TÌM HIỂU các VI KHUẨN gây NHIỄM KHUẨN HUYẾT tại BỆNH VIỆN hữu NGHỊ VIỆT TIỆP hải PHÒNG, 2016 2018

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

BÙI THỊ NHƯ QUỲNH

TÌM HIỂU CÁC VI KHUẨN
GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT TẠI BỆNH VIỆN
HỮU NGHỊ VIỆT TIỆP HẢI PHÒNG, 2016-2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
KHÓA 2015-2019

HẢI PHÒNG - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

BÙI THỊ NHƯ QUỲNH

TÌM HIỂU CÁC VI KHUẨN
GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT TẠI BỆNH VIỆN
HỮU NGHỊ VIỆT TIỆP HẢI PHÒNG, 2016-2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
KHÓA 2015-2019

Hướng dẫn khoa học: ThS.Lại Thị Quỳnh
ThS.Phạm Thị Tâm

HẢI PHÒNG – 2019

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những số liệu,
kết quả được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu các căn nguyên
vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tại bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải
Phòng, 2016-2018” hoàn toàn trung thực, khách quan và chưa được sử dụng
trong nghiên cứu khác.
Hải Phòng, ngày 5 tháng 6 năm 2019

Bùi Thị Như Quỳnh


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin cảm ơn Ths. Lại Thị Quỳnh và
Ths. Phạm Thị Tâm đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi những lời khuyên hết sức
bổ ích trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS.Bs Nguyễn Hùng
Cường- Trưởng khoa Kỹ thuật Y học đã tạo điều kiện cho tôi được học tập
cũng như làm việc và tham gia nghiên cứu để hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn đến các thầy cô, cán bộ, nhân viên khoa
Vi Sinh tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã hướng dẫn, chỉ bảo,
tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, thực tập và thu thập số liệu.
Đồng thời, tôi muốn gửi lời tri ân đến các thầy cô quản lý, đào tạo và
Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược Hải Phòng đã tận tâm dạy dỗ tôi
trong 4 năm học qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ- người đã sinh
thành, dưỡng dục, luôn ủng hộ mọi quyết định và lựa chọn của con. Con cảm
ơn ba mẹ đã luôn sát cánh bên con trong mọi vui buồn, khó khăn hay hạnh
phúc.

Tôi xin chân thành cảm ơn!


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BN
BV
CLSI

Bệnh nhân
Bệnh viện
Clinical and Laboratory Standards Institute – Viện tiêu chuẩn

DNA
ESBL
Gr
KS
KSĐ
NKH
PCR
SNK
VK
SHPT

lâm sàng và Xét nghiệm
Deoxyribonucleic acid
Extended Spectrum Beta Lactamase – beta lactamase phổ rộng
Gram
Kháng sinh
Kháng sinh đồ

Nhiễm khuẩn huyết
Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi polymerase
Sốc nhiễm khuẩn
Vi khuẩn
Sinh học phân tử

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN............................................................................3
1.1. Khái niệm nhiễm khuẩn huyết................................................................3


1.2. Tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và tại Việt Nam................4
1.2.1.Tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới.........................................4
1.2.2. Tình hình nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam......................................5
1.3. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết....................6
1.3.1. Quy trình lấy mẫu và chuyên chở bệnh phẩm....................................6
1.3.2. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết trên môi
trường cấy máu hai pha..................................................................................9
1.3.3. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết trên hệ thống
thiết bị tự động...............................................................................................11
1.3.4. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bằng ứng
dụng sinh học phân tử...................................................................................12
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........15
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................15
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................15
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................15
2.2.2. Phương pháp tiến hành.......................................................................15

2.3. Xử lý số liệu.............................................................................................17
2.4. Cách khắc phục sai số............................................................................17
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu......................................................................17
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................18
3.1. Xác định tỷ lệ các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp
phân lập được tại bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng, 2016 - 2018
.........................................................................................................................18
3.1.1. Tỷ lệ mẫu cấy dương tính trên tổng số mẫu máu được nuôi cấy
trong 3 năm từ 2016–2018.............................................................................18
3.1.2. Tỷ lệ mẫu cấy dương tính phân theo khoa phòng............................18


3.1.3. Tỷ lệ các căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp
phân lập được từ 2016 – 2018.......................................................................20
3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết
thường gặp phân lập được tại bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng
2016 – 2018.....................................................................................................21
3.2.1. Tình hình kháng kháng sinh của họ vi khuẩn đường ruột..............21
3.2.2. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn P.aeruginosa.................22
3.2.3. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter spp.........23
3.2.4. Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn S.aureus...............................24
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN...........................................................................25
4.1. Xác định tỷ lệ các căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết
thường gặp phân lập được tại bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng 25
4.1.1. Tỷ lệ mẫu cấy dương tính trên tổng số mẫu máu được nuôi cấy....25
4.1.2. Tỷ lệ mẫu cấy dương tính phân theo khoa phòng............................25
4.1.3. Tỷ lệ một số vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp.............26
4.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết
thường gặp.....................................................................................................28
4.2.1. Tình hình kháng kháng sinh của họ vi khuẩn đường ruột..............28

4.2.2. Tình hình kháng kháng sinh của P.aeruginosa.................................29
4.2.3. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter spp.........30
4.2.4. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn S.aureus........................32
KẾT LUẬN....................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG

Hình 1.1 Bình cấy máu hai phase

9

Hình 1.2 Hệ thống cấy máu BACT/ALERT

11

Hình 2.1 Chai cấy máu FA Plus

16

Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu cấy dương tính trên tổng số mẫu máu được nuôi cấy

18

Hình 3.2 Tỷ lệ mẫu cấy dương tính phân theo khoa phòng

19

Hình 3.3 Tỷ lệ các nhóm vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết

20

Hình 3.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh của họ vi khuẩn đường ruột

21

Hình 3.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của VK P.aeruginosa

22

Hình 3.6 Tỷ lệ kháng KS của VK Acinetobacter spp

23

Hình 3.7 Tỷ lệ kháng KS của VK S.aureus

24

Bảng 3.1 Tỷ lệ một số VK gây NKH thường gặp

20


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh nhiễm khuẩn toàn thân nặng, gây
ra do vi khuẩn (VK) và độc tố của VK lưu hành trong máu. NKH có nguy cơ tử

vong cao do sốc nhiễm khuẩn (SNK) và rối loạn chức năng nhiều cơ quan. Lâm
sàng của NKH rất đa dạng, diễn tiến thường nặng và không có chiều hướng tự
khỏi nếu không được điều trị kịp thời [2], [38], [40].
Nhiều năm qua, NKH vẫn là một trong 10 nguyên nhân chủ yếu gặp ở
bệnh nhân (BN) nhập viện. Nghiên cứu tại Mỹ trong 22 năm, từ 1979 đến 2000,
cho thấy, có 10.319.418 ca NKH, chiếm 1,3% các trường hợp nhập viện. Mặc
dù, năm 1970 chỉ có 164.000 ca NKH, nhưng trong vòng 15 năm gần đây con số
đã tăng lên 750.000 ca/năm, và tử vong cũng tăng từ 18.500 ca/năm lên đến
31.000 ca/năm và tăng dần theo tuổi (10% ở trẻ em và 38,4% ở người lớn trên
85 tuổi) [46]. Báo cáo mới đây của Trung tâm thống kê quốc gia chăm sóc sức
khỏe của Mỹ cho thấy, năm 2008, BN NKH nhập viện tăng gấp đôi so với năm
2000 (326.000 so với 727.000) [42]. Đặc biệt, nghiên cứu của Annae (2009),
NKH ngay lúc nhập viện là 836.000 ca [36]. Chi phí điều trị mỗi ca NKH dao
động từ 10.000- 50.000 đô la và lên tới 17 tỷ đô mỗi năm cho các trường hợp
NKH và thời gian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6 ngày [35], [37], [46].
Trong những năm trở lại đây, NKH cũng trở thành một thách thức lớn
đối với nền y học Việt Nam khi mà số ca mắc bệnh, tỷ lệ tử vong do NKH ngày
một gia tăng. Đồng thời có sự khác nhau về tần suất mắc bệnh cũng như loại VK
gây NKH giữa các bệnh viện (BV) trong cả nước. Theo kết quả nghiên cứu của
nhóm tác giả tại BV Trung ương Huế 2009-2012 cho thấy, các VK gây NKH
thường gặp là E.coli, K.pneumoniae và S.suis. Trong đó, E.coli chiếm 35,1%,
K.pneumoniae chiếm 14,9% và S.suis chiếm 16,2%. NKH do S.suis có khuynh
hướng ngày một gia tăng. Các VK khác gây NKH có thể gặp là: P.aeruginosa,
Burkholderia cepacia, S.aureus, Enterobacter spp... [4]. Một nghiên cứu khác
của Cao Minh Nga tại BV Thống Nhất Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả như


2
sau: các loài vi khuẩn định danh được bao gồm E.coli chiếm tỉ lệ cao nhất
(24,11%), tiếp theo là Klebsiella spp (17,85%), S.aureus (8,93%), P.aeruginosa

và Acinetobacter spp đều chiếm tỉ lệ thấp (8,04% mỗi loại) [15].
BV Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng là BV tuyến đầu của thành phố Cảng
Hải Phòng, có 1700 -1800 giường bệnh, mỗi ngày có khoảng 1000 BN đến
khám và nhập viện. Với tình hình NKH như hiện nay, số BN được chẩn đoán
NKH và điều trị tại BV ngày một gia tăng. Tuy nhiên chưa có một báo cáo cụ
thể nào về số BN NKH cũng như tỷ lệ các loại VK gây NKH tại BV. Vì vậy,
chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Xác định các căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm
khuẩn huyết và tính kháng kháng sinh của chúng tại bệnh viện Hữu nghị
Việt Tiệp Hải Phòng trong 3 năm từ 2016-2018” với hai mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ các căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp
phân lập được tại bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng, 2016-2018.
2. Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết
thường gặp phân lập được tại bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng,
2016-2018.


3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm nhiễm khuẩn huyết
NKH là bệnh lý nhiễm khuẩn rất thường gặp. Để chẩn đoán xác định
NKH ngoài biểu hiện lâm sàng đòi hỏi phải có kết quả cấy máu dương tính
nhưng kết quả thường có rất trễ trung bình 5-7 ngày sau và không phải lúc nào
cũng cho kết quả dương tính. Chính vì vậy, ngày nay người ta thường dùng thuật
ngữ “sepsis” thay cho “septicemia”, có thể hiểu “sepsis” là hội chứng nhiễm
khuẩn toàn thân dùng để diễn tả những trường hợp có kết quả cấy máu dương
tính hoặc những trường hợp nhiễm khuẩn nặng trên lâm sàng nhưng chưa có kết
quả hoặc kết quả cấy máu âm tính.
Hội chứng nhiễm khuẩn toàn thân là tình trạng đáp ứng viêm toàn thân mất
kiểm soát có thể dẫn đến SNK, rối loạn chức năng các cơ quan và tử vong [21].

