NGHIÊN cứu QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu HUYẾT TƯƠNG sử DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
******

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU
HUYẾT TƯƠNG SỬ DỤNG TRONG
CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV- DNA

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Trần Phương
Đặng Quang Huy

HÀ NỘI – 2017


CÁC CÁN BỘ THAM GIA NGHIÊN CỨU
1.Nguyễn Thị Thùy- BSNT Hóa Sinh khóa 39
2.Lê Ngọc Thúy sinh viên kỹ thuật y học


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................... 3
1.1. Virus viêm gan B ............................................................. 3
1.1.1. Hình thái virus......................................................... 3

1.1.2. Cấu trúc bộ gen virus.............................................. 4
1.1.3. Chu kỳ nhân lên của virus....................................... 5
1.1.4. Kiểu gen của HBV và vai trò sinh bệnh học............. 6
1.1.5. Dịch tễ học.............................................................. 7
1.2. Xét nghiệm định lượng HBV-DNA trong phòng xét nghiệm.
8
1.2.1. Ý nghĩa lâm sàng định lượng HBV- DNA.................. 8
1.2.2. Kĩ thuật định lượng HBV- DNA................................. 9
1.2.3. Kỹ thuật Real-time PCR .....................................................10
1.3. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm.................................... 13
1.3.1. Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm ......................14
1.3.2. Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm...................15
1.4. Tiêu chuẩn về mẫu chuẩn.............................................. 19
1.4.1. Tiêu chuẩn quốc tế về mẫu chuẩn......................... 19
1.4.2. Tiêu chuẩn cơ sở 20
1.5. Xét nghiệm định lượng HBV-DNA tại Việt Nam............... 22
1.5.1. Hệ thống các phòng xét nghiệm định lượng HBV-DNA tại
Việt Nam............................................................................22
1.5.2. Các phương pháp sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng
xét nghiệm định lượng HBV-DNA..................................... 23


1.6. Quy trình sản xuất mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng
dạng đông khô HBV-DNA................................................ 23
1.6.1. Về phương pháp điều chế...................................... 23
1.6.2. Quy trình chuẩn bị huyết tương đông khô theo hướng
dẫn của WHO ....................................................................24
1.7. Phương pháp đánh giá độ ổn định ngắn hạn ................ 24
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
27

2.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................ 27
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu................................................ 27
2.1.2. Tiêu chuẩn chấp nhận........................................... 27
2.1.3. Tiêu chuẩn loại bỏ.................................................. 27
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu....
27
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................ 28
2.3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................28
2.3.2. Xây dựng bộ mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng
dạng đông khô HBV-DNA................................................. 28
2.3.3 Xác định đặc tính của mẫu kiểm tra chất lượng..... 29
2.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở............................................. 32
2.4.1 Yêu cầu kỹ thuật.............................................................................32
2.4.2. Đánh giá chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra chất
lượng dạng đông khô HBV-DNA. .................................................33
2.5. Phương pháp thử nghiệm đánh giá ngoại kiểm xét
nghiệm định lượng HBV-DNA.......................................... 35
2.6. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................... 38


3.1. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết tương
kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA................ 38
3.1.1. Phương trình đường chuẩn định lượng HBV-DNA... 38
3.1.2. Kết quả phân tích đặc điểm bộ mẫu kiểm tra chất
lượng................................................................................ 40
3.2. Kết quả đánh giá chất lượng bộ mẫu............................. 41
3.2.1. Chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra HBV- DNA dạng
đông khô.......................................................................... 41
3.3. Độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết tương kiểm

tra dạng đông khô HBV- DNA ..........................................44
3.3.1 Độ đồng nhất của mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng
dạng đông khô HBV-DNA................................................ 44
3.3.2 Độ ổn định dài hạn của mẫu huyết tương kiểm tra
chất lượng dạng đông khô HBV-DNA ........................................48
3.3.3. Kết quả so sánh chất lượng mẫu huyết tương kiểm
tra với tiêu chuẩn Iso 13528............................................ 51
3.3.4. Độ ổn định ngắn hạn của mẫu kiểm tra chất lượng
xét nghiệm định lượng HBV- DNA.................................... 51
3.4. Kết quả thử nghiệm ngoại kiểm xét nghiệm định lượng
HBV-DNA......................................................................... 52
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN............................................. 55
4.1. Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô...... 55
4.1.1. Thu thập và xử lý mẫu huyết tương...................... 55
4.1.2. Chia và đông khô mẫu kiểm tra chất lượng........... 58
4.1.3. Trọng lượng khô của vật liệu nghiên cứu............... 59
4.1.4. Đánh giá chất lượng thiết bị phân tích mẫu.......... 59


