PHÂN TÍCH TÍNH đa HÌNH (TG)(T)n và một số đột BIẾN của GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN bất sản ỐNG dẫn TINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

------***------

DƯƠNG THỊ HẢI VÂN

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH (TG)(T)n VÀ MỘT SỐ
ĐỘT BIẾN CỦA GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN
BẤT SẢN ỐNG DẪN TINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
------***------

BỘ Y TẾ

DƯƠNG THỊ HẢI VÂN

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH (TG)(T)n VÀ MỘT SỐ
ĐỘT BIẾN CỦA GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN
BẤT SẢN ỐNG DẪN TINH
Chuyên ngành : Y sinh học di truyền
Mã số

: 62720301

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
Ts.Bs.LƯƠNG THỊ LAN ANH

HÀ NỘI – 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Dương Thị Hải Vân, bác sĩ nội trú khóa XXXIX Trường Đại học Y
Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học di truyền, xin cam đoan:
1.
2.
3.

Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của Ts.Bs. Lương Thị Lan Anh
Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam
Các số liệu và thông tin trong nghiên là hoàn toàn chính xác, trung thực
và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên
cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, Ngày…..tháng….năm 2017
Người viết cam đoan

MỤC LỤC

Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục bảng, biểu, sơ đồ, hình vẽ
ĐẶT VẮN ĐỀ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Không để bảng như thế này
CFTR
CBAVD
ACMG
CFTR- RDs
DNA
WHO
mPCR

:
:

Cystic fibrosis transmembrane conductance regular - Điều
hòa vận chuyển màng trong bệnh xơ nang.
Congenital bilateral aplasia of the vas deferens - Bất sản ống
dẫn tinh
American College Medical Genetics - Đại học y khoa di
truyền Hoa Kỳ

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator related
disorder - Rối loạn liên quan tới gen CFTR
Deoxyribonucleic acid
World heath organization – Tổ chức y tế thế giới
Mutilplex polymerase chain reaction – Phản ứng khuếch đại
chuỗi



DANH MỤC BẢNG Cách dòng nhiều quá


DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
Cách dòng nhiều quá


9

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất sản ống dẫn tinh là tình trạng ống dẫn tinh không hình thành đầy đủ
từ lúc trước sinh. Bệnh lý này có thể xuất hiện ở một bên hoặc hai bên ống
dẫn tinh [1],[2].
Bất sản ống dẫn tinh chiếm khoảng 1-2% vô sinh nam và chiếm 6% số
nam giới vô sinh do không có tinh trùng[3], theo Rapour và cộng sự bất sản
ống dẫn tinhcó thể chiếm tới 10% nam giới không có tinh trùng[4].Nguyên
nhân gây bệnh ở phần lớn bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh có liên quan đến
đột biến gen điều hòa vận chuyển màng CFTR trong bệnh xơ nang –một
bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể[1],[2].Hơn 95% trường hợp bệnh
nhân xơ nang có kèm bất sản ống dẫn tinh[5].Bất sản ống dẫn tinh được xếp
vào nhóm rối loạn có liên quan đến gen CFTR ( CFTR- RDs)[6].

Nghiên cứu về những đột biến và kiểu gen đa hình của gen CFTR trên
bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh đã được thực hiện nhiều tại các nước phương
Tây. Tuy nhiên, ở Đông Nam Á, những nghiên cứu về bệnh lý này vẫn còn
khá ít. Điều này có thể do tỉ lệ mang gen bệnh ở cộng đồng khu vực thấp và
những hạn chế về điều kiện, khả năng thực hiện. Theo thống kê của Đại học
Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG), ở người Mỹ gốc Á, tỉ lệ người mang gen
bệnh xơ nang CFTR là 1/ 8780 và tỉ lệ sinh trẻ bị bệnh là 1/ 35100 [7]. Thống
kê nghiên cứu về CFTR ở châu Á, đặc biệt ở Việt Nam còn chưa nhiều. Để
góp phần tìm hiểu về những đột biến gen CFTR trên bệnh nhân bất sản ống
dẫn tinh, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa hình (TG)m(T)n và một số
đột biến của gen CFTRtrên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh” nhằm mục
tiêu sau:
1.

Xác định được tỉ lệ đa hình (TG)m (T)n của intron 8 và một số đột

2.

biến khác của gen CFTR trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh.
Mô tả được tương quan giữa (TG)m (T)n và một số đột biến gen CFTR
trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh.


