NGHIÊN cứu đa HÌNH đơn GEN XRCC1 arg399gln TRÊN BỆNH NHÂN LUPUS BAN đỏ hệ THỐNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN TIẾN ĐẠT

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ĐƠN GEN XRCC1 Arg399Gln
TRÊN BỆNH NHÂN LUPUS BAN ĐỎ HỆ THỐNG
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. TRẦN HUY THỊNH

HÀ NỘI – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRẦN TIẾN ĐẠT

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ĐƠN GEN XRCC1 Arg399Gln
TRÊN BỆNH NHÂN LUPUS BAN ĐỎ HỆ THỐNG
Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. TRẦN HUY THỊNH

HÀ NỘI – 2017


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APE1

: Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1

ACR

: American College of Rheumatology

ANA

: Antinuclear Antibody (Kháng thể kháng nhân)

Anti-dsDNA

: Anti-double stranded DNA (Kháng thể kháng chuỗi kép DNA)

BER

: Base excision repair (Sửa chữa cắt bỏ base)

Bp

: Base pair

BRCA

: Breast Cancer genes

BRCT

: BRCA1 carboxy-terminal domain

CI

: Confidence Interval (Khoảng tin cậy)

DNA

: Deoxyribonucleotid Acid

dNTP

: Deoxyribonucleotid-5-triphosphate

OD

: Optical density (Độ hấp thụ quang)

OR

: Odds ratio (Tỷ suất chênh)

NER

: Nucleotide excision repair (Sửa chữa cắt bỏ nucleotide)

PCI

: Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol

PCR

: Polymerase chain reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase)

OGG1

: 8-oxoguanine DNA glycosylase 1

RFLP

: Restriction fragment length polymorphism
(Đa hình về chiều dài của các đoạn DNA do enzym giới hạn)

SLE

: Systemic Lupus Erythematosus (Lupus ban đỏ hệ thống)

SNP

: Single nucleotide polymorphism
(Hiện tượng đa hình thái đơn Nucleotid)

SSB

: Single strand break (Đứt gãy sợi đơn)

PARP-1

: Poly(ADP-ribose) polymerase-1

UV

: Ultraviolet

XRCC

: X-ray repair cross-complementing


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1
CHƯƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh lupus ban đỏ hệ thống.....................................................3
1.1.1. Dịch tễ học..............................................................................................3
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ..................................................................................4
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng........................................................7
1.1.4. Chẩn đoán xác định.................................................................................8
1.1.5. Các thể lâm sàng và tiên lượng.............................................................10
1.1.6. Điều trị..................................................................................................11

1.2. Tổng quan về gen XRCC1 ở người...............................................................12
1.2.1. Vị trí và cấu trúc....................................................................................12
1.2.2. Chức năng.............................................................................................12
1.2.3. Cơ chế sửa chữa cắt bỏ base (con đường BER)....................................13
1.2.4. Tính đa hình thái đơn nucleotide...........................................................15
1.3. Các kỹ thuật SHPT phát hiện tính đa hình thái đơn nucleotide....................18
1.3.1. Kỹ thuật PCR........................................................................................18
1.3.2. Kỹ thuật PCR-RFLP.............................................................................20
1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen......................................................................21
CHƯƠNG 2 . ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................23
2.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................23
2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................23
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng.................................................25
2.3.1. Dụng cụ.................................................................................................25
2.3.2. Trang thiết bị.........................................................................................25
2.3.3. Hóa chất................................................................................................25
2.4. Quy trình kỹ thuật........................................................................................27
2.4.1. Quy trình lấy mẫu.................................................................................27


2.4.2. Quy trình tách chiết DNA và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch................27
2.4.3. Quy trình khuếch đại DNA và điện di kiểm tra sản phẩm.....................29
2.4.4. Quy trình cắt enzym và điện di kiểm tra sản phẩm...............................31
2.4.5. Quy trình giải trình tự gen.....................................................................32
2.5. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................33
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu............................................................................33
CHƯƠNG 3 . KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................34
3.1. Kết quả tách chiết DNA...............................................................................34
3.2. Kết quả khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR....................................35
3.3. Kết quả cắt với enzym giới hạn (PCR-RFLP)..............................................35

3.4. Kết quả giải trình tự gen một số mẫu...........................................................35
3.5. Kết quả xác định đa hình Arg399Gln của gen XRCC1 trên nhóm bệnh và
nhóm chứng................................................................................................36
3.6. Kết quả xác định mối liên quan giữa đa hình đơn gen XRCC1 Arg399Gln với
nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống...................................................36
CHƯƠNG 4 . BÀN LUẬN....................................................................................37
4.1. Kết quả tách chiết DNA...............................................................................37
4.2. Kết quả khuếch đại DNA (PCR)...................................................................37
4.3. Kết quả cắt với enzym cắt giới hạn (PCR-RFLP).........................................37
4.4. Kết quả xác định đa hình Arg399Gln trên nhóm bệnh và nhóm chứng........37
4.5. Kết quả xác định mối liên quan giữa đa hình Arg399Gln với nguy cơ mắc
bệnh lupus ban đỏ hệ thống........................................................................37
KẾT LUẬN............................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Phân bố tỷ lệ mắc SLE trên thế giới..........................................................3
Hình 1.2. Vị trí gen XRCC1 trên NST số 19..........................................................12
Hình 1.3. Các cơ chế tổn thương base (hình A) và các bước sửa chữa cắt bỏ base
(con đường BER) (hình B)....................................................................14
Hình 1.4. Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn (SNP).........................................15
Hình 1.5. Các miền của protein XRCC1 và cấu trúc gen XRCC1..........................17
Hình 1.6. Sơ đồ chu trình phản ứng PCR................................................................19
Hình 1.6. Quy trình thực hiện PCR-RFLP..............................................................21
Hình 1.7. Giải trình tự gen bằng máy tự động........................................................22
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu.....................................................................24
Hình 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR................................................................30
Hình 2.3. Minh họa vị trí cắt của enzym NcilI trên đoạn DNA được khuếch đại....31