4.1.5. Đánh giá độ đồng nhất của bộ mẫu chuẩn HBV-DNA
60
4.1.6. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn HBV-DNA 61
4.1.7. Độ ổn định ngắn hạn của mẫu huyết tương kiểm tra
dạng đông khô sử dụng trong xét nghiệm định lượng HBVDNA. 64
4.2. Đánh giá kết quả thử nghiệm ngoại kiểm...................... 64
4.3. Tiêu chuẩn cơ sở............................................................ 65
KẾT LUẬN ...............................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HBV

: Hepatits B Virus

DNA

: Deoxyribonucleic acid

HBsAg

: Hepatitis B Surface Antigen

HBc

: Hepatitis B Core

PCR

: Polymerase chain reaction

EQA

: External quality assessment

QA

: Quality assurance

QC

: Quality Control

IQC

: Internal Quality Control

ISO

:

WHO

Standardization

International

Organization

: World Health Organization

for


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc HBV............................................................ 3
Hình 1.2: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan......... 5
Hình 1.3: Nguyên lý kỹ thuật Realtime PCR.......................... 11
Hình 1.4: Biểu đồ biểu diễn sự khuếch đại mẫu.................... 12
Hình 1.5: Đường biểu diễn kết quả của các nồng độ............ 13

Hình 1.6: Tính xác thực của xét nghiệm............................... 15
Hình 1.7: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm........... 16
Hình 3.1: Đường tín hiệu của các mẫu chuẩn HBV-DNA........ 38
Hình 3.2: Bộ mẫu chuẩn sau khi chia.................................... 41
Hình 3.3: Mẫu đông khô bị loại bỏ......................................... 42
Hình 3.4: Trước và sau hoàn nguyên của mẫu đông khô...... 42
Hình 3.5: Kết quả đồng nhất mẫu nồng độ thấp và nồng độ
cao........................................................................... 46
Hình 3.6: Kết quả chạy độ ổn định tháng 9........................... 49
Hình 3.7: Thời gian bộ mẫu vận chuyển đến các đơn vị và
quay trở lại Trung tâm kiểm chuẩn Đại Học Y Hà Nội...
51


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao................................... 27
Bảng 2.2: Máy móc và thiết bị sử dụng .................................28
Bảng 2.3: Mồi sử dụng trong định lượng HBV ........................29
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng realtime-PCR .....................30
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng realtime-PCR................ 30
Bảng 3.1: Các nồng độ xây dựng đường chuẩn ....................38
Bảng 3.2: Nồng độ các mẫu huyết tương ngoại kiểm HBVDNA với các mức nồng độ trước đông khô......... 40
Bảng 3.3: Kết quả đông khô mẫu kiểm tra nồng độ cao sau
đông khô............................................................ 43
Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu mẫu nồng độ thấp................. 44
Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu đồng nhất mẫu nồng độ cao. 45
Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu mẫu âm tính.......................... 47
Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ thấp...
48
Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ cao 50

Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra độ ổn định ngắn hạn................. 52
Bảng 3.10: Kết quả các bệnh viện ........................................53
Bảng 3.11: Kết quả các bệnh viện ........................................54



DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Biểu đồ mẫu HBV-DNA...................................... 39
Biểu đồ 3.2: Kết quả đánh giá thử nghiệm trên hệ thống RT-PCR
bán tự động....................................................... 53
Biểu đồ 3.3: Đánh giá thử nghiệm trên hệ thống RT-PCR tự
động.................................................................. 54


