Nghiên cứu phát hiện một số glucocorticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu băng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ QUY

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ
GLUCOCORTICOID TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ QUY

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ
GLUCOCORTICOID TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60 73 15
Người hướng dẫn khoa học: TS. Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI, NĂM 2012


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn
Cao Sơn, người thầy đã tận tình hướng dẫn trực tiếp, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám giám hiệu, phòng quản lý đào tạo sau
đại học, bộ môn hóa phân tích và các thày cô giáo trường Đại học Dược Hà nội đã
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường cũng như quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Trịnh Văn Lẩu, Thạc sỹ Phạm Thị
Giảng là những người đã giúp đỡ, tạo các điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
học tập và làm luận văn.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sỹ Nguyễn Tuấn Anh, người đã
giúp đỡ tôi rất tận tình và cho tôi những góp ý chân thành trong thời gian tôi thực
hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám đốc và các bạn đồng nghiệp Khoa kiểm
nghiệm đông dược-dược liệu- Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương đã giúp đỡ tôi
rất nhiều để tôi có thể hoàn thành tốt khóa học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012
DS Trịnh Thị Quy

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. VÀI NÉT VỀ GLUCOCORTICOID ......................................................................... 3

1.1.1. Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các Glucocorticoid. ...............3
1.1.2. Đặc tính của các glucocorticoid nghiên cứu Dexamethason .................... 4
1.1.3. Các phương pháp định tính định lượng glucocorticoid .............................5
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU ....................................................................... 6

1.2.1. Phương pháp chiết trực tiếp .......................................................................6
1.2.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng......................................................................6
1.2.3. Phương pháp chiết pha rắn .........................................................................6
1.3. Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao ................................................................. 10

1.3.1. Khái niệm .................................................................................................10
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng ...........................................................................12
1.3.3. Ứng dụng ..................................................................................................15
1.4. THỰC TRẠNG THUỐC ĐÔNG DƯỢC TRỘN TÂN DƯỢC .............................. 16

1.4.1. Vài nét về thuốc đông dược .....................................................................16
1.4.2. Tình hình thuốc đông dược bị trộn trái phép tân dược ............................17
1.4.3. Nghiên cứu phát hiện glucocorticoid ở trong nước .................................19
1.4.4. Nghiên cứu phát hiện glucocorticoid ở ngoài nước .................................19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................23

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.................................................................................. 23

2.1.1. Xây dựng đối tượng nghiên cứu...............................................................23
2.1.2. Chuẩn bị đối tượng nghiên cứu ................................................................23


2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................................. 24

2.2.1. Hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn ..............................................................24
2.2.2. Thiết bị- dụng cụ ......................................................................................24
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 26

2.3.1. Khảo sát phương pháp chiết .....................................................................26

2.3.1.1. Khảo sát chiết trực tiếp: ..............................................................26
2.3.1.2. Khảo sát chiết lỏng - lỏng: ..........................................................26
2.3.1.3. Khảo sát chiết SPE: .....................................................................26
2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc ký .......................................................................26
2.3.3. Đánh giá phương pháp .............................................................................26
2.3.4. Áp dụng trên một số mẫu chế phẩm đông dược ......................................27
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................29
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ................................................. 29

3.1.1. Chiết trực tiếp ...........................................................................................29
3.1.2. Chiết lỏng lỏng .........................................................................................31
3.1.3. Chiết pha rắn ............................................................................................33
3.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ........................................................................ 36
3.3. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ...................................................................................... 36
3.4. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP ................................................................................. 37

3.4.1. Khảo sát độ đặc hiệu ................................................................................37
3.4.2. Khảo sát tính tuyến tính ...........................................................................42
3.4.3. Khảo sát độ đúng ......................................................................................44
3.4.4. Khảo sát độ chính xác ..............................................................................48

3.4.4.1. Độ lặp lại .....................................................................................48
3.4.4.2. Độ chính xác trung gian: .............................................................50
3.4.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .......................52
3.4.5.1. Giới hạn phát hiện (LOD) ...........................................................52
3.4.5.2. Giới hạn định lượng (LOQ) ........................................................57
3.5. ÁP DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU THỬ ....................................................58
3.5.1. Chuẩn bị mẫu thử .....................................................................................58
3.5.2. Kết quả phân tích các mẫu thử .................................................................60


Chương 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................65
4.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH........................... 65
4.2. KÊT QUẢ ÁP DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MỘT SỐ MẪU THUỐC ĐÔNG
DƯỢC ............................................................................................................................. 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................69


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

C8

Octyl

C18

Octadecyl

DAD

Diode array Detector (detector chuỗi Diod)

GC-MS

Gas Chromatography- Mass Spectrometry (Sắc ký khí khối phổ)