Hình 2.4. Minh họa kết quả điện di sản phẩm cắt enzym........................................32
Hình 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự.....................................................33
Hình 3.1. Hình ảnh kết quả đo OD mẫu DNA MC1...............................................34
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR một số mẫu..........................................35
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RFLP một số mẫu bệnh và mẫu chứng........35
Hình 3.4. Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen XRCC1 của mẫu…..................35
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen XRCC1 của mẫu…..................35
Hình 3.6. Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen XRCC1 của mẫu…..................35



DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số đa hình đơn của gen XRCC1.......................................................16
Bảng 2.1. Đặc điểm mồi cho phản ứng PCR...........................................................26
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.....................................................................29
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-RFLP..........................................................31
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng giải trình tự gen...................................................32
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA trên nhóm bệnh
nhân và nhóm đối chứng.................................................................................34
Bảng 3.2. Kết quả xác định tính đa hình Arg399Gln của gen XRCC1....................36
Bảng 3.3. Tỷ lệ kiểu gen đa hình Arg399Gln trên nhóm bệnh và nhóm chứng.......36
Bảng 3.4. Tần số alen đa hình Arg399Gln trên nhóm bệnh và nhóm chứng...........36



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lupus ban đỏ hệ thống (SLE – Systemic Lupus Erythematosus) là bệnh lý
của mô liên kết có tổn thương nhiều cơ quan do hệ thống miễn dịch của cơ thể bị rối

loạn, đặc trưng bởi sự có mặt của kháng thể kháng nhân và nhiều tự kháng thể khác.
Các cơ quan thường bị tổn thương bao gồm khớp, da, thận, tế bào máu, tim, phổi,
thần kinh…[1], [2].
Tỷ lệ mắc SLE khác nhau tùy theo nghiên cứu của các tác giả trên thế giới,
thay đổi từ 14-172 ca/100.000 dân [3]. Bệnh chủ yếu gặp ở nữ giới, đặc biệt độ tuổi
sinh đẻ, tỷ lệ mắc bệnh của nữ : nam là 9 : 1 [4]. Mặc dù sinh bệnh học của SLE đến
nay vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng, nhưng bệnh có liên quan đến các yếu tố di truyền,
hormon và môi trường [5].
Có nhiều loại tự kháng thể đối với protein nội bào và acid nucleic trong
huyết thanh của bệnh nhân SLE như kháng thể dsDNA có thể tương quan với mức
độ hoạt động và biểu hiện của bệnh [6]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự suy
giảm của hệ thống sửa chữa DNA ở bệnh nhân SLE đã dẫn đến sự tích tụ các đứt
gãy trong DNA [7], [8]. Sự tích tụ các đoạn DNA đứt gãy kết hợp với các protein
nhân tế bào có thể hình thành các kháng nguyên miễn dịch, gây sản sinh kháng thể
và đáp ứng tự miễn ở những người nhạy cảm [9], [10].
Sửa chữa cắt bỏ base (BER) và sửa chữa cắt bỏ nucleotide (NER) là hai con
đường để sửa chữa hầu hết các DNA bị hư hỏng [11]. XRCC1 là một trong những
protein quan trọng nhất có vai trò quan trọng trong con đường BER [12]. Protein
này chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa hiệu quả các tổn thương DNA gây ra bởi
oxy hoạt động, bức xạ ion hóa và các chất alkyl hóa [13]. Mặc dù XRCC1 không thể
hiện hoạt động enzym, nhưng nó có chức năng tương tác để điều phối hoạt động của
các protein enzym khác trong bộ máy BER, bao gồm: glycosylase, endonuclease
(APE1), DNA polymerase β, ligase và Poly (ADP-ribose) Polymerases (PARP1 and
PARP2) [13], [14], [15].


2

Gen XRCC1 có vị trí nằm trên nhiễm sắc thể 19q13.31 và có 17 exon [12].
Mặc dù có hơn 300 SNP đã được mô tả trong gen XRCC1, ba SNP thường xuyên

được nghiên cứu là: Arg194Trp, Arg280His và Arg399Gln [16].
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa SNP
Arg399Gln của gen XRCC1 với nguy cơ mắc lupus ban đỏ hệ thống và một số bệnh
ung thư. Tuy nhiên, trên những chủng tộc người khác nhau, các nhà khoa học thu
được kết quả trái chiều [5], [17], [18], [19], [20], [21]. Việc xác định đa hình này có
thể giúp tầm soát lupus ban đỏ hệ thống ở những đối tượng có yếu tố nguy cơ, giúp
bệnh nhân được chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời, giảm các biến chứng cũng như cải
thiện tiên lượng bệnh.
Tại Việt Nam chúng tôi chưa thấy có nhiều nghiên cứu về gen XRCC1 nói
chung, đa hình Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống nói riêng. Do đó,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa hình đơn gen XRCC1
Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống” với 2 mục tiêu:
1. Xác định đa hình đơn gen XRCC1 Arg399Gln trên bệnh nhân lupus
ban đỏ hệ thống.
2. Tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình đơn gen XRCC1 Arg399Gln với
nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh lupus ban đỏ hệ thống
1.1.1. Dịch tễ học
Trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc SLE là 14-172 ca/100.000 dân, tỷ suất mới mắc
là 1,8-7,6/100.000 dân mỗi năm, thay đổi theo chủng tộc và vùng địa lý [3]. Bệnh
chủ yếu gặp ở nữ giới, đặc biệt độ tuổi sinh đẻ, tỷ lệ mắc bệnh của nữ : nam là 9 : 1
[4], tuổi khởi phát chủ yếu từ 15 đến 44 tuổi [22].
Tại Mỹ, tỷ lệ mắc SLE là 20-150 ca/100.000 dân [23], [24]. Do cải thiện việc
phát hiện bệnh nhẹ, tỷ suất mới mắc tăng lên gần gấp 3 lần trong 40 năm cuối của
thế kỷ 20 [25]. Bệnh dường như là phổ biến ở thành thị hơn khu vực nông thôn

[24], [26]. Xét trên cư dân cùng sống tại Mỹ thì tỷ lệ bệnh cao nhất ở người châu Á,
tiếp đến người Mỹ gốc Phi, người Caribe gốc Phi, người Mỹ gốc Địa Trung Hải và
thấp nhất ở người Mỹ gốc châu Âu [23], [24]. Phụ nữ da đen ở Anh và Mỹ mắc
SLE cao hơn khoảng 4 lần so với phụ nữ da trắng. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc của phụ nữ
da đen tại châu Phi lại thấp hơn. Điều này chứng tỏ vai trò của yếu tố môi
trường trong cơ chế bệnh sinh của SLE [27].