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm gan do virus B hiện đang là một vấn đề sức
khỏe toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2013 có
khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) trong đó có
tới 240 triệu người nhiễm mạn tính [1]. Bệnh diễn biến dẫn
đến các biến chứng nguy hiểm như: xơ gan, suy gan mất bù
và ung thư biểu mô tế bào gan [2-5], ước tính có đến 686 000
nghìn người tử vong hàng năm do các biến chứng trên [1].
Việc chẩn đoán nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên
sự phát hiện kháng nguyên HBsAg [6]. Tuy nhiên, kết quả của
xét nghiệm này không phản ánh được chính xác lượng virus
trong huyết thanh hay hoạt động của virus viêm gan B cũng
như hiệu quả của điều trị thuốc kháng virus, do đó định lượng
HBV-DNA là một xét nghiệm đáng tin cậy và có giá trị cao
trong: theo dõi tốc độ nhân lên của virus từ đó xác định thời
điểm điều trị thuốc kháng virus, đánh giá sự đáp ứng và nguy

cơ tiến triển dẫn tới xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan ở
những bệnh nhân bị bệnh viêm gan B mạn tính [7-11].
Trong những năm gần đây xét nghiệm định lượng HBVDNA bằng phương pháp Realtime PCR đã sử dụng ở nhiều
nơi do có độ nhạy và đặc hiệu cao [12]. Tuy nhiên chất
lượng xét nghiệm vẫn còn phụ thuộc vào phương pháp và
kinh nghiệm của kĩ thuật viên. Do đó kiểm tra nội chuẩn và
ngoại chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo
tính chính xác của kết quả xét nghiệm [13], [14]. Mặc dù có
1


vai trò quan trọng như vậy nhưng chỉ có một số phòng xét
nghiệm tham gia công tác ngoại kiểm vì các mẫu này đều
chưa được sản xuất trong nước mà phải nhập từ nước ngoài
với giá thành cao, và nguồn cung không ổn định do đó sẽ
làm tăng gánh nặng chi phí cho bệnh nhân. Xuất phát từ
vấn đề, chúng tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên
cứu quy trình sản xuất mẫu huyết tương sử dụng
trong chương trình kiểm tra chất lượng xét nghiệm
định lượng HBV- DNA", với 2 mục tiêu:
1.

Xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết tương dùng
trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBVDNA.

2.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho mẫu huyết tương đông
khô được sản xuất sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét
nghiệm định lượng HBV-DNA.

2


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virus viêm gan B (HBV)
1.1.1. Hình thái virus
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA xoắn kép
[15], [16]. Trong huyết thanh của người nhiễm HBV, virus tồn
tại dưới 2 dạng [17].
- Hạt Dane: được phát hiện vào thập niên 70 [18]. Là một
virion hoàn chỉnh hình cầu, đường kính 42 nm, bên ngoài có
vỏ bọc cấu tạo từ kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với 3 loại
protein S, M, L [19]. Bên trong là nucleocapside, đường kính
34 nm, cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg), DNA và các
enzyme như DNA polymerase, protein kinase.

Hình 1.1: Cấu trúc HBV [20]
- Các hạt HBs: có dạng hình cầu hoặc hình ống, có kích
thước thay đổi. Đây là các protein HBs được tạo ra dư thừa
3


trong bào tương của tế bào gan sau đó được phóng thích vào
máu và không chứa DNA của virus do đó không gây nhiễm
[21], [22].

4

1.1.2. Cấu trúc bộ gen virus
HBV có bộ gen là phân tử DNA dạng vòng, chiều dài
khoảng 3200 bases, gồm 2 chuỗi có chiều dài khác nhau.
Chuỗi dài (sợi âm) nằm phía ngoài, có chiều dài cố định là
3200 bases và gần như khép kín, mã hóa cho các thông tin di
truyền của virus.Chuỗi ngắn (sợi dương), nằm ở trong, chiều
dài thay đổi và chỉ bằng 50-80% chiều dài sợi âm.
Trên sợi DNA âm, có 4 đoạn gen tương tứng với 4 khung
đọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hóa cho sự
tổng hợp các protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBeAg,
HBcAg), polymerase và protein X [23].
Các gen đó gồm:
- Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1, Pre-S2 mã hóa cho sự
tổng hợp kháng nguyên bề mặt HBsAg. Đoạn gen S tổng hợp
nên Protein S, đoạn gen S và pre-S2 tổng hợp nên protein M
(Medium) có chiều dài 108 acid amin. Vùng Pre-S2 giúp cho
virus bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ liên kết
với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh của
người. Đoạn S, Pre-S1, Pre-S2 tổng hợp nên Protein L (Large).
Vùng Pre-S1 là vùng chủ yếu mà virus sẽ gắn lên các thụ thể
trên bề mặt của tế bào gan, giúp virus xâm nhập vào bên
trong tế bào [24].
- Gen C: gồm vùng C (Core) và pre-C (Pre-core), mã hóa
cho sự tổng hợp protein của nucleocapsid. Các nucleotide đầu
tiên của vùng Pre-core mã hóa cho việc tạo nên một đoạn
peptide tín hiệu có vai trò giúp cho kháng nguyên HBeAg
5