10

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 1.1. Bất sản ống dẫn tinh

1.1.1 1.1.1. Khái niệm
Bất sản ống dẫn tinh là tình trạng ống dẫn tinh không hình thành đầy đủ
từ lúc trước sinh. Bệnh lý này có thể xuất hiện ở một bên hoặc hai bên ống
dẫn tinh [1, 2]
1.1.2 1.1.2. Dịch tế học
Tỷ lệ bất sản ống dẫn tinh chiếm khoảng 1-2% vô sinh nam và tới 6%
nam giới vô sinh do không có tinh trùng [3]. Theo tác giả Radpour và cộng
sự, tỉ lệ bất sản ống dẫn tinh có thể lên đến 10% ở nam giới không có tinh
trùng [4].
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Thế Vũ và cộng sự về nguyên nhân
gây vô sinh nam cũng cho thấy tỉ lệ bất sản ống dẫn tinh chiếm 1% nam giới
không có tinh trùng [8]. Nghiên cứu đặc điểm tinh dich đồ của 1000 cặp vợ
chồng cho thấy vô sinh do không có tinh trùng chiếm 8%. Nghiên cứu của
Trần Văn Sắc, Trần Đức Phấn về đặc điểm tinh dịch đồ và lâm sàng bệnh
nhân vô sinh nặng, thiểu tinh…
1.1.3 1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bất sản ống dẫn tinh
Bất sản ống dẫn tinh có thể xuất hiện như một bệnh lý đơn độc trên
nam giới hoặc là một trong những triệu chứng đi kèm với bệnh xơ nang.Đây
là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường của tuyến nhầy, gây ra những
tổn thương tiến triển trên hệ thống hô hấp và những bệnh hệ tiêu hóa mạn
tính... Hơn 95% nam giớixơ nang bị vô sinh do không có tinh trùng gây ra
bởi không có, thiểu sản hay xơ hóa cấu trúc ống Wolffian xảy ra từ thời kì bào
thai [5].


11

Khi thăm khám nam khoa, bệnh nhân có tinh hoàn, dương vật bình
thường nhưng không sờ thấy hoặc chỉ sờ thấy sợi xơ vết tích của mào tinh
hoàn, ống dẫn tinh hoặc tuyền tinh và/ hoặc ống phóng tinh[5], [9].

Trên siêu âm qua đường trực tràng có thể thấy (bỏ): không có ống dẫn
tinh trong ổ bụng, không thấy tuyến tinh vầ những mức độ thiểu sản khác
nhau của túi tinh. Những bất thường này cũng có thể xác định được khi chọc
hút mào tinh hoàn.
Xét nghiệm tinh dich đồ bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh không có tinh
trùng, thể tích tinh dịch thấp (< 2.0 ml), pH < 7.2, không có hoặc giảm
fructose và α1-4 glucosidase.
Xét nghiệm hóa sinh máu những nội tiết nam cho thấy hormone FSH
(follicle stimulating), LH (luteinizing hormone), nồng độ testosterone bình
thường [10].
Tinh hoàn phát triển và có chức năng sinh tinh bình thường nhưngtinh
trùng không thể thoát ra ngoài qua ống dẫn tinh do tắc nghẽn. Kết quả là vô
sinh nam. Nam giới mắc bất sản ống dẫn tinhchỉ có thể làm cha khi có sự hỗ
trợ sinh sản. Bệnh lý này được báo cáo là không ảnh hưởng đến hoạt động
tình dục.
Đa sốnam giới bất sản ống dẫn tinh không có biểu hiện đặc trưng khác
của xơ nang, tuy nhiên một vài người nam giớimắc bệnh này có những biểu
hiện bệnh hô hấp nhẹ hoặc vấn đề tiêu hóa.
1.1.4 1.1.4. Nguyên nhân
Nguyên nhân của phần lớn trường hợp bất sản ống dẫn tinh liên quan
với bệnh xơ nang và đột biến gen CFTR. Hơn 95% nam giới bị xơ nang có
kèm bất sản ống dẫn tinh [5].


12

Tuy nhiên, kiểu đột biến gen CFTR ở bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh
rất khác biệt so với những đột biến gen CFTR tìm thấy trên bệnh nhân xơ
nang. Bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh thường là đồng hợp tử một đột biến nhẹ
trên một alen và một đột biến nhẹ trên alen thứ hai (88%) hoặc hai đột biến

nhẹ trên cùng alen (12%). Trong khi, những trường hợp biểu hiện bệnh xơ
nang đặc trưng có dạng đồng hợp tử hoặc dị hợp tử hai đột biến nặng gen
CFTR gây ra. Những đột biến gen hay gặp nhất trên bệnh nhân bất sản ống
dẫn tinh là đa hình alen T5, delF508, và R117H, hoặc sự kết hợp giữa alen T5
và một đột biến nặng trên alen khác [11].
Nhóm nhỏ hơn chiếm số lượng nhỏ hơn (từ 10- 40%) liên quan với bất
sản thận một bên. Cơ chế di truyền của nhóm này chưa được hiểu rõ [1],[2].
Theo hướng dẫn thực hành xét nghiệm phân tử chẩn đoán bệnh xơ nang
và những rối loạn liên quan đến bệnh xơ nang của châu Âu 2008, tiêu chuẩn
đánh giá đột biến gen CFTR gây bệnh xơ nang[10]:


Tiêu chuẩn đột biến gen CFTR có độ tin cậy cao gây bệnh:
o Đột biến gây thay đổi trình tự amino acid gây ảnh hưởng nặng
o

đến tổng hợp và/ chức năng protein CFTR
Đột biến gây ra tín hiệu kết thúc trước khi protein CFTR được
tổng hợp hoàn thiện ( thêm nucleotid, mất nucleotid hoặc đột

o



biến.
Đột biến gây thay đổi đa hình nucleotid GT/AG của instron tại vị

trí nối.
o Đột biến gây mất một hoặc nhiều exon.
Tiêu chuẩn đột biến gen CFTR gây bệnh có đột tin cậy thấp hơn:

o Đột biến làm thay đổi trình tự một acid amin không thấy ở gen
CFTR bình thường từ ít nhất 100 người mang gen đột biến CFTR
o

trong nhóm bệnh nhân cùng chủng tộc.
Đột biên làm thay đổi trình tự amino acid có tính bảo tồn cao
trong quá trình tiến hóa.


13

o
o

Đột biến gây ra một vị trí nối mới.
Đột biến giống những trình tự đa hình được quan sát thấy ở
những protein khác thuộc nhóm protein vận chuyển gắn ATP.

1.1.5 1.1.5. Chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh
Tiêu chuẩn chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh:
•
•
•

Không có tinh trùng
Thể tích tinh dịch thấp(<2 ml)
Triệu chứng sinh hóa điển hình: pH<7.2, không có hoặc giảm
fructose và α1-4 glucosidase (những marker bình thường của

•

•

tuyến tinh và mào tinh)
Không sờ thấy ống dẫn tinh
Trên siêu âm qua trực tràng: không thấy phần ống dẫn tinh trong
ổ bụng, globus không điển hình, và mức độ thiểu sản khác nhau
của túi tinh. Những bất thường này cũng có thể xác định thông

•

qua phẫu thuật chọc hút tinh trùng.
Hormon FSH,LH và testosterone bình thường


14

Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán nam giới CBAVD và CFTR- RDs của châu Âu 2009
1.2 1.2. Gen điều hòa vận chuyển màng xơ nang CFTR
1.2.1 1.2.1. Đặc điểm gen CFTR


Vị trí, kích thước gen
Gen CFTR nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7, vùng 3, băng 1, băng

phụ 2 (kí hiệu 7q31.2 ) được phát hiện đầu tiên năm 1989. Gen CFTR gồm 27
exon. Trình tự mã hóa của gen dài khoảng 230 kb; mRNA xấp xỉ 6,5 kb.

Hình 1.2. Mô tả vị trí gen CFTR trên nhiễm sắc thể số 7
( nguồn: ghr.nlm.nih.gov)

15



Cơ chế gây bệnh bất sản ống dẫn tinh nói chung
Gen CFTR mã hóa protein điều hòa vận chuyển màng trong bệnh xơ

nang. Đây là một glycoprotein gồm 1480 amino acid, có trọng lượng phân tử
khoảng 170.000 đơn vị cacbon. Protein này là thành viên gia đình protein vận
chuyển tích cựcgắn ATP. Protein là phức hợp gổm 2 tiểu đơn vị, mỗi đơn vị
có 6 vùng xuyên màng và gắn với nhau tại vị trí gắn ATP. Giữa 2 đơn vị là
một vùng điều hòa.[7].
Protein này hình thành kênh vận chuyển ion qua màng tế bào chủ yếu là
kênh clo ngoài ra nó còn có thể vận chuyển một số ion khác như natri, HCO3-

Hình 1.3. Mô tả cấu trúc protein CFTR
(nguồn: www.genet.sickkid.on.ca/CFTRtr/) (hình to quá)
MSD (membrane - spainning domain) vùng xuyên màng
NBD ( nucleotid binding domain) vùng gắn nucleotid
R(regulatory domain) vùng điều hòa
Đột biến gen tạo ra sản phẩm protein bất thường,dẫn đến sự thiếu hụt
vận chuyển điện tử và thiếu hụt kênh vận chuyển ion trên màng tế bào biểu


16

mô của tuyến nước bọt, đường thở, tuyến tụy, đường sinh dục và đường tiêu
hóa. Có 4 lớp phân loại đột biến gen CFTR:
•

•
•
•

Đột biến lớp 1 dẫn tới thiếu hụt sản phẩm protein.
Đột biến lớp 2 dẫn tới thiếu hụt tiến trình hoàn thiện protein.
Đột biến lớp 3 gây tổn thương điều hòa kênh.
Đột biến lớp 4 dẫn tới thiếu hụt vận chuyển qua kênh một phần do
đó bệnh có biểu hiện nhẹ hơn.

Ngoài ra, đột biến genCFTR có thể ảnh hưởng đến gắn cAMP vùng điều
hòa của kênh clo. Quá trình phosphoryl hóa vùng điều hòa có vai tròtrong
điều khiển hình thành lỗ màng hoặc mở cổng của kênh [7].
Ở bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh, protein mã hóa bởi gen CFTR hình
thành kênh vận chuyển ion clo ra vào tế bào.Đột biến gen CFTR gây rối loạn
chức năng kênh clo, mất điều hòa vận chuyển dòng ion clo và nước qua màng
tế bào. Những tế bào trong đường sinh dục nam sản xuất ra chất nhầy đặc
dính. Loại dịch nhầy này ức chế ống dẫn tinh hình thành và khiến chúng bất
sản từ thời kì bào thai.
Bất sản ống dẫn tinh, viêm tụy cấp tính hoặc mãn tính hay tái phát, bệnh
phổi tiến triển mạn tính kèm rối loạn chức năng protein CFTR được xếp vào
nhóm những rối loạn liên quan đến gen CFTR ( CFTR-RDs) [12]
1.2.2 Những đột biến gen CFTR liên quan đến bệnh xơ nang
Thống kê đầy đủ những đột biến gen CFTR có thể tìm thấy trongcơ sở
dữ

liệu

đột

biến

gen

CFTR

về

xơ

nang

tại

địa

chỉ

www.genet.sickkids.on.ca/CFTRtr/. Hơn 2000 đột biến đã được phát hiện trên
gen CFTR. Tuy nhiên, phần lớn những đột biến có tần số thấp< 0.1% hoặc chỉ
là những đột biến rời rạc, hiếm. Những đột biến này thay đổi theo chủng tộc
và khu vực địa lý. Đại học di truyền y học Hoa Kì (ACMG) đã đưa ra danh
sách thống kê 23 đột biến hay gặp. Đồng thời, ACMG cũng khuyến cáo


17

những phòng thí nghiệm cần xem xét kĩ danh sách đột biến sàng lọc tùy theo
vùng địa lý và chủng tộc để tỉ lệ phát hiện đột biến đạt được cao nhất.
Bảng 1-1: Thống kê 23 đột biến gen CFTR phổ biến gây xơ nang của ACMG

2008
ΔF508
ΔI507
621+1G>T
G85E
3849+10kbC>T

R553X
G542X
R117H
R334W
2789+5G>A

R1162X
G551D
1717-1G>A
R347P
3659delC

2184delA
W1282X
A455E
711+1G>T

3120+1G>A
N1303K
R560T
1898+1G>A

1.2.3 Những đột biến gen CFTR liên quan đến bất sản ống dẫn tinh

Đột biến gen CFTR gây bệnh ở nam giới bất sản ống dẫn tinh rất khác
biệt so với những đột biến gen CFTR tìm thấy trên bệnh nhân xơ nang. Bệnh
nhân bất sản ống dẫn tinh thường là đồng hợp tử một đột biến nhẹ trên một
alen và một đột biến nhẹ trên alen thứ hai (88%) hoặc hai đột biến nhẹ trên
cùng alen (12%).Trong khi, bệnh nhân xơ nang điển hình có đột biến gen
CFTR dạng đồng hợp tử hoặc dị hợp tử hai đột biến nặng. Những đột biến
gen hay gặp nhất trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh là đa hình alen T5,
delF508, và R117H, hoặc sự kết hợp giữa alen T5 và một đột biến nặng trên
alen khác [11]
•

Đột biến DelF508 (thêm các kí hiệu khác)

DelF508 là đột biến mất bộ ba nucleotid mã hóa acidamin phenylalanin tại
ví trí 508 trên phân tử protein CFTR trưởng thành. Đột biến này dẫn đến tạo
ra một protein không thể vận chuyển đến đúng vị trí trên màng tế bào. Kết
quả protein bị giáng hóa và thiếu hụt trầm trọng protein CFTR trên màng
ngoài tế bào biểu mô[13].
DelF508 là đột biến phổ biến hay gặp nhất chiếm tới 31-72% đột biến
CFTR trên người da trắng. Tỉ lệ này thay đổi tùy theo chủng tộc và địa lý[7].


18

Tại Trung Quốc, nghiên cứu của Wu- Hua Nivà cộng sự năm 2012 trên
109 bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh và 104 nam giới khỏe mạnh bình thường
cho thấy trong số những bệnh nhân này không phát hiện đột biến delF508
[14].
Tại Việt Nam, nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật phát hiện đột biến gen
CFTR của Trương Văn Hợp, Trần Đức Phấn trên 55 nam giới không có tinh

trùng tại khoa Y sinh học di truyền năm 2015 cũng không phát hiện đột biến
này [15].Nghiên cứu của Mai Hà Nam và cộng sự năm 2005 phân tích trên
495 mẫu máu ngẫu nhiên của người Việt Nam khỏe mạnh không phát hiện
đột biến delF508 [16]. Tuy số lượng nghiên cứu còn chưa nhiều, nhưng những
nghiên cứu này chỉ ra phần nào sự khác biệt về phân bố đột biến gen CFTR ở
người châu Âu và châu Á nói chung, người Việt Nam nói riêng.
•

Poly (Tn)(TG)m

Vùng poly T là đoạn chứa baso thymidin nằm ở intron8 của gen CFTR.
Kích cỡ vùng poly T có thể gây những rối loạn liên quan tới gen CFTRkhác
nhau. Bađa hình phổ biến của vùng poly T là 5T, 7T và 9T. Cả 7T và 9T được
xem là những đột biến đa hình. 5T được xem là đột biến gây rối loạn liên
quan đến đột biến gen CFTR trong đó có bất sản ống dẫn tinh. 5T được cho
rằng làm giảm khả năng nối của intron 8 dẫn tới mất exon 9 khi dịch mã.
Theo nghiên cứu của Chillon và cộng sự, Theo ACMG, đánh giá polyT là phù
hợp nhất khi có phát hiện đột biến R117H trên bệnh nhân xơ nang hoặc
đểđánh giábất sản ống dẫn tinh[5], [7].
Mức độ nặng của bệnh phổi ở những bệnh nhân có một hoặc hai đột
biến R117H phụ thuộc vào độ dài đoạn poly T của intron 8[17]. Những bệnh
nhân có một đột biến gen CFTR gây bệnh cộng thêm đoạn 5T ở vị trí cis với
đột biến R117H thường biểu hiện bệnh phổi của bệnh xơ nang, nhưng nếu đột


19

biến đó đi kèm với đa hình 7T hoặc 9T bệnh nhân có thể không có triệu chứng
hoặc triệu chứng nhẹ của bệnh phổi[18],[19].
Khi đa hình T5 trên gen CFTR được sử dụng để chẩn đoán bất sản ống

dẫn tinh hoặc những trường hợp bệnh xơ nang không điển hình, chiều dài
đoạn lăp TG nên đươc xác định[5].
Vùng TG nằm ngay ở đầu 5’ của vùng poly T. Vùng này chứa một đoạn
lặp TG ngắn thường lặp 11 hoặc 12 hoặc 13 lần. Vùng lặp TG càng nhiều (12
hay 13 lần) nối với đoạn poly T càng ngắn (5T) có liên quan chặt chẽ với tỉ lệ
mất nối intron8.Bệnh nhân mang (TG)12(T)5 và (TG)13( T)5 ở vị trí trans với
đột biến genCFTRkhác có thể phát triển thành triệu chứng nhẹ của xơ nang.
Những bệnh nhân này nên được đánh giá lâm sàng để theo dõi, quản lý bệnh
lâu dài[7].
Ramin Rapour và cộng sự khi nghiên cứu tính đa hình của vùng
(TG)m(T)n trên 112 bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Iran thấy rằng IVS8-T5 ở
vị trí cis với IVS8 - (TG) 12- 13 có tăng biểu hiện mất exon 9 [20]. Nghiên cứu
của Qiang Du và cộng sự trên 89 nam giới mắc bất sản ống dẫn tinh cho thấy
đồng hợp tử kiểu gen (TG)13T5 và (TG)12T5 dẫn tới bất sản ống dẫn tinh
[21].
(T)5 và lặp poly TG kết hợp với những đột biến khác ở vị trí cis trên gen
CFTRcó thể hình thành nên phức hợp allen gây bệnh. Ngoài việc những đột
biến này được sử dụng để phục vụ chẩn đoán, tiên lượng trên bệnh nhân có
triệu chứng xơ nangđiển hình còn giá trịđể sàng lọc trước sinh.
•

R117H (c.350G>A)

Đây là đột biến gen CFTR ở vị trí nucleotid thứ 480, đột biến này có sự
thay thế nucleotid guanine (G) thành adenine (A). Đột biến thuộc exon 4 của
gen CFTR gây thay thế acidamin Arginin (R) thành Histidine (H) ở vị trí 117
trên phân tử protein CFTR trưởng thành. Đột biến này có tần xuất khoảng


20

0,3% trong số đột biến gen CFTR (cơ sở dữ liệu gen CFTR:
R117H ở cùng vị trí cis trên nhiễm sắc thể
với T5 hoặc T7. R1117H(T)5 được xem như phức hợp alen gây nên những
biểu hiện bệnh xơ nang nhẹ trong đó có bất sản ống dẫn tinh [7], [10]. Ngược
lại, R117H ở vị trí trans với T5 được xem là đột biến không gây bệnh [7].
•

Đột biến M470V (c.1408A>G ):

Đây là đột biến gen CFTR ở vị trí nucleotid 1540 trên exon10. Đột biến
thay thế base adenin (A) thành guanine (G) gây ra sự thay thế acid amin thứ
470 của protein CFTR từMethionine (M) thành Valine (V). M70V không phải
là đột biến gây bệnh xơ nang …..khi kết hợp với những đột biến CFTR khác
( Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến này
khi kết hợp với một số kiểu gen (TG)m(T)n làm tăng nguy cơ bị bệnh bất sản
ống dẫn tinh. Nghiên cứu của Qiang Du và cộng sự năm 2012 trên bệnh nhân
bất sản ống dẫn tinh người Trung Quốc cho thấy kiểu gen (TG)12T5- V470 có
thể dẫn tới mắc bệnh bất sản ống dẫn tinh. Nghiên cứu của Wu- Hua Ni và
cộng sự (2012) về đa hình poly T, TG và M470V trên 109 bệnh nhân bất sản
ống dẫn tinh cũng cho kết quả tương tự [14]. Một số nghiên cứu khác cũng
cho thấy M470 là nhân tố bảo vệ trong sự xuất hiện bất sản ống dẫn tin h [16],
[22].
Ngoài ra còn rất nhiều đột biến gen CFTR khác gây bất sản ống dẫn tinh,
nghiên cứu của chúng tôi bước đầu tập trung vào nghiên cứu phân tích vùng
đa hình (TG)m(T)n, M470V và một số đột biến CFTR khác bao gồm del21kb,
L138ins, delI507, delF508, 394delTT, 604insA, 1677delTA, 2143delT,
2184insA, 3821delT, 3944delTG.

21

1.3 Xét nghiệm liên quan tới chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh
1.3.1 Tinh dịch đồ
Trong quá trình phóng tinh, tinh dịch được tạo thành từ sự trộn lẫn tinh
trùng trong cặp mào tinh hoàn với dịch tiết từ tuyến sinh dục. Khi so sánh tinh
dịch trước và sau thắt ống dẫn tinh cho thấy khoảng 90% thể tích tinh dịch
được tạo thành do những tuyến tiết dịch phụ này, phần lớn là dịch tuyến tiền
liệt và túi tinh với một lượng nhỏ góp vào của tuyến Cowper và mào tinh
hoàn.
Tinh dịch có 2 phần chính:
•

Tổng số tinh trùng: phản ánh khả năng sinh tinh của tinh hoàn

•

và sự thông thoáng của đường dẫn tinh
Tổng thể tích dịch tiết: Dịch tiết được tạo nên từ nhiều tuyến
tiết phụ do đó thể tích dịch phản ánh hoạt động bài tiết của
các tuyến

Tinh dịch đồ phân tích số lượng và chất lượng của tinh dịch thoát ra
trong quá trình xuất tinh. Tinh dịch đồ đánh giá cả hai thành phần của tinh
dịch là tinh trùng và dịch tiết. Đây là xét nghiệm đầu tay trong đánh giá vô
sinh nam.
Khi đánh giá chất lượng tinh dịch nam giới, WHO khuyến cáo cần đánh
giá 2 đến 3 mẫu tinh dịch để có được thông tin cơ bản của bệnh nhân.
Bảng 1-2: Giá trị tinh dịch đồ bình thường theo WHO 2010
Chỉ số xét nghiệm

Thể tích tinh dịch
pH tinh dịch
Độ tụ tinh trùng
Di động tinh trùng

Giá trị bình thường
≥1,5ml
≥7,2
mức 1-4
• Tổng
số tinh trùng di
động( gồm tiến tới nhanh và
không tiến tới) ≥ 40%
• Tổng số tinh trùng tiến nhanh ≥
32%


22

Tỉ lệ sống tinh trùng
≥58%
tổng số tinh trùng
≥39 x 106 tinh trùng
mật độ tinh trùng
≥15 x 106 tinh trùng/ml
tế bào khác ( tế bao biểu mô, tế bào < 1x 106 tế bào/ ml
tròn( tế bào gốc và bạch cầu) hoặc
tinh trùng biến dạng đầu và đuôi
Hình thái tinh trùng
≥ 4% bình thường

Bởi vì thể tích tinh dịch trong mỗi lần xuất tinh chủ yếu do túi tinh và
tuyến tiền liệt tiết ra, một lượng nhỏ do tuyến Cowper và mào tinh hoàn. Thể
tích tinh dịch dùng để tính toán tổng số lượng tinh trùng và tế bào khác trong
mỗi lần xuất tinh. Đo lường thể tích tinh dịch là cần thiết khi đánh giá bất kì
mẫu tinh dịch nào. pH tinh dịch phản ánh sự cân bằng toan kiềm trong dịch
tiết của những tuyến tiết sinh dục khác nhau. Trong đó, tuyến tinh tiết dịch
kiềm , tuyến tiền liệt tiết dịch toan. pH tinh dịch bình thường ≥7,2. Trong bất
sản ống dẫn tinh, do ống dẫn tinh và túi tinh không phát triển dẫn đến không
có hoặc ít tinh trùng trong tinh dịch, thể tích tinh dich và pH thấp(<7,0) [23].
1.3.2 Fructose tinh dịch
Fructose trong tinh dịch chủ yếu do tuyến tinh bài tiết. Fructose có vai
trò quan trọng trong sự vận động tinh trùng.
Nồng độ fructose tinh dịch thấp phản ánh tắc nghẽn ống dẫn tinh hoặc
bất sản ống dẫn tinh, xuất tinh ngược dòng một phần hoặc do thiếu hụt
androgen [23].
Trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh, nồng độ fructose tinh dịch thấp
30-80 mg/ 100ml trong khi bình thường nồng độ khoảng 250-720 mg/ 100ml
tinh dịch [5].
1.3.3 Xét nghiệm di truyền phân tử xác định đột biến CFTR
Test phát hiện đột biến gen CFTR (những đột biến là nguyên nhân gây
bệnh) chủ yếu dựa trên quá trình phân tích gen CFTR trực tiếp, mà quá trình
này cũng cần dựa trên kiến thức về bệnh học của đột biến gen CFTR và sự