Hình 1.1. Phân bố tỷ lệ mắc SLE trên thế giới [28]
Theo nghiên cứu của Rupert W. Jakes và cộng sự (2012) cho thấy sự khác
biệt đáng kể về gánh nặng SLE và tỷ lệ sống sót ở các nước Châu Á Thái Bình
Dương. Tỷ lệ hiện mắc SLE từ 4,3-45,3 ca/100.000 dân, tỷ suất mới mắc dao động
từ 0,9-3,1 ca/100.000 dân mỗi năm. Tỷ lệ bệnh nhân có viêm thận lupus ở thời điểm
chẩn đoán là 21-65% và lên đến 40-82% theo thời gian. Nhiễm trùng và SLE hoạt
động là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong (chiếm 30-80% và 19-95%), tiếp đến là


4

nguyên nhân tim mạch (6-40%) và sự tham gia của thận (7-36%). Tương quan giữa
chỉ số phát triển con người và tỷ lệ sống sót 5 năm là 0,83 [29].
Tại Việt Nam, chưa có số liệu thống kê dịch tễ đầy đủ. Ở khoa Cơ xương
khớp bệnh viện Bạch Mai, SLE đứng hàng thứ 5 trong số 15 bệnh xương khớp nội
trú thường gặp nhất [30].
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ
1.1.2.1. Yếu tố di truyền
Tỷ lệ cùng mắc SLE ở trẻ sinh đôi cùng trứng là 24-57%, trong khi trẻ sinh
đôi khác trứng là 2-5%; tỷ lệ mắc bệnh giữa anh chị em ruột khi có một người bị
bệnh là 20-29%, điều này cho thấy yếu tố di truyền đóng góp vai trò quan trọng
trong bệnh sinh SLE .
Vai trò HLA trong cơ chế bệnh sinh của SLE cũng được ghi nhận. HLADR

B1 alen đã được chứng minh có liên quan chặt chẽ với SLE ở người da trắng, nếu
người mang 2 alen trên sẽ có nguy cơ mắc lupus cao gấp 3 lần so với nhóm chứng
[31]. Các gen DR2, DR3 cũng liên quan đến sự có mặt của một số tự kháng thể như:
kháng thể kháng Smith, kháng thể kháng chuỗi kép ds-DNA, kháng thể kháng Ro
và kháng thể kháng La. Tuy nhiên, các gen này lại không có liên quan trong cơ chế
bệnh sinh chặt chẽ ở các chủng tộc khác không phải người da trắng.
Bổ thể có vai trò quan trọng trong sự lắng đọng các phức hợp miễn dịch và
sự chết theo chương trình của tế bào. Trong một số bệnh nhân SLE ghi nhận có
thiếu hụt mang tính di truyền của các thành phần bổ thể trong con đường cổ điển
như C1q, C2, C4. Thiếu hụt gen C4A gặp chủ yếu ở người mang HLAB8, HLADR3, HLA-A1 và đặc biệt các bệnh nhân SLE thiếu hụt gen C4A thường có biểu
hiện của viêm cầu thận [32].
Nhiều công bố cho thấy đa số các trường hợp SLE là hậu quả của sự tương
tác đa gen gây nên, một số ít có liên quan đến thiếu hụt một vài gen. Các gen liên
quan đến các bệnh lý tự miễn khác cũng được tìm thấy trong bệnh nhân SLE như
PTPN22 trong đái tháo đường hay STAT4 trong viêm khớp dạng thấp.
1.1.2.2. Yếu tố nội tiết
SLE chủ yếu gặp ở nữ giới, với tỷ lệ nữ : nam là 9 : 1. Trong đó, đa số bệnh
khởi phát trong độ tuổi sinh đẻ, đặc biệt từ 20-30 tuổi, hiếm khi khởi phát trước tuổi
dậy thì và sau mãn kinh. Bệnh nặng lên khi mang thai, đặc biệt là 3 tháng cuối [4].
Các bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter (47, XXY) đặc trưng bởi tình trạng cường
nội tiết nữ và giảm nội tiết tố nam có nguy cơ cao bị SLE và thường nặng hơn [33].
Estrogen có tác dụng kích thích miễn dịch, kích thích tăng sinh tế bào
lympho B, tăng sản xuất kháng thể. Nghiên cứu trên các đối tượng sử dụng hormon
ngoại sinh đã cho kết quả khá thú vị là nguy cơ mắc SLE ở nhóm dùng thuốc tránh
thai đường uống và nhóm dùng liệu pháp hormon cao gấp 1,54-1,9 và 2,1- 2,8 lần
so với nhóm đối tượng bình thường [34].
Prolactin là hormon thùy trước tuyến yên, có vai trò chủ yếu kích thích và
bài tiết sữa. Ngoài ra, nó cũng có vai trò trong duy trì đáp ứng miễn dịch cơ thể.
Một số nghiên cứu nhận thấy khoảng 15-33% bệnh nhân SLE có tình trạng tăng