được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, hòa
tan vào huyết thanh. Sự hiện diện của HBeAg phản ánh tình
trạng nhân lên của virus ở bên trong tế bào gan và có liên
quan đến tính lây nhiễm. Nếu quá trình đọc mã đi hết đoạn
gen C sẽ tổng hợp nên kháng nguyên HBcAg. Vì kháng
nguyên HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên không
được bài tiết ra ngoài tế bào gan do đó không được tìm thấy
trong huyết thanh [24].
- Gen X: mã hóa cho sự tổng hợp protein HBx. Chức năng
đầy đủ của protein HBx chưa được biết rõ. Protein HBx có vai
trò chuyển hoạt hóa trong quá trình sao chép của virus. Do
đó, protein HBx có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung
thư ở các tế bào gan bị nhiễm.
- Gen P (Polymerase): là gen lớn nhất chiếm 80% chiều
dài bộ gen mã hóa cho DNA-polymerase, có liên quan đến cơ
chế sao chép ngược của virus và đồng thời tham gia một phần
vào việc tạo ra capside bao bọc bên ngoài cấu trúc của tiền
genom [25], [26].
1.1.3. Chu kỳ nhân lên của virus

6


Hình 1.2: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [23]
Khi virus nhân lên, DNA không sao chép trực tiếp thành
DNA của virus mới mà qua bước trung gian là tạo ra 2 sợi
mRNA nhờ RNA của tế bào ký chủ. Hai sợi mRNA này được gọi
là tiền genome, chứa toàn bộ thông tin di truyền của virus. Từ
2 sợi mRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion. DNA
của virion sẽ sao chép từ mRNA thành DNA của virus. Như

vậy, DNA polymerase hoạt động như một men sao chép
ngược. Khi sợi DNA dài (L) được hình thành thì sợi mRNA cũng
tự phá hủy.
Phần lõi của virus được lắp ghép thêm phần vỏ bọc xung
quanh rồi được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào tương để
phóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng một virion hoàn

7


chỉnh hoặc phần lõi này sẽ trở lại nhân tế bào gan để vào lại
một chu trình sao chép mới [27], [28].
1.1.4. Kiểu gen của HBV và vai trò sinh bệnh học
Okamoto là tác giả đầu tiên đưa ra phân loại kiểu gen của
HBV vào năm 1988. Bằng phương pháp so sánh từng cặp và
phân loại sinh học dựa trên giải trình tự gen toàn bộ phân tử
HBV-DNA, tác giả và cộng sự đã phân loại được 4 kiểu gen của
HBV kí hiệu là: A, B, C, D. Các kiểu gen này có tỷ lệ khác biệt
nucleotid trên toàn bộ phân tử HBV-DNA lớn hơn 8%, hay tỷ lệ
đồng đạng nucleotid nhỏ hơn 92%.
Sau đó Norder và cộng sự xác định thêm được 4 kiểu gen
nữa là: E, F, G,H. Các kiểu gen của HBV có sự phân bố khác
nhau giữa các vùng địa lý, trong đó kiểu gen A, B, C gặp chủ
yếu ở châu Á và đông Nam Á. Nghiên cứu về kiểu gen của
HBV ở trong nước của Đông Thị Hoài An tại Thành phố Hồ Chí
Minh cho thấy kiểu gen B chiếm 76,8%, kiểu gen C chiếm
20%, kiểu gen A chiếm 1,1% [29], [30].

