ ở trong sinh khối. Để lựa chọn được phương pháp tách
15


chiết chất kháng sinh phù hợp phải dựa vào bản chất hoá học của các chất
kháng sinh. Các chất kháng sinh có thể tan trong nước hoặc tan trong các
dung môi hữu cơ. Đối với các chất tan trong dung môi hữu cơ dễ tinh sạch
hơn so với tan trong nước. Thông thường, nếu kháng sinh nằm trong dịch
nuôi cấy có thể lựa chọn các phương pháp: chiết rút bằng các dung môi
không hỗn hợp với nước, kết tủa thành dạng hợp chất không hoà tan hoặc

hấp phụ bằng nhựa trao đổi ion, còn nếu chất kháng sinh nằm trong sinh
khối tế bào có thể chiết rút bằng các dung môi hữu cơ. Trước khi tiến hành
chiết rút kháng sinh ra khỏi môi trường nuôi cấy, cần phải loại sinh khối tế
bào ra khỏi dịch nuôi bằng phương pháp lọc hay ly tâm.
Khi sử dụng phương pháp lọc để loại sinh khối, một điều cần lưu ý là
pH của dịch nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến việc chất kháng sinh đi ra môi
trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối nhiều. Ví dụ, nếu pH của dịch nuôi
cấy chủng Streptomyces rimosus thấp (axit), kháng sinh oxytetracyclin đi ra
môi trường nhiều, ngược lại nếu pH kiềm thì kháng sinh lại tích tụ trong
sinh khối nhiều hơn [15]. Đối với các dịch lên men có độ nhớt cao thường
gây khó khăn cho quá trình lọc, vì vậy để khắc phục, người ta thường bổ
sung một số chất trợ lọc giúp cho quá trình lọc diễn ra tốt hơn.
Phương pháp ly tâm không những loại được sinh khối mà còn loại bỏ
được các chất không có lợi ra khỏi dịch nuôi cấy. Tốc độ ly tâm được sử
dụng với mục đích này là 15.000 vòng/phút.
• Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối
Trước khi tách chiết, cần phải rửa sinh khối bằng nước để loại bỏ các
thành phần của môi trường. Chiết rút là phương pháp thích hợp nhất để tách
chiết chất kháng sinh ra khỏi sinh khối tế bào. Hiệu quả tách chiết phụ thuộc
vào khả năng hoà tan của chất kháng sinh trong dung môi chiết. Các dung
môi hữu cơ dùng để tách chiết chất kháng sinh có thể là: butanol, metanol,
etyl axetat, axeton,… Trong đó, methanol là dung môi thường được sử dụng
để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối rất có hiệu quả.
16


• Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc
Các chất kháng sinh có trọng lượng phân tử thấp thường hoà tan trong
nước và trong dung môi hữu cơ. Để tách chiết có hiệu quả cần phải lựa chọn
các loại dung môi hoà tan chất kháng sinh và có thể bổ sung một số chất

như: axit oleic, axit palmitic,… vào dịch lọc để làm tăng khả năng hoà tan
của chất kháng sinh. Dung môi có chứa chất kháng sinh được cô ở điều kiện
chân không và nhiệt độ thấp (dưới 60oC) để loại bỏ dung môi.
Chất kháng sinh thô nhận được từ dịch lọc hay sinh khối được làm
sạch hoá học bằng cách cô đặc và loại bỏ tạp chất. Điểm đáng chú ý là các
chất kháng sinh thường bị mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao, axit và
kiềm cao. Do vậy, khi tách chiết và tinh sạch, phải sử dụng các điều kiện
thích hợp sao cho chất kháng sinh giữ được hoạt tính.
• Phương pháp cơ bản để tinh sạch chất kháng sinh
Phương pháp chiết rút: phương pháp này làm sạch kháng sinh nhiều
lần bằng chiết dung môi, sau đó kết tủa và tinh chế.
Phương pháp hấp thụ trao đổi ion: phương pháp này dựa trên bản
chất hoá học của chất kháng sinh là axit, kiếm hay là hợp chất vô định hình
được hấp phụ trên nhựa trao đổi ion mang điện tích dương hay âm, dạng
cationit hay anionit trong cột, sau đó sử dụng dung dịch để thôi kháng sinh
khỏi nhựa ion. Dung dịch kháng sinh nhận được sẽ có độ sạch hơn.
Phương pháp kết tủa: phương pháp này dựa trên bản chất hoá học của
chất kháng sinh là chất hữu cơ hay vô cơ có thể kết tủa. Chất kết tủa nhận
được bằng cách lọc hay ly tâm. Sau khi sấy khô nhận được chất kháng sinh
ở dạng bột tinh sạch hơn.
• Tinh chế chất kháng sinh
Để chất kháng sinh có độ tinh khiết cao hơn cần sử dụng phương
pháp kết tinh. Đây là phương pháp quan trọng nhất để tinh chế các hợp
chất ở dạng rắn. Sự kết tinh có thể thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ
hay bằng cách thay đổi hệ dung môi. Dung môi chứa các vệt chất kháng sinh
cuối cùng của các quá trình kết tinh có thể loại bỏ bằng cách cô chân không.
17