Sau hội nghị đồng thuận năm 1991 và được khẳng định lại tại Hội nghị
lần thứ 2 năm 2001, American College of Chest Physicians (ACCP) và Society
of Critical Care Medicine (ACCP) đã đưa đến thống nhất một số thuật ngữ dùng
trong NKH.
Nhiễm khuẩn (Infection): Sự hiện diện của vi sinh vật ở những nơi mà
bình thường vô trùng, có hay không kèm theo đáp ứng viêm của cơ thể.
Du khuẩn huyết (Bacteriemia): Sự hiện diện thoáng qua của VK trong
máu tuần hoàn được xác định bằng cấy máu.
Hội chứng nhiễm khuẩn toàn thân (Sepsis): Lâm sàng nghĩ đến nhiễm
khuẩn và có sự đáp ứng toàn thân do nhiễm khuẩn (nhịp tim nhanh, thở nhanh,
sốt cao hay hạ thân nhiệt).
Hội chứng đáp ứng viêm toàn thân (SIRS): Là phản ứng toàn thân của cơ
thể gây ra bởi nhiều tác nhân, có thể do nhiễm trùng (vi khuẩn, siêu vi hoặc
nấm) hoặc không do nhiễm trùng (chấn thương, bỏng, viêm tụy cấp...). Được
biểu hiện khi có 2 hay nhiều dấu hiệu sau:


4
- Nhiệt độ >38°C hay <36°C
- Nhịp tim >90 lần/ phút
- Nhịp thở >20 lần/ phút hoặc PaCO2 <32mmHg
- BC >12.000mm3 hoặc <4000/mm3 hoặc >10% chưa trưởng thành (Band
Neutrophil)
Hội chứng nhiễm khuẩn huyết (Sepsis syndrome): NKH có giảm tưới máu
cơ quan với ít nhất một trong các biểu hiện sau: thay đổi tình trạng tri giác, thiểu
niệu, tăng lactat máu và thiếu oxy.
Hạ huyết áp (Hypotension): Huyết áp tâm thu <90mmHg hoặc giảm
>40mmHg so với huyết áp cơ bản trước đó mà không có nguyên nhân khác.
Hội chứng nhiễm khuẩn toàn thân nặng (Severe sepsis): NKH có rối loạn
chức năng cơ quan, giảm tưới máu mô hoặc hạ huyết áp. Giảm tưới máu mô và

những rối loạn về tưới máu có thể bao gồm nhưng không nhất thiết giới hạn ở
nhiễm toan lactic, thiểu niệu hoặc tri giác xấu đi cấp tính.
SNK (Septic shock): Hội chứng NKH với hạ huyết áp. Giảm tưới máu mô
và những rối loạn về tưới máu có thể bao gồm nhưng không nhất thiết giới hạn ở
nhiễm toan lactic, thiểu niệu hoặc giảm tri giác xấu đi cấp tính.
SNK khó hồi phục (Refactory shock): Hội chứng NKH có hạ huyết áp
kéo dài trên 1 giờ không đáp ứng với dịch truyền tĩnh mạch hoặc thuốc vận
mạch hỗ trợ.
Hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan: Đông máu nội mạch lan tỏa,
hội chứng suy hô hấp cấp, suy thận cấp, rối loạn chức năng gan mật, rối loạn
chức năng hệ thần kinh trung ương [21].
1.2. Tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và tại Việt Nam
1.2.1.Tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới
Mặc dù tần suất mắc NKH khác nhau tùy theo quốc gia, BV, mùa trong
năm, đường vào của VK và đối tượng BN, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ
lệ NKH chiếm 3-10% BN nhập viện và có thể tăng tới 75% nếu BN nằm điều trị


5
tại khoa hồi sức tích cực. Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, dao động 30-50%, tùy theo
nghiên cứu của các tác giả ở những nhóm BN khác nhau trên thế giới [37], [39].
Tại Mỹ, một nghiên cứu trong vòng 22 năm từ năm 1979-2000 trên những
BN nhập viện cho thấy, có tổng số 10.319.418 trường hợp được chẩn đoán là
NKH, chiếm 1,3% số BN nhập viện, trong đó có các trường hợp mới mắc là
17,3%/năm. Tần suất mắc bệnh trên 100.000 dân cư tăng từ 164.000 ca (82,7
ca/100.000 dân) năm 1979 lên tới 660.000 ca (240,5 ca/100.000 dân) trong
những năm gần đây. Tuy nhiên, ngược lại tỷ lệ tử vong lại giảm từ 28,7% (năm
1979-1984) xuống còn 17,9% (năm 1995- 2000) do những nỗ lực can thiệp
trong chẩn đoán, điều trị đem đến [46]. Một nghiên cứu khác của Lambiase và CS.,
năm 2011 cho thấy tỷ lệ NKH tiên phát tăng từ 11,6/10.000 ca (2000) lên đến