HLB

Hydrophilic Lipophilic Balance

HPLC

High Perform Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HPLC-MS

High Perform Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (Sắc ký
lỏng khối phổ)

IR

Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại)

RSD

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SI

Similarity index (Hệ số tương đồng)

SKĐ

Sắc ký đồ

SPE

Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)

UFLC

Ultra Fast Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu nhanh)

UV – VIS

Ultraviolet and Visible absorption Spectrophotometry (Phổ hấp thụ
tử ngoại khả kiến)

USP 34

The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34)

YHCT

Y học cổ truyền

BP 2010

The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010)


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Một số loại pha tĩnh thường dùng trong SPE .............................................8
Bảng 1.2: Lựa chọn pha tĩnh thường dùng trong SPE ................................................9
Bảng 1.3: Một số phương pháp chiết glucocorticoid của một số tác giả ..................21
Bảng 1.4: Một số chương trình sắc ký của một số tác giả ........................................22
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát chiết trực tiếp ................................................................30
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chiết lỏng lỏng ..............................................................32
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát chiết SPE:......................................................................35
Bảng 3.4: Kết quả so phổ các mẫu thử......................................................................41
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của dexamethason, prednisolon acetat và
dexamethason acetat ................................................................................42
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason trên nền mẫu 1 ............44
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng đối với prednisolon acetat trên nền mẫu 1 ......45

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason acetat trên nền mẫu 1 ..45
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason trên nền mẫu 2 ............46
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng đối với prednisolon acetat trên nền mẫu 2 ....47
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason acetat trên nền mẫu 2 .... 47
Bảng 3.12: Kết quả độ thích hợp của hệ thống .........................................................48
Bảng 3.13: Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu thử 1 ....................................................49
Bảng 3.14: Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu thử 2 ....................................................50
Bảng 3.15: Kết quả độ chính xác trung gian trên nền mẫu 1 ....................................51
Bảng 3.16: Kết quả độ chính xác trung gian trên nền mẫu 2 ....................................51
Bảng 3.17: Kết quả so sánh độ lặp lại giữa hai lần thử nghiệm................................52
Bảng 3.18: Kết quả giá trị đáp ứng của các glucocorticoid trong mẫu trắng 1 ........53
Bảng 3.19: Kết quả giá trị đáp ứng của các glucocorticoid trong mẫu trắng 2 ........55
Bảng 3.20: Các mẫu thuốc được phân tích ...............................................................59
Bảng 3.21: Kết quả phân tích một số mẫu thuốc ......................................................62


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

Hình 1.1: Công thức hóa học của dexamethason...................................................4
Hình 1.2: Công thức hóa học của Prednisolon acetat ............................................4
Hình 1.3: Công thức hóa học của dexamethason aceatat ......................................5
Hình 1.4: Cột SPE ..................................................................................................7
Hình 1.5: Quá trình chiết pha rắn.........................................................................10
Hình 1.6: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................................11
Hình 2.1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu.................................................25

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chiết trực tiếp .......................................................30
Hình 3.2: Sắc ký đồ khảo sát chiết lỏng lỏng ......................................................32
Hình 3.3: Sắc ký đồ khảo sát chiết SPE ...............................................................34
Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu ............................................................39
Hình 3.5: Phổ các chất nghiên cứu trong dung dịch chuẩn .................................40
Hình 3.6: Phổ các chất nghiên cứu trong dung dịch thử 1...................................40
Hình 3.7: Phổ các chất nghiên cứu trong dung dịch thử 2...................................41
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện tích
pic (mAU.s) ..........................................................................................43
Hình 3.9: SKĐ mẫu trắng 1 chứa 3 chất nghiên cứu ở nồng độ 2 µg/ml ............54
Hình 3.10: SKĐ mẫu trắng 2 chứa 3 chất nghiên cứu ở nồng độ 2 µg/ml ..........55
Hình 3.11: SKĐ mẫu trắng chứa 3 chất nghiên cứu ở nồng độ LOD .................57
Hình 3.12: Sắc ký đồ một số mẫu phát hiện có glucocorticoid ...........................63