23

sẵn có của các công cụ phân tử phát hiện đột biến. Có rất nhiều thiết bị được
sử dụng để phát hiện những biến đổi trên chuỗi gen CFTR và hiện chưa có
một tiêu chuẩn vàng nào cho test thường quy. Tất cả những phương pháp sẵn
có yêu cầu kỹ năng và kinh nghiệm để thực hiện và phiên dịch gen được. Dù

không có tiêu chuẩn hay một phương pháp thực sự hiệu quả nhưng các phòng
thí nghiệm nên nhận thức được các giới hạn trong lựa chọn phương pháp và
nên biết những đột biến nào không thể tìm ra, điều đó có nghĩa là một phòng
thí nghiệm độc lập nên chọn một phương pháp mà phù hợp nhất với kinh
nghiệm, khả năng và mục đích sử dụng.
Các phương pháp được sử dụng trong phát hiện đột biến gen CFTR có
thể chia thành 2 nhóm [10]:
- Nhóm xét nghiệm những đột biến đã biết. Ví dụ: kiểm tra các mẫu
ADN để tìm sự có mặt hay vắng mặt của một hoặc một vài đột biến nhất định.
- Nhóm sàng lọc phát hiện đột biến. Ví dụ: rà soát lại các mẫu ADN để tìm ra
sự chênh lệch so với các biến đổi chuẩn.
Mục đích chung của cả 2 nhóm phương pháp đều là để tìm ra sự sắp
xếp lại mức độ lớn chưa được phát hiện trên gen CFTR bao gồm cả những
mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn,... bằng việc sử dụng các kỹ thuật PCR bán
định lượng như MLPA (multiplex ligation-dependant probe amplification)
hoặc multiplex PCR [24-26]. Với các kỹ thuật này, các đột biến vốn khó được
phát hiện bằng các kỹ thuật khuếch đại thông thường, sẽ có khả năng tìm thấy
tăng thêm đến 2% trên các allen của bệnh nhân xơ nang [24-28]và 1% của các
bệnh nhânbất sản ống dẫn tinh[29].
Bảng 1-3: Những kỹ thuật phát hiện đột biến gen CFTR thường sử dụng ở
châu Âu
KT phát hiện đột Đột biến được Ưu điểm
biến đã biết
phát hiện
Phân
tích Chủ
yếu
là Nhanh, đơn giản

Giới hạn và lưu ý

Hạn chế
Sự di chuyển của


24

Heteroduplex

F508del
I507del

và

các mẫu không
đặc hiệu cho một
đột biến nhất
định.
Phân tích enzym Chủ yếu là các đột Nhanh, đơn giản, Không đặc hiệu,
giới hạn
biến độc lập
thuận tiện cho đặc biệt nếu có sự
việc tìm các đột thay đổi locus.
biến hiếm
Lai dot blot ngược > 20 đột biến khác Phù
hợp
với
nhau
nghiên cứu chuỗi
lớn
Inno LiPA

36 đột biến
Tính đặc hiệu cao
ARMS
> 20 đột biến
Phù
hợp
với Khó tạo đoạn mồi,
nghiên cứu chuỗi các kết quả dựa
lớn
trên sự vắng mặt
của sản phẩm
PCR.
Tepnel
28-30 đột biến
Độ đặc hiệu cao
OLA
Phù
hợp
với
nghiên cứu cỡ
mẫu lớn
Abbott Molecular 32 đột biến
Độ đặc hiệu cao
KT phát hiện đột
biến chưa biết
DGGE
Phát hiện tất cả Độ nhạy cao (> Khó thực hiện
các đột biến của 95%)
các mẩu base
trong vùng mã

hóa và vùng ranh
giới giữa các
intron
DHPLC
Nt
Độ nhạy cao (>
95%)
SSCP
Nt
Đơn giản, nhanh
Độ nhạy 80-85%
Sequencing
Nt
Độ nhạy gần
100%
MLPA
Phát hiện các đột Đơn giản, nhanh
Khó tìm ra đột
biến mất đoạn,
biến lặp đoạn
thêm đoạn, lặp
đoạn của tất cả


25

các vùng mã hóa.
Dù sao, các kỹ thuật và phương tiện không thể giúp phát hiện ra 100%
các đột biến. Những đột biến không thể tìm thấy có thể không nằm trong các
intron hoặc vùng điều hòa của gen, là những vị trí không thường được phân

tích.
Bên cạnh các quy trình phân tích gen trực tiếp được giới thiệu ở trên,
việc phân tích các marker CFTR đa hình thái cũng có thể hữu ích trong nhiều
trường hợp cụ thể mà thường dùng nhất là trong việc nghiên cứu phả hệ.
Thiếu phần multiplex PCR, Realtime PCR để phát hiện đột biến em sẽ sử
dụng trong nghiên cứu. Phàn các phương pháp trên chỉ để tham khảo thôi.