Các phương pháp: sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng hay sắc ký lỏng cao áp

là những phương pháp tinh chế chất kháng sinh rất có hiệu quả.
1.3. Một vài nét về hai chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28
 Chủng HT28
Chủng HT28 là một trong số các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh
có hoạt tính cao, đã được phân lập từ đất Thái Nguyên. Chủng HT28 đã
được định tên khoa học là Streptomyces cinereoruber subp. HT28 và nghiên
cứu một số đặc điểm sinh học.
•

Đặc điểm hình thái

Chủng HT28 có cuống sinh bào tử dạng thẳng (RF), bề mặt bào tử
nhẵn, số lượng bào tử trên một chuỗi là 20-45 (hình 1.1).

(Độ phóng đại 1000 lần)

( Độ phóng đại 15000)

Hình 1.1. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng HT28
•

Đặc điểm nuôi cấy

Chủng HT28 có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường Gause 1.
Trên môi trường này hệ khuẩn ty khí sinh hình thành sớm hơn, màu sắc rõ
ràng và có màu xám, không có khả năng sinh sắc tố hòa tan. HT28 có khả
năng hình thành sắc tố melanin.
•

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

18


Chủng HT28 có khả năng sinh các enzym ngoại bào: amylase,
cellulase và protease. Là chủng ít ưa mặn (chịu được nồng độ muối tối đa là
5%), sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 20 – 40 0C, sinh trưởng tốt nhất
trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 350C. Chúng sinh trưởng tốt trên môi trường
trung tính hoặc hơi axit (6,5 – 7). Còn pH thích hợp nhất cho quá trình sinh
tổng hợp chất kháng sinh của chủng là pH trung tính [12].
 Chủng HT17.8
Chủng HT17.8 mới được phân lập từ đất Hà Thượng – Đại Từ - Thái
Nguyên. Theo kết quả tuyển chọn sơ bộ và sàng lọc, chủng HT17.8 cũng là
một trong số các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, có hoạt phổ rộng.
Ngoài khả năng kháng được cả hai nhóm vi khuẩn Gr (+) và Gr (-) còn có
khả năng kháng nấm.
1.4. Ứng dụng của chất kháng sinh ngoài lĩnh vực y học
Chất kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học để chữa bệnh
cho con người mà còn được ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khác
như: bảo vệ thực vật, chăn nuôi, bảo quản thực phẩm,…
Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng để phòng chữa bệnh và kích
thích tăng trọng cho gia súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi có tác dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi
khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm
cho chúng khỏe mạnh tăng trưởng tốt. Rất nhiều chất kháng sinh được dùng
với mục đích này như tetracyclin, bacitraxin, monelzin,… Ở Việt Nam, năm
1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở quy mô 12 tấn / năm. Kết
quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng 15-25%, giảm tiêu tốn
thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5-7% [1].
Hiện nay việc dùng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật vẫn là phổ
biến nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học lại gây ra những tác