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xu hướng sử dụng thuốc đông dược trong điều trị bệnh đang gia tăng trong
nước cũng như trên thế giới, đặc biệt là các bệnh mãn tính như : thấp khớp, hen phế
quản, gout.... do thuốc đông dược dễ uống, ít tác dụng không mong muốn. Tuy
nhiên trên thực tế, nhiều cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền (YHCT) thậm chí
nhiều nhà sản xuất lớn đã lén lút (trái phép) trộn thêm các loại tân dược hoặc chất
cấm vào để tăng hiệu quả tức thời, cố tình lờ đi những biến cố nguy hiểm mà người
bệnh có thể mắc phải khi dùng các sản phẩm này.
Các tân dược được trộn thêm gồm nhiều nhóm khác nhau, trong đó đáng chú
ý là: nhóm thuốc tăng cường sinh lý, thuốc giảm béo, thuốc giảm đau hạ sốt, thuốc
chống viêm, thuốc điều trị tiểu đường… [8], [20], [24].
Tại diễn đàn Hòa hợp YHCT khu vực Châu Á – Tây Thái Bình Dương
(Forum in Herbal medicines Harmonisation, FHH) tổ chức tại Hà nội 11/2011, đã
nhìn nhận vấn đề trộn trái phép tân dược vào chế phẩm đông dược là hiểm họa lớn.
Tất cả các sản phẩm này được coi là thuốc giả, lưu hành ở tất cả các nước trong khu

vực và trên thế giới. Từ tháng 11/2009 – 10/2011, đã ghi nhận tai biến ở 28 sản
phẩm với 81 trường hợp tại 3 khu vực Hồng Kông, Nhật Bản và Singapore. Hội
nghị phòng chống thuốc giả toàn cầu (London, 5/2011) và Hội nghị phòng chống
thuốc giả của các nước thuộc diễn đàn hợp tác kinh tế APEC (Bắc Kinh, 9/2011),
cũng có báo cáo nhấn mạnh phải có biện pháp kỹ thuật và kiểm soát chặt chẽ các
sản phẩm này.
Nhóm glucocorticoid là thuốc chống dị ứng, chống viêm mạnh với nhiều tác
dụng phụ, khoảng điều trị hẹp, cần được bác sỹ kê đơn và phải theo dõi khi dùng [4],
[9], [16]. Các chất này rất hay được trộn một cách khéo léo và tinh vi : (ví dụ trộn tân
dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc…) vào thuốc đông
dược có chỉ định điều trị thấp khớp, hen phế quản, gout… hay thuốc bổ do tác dụng
nhanh, mạnh và tác dụng không mong muốn gây tích nước, béo phì giả tạo.

1


Ở nước ta, Bộ y tế đã có công văn đình chỉ lưu hành hai mẫu thuốc: Tân hòa
truy phong tê thấp thủy năm 2009 và Hạnh đức khu phong tê thấp thủy vào năm
2010 do các thuốc này đã trộn trái phép betamethasone [13]. Ngoài ra còn có rất
nhiều chế phẩm khác được phát hiện có tân dược như: Mẫu thuốc bột định xuyễn
của Trung Quốc có Prednisolone acetat, Tăng phì hoàn của Đài loan, Nam liên truy
phong thấu cốt hoàn của Trung Quốc có dexamethasone acetat [22], [24], [36]. Viện
kiểm nghiệm thuốc trung ương đã phân tích một số mẫu thuốc đông dược có nghi
ngờ trộn tân dược do bệnh nhân hay bác sỹ điều trị gửi tới. Kết quả cho thấy phần
lớn các mẫu này có chứa các glucocorticoid, trong đó hay gặp là prednisolone
acetate, dexamethasone và dexamethasone acetat...
Phương pháp phát hiện các chất thuộc nhóm glucocorticoid hiện nay được áp
dụng cho dạng kem bôi da, thuốc bột, thuốc hoàn [12], [20], [22], [24], [33], chủ
yếu ở mức độ sàng lọc, định tính. Trong khi đó, việc xác định hàm lượng các chất
này trộn trái phép trong thuốc đông dược rất cần thiết. Trên thực tế các phương

pháp trên cũng không thể áp dụng cho thuốc nước do kỹ thuật chiết tách cũng như
phân tích trên nền mẫu thuốc nước phức tạp hơn. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:
« Nghiên cứu phát hiện một số glucocorticoid trộn trái phép trong chế phẩm
đông dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao »
với mục tiêu :
-

Xây dựng được phương pháp phát hiện dexamethason, prednisolon
acetat, dexamethason acetat trong chế phẩm đông dược dạng thuốc nước
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD.

-

Áp dụng phương pháp xây dựng được trên một số chế phẩm đông dược
dạng thuốc nước có nghi ngờ trên thị trường.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. VÀI NÉT VỀ GLUCOCORTICOID
1.1.1. Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các Glucocorticoid.
Hormon vỏ thượng thận gồm 3 loại: mineralcorticoid có tác dụng trao đổi
chủ yếu lên chất khoáng, glucocorticoid có tác dụng chủ yếu lên trao đổi hydrat
carbon và các steroid sinh dục. Glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận
sản xuất ra gồm 2 chất là hydrocortison và cortison. Glucocorticoid tổng hợp gồm
rất nhiều chất khác nhau được nghiên cứu biến đổi công thức để cải thiện tác dụng,
kéo dài thời gian tác dụng và giảm tác dụng phụ [10].
Tác dụng của glucocorticoid: Ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân
bằng nội môi, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác

của cơ thể: Tác dụng trên chuyển hóa, trên các cơ quan và tuyến,… Trong đó tác
dụng chống viêm, chống dị ứng hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn
tính như: thấp khớp, hen phế quản, viêm xoang... [4], [6], [9].
Tác dụng không mong muốn của glucocorticoid: phù, loét dạ dày tá tràng,
suy thượng thận, tác dụng trên sự tăng trưởng của trẻ em,…Những tác dụng này
thường gặp ở những người dùng thuốc lâu dài hoặc dùng quá liều. Một số tác dụng
không mong muốn hay gặp:
- Gây suy tuyến thượng thận: do khi dùng thuốc glucocorticoid từ ngoài vào
cơ thể sẽ làm ức chế tuyến thượng thận bài tiết, dẫn đến tình trạng suy giảm khả
năng bài tiết glucocorticoid của chính cơ thể người đó. Lúc đó cơ thể hay mệt mỏi,
nôn ói, nặng hơn nữa có thể gây huyết áp thấp hay tụt huyết áp.
- Tăng cân do giữ muối nước, cơ thể bệnh nhân mập ra, bụng to, chân tay
teo lại, da mỏng dễ bầm máu, nứt da bụng...
- Loét dạ dày tá tràng.
- Loãng xương: uống corticoid lâu ngày làm cho xương bị mỏng dần nên rất
dễ bị gãy xương.
- Thai kỳ: có thể gây hại cho thai.
- Làm trẻ em chậm phát triển chiều cao, dẫn đến bị lùn.

3


Chỉ định của corticoid: Điều trị thay thế khi vỏ thượng thận không tiết đủ
hormon, bệnh tự miến, dị ứng, shock phản vệ, hen phế quản, viêm cơ khớp, viêm
da,…
Liều dùng của glucocorticoid: Liều dùng glucocorticoid dao động rộng từ
0,5-20mg/ lần tùy thuộc tác dụng của thuốc và mục đích điều trị [4], [6], [9].
1.1.2. Đặc tính của các glucocorticoid nghiên cứu.
Dexamethason C22H29FO5

[4],[5],[10],[28],[29]

Dexamethason là 9-fluoro-11b, 17, 21-trihydroxy-16a-methylpregna-1,4- diene3,20-dione
-

Tính chất: Không tan trong nước,
ít tan trong ethanol, hơi tan trong
methylen clorid, tan trong aceton

-

Liều dùng: 0,5-10mg/ ngày

Hình 1.1: Công thức hóa học của dexamethason
Prednisolon acetat C23H30O6 [5],[10],[28],[29]
Prednisolon acetat là 11b, 17-dihydroxy-3,20-dioxopregna,-1,4-dien-21-yl acetate
-

Tính tan: không tan
trong nước, hơi tan
trong

ethanol

và

methylen clorid.
-

Liều dùng: 5- 60 mg/

ngày
Hình 1.2: Công thức hóa học của Prednisolon acetat

4


Dexamethason acetat C24H31FO6
Dexamethason

acetat

là

[5],[10],[28],[29]

9-fluoro-11b,17

-

dihydroxy-16a-methyl-3,20-

dioxopregna-1,4-dien-21-yl acetate
-

Tính chất: Không tan trong nước,
tan tự do trong aceton, cồn, hơi tan
trong methylen clorid.

-

Liều dùng trung bình: 0,5-10mg/
ngày
Hình 1.3: Công thức hóa học của dexamethason aceatat

1.1.3. Các phương pháp định tính định lượng glucocorticoid
- Định tính
+ Đo phổ hấp thụ UV VIS: Hòa tan mẫu hoặc tạo màu thích hợp, so với phổ
của chất chuẩn. Phương pháp này chỉ áp dụng cho nguyên liệu và một số chế
phẩm có thành phần đơn giản [5], [10], [28].
+ Đo phổ hấp thụ hồng ngoại: so với phổ của chất chuẩn. Phương pháp này áp
dụng cho nguyên liệu, đa số chế phẩm không áp dụng được [5], [10], [28].
+ Sắc ký lớp mỏng: Do đặc tính hấp thụ quang của các glucocorticoid, đa số
các chất thuộc nhóm này được chiết và phân tích bằng sắc ký lớp mỏng, hiện
vết dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm hoặc phun thuốc thử hiện màu
thích hợp [5],[10],[28],[29].
- Định lượng:
+ Dạng nguyên liệu, dạng viên nén, thuốc tiêm: Đo độ hấp thụ tử ngoại

[5],

[10], [28], [29].
+ Dạng thuốc kem: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [28], [29].
+ Dạng thuốc nước: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lớp mỏng
điều chế và đo phổ hấp thụ tử ngoại [28], [29].
- Xác định tạp chất liên quan: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [5], [28],
[29].