8

1.1.5. Dịch tễ học
1.1.5.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới ước tính có khoảng hơn 2 tỉ người
bị nhiễm HBV. Trong số này có khoảng 240 triệu người mang
HBV mạn tính (HBV carier) [1]. Ở Mỹ tuy có tần suất thấp hơn
so với Châu Phi và Châu Á nhưng mỗi năm có khoảng 5000
người tử vong liên quan đến nhiễm HBV. HBV có khả năng lây
nhiễm nhiều gấp 100 lần so với HIV [31]. HBV là yếu tố gây
ung thư đứng hàng thứ 2 sau thuốc lá và là nguyên nhân gây
ra 60-80% trường hợp ung thư gan nguyên phát và 50%
trường hợp xơ gan. Nhìn chung tình hình nhiễm HBV thay đổi
theo từng vùng địa lý và tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, vệ
sinh môi trường, tập quán sinh sống [12]. Có 75% các trường
hợp nhiễm HBV mạn tính trên thế giới là người châu Á và châu
Phi. Ở một số nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan, Đài
Loan, tỷ lệ nhiễm HBV rất cao ở trẻ nhỏ và trong thời kỳ thơ
ấu với tỷ lệ HBsAg (+) đến 25%. Dựa vào tỷ lệ nhiễm HBV
trong dân số, người ta chia ra các vùng dịch tễ HBV trên thế
giới như sau:
- Vùng lưu hành dịch cao là vùng có tỷ lệ người mang
HBsAg (+) >8%, gồm châu Á, châu Phi và hầu hết các nước
Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon.
- Vùng lưu hành trung bình là vùng có tỷ lệ người mang
HBsAg (+) từ 2-7% gồm có Ấn Độ, một phần Trung Đông, Nhật
Bản, Đông Âu và hầu hết các nước Nam Mỹ, Trung Mỹ.

9

- Vùng lưu hành dịch thấp là vùng có tỷ lệ người mang
HBsAg (+) < 2% gồm có Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc…và tỷ lệ
người từng phơi nhiễm với HBV < 20% [32].

10


1.1.5.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam
Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới khu vực Tây Thái
Bình Dương, thì Việt Nam hiện có khoảng 8.6 triệu người
nhiễm virus viêm gan B. Trong đó có khoảng 8.8% ở phụ nữ
và 12.3% ở nam giới [33]. Ứớc tính tử vong liên quan tới viêm
gan B ở Việt Nam khoảng 42000 người [34].
1.2. Xét nghiệm định lượng HBV-DNA trong phòng xét
nghiệm
1.2.1. Ý nghĩa lâm sàng định lượng HBV- DNA
Trong hướng dẫn thực hành điều trị viêm gan B của hội
gan mật Mỹ (AASLD) năm 2009 và những năm gần đây đều
sử dụng chỉ số HBV-DNA để làm tiêu chuẩn chẩn đoán các thể
bệnh. Để chẩn đoán viêm gan B mạn tính thì một trong các
tiêu chẩn là HBV-DNA > 105 copies/mL, người mang HbsAg
không hoạt động là HBV-DNA < 2000 IU/mL, viêm gan B hồi
phục là HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện [35].
Cũng theo Hội gan mật Mỹ, định lượng HBV-DNA có vai trò
quan trọng trong việc quản lý bệnh nhân để có chỉ định điều
trị kịp thời. Mặc dù nồng độ HBV-DNA > 10 5 copies/ml được
lựa chọn như là một tiêu chuẩn điều trị viêm gan B mạn tính.
Tuy nhiên viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế
bào gan đã gặp ở các bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA thấp
hơn. Do đó, kiểm tra nồng độ HBV-DNA liên tục có vai trò

quan trọng.
Nồng độ HBV- DNA phản ánh sự nhân lên của vi rút. HBVDNA thay đổi tùy theo từng giai đoạn trong quá rình diễn biến
11


tự nhiên của viêm gan B mạn tính. Theo nghiên cứu của T.
Nguyen và J. Jaroszewics thấy nồng độ HBV-DNA cao nhất ở
giai đoạn dung nạp miễn dịch, tiếp theo là giai đoạn thải loại
miễn dịch và giai đoạn tái hoạt động, thấp nhất ở giai đoạn
không hoạt động [36]. Định lượng HBV-DNA có ý nghĩa rất lớn
trong tiên lượng tiến triển của bệnh. Nồng độ HBV-DNA cao thì
nguy cơ dẫn đến xơ gan ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.
Nồng độ HBV-DNA > 104 copies/mL dự báo khả năng tiến triển
xơ gan. Và trên nền xơ gan thì nồng độ HBV-DNA càng cao
nguy cơ biến chứng càng nhiều [37-40].
Nồng độ HBV-DNA là tiêu chuẩn quyết định điều trị thuốc
kháng vi rút. Theo khuyến cáo của các Hội gan mật Mỹ, Châu
Âu và Châu Á Thái Bình Dương thì trong trường hợp viêm gan
B có HbeAg (+), men gan ALT tăng > 40 U/L, HBV-DNA > 10 5
copies/mL là chỉ định điều trị thuốc kháng vi rút.
Nồng độ HBV-DNA giúp theo dõi sự kháng thuốc. Nếu sau
một thời gian điều trị đặc hiệu mà lượng vi rút không giảm
quá 100 lần hoặc trong quá trình điều trị xét nghiệm thấy
HBV- DNA từ âm tính thành dương tính trở lại thì bác sĩ điều trị
cần nghĩ đến khả năng kháng thuốc của vi rút.
HBV-DNA tiên lượng đáp ứng trong điều trị. Dấu ấn để
đánh giá hiệu quả trực tiếp của thuốc kháng vi rút là HBVDNA. Nếu nồng độ HBV-DNA giảm theo thời gian điều trị và
tiếp tục duy trì dưới ngưỡng phát hiện, hoặc < 10 4 copies/mL
là dấu hiệu đáp ứng tốt. Thông thường phác đồ điều trị hiện
nay được khuyến cáo là kéo dài ít nhất 2 năm đối với các

12


thuốc nhóm nucleotide, 1 năm với thuốc nhóm Interferon. Sau
thời gian điều trị phải kiểm tra HBV-DNA 3-6 tháng/ lần.
HBV-DNA giúp đánh giá khả năng lây truyền của vi rút. Sự
lây truyền HBV qua nhau thai liên quan đến nồng độ HBV-DNA
và HbeAg (+). Nếu nồng độ HBV-DNA cao thì khả năng lây
truyền mạnh hơn [41]. Do đó các bà mẹ khi sinh con mà có
HbeAg (+) và nồng độ HBV-DNA cao thì nên tiêm Globulin
miễn dịch cho con hoặc Lavumidine cho mẹ vào 3 tháng cuối
thai kỳ.
1.2.2. Kĩ thuật định lượng HBV- DNA
Để đánh giá mức độ nhân lên của HBV, chúng ta có thể
làm các xét nghiệm định lượng HBV- DNA bằng một số
phương pháp như: Direct hybrization, phương pháp chuỗi
nhánh ( b-DNA) và phương pháp PCR.
Phương pháp Direct hybrization là kỹ thuật lai ghép trên
màng lọc hoặc trong môi trường lỏng, hạn chế về độ nhạy, chỉ
phát hiện được HBV-DNA từ 105 copies/mL. Hiện nay kỹ thuật
này ít được thực hiện.
Phương pháp phân nhánh (b-DNA) là kỹ thuật lai ghép
chuyên biệt nhờ sự khuếch đại tín hiệu lai ghép. Kỹ thuật này
cho phép định lượng HBV-DNA nhạy gấp 10-20 lần so với
phương pháp lai ghép trực tiếp, khả năng định lượng được
HBV-DNA từ 103 copies/mL, ngày nay phương pháp này cũng
ít được sử dụng.
Với sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR có độ nhạy cao
và có khả năng định lượng được nồng độ HBV-DNA từ 10 2

13


copies/mL đến 108 copies/mL, kỹ thuật này ngày nay được sử
dụng nhiều nhất.
1.2.3. Kỹ thuật Real-time PCR
Khái niệm Real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại
DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản
ứng [42], [43].
Nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR trong định lượng HBV
Cặp mồi (primer) được thiết kế trong vùng gen S của bộ
gen HBV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 98
cặp base. Trong khi chạy PCR, một khi có sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc
hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và
sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase (nhờ hoạt tính 5’-3’
exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài. Sự
thủy phân taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh
quang (fluorophore) ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang
(quencher) ở đầu 3’ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát
huỳnh quang khi bị chiếu ánh sáng kích thích và sự phát
huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bộ phận cảm biến quang
của máy.

14