Nghiên cứu định lượng đồng phân atenolol trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
PHÂN ATENOLOL TRONG CHẾ
PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
PHÂN ATENOLOL TRONG CHẾ
PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
ThS. Tạ Mạnh Hùng

HÀ NỘI 2012


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn
và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè.
Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới :
PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
ThS. Tạ Mạnh Hùng
Là 2 người thầy đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật
viên ở Phòng thí nghiệm trung tâm – Đại học Dược Hà Nội và trung tâm tương
đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, các thầy cô trong Ban
giám hiệu, Phòng đào tào cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ trong trường đại học
Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 09 năm 2012
Học viên

Nguyễn Thị Thu Hiền


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT, BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
PHẦN 1.TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1.VÀI NÉT VỀ ATENOLOL ............................................................................... 3
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất vật lý ............................................................. 3
1.1.2. Tác dụng dược lý của atenolol ....................................................................... 3
1.1.3. Phương pháp định tính, định lượng atenolol trong chế phẩm.......................... 5
1.1.3.1. Định tính ..................................................................................................... 5
1.1.3.2. Định lượng.................................................................................................. 5
1.2. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ......................................... 6
1.2.1. Khái niệm ...................................................................................................... 6
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ..................................................................... 6
1.2.3. Cấu tạo máy HPLC ........................................................................................ 7
1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký................................................... 8
1.2.5. Ứng dụng của HPLC...................................................................................... 9
1.2.5.1. Định tính ..................................................................................................... 9
1.2.5.2. Định lượng………………………………………………………………... 9
1.3. TÁCH, PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ VÀ ĐIỆN DI MAO QUẢN ...................................................................... 11
1.3.1. Đồng phân quang học .................................................................................... 11
1.3.2. Tác nhân chọn lọc hoạt quang ....................................................................... 11
1.3.3. Một số ứng dụng phân tích đồng phân quang học bằng HPLC ....................... 14
1.3.4. Ứng dụng CE trong phân tích đồng phân quang học ..................................... 16
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA
ATENOLOL ........................................................................................................... 16
1.4.1. Phương pháp HPLC ....................................................................................... 16
1.4.2. Phương pháp CE ............................................................................................ 17

PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .................................................................... 18
2.1.1. Hóa chất ........................................................................................................ 18
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................ 18
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 19
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện phân tích ................................................. 19
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................. 20
2.2.3. Ứng dụng ....................................................................................................... 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 22
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................... 22
2.3.1.1. Các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát ............................................................. 22
2.3.1.2. Xác định các điều kiện tách đồng phân quang học atenolol ......................... 24
2.3.1.3. Xử lý mẫu nghiên cứu ................................................................................. 24
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................. 25
2.3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống ............................................................................ 25
2.3.2.2. Tính chọn lọc .............................................................................................. 25
2.3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ......................................................................... 25
2.3.2.4. Độ chính xác của phương pháp ................................................................... 26
2.3.2.5. Độ đúng của phương pháp .......................................................................... 26
2.3.3. Định lượng đồng thời đồng phân quang học (R), (S)-atenolol trong mẫu thử . 26
2.3.4. Xử lý thống kê ............................................................................................... 26
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................27
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký với cột Ultron ES-OVM ........................................ 27
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký với cột Chiralcel AGP ........................................... 29
3.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký với cột Astec cyclobond I 2000 ............................ 33
3.1.4. Khảo sát điều kiện sắc ký với cột Chirex 3022 ............................................... 36
3.1.4.1. Lựa chọn thành phần, tỷ lệ pha động ........................................................... 36
3.1.4.2. Khảo sát và lựa chọn tốc độ dòng................................................................ 41

3.1.4.3. Khảo sát và lựa chọn nồng độ chất phân tích và thể tích tiêm mẫu .............. 41
3.1.4.4. Xác định bước sóng phân tích ..................................................................... 41
3.1.5. Lựa chọn điều kiện sắc ký.............................................................................. 42
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................................... 42
3.2.1. Xác định hàm lượng (R)- và (S)-atenolol trong chuẩn atenolol racemic ......... 42
3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký .................................................................... 43
3.2.3. Tính chọn lọc-đặc hiệu................................................................................... 45
3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính ............................................................................ 48
3.2.5. Độ lặp lại và tái lặp ........................................................................................ 50
3.2.6. Độ đúng ........................................................................................................ 53
3.3. Ứng dụng định lượng đồng phân quang học atenolol trong chế phẩm ............... 56
Phần 4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CE (capillary electrophoresis)

Điện di mao quản

HPLC (high performance liquid chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

CSP (Chiral stationary phase)
α1-AGP

Pha tĩnh chọn lọc hoạt
quang
α1-acid glycoprotein

HSA (Human serum albumin)

Albumin

huyết

thanh

người
BSA (Bovine serum albumin)

Albumin huyết thanh bò

CD

Cyclodextrin

SĐK

Số đăng ký

STT

Số thứ tự

S

Diện tích pic

PĐ

Pha động

DAD (diode array detector)

Detector mảng diod

LC/MS

(liquid

chromatography/mass

Sắc ký lỏng khối phổ

spectrometry)
TLC (thin layer chromatography)

Sắc ký lớp mỏng

SFC (super – critical fluid chromatograyphy)

Sắc ký lỏng siêu tới hạn

GC (Gas chromatography)

Sắc ký khí

TT

Thuốc thử

KLTB

Khối lượng trung bình

KL

Khối lượng

MeCN

Acetonitril


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình
1.1
1.2

Nội dung
Công thức cấu tạo của atenolol
Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic và nồng độ

Trang
3

10

Mô hình tương tác ba điểm.
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Ultron ES –
OVM với PĐ 1.1
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Ultron ES –
OVM với PĐ 1.2

12
28

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Ultron ES –
OVM với PĐ 1.3
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Ultron ESOVM với PĐ 1.4

28

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chiral AGP
với PĐ 2.1
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chiral AGP
với PĐ 2.2
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chiral AGP
với PĐ 2.3
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chiral AGP
với PĐ 2.4

30

3.9

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chiral AGP
với PĐ 2.5

32

3.10

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Astec
cyclobond I 2000 với PĐ 3.1
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Astec
cyclobond I 2000 với PĐ 3.2
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Astec
cyclobond I 2000 với PĐ 3.3

35

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chirex 3022
với PĐ 4.1
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chirex 3022

37

1.3
3.1
3.2
3.3
3.4

3.5
3.6

3.7
3.8

3.11
3.12

3.13
3.14

28

29

31
31
32

35
36

38


với PĐ 4.2
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20

3.21
3.23

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chirex 3022
với PĐ 4.3
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chirex 3022
với PĐ 4.4

38

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chirex 3022
với PĐ 4.5
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn atenolol sử dụng cột Chirex 3022
với PĐ 4.6
Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc –đặc hiệu của phương pháp

39

Kết quả chồng phổ UV các pic trong sắc ký đồ mẫu chuẩn
atenolol racemic
Đồ thị biểu diễn mỗi tương quan giữa diện tích pic và nồng
độ (S)-atenolol
Đồ thị biểu diễn mỗi tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
(R)-atenolol

47

39

40

46

49
49


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng

Nội dung

Trang

3.1

Kết quả sắc ký mẫu chuẩn racemic và chuẩn đơn thành phần

43

3.2

Kết quả hàm lượng (R)- và (S)-atenolol trong chuẩn racemic

43

(µg/mg)
3.3

Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký

44

3.4

Nồng độ và diện tích pic tương ứng của (S)-atenolol và (R)-

48

atenolol
3.5

Kết quả định lượng (R)-atenolol và (S)-atenolol (trong

51

ngày)
3.6

Kết quả định lượng (R)-atenolol và (S)-atenolol (khác

52

ngày)
3.7

Kết quả đánh giá thống kê độ lặp lại của phương pháp phân

53

tích

3.8

Kết quả định lượng (S)-atenolol và (R)-atenolol thẩm định

54

độ đúng
3.9

Kết quả khảo sát độ đúng với (S)-atenolol

54

3.10

Kết quả khảo sát độ đúng với (R)-atenolol

55

3.11

Kết quả định tính, định lượng atenolol trong một số thuốc trên
thị trường

56


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Nội dung

Sơ đồ

Trang

3.1

Khảo sát điều kiện sắc ký của cột Ultron ES-OVM

27

3.2

Khảo sát điều kiện sắc ký của cột Chiracel AGP

30

3.3

Khảo sát điều kiện sắc ký của cột Astec cyclobond I 2000

33

(sắc ký pha đảo)
3.4

Khảo sát điều kiện sắc ký của cột Astec cyclobond I 2000 (hệ
dung môi phân cực)

34

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, số lượng các hoạt chất được sử dụng tồn tại dưới dạng đồng phân
quang học chiếm một tỷ lệ lớn. Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng có sự
khác biệt lớn trong dược động học và dược lực học giữa các đồng phân của nhiều
hoạt chất ví dụ như nhóm chất ức chế β1-adrenergic (amlodipine, atenolol…), kháng
sinh quinolon (ofloxacin, gemifloxacin…) [4],[5]…Chính vì vậy mà các nhà sản
xuất bắt đầu chuyển hướng sản xuất thuốc chỉ chứa một đồng phân đối quang có tác
dụng.
Atenolol là dẫn chất của benzenacetamid, có tác động ức chế thụ thể βadrenergic với tác động chủ yếu lên thụ thể β1. Thuốc không có tác động ổn định
màng hay giống giao cảm nội tại, được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp, dự
phòng đau thắt ngực, loạn nhịp nhanh trên thất và nhồi máu cơ tim sớm. Trong công
thức phân tử có một nguyên tử carbon bất đối nên hợp chất này có 2 đồng phân
quang học (S- hoặc R- atenolol). Trên thị trường hiện nay, các chế phẩm thuốc
atenolol hầu hết gồm hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang ((R,S)-atenolol)
và đã có một số chế phẩm đơn đồng phân (S)-atenolol tuy nhiên chưa có mặt ở thị
trường Việt Nam. Mặc dù hai dạng đồng phân có cấu trúc hóa học tương tự nhau
nhưng khi vào cơ thể biểu hiện tác dụng khác nhau. Theo một số nghiên cứu về tác
dụng dược lý, dược động học của từng đồng phân và hỗn hợp racemic atenolol cho
thấy đồng phân (S)-atenolol đóng vai trò chính trong tác dụng điều trị tăng huyết áp
và đau thắt ngực. Một vài nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng (S)-atenolol có độc
tính thấp hơn (R)-atenolol [14],[19],[20]. Việc sản xuất và sử dụng các chế phẩm
chỉ chứa đồng phân (S)-atenolol ngày càng được chú trọng nhiều hơn. Vì vậy xác
định chính xác và định lượng các đồng phân atenolol trong hỗn hợp racemic nhận
được nhiều sự quan tâm và xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm atenolol cũng như
phương pháp thử tương đương sinh học atenolol được chú ý nhiều hơn.
Đã có một số công trình nghiên cứu trên thế giới về định lượng đồng thời các
đồng phân atenolol trong chế phẩm [11],[15],[16]. Phương pháp phân tích được sử
dụng nhiều nhất trong định lượng các đồng phân atenolol là HPLC. Tính đến nay
1

chưa có tác giả nào trong nước ta công bố phương pháp phân tích để giải quyết vấn
đề này. Để nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc của hệ thống kiểm nghiệm
cũng như hội nhập với xu hướng phát triển chung của ngành Dược trên thế giới
chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định lượng đồng phân atenolol trong chế
phẩm sắc ký lỏng hiệu năng cao” để thực hiện các mục tiêu sau :
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời các đồng phân
quang học atenolol trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Ứng dụng phương pháp này định lượng các chế phẩm trên thị trường có
chứa atenolol.

2


PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1.

VÀI NÉT VỀ ATENOLOL:

1.1.1.Công thức cấu tạo và tính chất vật lý [1]

*

Hình 1.1 : Công thức cấu tạo của Atenolol
- Công thức phân tử:

C14H22N2O3

- Trọng lượng phân tử:

266,3

- Tên khoa học:

2-[4-[(2RS)-2-hydroxy-3-[(1-metthylethyl)-amino]propoxy]-phenyl]-acetamid.

- Tính chất vật lý:

Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, hơi tan trong
nước, tan trong ethanol, khó tan trong methylen clorid.

1.1.2.Tác dụng dược lý của Atenolol [2]
a. Tác dụng và cơ chế:
- Atenolol có tác dụng chống tăng huyết áp, là dẫn chất của benzenacetamid, tác
dụng ức chế chọn lọc trên thụ thể beta1.
- Cơ chế tác dụng:
+ Thuốc chẹn thụ thể beta có tác dụng làm giảm lực co cơ và giảm tần số tim.
Atenolol không có tác dụng ổn định màng. Atenolol tan trong nước, do đó ít
thấm vào hệ thần kinh trung ương.
+ Ðiều trị bằng atenolol sẽ ức chế tác dụng của catecholamin khi gắng sức và
căng thẳng tâm lý, dẫn đến làm giảm tần số tim, giảm cung lượng tim và giảm
huyết áp.
+ Ðiều trị bằng atenolol không làm tăng hoặc làm tăng rất ít sức cản của mạch
ngoại biên. Trong điều kiện có stress với tăng giải phóng adrenalin từ tuyến
thượng thận, atenolol không làm mất sự co mạch sinh lý bình thường. Ở liều
điều trị, tác dụng co cơ trơn phế quản của atenolol kém hơn so với những thuốc
3

chẹn thụ thể beta không chọn lọc. Tính chất này cho phép điều trị cả những
người có bệnh hen phế quản nhẹ hoặc bệnh phổi tắc nghẽn khác. Ðiều trị như
vậy phải được kết hợp với thuốc chủ vận thụ thể beta2 dùng theo đường hít,
dưới sự giám sát chặt chẽ của thầy thuốc chuyên khoa về hen.
- Atenolol ít ảnh hưởng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat. Phản
ứng tim mạch đối với hạ đường huyết (như tim đập nhanh) không bị ảnh hưởng một
cách có ý nghĩa bởi atenolol. Bởi vậy, atenolol có thể dùng được cho người đái tháo
đường. Ở người tăng huyết áp, atenolol làm giảm một cách có ý nghĩa huyết áp cả ở
tư thế đứng lẫn tư thế nằm.
- Ðể điều trị tăng huyết áp, nếu cần, có thể kết hợp atenolol với thuốc chống tăng
huyết áp khác, chủ yếu là thuốc lợi niệu và/hoặc thuốc giãn mạch ngoại biên.
b. Dược động học:
- Nồng độ tối đa trong huyết tương của thuốc đạt được trong vòng từ 2-4 giờ sau khi
uống. Khả dụng sinh học của atenolol xấp xỉ 45%, nhưng có sự khác nhau tới 3-4
lần giữa các người bệnh.
- Thể tích phân bố khoảng 0,7 lít/kg. Atenolol chỉ được chuyển hóa một lượng nhỏ;
dưới 10% của liều dùng được bài tiết là chất chuyển hóa. Phần lớn liều thuốc dùng
được bài tiết qua thận dưới dạng không thay đổi. Nửa đời trong huyết tương của
thuốc từ 6-9 giờ đối với người lớn có chức năng thận bình thường. Tác dụng trên
mạch và huyết áp dài hơn và duy trì được ít nhất 24 giờ. Nửa đời trong huyết tương
của thuốc tăng lên đối với người có chức năng thận giảm và không bị ảnh hưởng
bởi bệnh gan. Tuy nhiên, nồng độ trong máu của thuốc thường tăng theo tuổi. Nếu
atenolol được dùng cùng với thức ăn, khả dụng sinh học của thuốc giảm ít nhất là
20%. Ðiều đó không có ý nghĩa lâm sàng.
c. Chỉ định, liều dùng:
- Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong vòng
12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất.
- Liều dùng :
+ Tăng huyết áp khởi đầu liều đơn 50 mg/ngày, có thể tăng lên 100 mg/ngày.
4

+ Đau thắt ngực khởi đầu 50 mg/ngày, có thể tăng lên 100 mg/ngày.
+ Loạn nhịp tim : uống dự phòng 50 – 100 mg/ngày.
d. Chống chỉ định:
Atenolol không nên dùng trong những trường hợp: Chậm nhịp xoang, block nhĩ
thất độ hai và ba; Suy thất phải thứ phát do tăng áp phổi, suy tim xung huyết, sốc
tim; Gây vô cảm với những tác nhân suy tim như ether; Quá mẫn với atenolol.
e. Các dạng bào chế trên thị trường:
- Viên nén: 25, 50 và 100 mg.
- Thuốc tiêm tĩnh mạch: 5 mg/10 ml.
Một số chế phẩm atenolol tồn tại dạng racemic trên thị trường như viên nén
Tenormin 50 mg và 100 mg, Atenolol Stada 50mg, Tenocar 50mg; thuốc tiêm
Tenormin 5mg…và chế phẩm chỉ chứa (S)-atenolol: viên nén Ahngook 25 mg,
Adbeta 12,5 mg và 25 mg...
g. Một số nghiên cứu so sánh tác dụng các đồng phân atenolol:
- Nghiên cứu mù đôi, có kiểm soát so sánh tác dụng giảm nhịp tim của (R,S)atenolol và (R), (S)-atenolol so với giả dược trên người tình nguyện sau khi tập thể
dục do Stoschitzky K. và cộng sự thực hiện cho thấy tác dụng giảm nhịp tim sau khi
uống 100 mg (R,S)-atenolol tương đương với uống 50 mg (S)-atenolol, trong khi
không thấy hiệu quả giảm nhịp tim sau khi uống 50 mg (R)-atenolol [14],[19],[20].
- Theo McCoy R. và cộng sự cho thấy một thử nghiệm trên người, (S)-atenolol có
tác dụng ức chế chọn lọc β1-adrenergic hơn khoảng 40 lần và có ít tác dụng phụ
(loạn nhịp, đánh trống ngực) so với (R)-atenolol [14].
1.1.3. Phương pháp định tính, định lượng atenolol trong chế phẩm [1]
1.1.3.1. Định tính:
- Pha dung dịch thử atenolol 0,01% trong methanol. Đo phổ tử ngoại của dung dịch
thử trong khoảng 230 – 350 nm có các hấp thụ cực đại khoảng 275 nm và 282 nm.
Tỉ số độ hấp thụ cực đại đo ở 275 nm và 282 nm từ 1,15 đến 1,20.
- Đo điểm chảy: Từ 152 oC đến 155 oC
1.1.3.2. Định lượng:

5


- Định lượng bằng phương pháp đo quang: Pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn
trong ethanol sao cho nồng độ xấp xỉ nhau (khoảng 0,07 mg/ml). Đo độ hấp thụ của
dung dịch chuẩn và dung dịch thử ở bước sóng khoảng 276 nm trong cốc đo dày 1
cm, so với mẫu trắng là ethanol (TT). Dựa vào độ hấp thụ đo được của dung dịch
chuẩn, dung dịch thử và nồng độ C14H22N2O3 của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng
atenolol, C14H22N2O3 trong viên.
- Định lượng bằng HPLC với điều kiện sắc ký như sau [9]:
+ Cột Atlantis C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).
+ Pha động: Đệm amoni acetat 20 mM/methanol = 60:40.
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
+ Bước sóng phát hiện: 225 nm
Tuy nhiên các phương pháp định lượng trên chỉ có thể định lượng được atenolol ở
dạng racemic, chưa định tính và định lượng đồng thời các đồng phân atenolol.
1.2. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Khái niệm
HPLC là một kỹ thuật tách, trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa
các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của
chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha
tĩnh và pha động do đó thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các
yếu tố này. Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được
điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Sắc ký là một quá trình phức tạp, có sự tương tác giữa ba thành phần: Chất tan,
pha động và pha tĩnh.
Chất tan
F1

Pha tĩnh

F2

Pha động

F3

6


Chất tan được phân bố giữa pha tĩnh và pha động. Quá trình tách dựa trên tính
chất vật lý, hóa lý của các chất; dựa trên hai quá trình là hấp phụ và giải hấp phụ
xảy ra liên tục giữa hai pha: Pha tĩnh (chất rắn hoặc chất lỏng) và pha động (gồm
một chất hoặc hỗn hợp nhiều chất). Pha động hòa tan, đẩy chất phân tích di chuyển.
Pha tĩnh giữ chất phân tích. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi ba lực
F1, F2, F3; Trong đó lực F1, F2 giữ vai trò quyết định. F1 là lực giữ chất phân tích
của pha tĩnh trên cột, F2 là lực của pha động kéo chất phân tích ra khỏi cột. Như
vậy các chất khác nhau có lực F1, F2 khác nhau, do đó chúng di chuyển trong cột
với tốc độ khác nhau và sẽ tách nhau khi ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ
được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic sắc ký. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho
chúng ta sắc ký đồ.
1.2.3. Cấu tạo máy HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm
cao áp, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào cột, cột sắc ký, detector, bộ phận xử lý số liệu
(máy tính hoặc máy ghi).
Để đáp ứng nhu cầu thực tế phải phân tích các chất có cấu trúc, tính chất rất đa
dạng, bộ phận phát hiện của thiết bị HPLC được phát triển với rất nhiều loại
detector khác nhau.
Detector là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột và

các tín hiệu này được ghi dưới dạng pic trên sắc đồ để có thể định tính và định
lượng.
Các tín hiệu này có thể là độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế,
độ dẫn điện …
Một số loại detector:
-

Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (Ultra violet - Visible - UV-VIS): Đo ở

vùng 190-900nm để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại detector phổ biến
nhất, được trang bị cho các đơn vị kiểm nghiệm ở Việt Nam. Detector UV-VIS loại
hiện đại có dãy diod (Diode array detector - DAD) có khả năng quét chồng phổ để
định tính theo phổ hấp thụ của các chất.
7


-

Detector huỳnh quang: Để phát hiện các chất phát huỳnh quang và các chất

có khả năng tạo dẫn chất phát huỳnh quang. Đây là loại detector có độ chọn lọc cao.
Ngoài ra còn có một số detector khác: tán xạ bay hơi, điện hóa, đo chỉ số khúc xạ,
đo độ dẫn điện, khối phổ…
1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký [3]
 Thời gian lưu (Retention time-tR): Thời gian lưu của một chất tan là
khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu thử vào cột đến khi detector phát hiện giá trị cực
đại. Thời gian lưu của chất không bị lưu giữ được gọi là thời gian chết. Tốc độ di
chuyển của chất không bị lưu giữ bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử
pha động. Trong cùng một điều kiện sắc ký, mỗi chất có một tR khác nhau nên tR
giúp định tính các chất.



Hệ số dung lượng k’(capacity factor): Hệ số k’ là một thông số quan trọng

mô tả tốc độ di chuyển của một chất phân tích qua cột

k’ = K×

=

Bằng thực nghiệm, k’ được tính theo công thức sau:

k’ =
K:

Hệ số phân bố

Qm: Lượng chất trong pha động

Vs: Thể tích pha tĩnh

tR:

Thời gian lưu

Vm: Thể tích pha động

t0:

Thời gian chết

Qs: Lượng chất trong pha tĩnh
Nếu hệ số k’<< 1, quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh cho nên khó xác định
chính xác thời gian lưu, ngược lại nếu k’ quá lớn (20÷30) quá trình rửa giải quá dài.
Cần chọn cột, pha động… sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 5.


Hệ số chọn lọc α (relative retention):

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất A và B

α=

=

k’: Hệ số dung lượng

tR: Thời gian lưu

8


Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1.
Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0.


Độ phân giải Rs (resolution) :

Là thông số đánh giá mức độ tách nhau của 2 píc liền kề.

=

=

tRB, tRA:

Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A),

WB, WA:

Chiều rộng đo ở đáy các pic,

W1/2B, W1/2A: Độ rộng đo ở nửa chiều cao của pic.
Yêu cầu Rs > 1, trong định lượng Rs ≥ 1,5.
1.2.5. Ứng dụng của HPLC
1.2.5.1. Định tính [2],[3]
Trong HPLC để định tính các chất người ta dựa vào giá trị thời gian lưu. Thời
gian lưu của mỗi chất là xác định. Các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau
trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Ngoài thời gian lưu, để định tính các chất
còn sử dụng các thông số khác căn cứ vào đặc điểm của detector phát hiện như hệ
số chồng phổ UV áp dụng đối với máy HPLC có detector DAD khi chất phân tích
có khả năng hấp thụ UV-VIS; loại phổ khối, số khối của ion mẹ, mảnh ion con đối
với LC/MS.
1.2.5.2. Định lượng [2],[3]
Các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của
chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có bốn phương pháp
định lượng hay được sử dụng trong sắc ký:
-

Phương pháp chuẩn nội,

-

Phương pháp chuẩn ngoại,

-

Phương pháp thêm chuẩn,

-

Phương pháp chuẩn hóa diện tích.

Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi xin trình bày cụ thể về phương
pháp chuẩn ngoại.
9


Phương pháp chuẩn ngoại:
- Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
- So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao)
pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu
thử.
- Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.
+ Chuẩn hóa một điểm : Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

Cx =
Cx:

Nồng độ mẫu thử

Cs:

Nồng độ mẫu chuẩn

Sx:

Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu thử

Ss:

Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn.

+ Chuẩn hóa nhiều điểm : Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất phân
tích tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc
chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện
tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn C. Sử dụng đoạn
tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể
thực hiện việc tính toán này theo 2 cách:
o Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn

Hình 1.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic và nồng độ
o Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
10


pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định.
Y = a + bCx

Y

: Diện tích pic

a

: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b

: Độ dốc của đường chuẩn

Cx

: Nồng độ của chất thử.

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử.

Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong
đoạn tuyến tính của đường chuẩn.
1.3. TÁCH, PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ VÀ ĐIỆN DI MAO QUẢN
1.3.1. Đồng phân quang học [3]
- Đồng phân là những hợp chất khác nhau có cùng một công thức phân tử. Đồng
phân quang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay
của mặt phẳng ánh sáng phân cực.
- Dạng đồng phân quang học đơn giản nhất xuất hiện trong trường hợp khi hợp chất
có thể tồn tại dưới hai dạng đồng phân lập thể có cấu tạo không chồng khít lên nhau
được. Ngoài sự khác biệt trong cấu trúc phân tử theo kiểu như sự khác biệt giữa bàn
tay phải và bàn tay trái, còn tất cả các tính chất lý học thông thường của các đồng

phân đó là giống nhau, trừ khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những
góc bằng nhau nhưng ngược chiều.
- Chất mà có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc α nào
đó gọi là chất hoạt quang. Hỗn hợp racemic là hỗn hợp có số phân tử bằng nhau của
mỗi dạng đối quang, có tổng cộng độ quay cực bằng không.
1.3.2. Tác nhân chọn lọc hoạt quang (chiral selector) [4],[5],[21]
- Các đồng phân quang học rất giống nhau về tính chất lý hóa nên áp dụng các
phương pháp tách thông thường không đem lại kết quả. Tuy nhiên các đồng phân
11


này có khả năng tương tác khác nhau với một số chất đặc biệt, gọi là tác nhân chọn
lọc hoạt quang (chiral selectors). Khi có mặt trong hệ thống phân tích, chúng sẽ
tương tác với hỗn hợp đồng phân quang học. Quá trình tách đồng phân này đạt được
do sự khác nhau về năng lượng tương tác ∆ (∆G) của tác nhân chọn lọc hoạt quang
với mỗi đồng phân. Trung bình ∆Gmin = 0.24 kcal/mol thì hệ số tách α có thể đạt
1,5. Một cơ chế khác của quá trình tách đồng phân liên quan đến cấu trúc xoắn hoặc
tạo thành các hốc của phân tử polymer.
- Cơ chế tương tác đặc hiệu của chất chọn lọc (selector) và đồng phân quang học:
Có một số mô hình đã được thảo luận nhưng đến nay, mô hình đáng tin cậy nhất là
mô hình tương tác ba điểm của Dalgiesh (Hình 1.3). Giữa selector và các đồng phân
quang học có 3 điểm tương tác trong đó có ít nhất 1 trong 3 tương tác này đặc hiệu
với 1 đồng phân quang học. Sự khác nhau này là cơ sở cho phép tách được hai đồng
phân đối quang.

Hình 1.3 : Mô hình tương tác ba điểm.
- Các tác nhân hoạt quang là thành phần quan trọng nhất của hệ thống phân tích.
Chính vì vậy trong quá trình phát triển các kỹ thuật tách đồng phân quang học,
người ta luôn chú ý nghiên cứu, tìm kiếm các tác nhân này. Một lượng lớn các pha
tĩnh chọn lọc và tác nhân hoạt quang đã được phát triển ứng dụng đáp ứng các yêu

cầu phân tách đồng phân các chất khác nhau. Trong những năm 1990, có khoảng 90
loại cột tách chọn lọc hoạt quang được thương mại hóa trong kỹ thuật tách đồng
phân quang học sử dụng HPLC.
Các chất chọn lọc hoạt quang có bản chất hóa học khá đa dạng, được chia thành
các nhóm chính sau:
- Proteins: Pha tĩnh chọn lọc hoạt quang đầu tiên gắn α1-acid glycoprotein cố định
(α1-AGP) trên hạt silica được phát triển bởi Hermasson (năm 1983). Ngoài ra còn
12


sử dụng albumin huyết thanh (HSA, BSA), ovalbumin (trong trứng gà)…
- Dẫn chất polysaccarid: Dẫn xuất cellulose vi tinh thể được sử dụng trong tách
đồng phân quang học từ những năm 1970, tuy nhiên đến những năm 1980 nguyên
liệu này mới được sử dụng hiệu quả trong HPLC (bởi Okamoto). Một số pha tĩnh
chọn lọc hoạt quang (CSPs) gồm dẫn xuất ester, carbamat của cellulose và amylase
được bao trên hạt silica. Mặc dù những chất này có tính chọn lọc không cao nhưng
được sử dụng trong tách số lượng lớn hỗn hợp racemic khác nhau.
- Polyme tổng hợp: Blaschke đã tổng hợp gel liên kết chéo từ N-acryloylated Lamino acids và một phần trăm nhỏ ethylen dimethacrylat hoặc divinylbenzen và sử
dụng trong kỹ thuật sắc ký áp suất thấp để tách hỗn hợp racemic của dẫn xuất amino
acid và acid mandelic. Một CSP chứa isotatic poly (triphenyl methyl methacrylat)
được phát triển bởi Okamoto. Tuy nhiên, các cột tách chọn lọc chứa các polymer
này thường kém bền và đắt tiền nên ít được ứng dụng trong phân tích quy mô lớn.
- Macrocyclic glycopeptides: Armstrong phát triển CSP đầu tiên dựa trên liên kết
của silica và kháng sinh vancomycin. Ngoài ra còn sử dụng một số kháng sinh
polycyclic như teicoplanin, ristocetin A…nhóm chất chọn lọc này khá bền và sử
dụng được trong cả 2 loại sắc ký pha thuận và pha đảo. Tuy nhiên chỉ có một số
lượng hạn chế các chất này là có sẵn trên thị trường và giá cao.
- Nhóm chất vòng có khối lượng phân tử thấp: ether vòng được bất động trên silica
hoặc polymer được phát triển sớm vào giữa năm 1970; các cyclodextrins (CD) như
β-CD, dẫn chất sulfat hóa, alkylhydroxy hóa của β-CD có thể được sử dụng tách