5

prolactin máu [35]. Nồng độ prolactin cao bất thường ở phụ nữ mang thai mắc SLE
cũng tương quan với mức độ hoạt động bệnh [36]. Tuy nhiên, nguồn gốc và vai trò
của prolactin trong bệnh sinh của SLE chưa được biết rõ.
Androgen được coi như là đối trọng của estrogen trong vai trò miễn dịch. Ở
một số bệnh nhân SLE nam có nồng độ testosteron giảm và estrogen tăng cao hơn
bình thường, còn ở bệnh nhân SLE nữ, nồng độ androgen cũng thấp hơn [37], [38].
1.1.2.3. Yếu tố môi trường
Gen và hormon là yếu tố nhạy cảm dưới sự kích thích của môi trường làm
xuất hiện bệnh. Các yếu tố môi trường gồm: vật lý, hóa học và nhiễm khuẩn.
- Tia cực tím (UV): đặc biệt là UV-A1 và UV-B, có thể gây ra các đợt bùng
phát bệnh ở bệnh nhân SLE và kích hoạt sự khởi phát bệnh SLE [39]. Hơn nữa, khả
năng của tia cực tím trong việc gây nên đợt bùng phát bệnh SLE hoặc lupus da
dường như là liều phụ thuộc [40]. Một điều chắc chắn là UV-B gây ra hiện tượng
chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào sừng (keratinocytes) và các tế bào da
khác, và quá trình đã giải phóng một lượng lớn các tự kháng nguyên và các
cytokine tiền viêm vào tuần hoàn, gây ra viêm hệ thống miễn liên quan đến tự miễn
[40]. Ở liều thấp của tia UV-B, apoptosis phụ thuộc vào dòng thác bình thường gây
ra ở keratinocytes, trong khi ở liều vừa và cao, sự phân mảnh DNA, tăng biểu hiện
IL-1α và hoại tử của keratinocytes đã được quan sát thấy [40]. Ngoài ra, nghiên
cứu in vitro cho thấy thay vì sự dịch chuyển các kháng nguyên miễn dịch Ku, Sm và
DNA vào màng tế bào, UV-B liều cao đã được chứng minh là gây ra sự phóng thích
các tự kháng nguyên này vào trong tế bào chất và ngay cả trên bề mặt khi sự toàn
vẹn của tế bào bị tổn thương [40]. Cùng với nhau, sự tiếp xúc với tia UV-B liều
trung bình và liều cao thúc đẩy quá trình chết theo chương trình và hoại tử, kèm
theo việc giải phóng các kháng nguyên tự nhiên và một số lượng lớn các cytokine
tiền viêm, gây ra phản ứng viêm [40], [41].
- Lupus do thuốc (Drug-induced lupus erythematosus – DILE): là một rối

loạn với các đặc điểm lâm sàng, mô học và miễn dịch tương tự lupus ban đỏ hệ
thống (SLE), do sử dụng lâu dài một số loại thuốc nhất định và các triệu chứng sẽ
hết sau khi ngừng thuốc. Có khoảng hơn 100 loại thuốc đã được báo cáo có thể gây
ra tình trạng này và danh sách còn tiếp tục mở rộng, những thuốc phổ biến nhất
là: procainamide, hydralazine, quinidine. Các cơ chế khác nhau được đề xuất bao
gồm: giảm methyl hóa DNA bằng cách ức chế trực tiếp DNA methyltransferases
hoặc gián tiếp bằng tín hiệu theo con đường ERK. Thuốc đóng vai trò như một
hapten, gắn với protein mô hoặc huyết tương gây đáp ứng miễn dịch. Thêm vào đó,
sự chuyển hóa thuốc cục bộ trong bạch cầu hoặc tế bào gan có thể chuyển đổi thuốc
thành các hợp chất gây độc tế bào, làm tăng các tế bào hoại tử và kích hoạt đại thực
bào. Các thuốc có thể làm tăng hoặc giảm apoptosis [42], [43].
- Nhiễm trùng: nhiễm khuẩn, nhiễm virus cũng được đề cập đến
trong bệnh sinh của SLE như HTLV1, retrovirus, epstein-Barr virus hiện
đang được nghiên cứu thêm. Các nghiên cứu cho thấy nhiễm khuẩn chỉ có
vai trò khởi phát, tạo điều kiện thuận lợi cho phát sinh bệnh.


6

1.1.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng
1.1.3.1. Lâm sàng [2]
Chủ yếu gặp thể bán cấp
Tỷ lệ mắc bệnh nữ : nam = 9 : 1, chủ yếu ở độ tuổi 20 - 30.
Khởi phát: Đa số bắt đầu từ từ, tăng dần với sốt dai dẳng không rõ nguyên
nhân, đau khớp hoặc viêm khớp với biểu hiện tương tự trong bệnh viêm
khớp dạng thấp. Có một số yếu tố thuận lợi khởi phát bệnh: nhiễm trùng,
chấn thương, stress, thuốc…
Toàn phát: tổn thương nhiều cơ quan
o Toàn thân: sốt dai dẳng kéo dài, mệt mỏi, gầy sút.
o Cơ xương khớp: đau hoặc viêm các khớp với biểu hiện tương tự trong

bệnh viêm khớp dạng thấp song hiếm khi biến dạng khớp; đau cơ.
Một số hiếm trường hợp có hoại tử xương (thường gặp hoại tử vô
mạch đầu trên xương đùi).
o Da niêm mạc: ban đỏ hình cánh bướm ở mặt (rất thường gặp), ban
dạng đĩa, (gặp trong thể mạn tính), nhạy cảm với ánh sáng (cháy,
bỏng, xạm da sau khi tiếp xúc với ánh nắng), loét niêm mạc miệng,
niêm mạc mũi, rụng tóc, viêm mao mạch dưới da…
o Máu và cơ quan tạo máu: thiếu máu do viêm, thiếu máu huyết tán,
chảy máu dưới da (do giảm tiểu cầu) , lách to, hạch to.
o Thần kinh tâm thần: rối loạn tâm thần, động kinh...
o Tuần hoàn, hô hấp: thường gặp các triệu chứng tràn dịch màng tim,
màng phổi, tăng áp lực động mạch phổi, viêm phổi kẽ. Các triệu
chứng hiếm gặp: viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc , hội chứng
Raynaud, viêm tắc động mạch, tĩnh mạch...
o Thận: rất thường gặp: protein niệu, tế bào trụ niệu, hội chứng thận hư,
viêm cầu thận...
o Gan: cổ trướng, rối loạn chức năng gan (hiếm gặp).
o Mắt: giảm tiết nước mắt (Hội chứng Sjogren), viêm giác mạc, viêm
kết mạc, viêm võng mạc.