hại không nhỏ đến môi trường và sức khỏa con người. Để khắc phục những
19


nhược điểm trên thì việc sử dụng các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật
vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một
hoặc một số sâu bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến những loài có ích
khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có khả năng ức chế cả các vi sinh vật
đã kháng thuốc hóa học. Các kháng sinh được ứng dụng để tiêu diệt các nấm
và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa
(calydamyxin, blasticidin S, kasugamyxin,…) bệnh thối cổ rễ ở các cây có
củ,… Ngoài ra chất kháng sinh còn được sử dụng làm chất kích thích tăng
trưởng ở những nồng độ nhất định như kích thích nảy mầm ở hạt. Việc sử
dụng các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật ngày càng được phổ biến
rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ.
Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng Streptomyces sp. 5406 có
khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum gây thối rễ
ở bông non [13]. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces
sp. 201 có khả năng sinh chất kháng sinh mới là z – methylheptyl iso nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng lại nhiều loại nấm gây
bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum,
Fusarium moniliforme. Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học – Đại học
Quốc gia Hà Nội đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. LD30
có khả năng ức chế được vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây bệnh
héo lá ở cây trồng [3]. Năm 2008, 2 chủng xạ khuẩn Actinomyces
brunneofungus Đ1 và Streptomyces misawaensis R2 có hoạt tính kháng nấm
mạnh, đặc biệt là có khả năng kháng được các chủng nấm gây bệnh trên chè
cũng đã được phân lập ở Thái Nguyên [8].
Bên cạnh đó chất kháng sinh còn được sử dụng để bảo quản thực
phẩm. Dùng kháng sinh để bảo quản thực phẩm vừa rẻ vừa đơn giản, vừa
không cần trang thiết bị đặc biệt nhưng vẫn đảm bảo chất lượng thực phẩm

cho nên vào những năm 1960 nhiều nước trên thế giới đã sử dụng rộng rãi
các loại kháng sinh để bảo quản thịt, cá tươi và ướp lạnh các sản phẩm chế
biến từ cá, thịt… Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảo
20


quản thực phẩm như: clotetraciclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Các
chất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để
tác động lên cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh
trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó
phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm
cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc,
làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị. Vì vậy để khắc phục tồn
tại trên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải
tuân theo đúng nguyên tắc. Nên ưu điểm sử dụng các chất kháng sinh ít hoặc
không được dùng trong y học như nisin. Ngày nay rất nhiều nước đã sản
xuất những chất kháng sinh chuyên dùng cho mục đích này.

21


Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Xạ khuẩn
Hai chủng xạ khuẩn là HT17.8 và Streptomyces cineveoruber subp.
HT28 do Khoa Khoa học sự sống – Trường Đại học Khoa học cung cấp.
Đây là hai trong số các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh được
tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu. Chủng được bảo quản và giữ giống trong

môi trường Gause 1.
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định
Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 do Viện Kiểm
nghiệm – Bộ Y tế cung cấp.
Chủng được bảo quản và giữ giống trong môi trường MPA.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Hóa chất
- Các loại dung môi hữu cơ: axeton, n-butanol, iso butanol, etyl axetat, npropanol, metanol, etanol, axit axetic, benzen, cloroform,…
- Các loại muối: NaCl, KNO3, CaCO3, K2HPO4, MgSO4,…
- Các loại cao: cao thịt, pepton, cao nấm men,…
- Các loại hóa chất khác: tinh bột, thạch, casein,…
2.2.2. Dụng cụ
- Tủ ấm, tủ sấy (Đức), tủ lạnh

- Máy li tâm Hettich (Đức)

- Cân phân tích, cân kĩ thuật

- Box cấy vô trùng (Mỹ)

- Nồi khử trùng (Đài Loan)

- Máy lắc (Hàn Quốc)

- Lò vi sóng Sharp

- Máy cất nước một lần Hamilton

- Các dụng cụ thủy tinh của Việt Nam, Trung Quốc, Đức,….
22

2.3. Môi trường nghiên cứu (g/l)
 Môi trường Gause 1
- Tinh bột tan:
- NaCl :
- KNO3:
- MgSO4.7H2O:

20
0,5
1
0,5

- K2HPO4:
0,5
- FeSO4:
0,01
- Thạch:
20
- Nước máy vừa đủ 1 lít
- pH = 6,8 ÷ 7

 Môi trường MPA
- Cao thịt:
- NaCl:
- Pepton:

3
5

10

- Thạch:
20
- Nước máy vừa đủ 1 lít
- pH = 7

 Môi trường A – 4
- Glucose:
10
- Bột đậu tương: 10
- NaCl:
5

- CaCO3:
1
- Nước máy vừa đủ 1 lít
- pH = 7

 Môi trường A – 4H
- Glucose:
15
- Bột đậu tương: 15
- NaCl:
5

- CaCO3:
1
- Nước máy vừa đủ 1 lít
- pH = 7

 Môi trường Gause 2
- Cao thịt:
- Pepton:
- NaCl:

3
5
5

- Glucose:
10
- Thạch:
20
- Nước máy vừa đủ 1 lít
- pH = 7 ÷ 7,4

 Môi trường 79
- Glucose:
- Pepton:
- Cazein thủy phân:
- Cao nấm men:

10
10
2
2

- NaCl:
6

- K2HPO4: 0,2
- Thạch: 20
- Nước máy vừa đủ 1 lít
- pH = 7 ÷ 7,4
23


2.4. Các phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp giữ giống
Hai chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28 được nuôi trên môi trường
thạch nghiêng (môi trường Gause 1). Sau 5 ÷ 7 ngày nuôi cấy, kiểm tra các
ống giống, loại bỏ các ống bị nhiễm, sau đó bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt
độ 30C ÷ 50C. Cấy chuyển giống định kì mỗi tháng một lần. Trước khi sử
dụng phải cấy truyền sang ống thạch mới để hoạt hóa giống [5].
2.4.2. Phương pháp lên men xạ khuẩn tạo kháng sinh
Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản là: A – 4; A - 4H;
Gause 1; Gause 2; 79. Sau 96 giờ nuôi trên máy 220 vòng/ phút ở nhiệt độ
phòng. Xác định HTKS của dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ để chọn
ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [9].
2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh
* Phương pháp khối thạch [6, 7]
Đây là phương pháp để sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh.
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause l hoặc Gause 2, sau
5 ÷ 7 ngày, khi xạ khuẩn mọc tốt dùng khoan nút chai khoan các thỏi
thạch đặt vào đĩa petri đã cấy sẵn vi sinh vật kiểm định. Sau đó đặt vào tủ
lạnh 40C trong vòng 4 ÷ 5 giờ để chất kháng sinh kịp khuếch tán rồi nuôi ở
nhiệt độ ấm 28 ÷ 300C. Đọc kết quả sau 24 giờ đối với vi khuẩn, 3 ngày đối
với nấm kiểm định.
Hoạt tính kháng sinh được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn:
D-d (mm) trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính thỏi

thạch. Các vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy trên môi trường MPA.
* Phương pháp đục lỗ
Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn trong
dung dịch. Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường lên men thích hợp trên
24


máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ 28 ÷ 30 0C, sau 120 giờ lấy ra đem li
tâm ở 5000v/p trong 10 phút để thu dịch kháng sinh thô. Dùng khoan nút
chai khoan các lỗ trên bề mặt thạch đã cấy vi khuẩn ở hộp petri, nhỏ vào
mỗi lỗ thạch 0,1 ml dịch nuôi cấy cần thử. Các bước tiếp theo giống như
phương pháp khối thạch.
2.4.4. Phương pháp tách chiết chất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
* Phương pháp tách chiết CKS từ sinh khối bằng dung môi hữu cơ
Sau khi lên men trong 5÷7 ngày, dịch nuôi cấy và sinh khối được tách
riêng. Phần sinh khối được tách bằng các loại dung môi khác nhau với tỉ lệ
chiết là 1:1 theo đơn vị thể tích/ thể tích. Hỗn hợp dung môi sinh khối này
được lắc 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm loại sinh khối. Cuối cùng
dung môi chiết được thử hoạt tính kháng sinh trên vi sinh vật kiểm định
bằng phương pháp đục lỗ thạch.
* Phương pháp tách chiết CKS từ dịch ngoại bào bằng dung môi hữu cơ
Dịch lên men sau khi loại sinh khối có thể được tách bằng các loại
dung môi hữu cơ khác nhau như n- butanol, etyl axetat... tỷ lệ giữa dịch
chiết và dung môi là 1:1 theo đơn vị thể tích/ thể tích. Hỗn hợp dịch lên
men và dung môi được lắc ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thử hoạt
tính kháng sinh trong dung môi chiết trên vi sinh vật kiểm định bằng
phương pháp đục lỗ thạch.
2.4.5. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng sinh
* Phương pháp xác định khả năng bền trong pH của chất kháng sinh
Xạ khuẩn được nuôi lắc trong môi trường lên men thích hợp sau

5÷7 ngày tiến hành ly tâm thu dịch lên men. Dịch lên men được chỉnh pH
theo các pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 bằng NaOH 0,5M và CH 3COOH 0,4M và
giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó chỉnh tiếp dịch lên men có các
mức pH trên về pH = 7 rồi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng
phương pháp đục lỗ thạch.
25