24/10.000 ca (2008) và NKH được coi như là một chẩn đoán thứ hai trong quá
trình nằm viện tăng từ 22,1/10.000 ca (2000) lên đến 37/10.000 ca (2008) [45].
Tại Anh, nghiên cứu của Harrison và CS., năm 2006 trên 92.673 BN nhập
viện cho thấy, tình trạng NKH nặng xuất hiện trong vòng 24h đầu tăng từ 23,5%
(1996) lên đến 28,7% (2004) và tử vong cũng tăng từ 9.000 ca (48,3%) năm
1996 lên đến 14.000 ca (44,7%) năm 2004 [43].
Nghiên cứu của Jason và CS., năm 2011, tại 150 khoa hồi sức tích cực của
16 nước trong khu vực châu Á, tỷ lệ NKH trên BN nằm tại khoa hồi sức tích cực
tỷ lệ dao động từ 5-53% tùy theo quốc gia [44]. NC của Divatia và CS., năm
2012, ở Ấn Độ trên BN nhập viện vào khoa hồi sức tích cực cho thấy, tỷ lệ NKH
là 26%, tử vong 38% [41].
1.2.2. Tình hình nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam
Tại Việt Nam, trong báo cáo của Nguyễn Văn Kính và CS, năm 2008 khi
phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh (KS) tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ NKH
nói chung là 8% [14]. Nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và nhóm MIDAS năm
2008-2009, về tính kháng thuốc của các VK Gram âm cho thấy sự đề kháng với
nhóm carbapenem của trực khuẩn Gram âm ở BN có cấy máu dương tính là


6
11,7% [33]. Mới đây, NC của Vũ Đình Phú và CS., năm 2013 ở các khoa hồi
sức tích cực của 15 BV trong toàn quốc cho thấy tỷ lệ NKH chiếm 10,4% [22].
Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hà “Nghiên cứu đặc điểm lâm
sàng và vi sinh ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do A.baumannii (2011- 2012)”
cho thấy tình trạng có SNK ngay lúc chẩn đoán NKH gặp ở cả người lớn và trẻ
em. Theo diễn tiến của bệnh thì tỷ lệ SNK ở nhóm tử vong cao hơn nhóm BN
còn sống. Cũng theo nghiên cứu này có tới 66,47% BN NKH ở trẻ em lúc nhập
viện có SIRS, trong khi đó ở người lớn chiếm 48,3% và đặc biệt ở nhóm BN tử
vong cả trẻ em và người lớn có tình trạng SIRS rất cao so với nhóm còn sống
(91,1% và 83,6% so với 8,8% và 16,3% với p <0,05). Điều này cho thấy tình

trạng SIRS là một trong những dấu hiệu quan trọng chẩn đoán và tiên lượng
NKH, đặc biệt nhất là ở nhóm BN tử vong [8].
Tác nhân gây NKH rất đa dạng, có thể là VK Gram âm, VK Gram dương
hoặc Nấm. Tần suất mắc bệnh cũng như loại tác nhân gây bệnh giữa các BV, các
vùng, các quốc gia khác nhau là khác nhau. Một nghiên cứu gần đây của
Nguyễn Nhị Hà và Phạm Hồng Nhung tại BV Bạch Mai năm 2016 cho thấy, tác
nhân gây NKH thường gặp là E.coli, Klebsiella pneumoniae, S.aureus,
Acinetobacter baumannii và P.aeruginosa [7]. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên
cứu của nhóm tác giả tại BV Trung ương Huế, 2009-2012 cho thấy các căn
nguyên hàng đầu gây NKH lại bao gồm: E.coli, K.pneumoniae, và S.suis [4].
1.3. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết
1.3.1. Quy trình lấy mẫu và chuyên chở bệnh phẩm
1.3.1.1. Chỉ định cấy máu
Cấy máu nên được bác sĩ điều trị chỉ định trước các trường hợp nhiễm
trùng có thể có khuẩn huyết (bacteremia)

hay gây nhiễm trùng huyết

(septicemia).
Cụ thể, bác sĩ điều trị nên cho chỉ định cấy máu trước các BN có một
trong các triệu chứng nghi ngờ nhiễm trùng như sốt, ớn lạnh, lạnh run kèm các
dấu hiệu nghi ngờ nguồn gốc nhiễm trùng như có tiếng thổi tim (cardiac mumur)


7
nghi ngờ viêm nội tâm mạc, ran ẩm ở phổi nghi ngờ nhiễm trùng hô hấp dưới,
cổ cứng hay dấu Kemig nghi ngờ viêm màng não mủ, đau hạ sườn phải nghi
ngờ nhiễm trùng túi mật, đau hố chậu phải nghi ngờ viêm ruột thừa, cứng bụng
nghi ngờ viêm phúc mạc, tiểu giắt- khó- đau nghi nhiễm trùng niệu, đau hông
hay đau lưng nghi ngờ viêm thận mủ, nhiễm trùng da mô với triệu chứng viêm

cấp tính sưng đỏ nóng đau...Chỉ định cấy máu là một chỉ định bắt buộc trước các
trường hợp BN có các biểu hiện nghi ngờ NKH trên lâm sàng và có trên hai
trong bốn dấu hiệu của đáp ứng viêm toàn thân. Chỉ định cấy máu cũng là một
chỉ định bắt buộc trước các BN nghi ngờ nhiễm trùng huyết có diễn tiến đe dọa
tính mạng như xuất huyết ở da hay niêm mạc, xuất huyết dạng sao (splinder)
trên móng tay, choáng nhiễm trùng kéo dài.
1.3.1.2. Thời điểm cấy máu
Cấy máu được thực hiện trước khi BN dùng KS hệ thống, có nghĩa là
trong BV, bác sĩ phải cho cấy máu trước khi bắt đầu cho BN dùng KS. Tuy
nhiên, trong các trường hợp BN đang điều trị KS nhưng các triệu chứng của
nhiễm trùng gây khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết vẫn không thuyên giảm thì
bác sĩ vẫn nên chỉ định thực hiện cấy máu mà không cần phải ngưng KS điều trị
để phát hiện tác nhân VK gây nhiễm trùng, và trong trường hợp này phải cho
cấy máu trước khi sử dụng liều KS tiếp theo. Thời điểm tốt nhất để cấy máu là
khi BN bị ớn lạnh hay đang lạnh run trước khi sốt, hay lúc BN đang lên cơn sốt.
1.3.1.3. Kỹ thuật lấy máu:
Lấy máu tĩnh mạch bằng phương pháp vô trùng. Trước hết sát trùng da
bằng cồn iodine 2% hay polyvidone iodine 10%, hay cồn 70%, hay chlohexidine
0,5% trong cồn 70%. Chờ cồn khô ít nhất 15 giây dùng kim tiêm vô trùng để lấy
máu tĩnh mạch. Sau khi lấy máu xong, sát trùng da lại và dán băng keo cá nhân.
Nếu trường hợp trước khi lấy máu sát trùng da bằng cồn có iodine thì sau khi lấy
máu có thể tẩy vết màu của iodine bằng alcohol 70%. Máu sau khi lấy được tiêm


8
ngay vào chai môi trường cấy máu. Trước khi tiêm vào chai môi trường phải
khử trùng nút cao su đậy trên miệng chai bằng các dung dịch khử trùng ở trên và
chờ khô rồi mới đâm xuyên vào nút cao su để bơm máu vào môi trường cấy máu
có trong chai. Cấy máu là một thủ thuật phải thực hiện ngay tại giường bệnh, do
vậy mà kỹ thuật viên hay điều dưỡng thực hiện cấy máu phải lưu ý thủ thuật vô

trùng được hướng dẫn, có như vậy mới tránh được nguy cơ ngoại nhiễm làm sai
lệch kết quả cấy máu.
1.3.1.4. Lượng máu dùng để cấy máu
Do số lượng VK trong mỗi ml máu thường thấp nên cần lấy đủ thể tích
máu để cấy. Thông thường ở người lớn thì phải lấy từ 8-10ml máu tĩnh mạch
cho mỗi chai cấy máu. Thể tích máu được lấy để cấy vào chai cấy máu là nên
bằng hay dưới 1/5 thể tích môi trường cấy máu có trong chai cấy máu.
Mỗi lần cấy máu nên cấy vào hai chai, một chai hiếu khí và một chai kỵ
khí, lấy cùng vào một thời điểm, hoặc có thể cách nhau 30 phút. Có thể cấy máu
trong vòng 1 giờ đầu, sau khi BN lên cơn sốt, và thực hiện cấy máu tại hai vị trí
lấy máu khác nhau trên cơ thể. Nếu không có chai kỵ khí thì sử dụng cả hai
chai hiếu khí nhằm tăng khả năng bắt được vi khuẩn và loại trừ ngoại nhiễm.
Một bệnh nhân có thể cấy máu nhiều lần, đặc biệt với những trường hợp có
nghi ngờ viêm nội tâm mạc, viêm cơ tim.
1.3.1.5. Bảo quản và vận chuyển chai cấy máu
- Chai máu nuôi cấy cần được chuyển ở tư thế đứng thẳng và an toàn
trong hộp đựng có nắp hoặc trong túi để trong hộp vận chuyển.
- Vận chuyển bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt (trước 2h)
- Trong trường hợp chưa thể chuyển bệnh phẩm thì bảo quản ở nhiệt độ
phòng (không bảo quản trong tủ lạnh)


9
1.3.2. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết trên môi trường
cấy máu hai pha
Chai cấy máu hai pha là sản phẩm từ đề tài nghiên cứu cấp bộ của TS.BS
Phạm Hùng Vân. Chai cấy máu gồm hai pha là pha đặc và pha lỏng trong cùng
một chai môi trường nhưng tách rời nhau. Sản phẩm này chỉ dùng một lần
(disposable), không dùng lại được. Cấu tạo gồm các thành phần sau: (1) Chai
bằng nhựa trong suốt; (2) Nút cao su làm bằng cao su trung tính để chọc kim lấy

máu qua và (3) Nắp vặn bằng nhựa màu đỏ để mở nắp
chai cấy máu thực hiện cấy truyền khi đã có dấu hiệu
VK mọc trong pha lỏng hay trên bề mặt pha đặc; (4) Nắp che
bằng nhựa màu xanh lá để bảo vệ phần nút cao su; (5) Pha
đặc là mặt môi trường BHI agar (Difco, Oxoid hay Merck);
(6) Pha lỏng là BHI lỏng (Difco, Oxoid hay Merck) có SPS
(Sigma); (7) Vách ngăn pha đặc và pha lỏng để pha lỏng
không ngấm vào pha đặc.
 Chai cấy máu hai pha có ưu điểm:

Hình 1.1: Bình cấy máu 2
pha.