5

1.2.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU

1.2.1. Phương pháp chiết trực tiếp
- Chiết trực tiếp với dung môi hữu cơ là phương pháp chiết phổ biến nhất
trong kiểm nghiệm thuốc nhằm hòa tan dược chất. Tùy vào độ tan của dược chất và
tính chất của dung môi mà người ta lựa chọn cách hòa tan như ngâm, khuấy, lắc cơ
học, lắc siêu âm… Khi chiết trực tiếp, còn có thể thay đổi thời gian chiết, nhiệt
độ… để tăng hiệu suất chiết [8].
- Phương pháp chiết trực tiếp thường được áp dụng cho các mẫu dạng rắn:
thuốc bột, thuốc viên, dược liệu… hoặc dạng bán rắn như thuốc kem, thuốc mỡ.
1.2.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng
- Là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang
dung môi thứ hai không đồng tan với môi thứ nhất, cất thu hồi dung môi thu được
chất phân tích. Tùy vào bản chất chất phân tích và mục đích nghiên cứu có thể chiết
dạng phân tử hay chiết cặp ion, chiết nội phức [3].
- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: độ tan của chất phân tích trong
dung môi, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hòa tan khác trong dung dịch.
- Ứng dụng: Chiết lỏng lỏng được áp dụng khá phổ biến trong kiểm nghiệm
các dạng thuốc dạng dung dịch như: thuốc nước, siro, rượu thuốc… hay các mẫu dịch
sinh học như máu, nước tiểu… Ngoài ra, đối với mẫu phân tích dạng rắn, người ta
chuyển vào pha nước rồi chiết lỏng lỏng tách các nhóm chất, tinh chế dịch chiết.
1.2.3. Phương pháp chiết pha rắn
- Là quá trình tách một chất từ hệ phức tạp bằng một chất rắn được gọi là
chất liên kết (sorbant). Bước tiếp theo là rửa giải chất đó bằng một dung môi hữu
cơ. Các tài liệu tiếng anh gọi là SPE (Solid phase extraction). Kỹ thuật này đã được
sử dụng từ lâu để tinh chế dịch chiết trong chiết xuất lỏng - lỏng. Công nghệ tiên
tiến đã tạo ra nhiều chất liên kết chọn lọc, hiệu quả nên trong vài thập kỷ qua SPE
ngày càng được ứng dụng rộng rãi. SPE không chỉ được dùng độc lập mà còn được

cài đặt vào các hệ GC/MS, HPLC/MS tạo thành một hệ phân tích tự động hoàn
chỉnh (online-method) [2], [3].

6


Ngy nay SPE c ỏp dng rng rói chit tỏch, tinh ch, lm giu mu,
c bit hiu qu cho cỏc mu dch sinh hc, phõn tớch vi lng, mụi trng [3],
[15], [19].
Mt s loi ct v pha tnh thng dựng

Thân cột chiết bằng
thuỷ tinh hoặc
polypropylen

Thõn ct:Thng lm bng thy tinh hoc cht do
tinh khit chu dung mụi (polypropylen), cú dng
hỡnh tr. Ct rng c mụ t th tớch v chiu di

Mng lọc
bằng PTFE

Pha tĩnh

thõn ct, cng cú khi c mụ t ng kớnh trong
(ID) ca thõn v th tớch ct
Hỡnh 1.4: Ct SPE
Pha tnh: Tng t trong sc ký lng, pha tnh dựng trong chit pha rn cú 3 dng:
pha thun, pha o v trao i ion. Ngoi ra ngi ta cng dựng than hot tớnh, cht
nhi HLB hay dng hn hp cht nhi pha o vi trao i ion nhi vo ct SPE

[15], [19]. Mt s loi pha tnh thng dựng c ghi trong bng 1.1

7


Bảng 1.1: Một số loại pha tĩnh thường dùng trong SPE
Pha tĩnh (cơ chế tương tác)

Bản chất hóa học

Pha thuận

Silica gel (hấp phụ)

-Si-OH

x

Florisil® (hấp phụ)

Magnesi silicat

x

Alumina (hấp phụ)

Nhôm oxyd

x

Amin, NH2 (phân bố)

x
Si

x
Si

SAX (trao đổi anion)

x

x
Si

Phenyl (phân bố)

x

(CH2)3CN

Diol (phân bố)

C18 (phân bố)