7

1.1.3.2. Cận lâm sàng [2]
Các xét nghiệm không đặc hiệu: tế bào máu ngoại vi (giảm hồng cầu, giảm
bạch cầu, giảm tiểu cầu), tốc độ lắng máu tăng, điện di huyết thanh (gamma
globulin tăng), tìm thấy phức hợp miễn dịch trong máu, phản ứng huyết
thanh giang mai BW (+) giả…
Các xét nghiệm đặc hiệu: kháng thể kháng nhân (ANA), kháng thể kháng
Ds-DNA, Kháng thể chống các kháng nguyên hòa tan, kháng thể kháng hồng

cầu, kháng Lympho bào, kháng tiểu cầu…, giảm bổ thể, giảm tỷ lệ Lympho
bào so với tế bào B.
Sinh thiết các cơ quan tổn thương:
o Sinh thiết da: lắng đọng globulin miễn dịch IgM, IgG và bổ thể thành một
lớp thượng bì và trung bì của da (+70%)
o Thận: viêm cầu thận, dày màng đáy do lắng đọng IgG, IgM và bổ thể.
o Màng hoạt dịch khớp: tổn thương gần tương tự viêm khớp dạng thấp.
1.1.4. Chẩn đoán xác định
Năm 1982, Hội Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR – American College of
Rheumatology) đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán SLE gồm 11 tiêu chuẩn và đến năm
1997 được sửa đổi và áp dụng phổ biến đến ngày nay [44].
Gần đây, năm 2012, các trung tâm cộng tác quốc tế về lupus hệ thống
(Systemic Lupus International Collaborating Clinics - SLICC) đã đưa ra tiêu chuẩn
mới gồm 11 tiêu chuẩn lâm sàng và 6 tiêu chuẩn miễn dịch [2].
Theo nghiên cứu của Peri M. và cộng sự (2012), tiêu chuẩn ACR 1997 cho
độ nhạy 86% và độ đặc hiệu 93%, còn tiêu chuẩn SLICC 2012 cho độ nhạy 94% và
độ đặc hiệu 92% [44].
1.1.4.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán SLE của ACR năm 1997
Chẩn đoán xác định SLE khi có ít nhất 4 trên 11 tiêu chuẩn sau [45]:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Ban đỏ hình cánh bướm ở mặt.
Ban đỏ dạng đĩa ở mặt và thân.
Nhạy cảm với ánh nắng.
Loét miệng hoặc mũi họng.

Viêm nhiều khớp không có hình bào mòn trên phim chụp X quang.
Viêm màng phổi hoặc màng tim.


8

7. Tổn thương thận: Protein niệu > 500mg/24h hoặc tế bào niệu (có thể là
hồng cầu, hemoglobin, trụ hạt, tế bào ống thận hoặc hỗn hợp).
8. Tổn thương thần kinh: Cơn động kinh hoặc loạn thần đã loại trừ các nguyên
nhân khác.
9. Rối loạn công thức máu :
- Thiếu máu huyết tán có tăng hồng cầu lưới
- hoặc giảm tổng số bạch cầu < 4G/l trong ≥ 2 lần
- hoặc giảm lympho bào < 1,5G/l trong ≥ 2 lần
- hoặc giảm tiểu cầu < 100 G/l khi không có sai lầm trong dùng thuốc
10. Rối loạn miễn dịch:
- Kháng thể kháng chuỗi kép (anti-dsDNA)
- hoặc kháng thể kháng Smith (anti-Sm)
- hoặc tìm thấy kháng thể anti-phospholipid dựa trên:
o có kháng thể anticardiolipin loại IgG hoặc IgM
o hoặc các yếu tố chống đông lupus
o hoặc test huyết thanh với giang mai dương tính giả trên 6
tháng, được xác nhận bằng test cố định xoắn khuẩn hoặc hấp
thụ kháng thể xoắn khuẩn bằng miễn dịch huỳnh quang.
11. Kháng thể kháng nhân (ANA): Hiệu giá bất thường của kháng thể kháng
nhân được xác định bằng miễn dịch huỳnh quang hoặc các thử nghiệm
tương đương, không do sử dụng các thuốc có thể gây “lupus do thuốc”.
Tiêu chuẩn lâm sàng

Tiêu chuẩn miễn dịch

1. Lupus da cấp

1. ANA

2. Lupus da mạn

2. Anti-dsDNA

3. Loét miệng hay mũi

3. Anti-Sm

4. Rụng tóc không sẹo

4. KT Antiphospholipid

5. Viêm khớp

5. Giảm bổ thể (C3, C4)

6. Viêm thanh mạc

6. Test Coombs trực tiếp

7. Thận

(Không được tính khi có sự tồn tại của

8. Thần kinh

thiếu máu tan huyết)

9. Thiếu máu tan huyết
10. Giảm bạch cầu
11. Giảm tiểu cầu (<100G/l)
Chẩn đoán SLE khi có ≥ 4 tiêu chuẩn (có ít nhất 1 tiêu chuẩn lâm sàng và 1