- Tránh được ngoại nhiễm nhờ không cần phải mở nắp chai cấy máu mà
vẫn thực hiện được cấy truyền bằng cách tráng pha lỏng qua pha đặc mỗi ngày
để theo dõi VK mọc ngay trong chai cấy máu;
- Sử dụng môi trường cấy máu lý tưởng vì chế từ môi trường BHI đảm
bảo chất lượng cao của Difco, Oxoid hay Merck;
- Dùng kháng đông là SPS của Sigma với các công dụng: ức chế được
thực bào, ức chế được tác động của kháng sinh aminoglycosides và kháng đông
nhờ đó VK không bị bẫy trong cục máu đông;
- Tách rời pha lỏng và pha đặc do vậy nếu trong máu có chất ức chế VK
(KS) thì chất ức chế từ máu vào pha lỏng sẽ không thấm qua pha đặc nhờ vậy
giúp VK dù không mọc được ở pha lỏng vẫn có thể mọc được ở pha đặc;
- Làm được định danh và làm kháng sinh đồ (KSĐ) trực tiếp từ các
khúm VK mọc trên pha đặc mà không cần chờ cấy phân lập VK mọc trong


10
chai cấy máu, rút ngắn thời gian phòng xét nghiệm trả lời kết quả chung cuộc

đến lâm sàng.
Theo dõi sự phát triển của VK trong chai cấy máu:
Ngay sau khi bơm máu vào chai, chai cấy máu phải được ủ trong tủ ấm
35ºC hay 37ºC và theo dõi hằng ngày trong 5-7 ngày xem có VK mọc bằng
cách quan sát bằng mắt thường trong môi trường cấy máu lỏng, đó là (1) có hạt
đóng trên mặt hồng cầu, (2) đục đều hay có màng, (3) tiêu huyết, (4) đông huyết
tương, (5) có gas, (6) có hạt trắng trong lớp hồng cầu hay mặt lớp hồng cầu. Lưu
ý phải tráng pha lỏng lên trên pha đặc rồi nghiêng tách pha lỏng khỏi pha đặc
trước khi ủ vào tủ ấm. Mỗi ngày phải quan sát mặt thạch của pha đặc xem có
khúm VK mọc trên pha đặc hay không. Nếu không có tiến hành tráng pha lỏng
lên pha đặc rồi tiếp tục ủ. Do có một số VK rất dễ bị ly giải sau khi mọc trong
môi trường lỏng như S.pneumoniae, hay khó mọc thành khúm trên pha đặc của
chai cấy máu hai pha như Streptococci vì vậy bất cứ lúc nào phát hiện có dấu
hiệu VK mọc (trên pha đặc có khúm VK mọc hay trong pha lỏng có một trong
các dấu hiệu VK mọc như kể trên) hay nghi ngờ VK mọc, tiến hành cấy ngay
trên môi trường thạch dinh dưỡng (tốt nhất là thạch nâu bổ sung XV = CAXV
nếu không có thì cấy trên thạch máu, sau đó ủ trong tủ ấm CO 2 hay bình nến) và
đồng thời làm một phết lam Gram để xem có VK hay không. Nếu có VK phải
thông báo cho lâm sàng và có thể làm ngay KSĐ trực tiếp VK mọc trong chai
cấy máu.Nếu trên pha đặc có VK mọc thì tiến hành định danh và làm KSĐ theo
đúng chuẩn mực ngay mà không cần phân lập VK mọc trong môi trường cấy
máu. Sau 5 ngày theo dõi chai cấy máu, phải cấy truyền một lần nữa để chắc
chắn không có VK mọc trong môi trường cấy máu trước khi trả lời kết quả cấy
máu âm tính.


11
1.3.3. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết trên hệ thống
thiết bị tự động.
Kỹ thuật phát hiện VK bằng hệ thống thiết bị tự động là một bước tiến

quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị NKH. Kỹ thuật này cho phép phát
hiện VK nhanh chóng và chính xác các VK, nấm và VK lao trong máu và trong
các dịch vô trùng trong cơ thể như dịch
màng phổi. Hệ thống thiết bị tự động bao
gồm các phần cơ bản: Giao diện là màn hình
cảm ứng màu, ổ đĩa Zip để lưu trữ dữ liệu,
bộ phận ủ nhiệt cho các chai cấy, máy tính
và phần mềm điều khiển, quản lý dữ liệu kết
hợp bên trong máy.
Thao tác với người sử dụng đơn giản,
nhanh gọn, dễ tiếp cận. Máu sau khi bơm
vào các chai môi trường sẽ được quét mã để

Hình 1.2: Hệ thống cấy máu
BACT/ALERT

lưu thông tin. Hệ thống sẽ cho biết các vị trí nuôi cấy còn trống qua đèn báo. Từ
đó, người sử sử dụng có thể dễ dàng đưa chai cấy vào. Hệ thống máy hoàn toàn
tự động có khả năng ủ, lắc và theo dõi liên tục, phát hiện sự hiện diện của VK
trong các chai cấy máu. Các chai cấy máu tự động này chỉ có một pha lỏng với
môi trường dinh dưỡng là TSB và sử dụng chất kháng đông là SPS.
Ngoài ra, trong môi trường cấy máu tự động còn có các hạt resin có vai
trò trung hòa KS. Khí trường trong chai cấy máu tự động có chứa CO 2 và O2
thích hợp cho nhiều VK khác nhau. Chai cấy máu kỵ khí chứa khí trường CO 2,
N2 và không chứa O2. Dưới đáy chai cấy máu có một lớp nhựa chứa hóa chất có
khả năng phát huỳnh quang khi có sự gia tăng hàm lượng CO 2 hay có sự khử O2
của môi trường chai cấy máu nhờ vậy mà máy theo dõi chai máu tự động có thể
phát hiện được chai máu nào là dương tính vì khi có VK mọc trong môi trường
cấy máu thì hàm lượng CO 2 trong môi trường sẽ gia tăng hay O 2 bị khử đi do sự
biến dưỡng của VK.

12
Hệ thống tự động theo dõi chai cấy máu có trang bị quang học tự động
phát ra nguồn sáng có bước sóng thích hợp đến đáy chai cấy máu và ghi nhận
ánh sáng huỳnh quang phát ra từ đây. Khi bắt đầu hoạt động, hệ thống tự động
kiểm tra mức phát quang ở đáy chai cấy máu để ghi nhận mức phát quang nền
và sau đó, cứ mỗi lần 10 phút hệ thống tự động kiểm tra cường độ huỳnh quang
phát ra từ đáy của các chai cấy máu. Một khi có VK mọc bên trong một chai cấy
máu nào đó thì sẽ làm nồng độ CO 2 trong môi trường cấy máu của chai này tăng
lên và làm cho hóa chất trong lớp nhựa ở đáy chai cấy máu được phát huỳnh
quang vượt quá mức huỳnh quang nền, nhờ vậy hệ thống sẽ phát tín hiệu cho
biết chai cấy máu đó dương tính tức là có VK mọc. Lúc này người làm xét
nghiệm sẽ lấy chai máu dương tính này ra để thực hiện khảo sát trực tiếp và cấy
trên mặt thạch để tiến hành định danh và làm KSĐ. Nếu phết nhuộm Gram phát
hiện sự hiện diện của VK thì người làm xét nghiệm phải thông báo kết quả sơ bộ
ngay cho lâm sàng và có thể làm KSĐ trực tiếp để có kết quả KSĐ sớm nhưng
tạm thời đến bác sĩ điều trị.
1.3.4. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bằng ứng dụng
sinh học phân tử.
Cấy máu là chuẩn vàng để phát hiện du khuẩn huyết hay nhiễm trùng
huyết. Tuy nhiên, cấy máu cũng có một số hạn chế làm giảm độ nhạy của
phương pháp như BN đã dùng KS trước đó, cấy máu không đúng thời điểm hay
thể tích máu lấy để cấy không đủ, hay một số VK dù hiện diện trong máu nhưng
cũng khó phát hiện như các VK thuộc nhóm HACAEK (Haemophilus
aphrophilus,

Actinobaccillus

actinomycetemcomitans,

Cardiobacterium

hominis, Eikenella corrodens, và Kingella kingae) là các trực khuẩn Gr (-) gây
viêm nội tâm mạc và rất khó mọc; hay các VK cũng rất khó mọc và ít gặp hay
chỉ gặp trong các trường hợp dịch tễ đặc biệt hay lâm sàng đặc biệt như
Capnocytophaga, Rothia dentocariosa, Flavobacterium và Chromobacterium,
Borrelia recurrentis, Leptospira, hoặc các VK mọc rất chậm như
Campylobacter, Helicobacter, Brucella, Granulicatella, Abiotrophia, Coxiella


13
buneti, Bartonella... Thậm chí những tác nhân không thể hay khó nuôi cấy như
Mycoplasma, Chlamydia, và virus.
Chính vì vậy, giải pháp sinh học phân tử (SHPT) dựa trên kỹ thuật realtime PCR đang được ứng dụng để phát hiện các tác nhân thường gặp trong
nhiễm trùng huyết hay khuẩn huyết. Nguyên tắc của phương pháp này là tách
chiết toàn bộ nucleic acid có trong mẫu máu lấy từ BN, sau đó cho vào các realtime PCR mix chứa các mồi và đoạn dò đặc hiệu của tác nhân vi sinh gây bệnh
muốn tìm, rồi chạy chương trình luân nhiệt thích hợp để khuếch đại và phát hiện
các nucleic acid của vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu.
Một phương pháp SHPT khác cũng được áp dụng, đó là phương pháp
meta-genomic sử dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS = Next Generation
Sequensing) để phát hiện các tác nhân vi sinh gây bệnh hiện diện trong mẫu
máu. Phương pháp meta-genomic có thể phát hiện định lượng cũng như cho biết
tỷ lệ của tất cả các DNA đích của tác nhân vi sinh có trong mẫu. Đây chính là
một giải pháp không chỉ phát hiện được các tác nhân đã biết mà còn có thể phát
hiện các tác nhân nhiễm trùng bí mật mà chúng ta còn chưa biết.
Kỹ thuật Multiplex-PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có
thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều
cặp mồi (primer) trong một phản ứng. Multiplex – PCR lần đầu tiên được mô tả
bởi Chamberlain năm 1988, và kể từ đó đến nay được sử dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục đích khác nhau
như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do VK hay phát hiện gen kháng KS của
các VK [32].
Trong những năm trở lại đây, nền y học Việt Nam đã đạt được những thành
tựu đáng khích lệ trong việc phát hiện theo dõi tác nhân gây NKH. Xuất phát từ
thực tế phương pháp PCR gặp phải khó khăn là để dư thừa quá nhiều DNA của
người trong mẫu so với lượng DNA của VK, mới đây dưới sự chỉ đạo, chủ trì
của PGS. TS. Lê Hữu Song, nhóm nghiên cứu của BV 108 do TS. Ngô Tất
Trung và cộng sự đã tập trung nghiên cứu và tìm ra giải pháp cho vấn đề này.


14
Nhóm tác giả đã tìm được phương pháp loại bỏ hơn 99% DNA của người mà
không làm mất DNA của VK trong mẫu máu. Từ đó nâng tỷ lệ dương tính của
PCR lên hơn 50% so với cấy máu chỉ là 34%. Công trình đã vinh dự được Hội y
khoa Thụy Sĩ – Việt Nam đánh giá là một trong bốn công trình xuất sắc nhất của
Việt Nam năm 2017 và được trao tặng giải thưởng Alexandre Yersin.


15
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các mẫu bệnh phẩm cấy máu đủ tiêu chuẩn chấp nhận nuôi cấy được gửi
về khoa Vi sinh làm xét nghiệm từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2018 (theo tiêu
chuẩn chấp nhận và từ chối mẫu bệnh phẩm- phụ lục 1).
- Các dữ liệu định danh VK và KSĐ được lưu trữ bằng phần mềm
Whonet 5.6
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2018
- Địa điểm nghiên cứu: Tại khoa Vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp
Hải Phòng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả cắt ngang.
2.2.2. Phương pháp tiến hành
(Phương pháp nuôi cấy và làm KSĐ trên hệ thống thiết bị tự động)
2.2.2.1.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm
a. Thiết bị, dụng cụ
- Máy cấy máu tự động BACT/ALERT 3D;
- Tủ ấm thường, tủ ấm CO2;
- Kính hiển vi quang học vật kính dầu;
- Que cấy;
- Giá để ống nghiệm;
- Đèn cồn;
- Lam kính sạch, lamen;
- Bút viết kính, bút chì HB;
- Pipett Paster vô trùng;
- Bơm kim tiêm nhựa vô trùng.


16
b. Hóa chất, sinh phẩm
- Chai cấy máu FA Plus (FA aerobic) 50ml
peptone giàu TSB, có các hạt resin có khả năng
trung hòa nhiều loại kháng sinh khác nhau, giúp
cho khả năng phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong
mẫu máu được tăng lên đáng kể. Chai cấy máu
dành cho các vi khuẩn hiếu khí hay hiếu kị khí tùy

tiện. Các chai môi trường được thiết kế sử dụng
một lần.

Hình 2.1: Chai cấy máu FA Plus

- Môi trường nuôi cấy và làm KSĐ: các loại thạch đĩa như thạch máu,
thạch Mac Conkey không tím, thạch socola, thạch Sabouraurd.
- Môi trường xác định tính chất sinh vật hóa học: KIA, Citrat Simon,
thạch thường nghiêng, thạch mềm, ure-indol
- Thẻ định danh và làm KSĐ vi khuẩn hoặc nấm
- Bộ thuốc nhuộm Gram
- Dầu soi kính
- Các thuốc thử: oxidase, catalase …
- Kháng huyết thanh đặc hiệu các type của Salmonella, Shigella, Vibrio
cholera, Streptococcus
- Khoanh giấy KS của Oxoid, Mast.
2.2.2.2. Kỹ thuật cấy máu vào môi trường nuôi cấy
Kỹ thuật lấy máu và cấy máu vào môi trường nuôi cấy - Phụ lục 2
2.2.2.3. Các bước tiến hành
a. Nhận mẫu và vào sổ.
- Quan sát tình trạng của chai cấy máu, quan sát điều kiện bảo quản và
thời gian vận chuyển phù hợp
- Tra thông tin giữa chai cấy máu và trên hệ thống máy tính
- Đánh số thứ tự cho chai cấy máu


17
- Dán barcode và ghi chép đầy đủ thông tin của chai cấy máu vào sổ
b. Đưa bình cấy máu vào máy cấy máu tự động BACT/ALERT 3D
c. Theo dõi, phân lập và xác định vi khuẩn

+)Theo dõi chai cấy máu.
- Máy báo kết quả âm tính (-) khi đủ 7 ngày theo dõi và trên màn hình
hiển thị tổng số bình âm tính. Thực hiện thao tác lấy bình âm tính ra (xem thêm
trong hướng dẫn sử dụng máy).
- Máy báo dương tính (+) bằng âm thanh và toàn màn hình chuyển màu
vàng. Bấm vào biểu tượng (dương tính) trên màn hình máy cấy máu
BACT/Alert 3D, vị trí của những chai cấy máu dương tính được thể hiện bằng
đèn sáng trên cửa khoang chứa và tại góc trên bên phải của vị trí để chai cấy
máu,tiến

hành

phân

lập

và

xác

định

vi

khuẩn

gây

bệnh

Chú ý: Theo dõi sau 4 ngày nuôi cấy mà bình máu vẫn không mọc thì trả kết quả
âm tính sơ bộ và theo dõi tiếp đến ngày thứ 7.
+)Định danh vi khuẩn và làm KSĐ
- Bình cấy máu dương tính được đưa ra khỏi máy và tiến hành phân lập
ngay, càng sớm càng tốt và có khả năng bắt được căn nguyên cao nhất.
2.3. Xử lý số liệu
- Số liệu được xử lý và phân tích bằng phần mềm WHONET 5.6
2.4. Cách khắc phục sai số
- Có sự hướng dẫn và giám sát quy trình thu thập số liệu của nhân viên
khoa Vi sinh.
- Phải trang bị kiến thức và có chuyên môn trong các quy trình xét nghiệm
phân lập và làm KSĐ.
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu
- Khóa luận được sự đồng ý của lãnh đạo BV, trưởng khoa Vi sinh Bệnh
viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng.
- Nghiên cứu có sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, trưởng khoa Kỹ
thuật Y học.
- Thông tin BN được bảo mật, chỉ nhằm mục đích nghiên cứu.