(CH2)3CH

CH2

OH

OH

Si

(CH2)7CH3

Si

(CH2)17CH3

x
x
x

Si

Si

x

(CH2)3N+(CH3)3

SCX (trao đổi cation)

x
SO3-H+

Si (CH2)2
HLB

Trao đổi ion

(CH2)3NH2

Nitril, CN (phân bố)

C8 (phân bố)

Pha đảo

Styrene polymer

x

Lượng pha tĩnh trong cột thường là 50 mg, 100mg, 200mg, 500mg, 1g, 2g, 5g và 10g.
※ Cơ chế chiết: Tương tự sắc ký lỏng [15], [19], [41].
Hấp phụ (pha thuận): Sử dụng ngay các nhóm chức trên bề mặt nguyên liệu hấp
phụ. Về cơ bản, sử dụng các điều kiện sắc ký pha thuận. Chất hấp phụ hay được
dùng nhất là silica gel, magnesi silicat (Florisil®), nhôm oxyd.
Phân bố trên pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ đã thay đổi, được gắn thêm các
nhóm chức hoá học khác nhau tạo ra cơ chế chiết theo kiểu sắc ký phân bố. Kiểu
pha thuận: pha tĩnh phân cực giữ lại các chất phân tích (hoặc/và tạp chất) phân cực,
cho phép các chất phân tích không (hoặc/và tạp chất) phân cực đi qua cột. Kiểu này

8


thường sử dụng các dung môi ít hoặc không phân cực. Kiểu pha đảo: pha tĩnh
không phân cực, kiểu này ngược lại với kiểu trên, dung môi sử dụng thường có độ

phân cực nhất định.
Trao đổi ion: Bề mặt chất hấp phụ được gắn với các nhóm chức có thể ion hoá. Cơ
chế tách chiết tương tự sắc ký trao đổi ion.

※ Thực hành chiết, làm sạch và làm giàu mẫu thường qua 5 bước [40], [41], [42].
X Chọn loại cột pha rắn: Tùy thuộc kiểu chiết như mô tả ở trên, thể tích mẫu, mức

độ tạp chất, mà chọn cột có thể tích, lượng và loại pha tĩnh khác nhau. (bảng 1.2)
Bảng 1.2: Lựa chọn pha tĩnh thường dùng trong SPE
Mẫu
thử

Dung dịch nước
(dịch sinh học, nước, dịch chiết nước,..)

Pha hữu cơ
(dịch chiết hữu cơ,chất tan hòa trong
nhexan, chloroform,….)

___________|_________________ ________________|__________
|____________________________| |__________________________|
Cơ chế

Phađảo

Tính
chất:

Phân cực trung bình đến
không phân cực

Pha
tĩnh:

DSC-18
DSC-18Lt
DSC-8
DSC-Ph
DSC-CN
DPA-6S
HybridSPE-PL

Trao đổi ion

Pha thuận

cation / anion cation/ anion Phân cực trung bình đến
yếu
mạnh
phân cực

DSC-SAX
DSC-SCX

DSC-WCX
DSC-NH2

DSC-Si
DSC-CN
DSC-Diol

DSC-NH2

Y Luyện cột: Luyện cột chiết pha rắn nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu

cần chiết và loại một số tạp chất còn ở trên cột.
Z Chuyển mẫu vào cột chiết: Chuyển mẫu chiết lên cột, sau đó sử dụng áp suất

giảm hoặc áp lực đẩy hoặc để mẫu tự chảy bằng áp lực tỷ trọng.
[

Rửa:Nếu chất quan tâm lưu trên cột, rửa tạp chất không lưu bằng dung dịch đã
dùng để chuẩn bị mẫu hoặc bằng một dung dịch khác mà nó không rửa giải chất
quan tâm.

9


\

Rửa giải:Sử dụng lượng nhỏ dung môi hữu cơ mà nó chỉ rửa giải hay chiết các
hợp chất quan tâm và để lại tạp chất không loại được trong quá trình rửa.

Hình 1.5: Quá trình chiết pha rắn
™ Áp dụng và ưu, nhược điểm:Một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật SPE để chiết và
làm sạch hóa chất bảo vệ thực vật từ mẫu dược liệu.So sánh với các kỹ thuật
chiết lỏng- lỏng truyền thống, SPE đơn giản, thuận tiện hơn, và dễ dàng hơn

để tự động hóa. Lợi thế của SPE là: (1) Lượng dung môi hữu cơ sử dụng ít
hơn so với chiết lỏng lỏng. Điều này đặc biệt có ý nghĩa, đặc biệt đối với
những dung môi độc hại như chloroform, toluen; (2) thao tác đơn giản, không

tốn thời gian và không cần xử lý mẫu trước khi chiết; (3) độ thu hồi và lặp lại
tốt; (4) có thể tự động hóa. Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn tương đối đắt, kỹ thuật
SPE chưa được phổ biến rộng rãi, do đó phương pháp này chưa được áp dụng
rộng rãi ở Việt Nam.
1.3.

Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao. [1],[5],[11]

1.3.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách

10


dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion hay loại trừ theo kích cỡ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định
lượng trong phân tích kiểm nghiệm. Ra đời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát triển
và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một
phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là
một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một
chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các
nhóm hữu cơ.
Trong HPLC, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được đi vào cột
nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh chứa
trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ.

Hình 1.6: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Pha tĩnh hay dùng nhất trong HPLC là pha tĩnh mà trong đó các nhóm silanol

trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa học khác
nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết:

|

|

– Si – O – Si – R
|

11

|


Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động
phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là dung
môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC
được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau. Cột thông dụng là
cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10μm. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm
dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UFLC) vào ứng
dụng rộng rãi. Trong UFLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 - 2,2μm)
và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm).
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các
chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa
giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt. Pha động có hai loại phân cực và ít
phân cực thường dùng cho sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận. Tuy nhiên pha động
một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường
phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao

phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là
rửa giải gradient dung môi.
Có nhiều loại detector khác nhau như detector tử ngoại - khả kiến (UVVIS),tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối (MS)...
trong đó detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương
trình đã đặt trong một quá trình sắc ký.

Detector này có một hoặc hai mảng diod

để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser. Quang phổ và sắc ký
đồ có thể hiển thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng
máy tính. Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và
thời gian.
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng
- Thời gian lưu (tR): là thời gian cần thiết để một chất tan dịch chuyển từ lúc
nó được nạp vào đầu cột sắc ký đến thời điểm được phát hiện ở nồng độ cực đại
(Cmax). Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan

12


trong điều kiện sắc ký nhất định. Để định tính, người ta so sánh thời gian lưu của
pic chất tan trên sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của pic chất chuẩn
trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Với detector DAD, có thể so phổ của chất phân
tích với chất chuẩn ở nhiều bước sóng cùng lúc để định tính.
- Hệ số phân bố K: Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh Cs và trong
pha động Cm tại thời điểm cân bằng.

K=

Cs

Cm
Khi nồng độ chất tan không quá lớn thì K là một hằng số và phụ thuộc vào
bản chất hai pha và nhiệt độ. Đối với một chất K càng lớn thì nồng độ chất tan
trong pha tĩnh càng lớn vì vậy tR lớn và ngược lại.
-

Hệ số dung lượng k ’(Capacity factor): mô tả tốc độ di chuyển của một chất.

Ta có:

k’=

QSP

=

KD

QMP
Trong đó:

VSP

hoặc k’=

tR – t0

VMP

t0

QSP, QMP: lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động
VSP, VMP: thể tích lưu và thể tích chết của cột (thể tích pha
động có trong cột từ nơi tiêm mẫu đến detector)

Vậy k’ phụ thuộc bản chất 2 pha, chất phân tích, nhiệt độ và đặc điểm cột
(VSP/VMP). k’<<1 quá trình rửa giải nhanh nên khó xác định chính xác tR. Ngược lại
nếu k’ quá lớn (20 - 30) quá trình rửa giải quá dài. Thực tế chọn điều kiện phân tích
sao cho k’ = 1-5 là tối ưu.

- Hệ số chọn lọc α (Selectivity factor): là đại lượng đặc trưng cho tốc độ
di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.

α=

KB

=

KA

k’B
k’A

13

=

tR,B – t0

tR,A – t0


Theo quy ước: KB> KA → tR,B> tR,A nên α > 1.
α khác 1 càng nhiều thì thì khả năng tách càng rõ ràng (α từ 1,05 đến 2,0 là tối ưu).
-

Độ phân giải R (Resolution)

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta
thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 píc (píc
số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:

R

=
s

2(t R, B − t R, A)

W +W
B

=

A

1,18(t R, B − t R, A)

W

1/ 2B

+W 1/ 2 A

N
4

=

⎛ α − 1 ⎞⎛⎜ k 'B ⎞⎟
⎜
⎟
⎝ α ⎠⎜⎝ k 'B + 1 ⎟⎠

với: W là độ rộng đáy pic.
Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu
là R=1,0. Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp. Nếu R nhỏ thì các pic chưa
tách hẳn vì vậy khi tính diện tích pic sẽ không chính xác.
- Hệ số bất đối AF(assymetry factor)
AF = W 1 / 20
2a