đồng phân trong sắc ký lỏng, sắc ký khí, điện di. Các chất này tương tác với đồng
phân dựa trên cấu trúc tạo thành một “hốc” chọn lọc đối quang (chiral cavity). Một
số ví dụ cột sắc ký thuộc nhóm này là các cột Astec Cyclobond: các hạt silica gắn
với nhóm chất dẫn xuất hay không dẫn xuất của β- và γ-cyclodextrins.
- Phức ion kim loại: Các CSPs “cổ điển” thuộc nhóm này được phát triển độc lập
bởi Davankov và Bernauer vào cuối năm 1960. Ví dụ điển hình là phức đồng (II) và
L-proline được gắn trên bề mặt polymer như nhựa Merrifield. Chúng có khả năng
tách tốt các hỗn hợp racemic của amino acid, amino alcol và hydroxyl acid.
13


- Chất hoạt quang phân tử lượng nhỏ: là các chất chọn lọc kiểu Pirkle. Các chất
chọn lọc đối quang này tương tác với đồng phân quang học chủ yếu giữa nhóm cho
và nhận điện tử π. Ví dụ : amino acid mang nhóm nhận và cho điện tử π;
cyclohexan thế vị trí 1, 2; alkaloid cây canh-ki-na.
Tác nhân chọn lọc hoạt quang được sử dụng trong nhiều phương pháp như
phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng siêu
tới hạn (SFC), sắc ký lớp mỏng (TLC) và điện di mao quản (CE) để phân tách đồng
phân quang học. Trong đó hai kỹ thuật phổ biến hiện nay dùng để tách đồng phân
quang học là điện di mao quản và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong HPLC, tác nhân
chọn lọc hoạt quang có thể gắn trên bề mặt pha tĩnh hoặc được bổ sung vào dung
môi pha động còn trong phương pháp CE tác nhân chọn lọc hoạt quang được bổ
sung vào dung dịch chất điện ly nền.
1.3.3. Một số ứng dụng phân tích đồng phân quang học bằng HPLC
- HPLC là một kỹ thuật được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Có 3 kỹ
thuật để tách các đồng phân quang học trong hỗn hợp racemic:


Sử dụng cột tách chọn lọc (Chiral stationary phases): Tác nhân chọn lọc hoạt

quang được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh. Đây là phương pháp được sử dụng
phổ biến nhất do tính tiện lợi, nhanh chóng và chính xác. Số lượng pha tĩnh thương
mại hóa sẵn có lớn, với hơn 100 loại cột khác nhau đáp ứng như cầu của người làm
phân tích. Một số ví dụ cho cột sắc ký có pha tĩnh gắn chất chọn lọc hoạt quang:
+ Cột Chiral AGP: Sử dụng chất chọn lọc hoạt quang là α1-acid glycoprotein
(AGP). Đây là một loại protein bền trong dung môi hữu cơ, chịu được nhiệt độ
cao và pH thấp. Cột Chiral AGP được sử dụng trong sắc ký pha đảo, có thể rửa
giải nhiều chất phân tích có đồng phân quang học có bản chất khác nhau : amin,
acid, ester, sulphoxyd, amid, ancol...[10],[18]
+ Cột Ultron ES-OVM: Pha tĩnh gắn với chất chọn lọc hoạt quang là protein
ovomucoid. Ứng dụng trong tách và định lượng đồng phân quang học của nhiều
hoạt chất như nhóm thuốc chẹn β-adrenergic: alprenolol, bunitrolol... và nhóm
thuốc chống viêm không steroids: ibuprofen... Cột Ultron ES-OVM được sử
14