9

tiêu chuẩn miễn dịch) hoặc bệnh nhân phải có sinh thiết thận chứng minh
bệnh thận lupus kèm theo ANA ( + ) hoặc anti-dsDNA ( + ).
1.1.4.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán SLICC 2012 [2]
1.1.5. Các thể lâm sàng và tiên lượng [30]
Tiên lượng phụ thuộc vào các thể lâm sàng:
Thể cấp tính: biểu hiện tổn thương nhiều phủ tạng. Tiến triển nhanh, tử
vong sau vài tháng do tổn thương ở thận, thần kinh, tim, phổi, nhiễm khuẩn.
Thể bán cấp: tiến triển từng đợt, nặng dần. Sống sót sau 5 – 10 năm. Bệnh
nặng thêm trong thời kỳ thai nghén, nhiễm khuẩn, chấn thương, phẫu thuật.
Thường tử vong do biến chứng thận, thần kinh, nhiễm khuẩn.
Thể mạn tính: ít tổn thương nội tạng, diễn biến chậm. Biểu hiện ngoài da
nhẹ, tiên lượng tốt.
1.1.6. Điều trị [2]
1.1.6.1. Nguyên tắc chung
-

Đánh giá mức độ nặng của bệnh, các bệnh kèm theo.
Điều trị bao gồm: giai đoạn tấn công, củng cố và duy trì.
Cần cân nhắc giữa tác dụng mong muốn và tác dụng phụ của mỗi loại thuốc.

1.1.6.2. Các nhóm thuốc được sử dụng
-

Thuốc kháng viêm không steroid: trong các trường hợp lupus kèm viêm
đau khớp, sốt và viêm nhẹ các màng tự nhiên nhưng không kèm tổn thương

-

các cơ quan lớn. Nên tránh dùng ở các bệnh nhân viêm thận đang hoạt động.
Hydroxychloroquine: đáp ứng tốt với các trường hợp có ban, nhạy cảm ánh

-

sáng, đau hoặc viêm khớp. Cần theo dõi biến chứng mắt, khám 1 lần/năm.
Liệu pháp glucocorticoid đường toàn thân: Chỉ định với SLE có đe dọa
tính mạng như có tổn thương thần kinh, giảm tiểu cầu, thiếu máu huyết tán

-

hoặc SLE không đáp ứng với các biện pháp điều trị bảo tồn.
Liệu pháp dùng các thuốc ức chế miễn dịch khác: Chỉ định với SLE thể
nặng có khả năng đe dọa tính mạng như: viêm cầu thận cấp nặng, có tổn
thương thần kinh, giảm tiểu cầu và thiếu máu huyết tán hoặc SLE không đáp
ứng với corticoid hoặc xuất hiện tác dụng phụ nặng của corticoid. Các loại
thuốc có thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với nhau, hoặc với corticoid:


10

o Cyclophosphamide: phối hợp với mesna để dự phòng biến chứng
bàng quang.
o Azathioprine, mycophenolate mofetil là nhóm thuốc đang được ưa
chuộng vì ít tác dụng phụ, hiệu quả cao, thích hợp với phụ nữ còn độ
tuổi sinh đẻ, tuy nhiên giá thành tương đối cao.
o Methotrexate.
o Các thuốc khác: leflunomide, liệu pháp hormon, thalidomide, truyền
tĩnh mạch immunoglobulin liều cao…
o Chế phẩm sinh học: rituximab là thuốc ức chế tế bào B. Cần sàng lọc
-

lao, viêm gan và các bệnh nhiễm khuẩn nặng trước khi điều trị.
Điều trị không dùng thuốc: Chủ yếu là đối với thể nhẹ, bao gồm: nghỉ ngơi,
tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, dự phòng nhiễm khuẩn, giáo dục bệnh
nhân hiểu rõ về bệnh. Một số trường hợp tổn thương suy thận nặng có thể
phải lọc máu hoặc ghép thận.

1.2. Tổng quan về gen XRCC1 ở người
1.2.1. Vị trí và cấu trúc
Gen XRCC1 có vị trí 19q13.31 (NST 19, cánh dài, vùng 1, băng 3, băng phụ
3, băng dưới phụ 1), bắt đầu từ cặp base 43.543.040 và kết thúc ở cặp base
43.580.473. Gen gồm 37.434 cặp base và có 17 exon [12].

Hình 1.2. Vị trí gen XRCC1 trên NST số 19
(Nguồn: )
1.2.2. Chức năng
XRCC1 mã hóa cho protein XRCC1 chứa 633 acid amin, khối lượng phân tử
69.477 Da. XRCC1 là một trong những protein đóng vai trò quan trọng trong cơ chế
cắt bỏ sửa chữa base (BER). Protein này chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa có hiệu
quả các tổn thương DNA gây ra bởi các tác động oxy hóa, bức xạ ion hóa và alkyl

hóa [5]. Đây là thành viên XRCC được nghiên cứu nhiều nhất trên SLE [16].
Cùng thuộc gia đình XRCC thì XRCC3 được đề xuất đóng vai trò then chốt
trong sự phát triển của ung thư, XRCC4 đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định
hệ gene [46]. Mặc dù chức năng của chúng rất quan trọng trong sự ổn định DNA,
các gen này chưa được nghiên cứu về rối loạn tự miễn, đặc biệt là SLE [16].
Mặc dù XRCC1 không thể hiện hoạt động enzym, nhưng nó có chức năng
tương tác để điều phối hoạt động của các protein enzym khác trong bộ máy BER,