Trong đó:
W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20.
a: khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của
pic ở 1/20 chiều cao.
Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ. Trong phép
định lượng thì yêu cầu AF nằm trong khoảng 0,8-2.
- Số đĩa lý thuyết N (Theoretical plates):là đại lượng biểu thị Hiệu lực của

cột sắc ký trong điều kiện sắc ký nhất định.
Có thể tính số đĩa lý thuyết N theo các công thức sau:
2

⎛t ⎞
N = 16 ⎜ R ⎟
⎝W ⎠

2

⎛ t R ⎞ hoặc
= 5,54 ⎜
⎟⎟
⎜
⎝ W 1/ 2 ⎠

2

h⎞
⎛
N = 2π .⎜ t R× ⎟
A⎠
⎝

14

2

h⎞
⎛

= 6,28 ⎜ t R× ⎟
A⎠
⎝


trong đó:

h: chiều cao pic

A: diện tích của pic.

Ngoài ra, người ta còn quan tâm tới hệ số match (một số phần mềm dùng
SI- similarity index) để đặc trưng cho mức độ tương đồng các pic khi so phổ đồ.
Khi giá trị này càng gần với 1 thì độ tương đồng càng cao
1.3.3. Ứng dụng
- Định tính:
Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn và thử là cơ sở của
phép thử định tính. Trên các máy HPLC hiện đại với detector diod array ta có thể vẽ
phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ với nhau để thấy sự giống
nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index)
- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn
- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao
- Hệ số Match > 0,900 thì chỉ ra 2 phổ tương tự.
- Hệ số Match < 0,900 thì chỉ ra 2 phổ khác nhau.
Hơn thế nữa, với detector khối phổ (MS) nhờ thư viện phổ mà không cần chất
chuẩn ta cũng có thể định tính được nếu như chất thử có mặt trong thư viện phổ này.
-

Định lượng

Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và pic thử (diện tích hoặc
chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép định lượng.
Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là:

-

Phương pháp dùng chuẩn ngoại

-

Phương pháp dùng chuẩn nội

-

Phương pháp thêm chất chuẩn

-

Phương pháp chuẩn hoá diện tích.

-

Thử tạp chất

15


Về cơ sở của cách thử tạp chất cũng giống như định lượng. Ngoài ra, đối
với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp
chất chuẩn thì có thể tính tỉ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic của tạp so với

hoạt chất.
1.4.

THỰC TRẠNG THUỐC ĐÔNG DƯỢC TRỘN TÂN DƯỢC

1.4.1. Vài nét về thuốc đông dược
Theo tổ chức y tế thế giới, thuốc đông dược là những chế phẩm được làm từ
thảo dược hay động vật được chế biến theo các phương pháp cổ truyền nhằm mục
đích phòng bệnh, chữa bệnh.
Ở nước ta, bên cạnh các cơ sở điều trị bằng YHCT (bắt mạch, kê đơn thuốc,
sử dụng thuốc thang), có nhiều cơ sở sản xuất thuốc đông dược với các dạng bào
chế tiện lợi như: Hoàn cứng, hoàn mềm, thuốc nang, thuốc nước, siro, rượu
thuốc,…Số đăng ký thuốc đông dược qua các năm tăng khá nhanh, chiếm khoảng
20% tổng số các thuốc được cấp số đăng ký. Ngoài ra, thực phẩm chức năng có
nguồn gốc thảo dược cũng phát triển mạnh mẽ. Chỉ định của các chế phẩm này rất
phong phú, từ các bệnh cấp tính, mãn tính đến thuốc bổ dưỡng, thực phẩm chức
năng, áp dụng cho nhiều đối tượng bệnh nhân ở các lứa tuổi khác nhau. Các thuốc
đông dược và thực phẩm chức năng lại được bán tự do không cần đơn. Đây là cơ
hội tốt cho người bệnh lựa chọn các sản phẩm để điều trị hiệu quả, tuy nhiên, cũng
là thách thức lớn cho các cơ quan quản lý chất lượng khi các cơ sở không thực hiện
tốt việc cam kết chất lượng.
Theo thống kê, số thuốc đông dược không đạt chất lượng tăng mạnh vào năm
2008, trong đó có một số mẫu trộn trái phép tân dược và được coi như thuốc giả.
Điều trị bệnh mãn tính như thấp khớp hay hen phế quản được nhiều người
tìm đến thuốc đông dược. Bệnh nhân có thể khám bệnh, bốc thuốc tại các cơ sở
hành nghề y học cổ truyền được cấp phép. Đôi khi họ cũng nghe mách bảo để điều
trị ở những cơ sở không có giấy phép, khi có vấn đề liên quan đến chất lượng thuốc
không đảm bảo, cơ quan chức năng gặp khó khăn trong xử lý. Ngoài ra có rất nhiều
dạng chế phẩm được bào chế ở dạng tiện dụng và bày bán ở các hiệu thuốc mà

16