11

bao gồm: glycosylase, endonuclease (APE1), DNA polymerase β, ligase và Poly
(ADP-ribose) Polymerases (PARP1 and PARP2) [13], [14], [15].
1.2.3. Cơ chế sửa chữa cắt bỏ base (con đường BER)
Sự thoái hóa base của DNA xảy ra tự phát thông qua thủy phân cũng như qua
sự tương tác với các phân tử hoạt động. Các chất alkylating nội sinh như SAdenosyl methionine và các tác nhân ngoại sinh (như các chất hóa học dùng trong
trị liệu và các chất chuyển hóa khói thuốc lá) sẽ thêm các nhóm methyl vào các
nitrogens và oxygens của purine và pyrimidines (Hình 1.3 A). Các nhóm oxy hoạt
động (ROS) được tạo ra do chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể, hoặc do sự ion
hóa và tia cực tím, thường thêm các nhóm hydroxyl vào nguyên tử carbon có liên
kết đôi trong các purine và pyrimidin, cũng như gây đứt gãy mạch khung đường
phosphate của DNA (Hình 1.3 A) [47].
Sự mất base và tổn thương base làm thay đổi tính chất ghép cặp base của
DNA có khả năng gây nên đột biến, cùng với sự thủy phân tự phát của các base
trong DNA ước tính xảy ra hơn 18.000 lần mỗi tế bào mỗi ngày [48]. Mặc dù số
lượng DNA tổn thương này cao, tỷ lệ đột biến soma ở người đã được ước tính là 10 6

trên mỗi tế bào trong 1 lần phân chia [49].
Phần lớn các base bị hư hại được loại bỏ và thay thế bằng BER. Mặc dù BER

bao gồm một số con đường phụ, nhưng nó có thể được tổng kết dưới dạng 5 bước
cùng enzym tương ứng (Hình 1.3 B)
Bước 1: Liên kết N-glycosidic của base bị hư hại bị cắt bởi DNA glycosylase
để lại một vị trí abasic trong DNA (vị trí khuyết không có base purine hay
base pyrimidin).
Bước 2: Đường deoxyribose phosphate tại vị trí abasic được cắt bởi một
glycosylase hai chức năng và/hoặc một AP-endonuclease. Nếu cần thiết, đầu
tận 3’ của sợi trục bị đứt gãy được chuyển thành hydroxyl cho phép DNA
polymerase gắn lại các base mới.
Bước 3: Tổng hợp của một bazơ được gọi là miếng vá ngắn (SP – short
patch) BER và tổng hợp của một số bazơ được gọi là miếng vá dài (LP –
long patch) BER.


12

Bước 4: Đầu tận 5' của sợi đơn đứt gãy (SSB - Single strand break) bị tách
rời sau đó sẽ được xử lý để cho phép gắn DNA ligase III.
Bước 5: Gắn sợi đơn đứt gãy nhờ DNA ligase III.

Hình 1.3. Các cơ chế tổn thương base (hình A) và các bước sửa chữa cắt bỏ
base (con đường BER) (hình B) [47].
Bên cạnh sửa chữa các base bị hư hại, con đường BER cũng tham gia vào
việc sửa chữa các vị trí abasic và sợi đơn đứt gãy (SSB) được tạo ra độc lập với các
glycosylases và/hoặc AP-endonucleases, chẳng hạn như: sự đứt gãy phân tách
đường deoxyribose phosphate gây ra bởi ROS hoặc sự thủy phân tự phát liên kết Nglycosidic.


13

1.2.4. Tính đa hình thái đơn nucleotide
1.2.4.1. Đa hình thái đơn là gì?
Hiện tượng đa hình thái đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism –
SNP) là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn A, T, G, C ở
trong bộ gen bị thay đổi so với bộ gen chung của loài. Một biến thể được coi là một
SNP thì nó phải xảy ra ở ít nhất 1% dân số [50].

Hình 1.4. Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn (SNP)
(Nguồn: )
SNP là một hiện tượng tương đối phổ biến diễn ra trong suốt chiều dài DNA
của một người, trung bình xảy ra một lần sau mỗi 300 nucleotide nghĩa là bộ gen
người có khoảng 3 tỷ bp sẽ có khoảng 10 triệu SNP [51]. Sự phân bố SNP là không
đồng nhất, nó có thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nào trên hệ gen, ở vùng mã hóa hay
không mã hóa, tuy nhiên người ta thường tìm thấy SNP với tần suất cao ở các đoạn
DNA nằm giữa các gen [52].
SNP trong vùng mã hóa có 2 loại: đồng nghĩa và không đồng nghĩa. SNP
đồng nghĩa không ảnh hưởng đến các chuỗi protein trong khi SNP không đồng
nghĩa thay đổi trình tự axit amin của protein. Các SNP không đồng nghĩa lại được
chia thành sai nghĩa và vô nghĩa.
SNP không nằm trong vùng mã hóa protein có thể vẫn ảnh hưởng đến sự liên
kết gen, sự gắn kết yếu tố phiên mã, sự thoái hoá của mRNA, hoặc trình tự RNA
không mã hóa.
Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con người là giống nhau, nhưng chỉ một
sự thay đổi nhỏ trong hệ gen cũng có thể tác động lớn đến tính nhạy cảm của mỗi cá
thể khác nhau với bệnh tật, sự đáp ứng với các liệu pháp điều trị cũng như khả năng
thích nghi với các yếu tố từ môi trường như: chất độc, vi khuẩn, virus… Điều này
làm cho SNP có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực y sinh học [53].


14

Những biến thể này được xem như là các dấu ấn sinh học. Các nhà nghiên
cứu sẽ tiến hành so sánh trình tự gen của các nhóm người khác nhau (giữa nhóm
người bị bệnh và không bị bệnh) để từ đó xác định mối liên quan giữa các SNP với
khả năng mắc bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ cũng như phương pháp chữa trị.
1.2.4.2. Tính đa hình thái đơn nucleotide của gen XRCC1
Mặc dù có hơn 300 SNP đã được mô tả trong gen XRCC1, chỉ có ba SNP
thường xuyên được nghiên cứu [16]:
Bảng 1.1. Một số đa hình đơn của gen XRCC1
Vị trí trên gen
Acid amin
SNP
Biến đổi nucleotide
XRCC1
rs1799782
26304, exon 6
CGG → TGG
Arg194Trp
rs25489
27466, exon 9
CGT → CAT
Arg280His
rs25487
28152, exon 10
CGG → CAG
Arg399Gln
Đa hình Arg399Gln (rs25487, G > A) là đa hình được nghiên cứu trong đề tài
này. Tính đa hình của Arg399Gln nằm ở trung tâm của miền XRCC1 BRCT1, liên
quan đến chức năng của PARP1, PARP2 và APE1 [54], [31]. Monaco và cộng sự
(2007) cho thấy việc thay thế Arg399Gln XRCC1 tạo ra sự thay đổi đáng kể về cấu

hình ở một số vị trí khác trong miền BRCT1. Những thay đổi này có thể là rất quan
trọng trong sự tương tác protein-protein và sau đó có thể giảm khả năng tạo ra các
bộ máy BER [55].

Hình 1.5. Các miền của protein XRCC1 và cấu trúc gen XRCC1 [56]
A: Sơ đồ mạch cho thấy các vùng tương tác giữa các protein trong BER
B: Sơ đồ vị trí của các SNP phổ biến nhất và được nghiên cứu nhiều nhất
Sự giảm khả năng của protein XRCC1 399Gln trong quá trình sửa chữa
DNA gần đây đã được chứng minh. Li Y. và cộng sự (2009) nghiên cứu cho thấy
các “tế bào lymphoblast bất tử” (immortalized lymphoblasts) lấy từ những người
công nhân vinyl chloride mang kiểu gen XRCC1 399Arg/Arg, đã phơi nhiễm với
chloroethylene oxide (CEO) và tiếp xúc với etheno-adenosine có hiệu quả sửa chữa
trung bình là 82%. Ngược lại, các “tế bào lymphoblast bất tử” ở những người công


15

nhân có kiểu gen XRCC1 399 Gln/Gln và cùng phơi nhiễm như trên thì hiệu quả
sửa chữa trung bình là 32% [57].
Việc sửa chữa DNA bị suy giảm có thể gây phản ứng tự miễn dịch ở những
người dễ bị tổn thương với biến thể protein XRCC1 đã bị phơi nhiễm với các yếu tố
phá hủy DNA [10], [9], [58], [59], [60].
Một nghiên cứu phân tích cộng gộp gần đây (2012) bao gồm các dân tộc Đài
Loan Trung Quốc, Ba Lan và Brazil cho thấy kiểu gen XRCC1 399 Gln/Gln hoặc
Gln/Arg và alen Gln có liên quan đến tỷ lệ mắc SLE. Tỷ suất chênh OR cho gen
399 Gln/Gln hoặc Gln/Arg so với Arg/Arg là 1,440 (p = 0,0019) và OR cho alen
Gln là 1,27 (p = 0,0051) [5].
Tuy nhiên, nghiên cứu ở Đông Nam Iran (2014) lại cho thấy nguy cơ SLE
thấp hơn ở các cá thể có gen 399 Gln/Gln và Gln/Arg so với những người có kiểu
gen Arg/Arg với tương ứng OR = 0,73 (p = 0,063) và OR = 0,44 (p = 0,001). Ngoài

ra, tần số của alen Gln thấp hơn đáng kể ở bệnh nhân SLE OR = 0,7 (p = 0,02) [17].
Đa hình Arg399Gln (rs25487, G > A) được nghiên cứu không chỉ trong SLE
mà còn trong nhiều bệnh ung thư khác nhau. Sự có mặt của alen A (tương ứng kiểu
gen 399 Gln/Gln hoặc 399 Gln/Arg) được coi là yếu tố nguy cơ xuất hiện các loại
ung thư như: ung thư tụy ở người châu Á [18] và là yếu tố tiên lượng xấu làm giảm
đáp ứng điều trị đối với ung thư phổi [19], ung thư dạ dày và đại trực tràng ở người
châu Á [20], ung thư vú (xạ trị và hóa trị) [21]. Tuy nhiên đa hình này được cho là
không liên quan tới ung thư biểu mô tế bào gan [61], ung thư vú ở người Ả Rập
Saudi [62], ung thư bàng quang ở người châu Á [63]. Ngoài ra đa hình Arg399Gln
cũng có thể đóng góp trong bệnh tâm thần phân liệt [64], bệnh xơ vữa động mạch
vành [65]…
Tại Việt Nam chúng tôi chưa thấy có nhiều nghiên cứu về gen XRCC1 nói
chung, đa hình Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống nói riêng.
1.3. Các kỹ thuật SHPT phát hiện tính đa hình thái đơn nucleotide
1.3.1. Kỹ thuật PCR
1.3.1.1. Khái niệm
Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) là một kỹ
thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) của
một đoạn DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt [66].
1.3.1.2. Thành phần và các bước tiến hành
 Các thành phần tham gia trong phản ứng PCR
DNA khuôn: Là DNA cần khuếch đại, có thể là mạch thẳng, mạch vòng,
DNA plasmid, cDNA hay RNA đều được.
Cặp mồi đặc hiệu: Gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R). Nó gắn chặt với
DNA khuôn ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA polymerase
nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới.


16

DNA polymerase: Là enzym xúc tác quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G,
C vào mạch DNA mới tổng hợp. Thường gặp là Taq polymerase.
Các dNTP: Gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo
nên mạch DNA mới.
MgCl2 và dung dịch đệm (Buffer): Thành phần dung dịch của phản ứng PCR
thường phụ thuộc vào loại enzym DNA polymerase sử dụng trong PCR, quan
trọng nhất là ion Mg2+. Mg2+ cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc
tác cho Taq polymerase làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ còn là Cofactor của Taq polymerase.
 Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại. Mỗi chu kỳ gồm có 3 giai đoạn
được điều hòa bởi nhiệt độ:
Giai đoạn biến tính (92 – 95oC): Chuỗi xoắn kép DNA bị biến tính, tách
thành 2 sợi đơn.
Giai đoạn gắn mồi (50 – 52oC): Đoạn DNA mồi được lai ghép với sợi đơn
của DNA ban đầu.
Giai đoạn tổng hợp (70 – 72oC): DNA polymerase điều khiển sự gắn tiếp các
dNTP vào đoạn DNA mồi dựa trên DNA khuôn ban đầu.

Hình 1.6. Sơ đồ chu trình phản ứng PCR
(Nguồn: )
1.3.2. Kỹ thuật PCR-RFLP
1.3.2.1. Khái niệm
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length
Polymorphism) là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA