ĐÁNH GIÁ mối LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NGÀY 3 với kết QUẢ xét NGHIỆM DI TRUYỀN TRONG kỹ THUẬT SÀNG lọc DI TRUYỀN TIỀN làm tổ

SỞ Y TẾ HÀ NỘI

BỆNH VIỆN PHỤ SẢN HÀ NỘI

NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI
PHÔI NGÀY 3 VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM
DI TRUYỀN TRONG KỸ THUẬT SÀNG LỌC
DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ

Hà Nội, năm 2018


SỞ Y TẾ HÀ NỘI

BỆNH VIỆN PHỤ SẢN HÀ NỘI

NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI
PHÔI NGÀY 3 VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM
DI TRUYỀN TRONG KỸ THUẬT SÀNG LỌC
DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ
Chủ nhiệm đề tài
BS.CKII. Phạm Thúy Nga
Nhóm nghiên cứu:
CN. Nguyễn Thu Huyền
KS. Đinh T. Phương Thảo
CN. Ngô Tuấn Khanh
HS. Lê Thị Hương

Hà Nội, năm 2018


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
a-CGH

: Array Comparative Genomic Hybridization
(lai so sánh bộ gen)

FISH

: Fluorescent In Situ Hybridization
(lai huỳnh quang tại chỗ)

hCG

: Human Chorionic Gonadotropin

ICSI

: IntraCytoplasmic Sperm Injection
(tiêm tinh trùng vào bào tương noãn)

IVF

: In-Vitro Fertiliztion (thụ tinh trong ống nghiệm)

LBNST

: Lệch bội nhiễm sắc thể

NC

: Nghiên cứu

NGS

: Next Generation Sequencing (giải trình tự gene thế hệ mới)

NST

: Nhiễm sắc thể

PGD

: Preimplantation genetic diagnosis
(Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ)

PGS

: Preimplantation genetic screening
(Sàng lọc di truyền tiền làm tổ)

TTTON

: Thụ tinh trong ống nghiệm

VS

: vô sinh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1......................................................................................................3
TỔNG QUAN..................................................................................................3
1.1. SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TTTON VÀ TIÊU CHUẨN ĐÁNH
GIÁ HÌNH THÁI PHÔI ĐANG PHÂN CHIA.......................................3
1.1.1. Giai đoạn tiền nhân.......................................................................3
1.1.2. Giai đoạn phân chia (Cleavage)...................................................3
1.1.3. Giai đoạn phôi dâu (morula)........................................................4
1.1.4. Giai đoạn phôi nang (blastocyst)..................................................4
1.1.5. Các yếu tố hình thái của phôi ngày 3...........................................6
1.2. SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ............................................8
1.2.1. Khái niệm, chỉ định.......................................................................8
1.2.2. Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ.....................................8
1.3. BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI VÀ BẤT THƯỜNG NST.................12
1.3.1. Bộ nhiễm sắc thể người...............................................................12
1.3.2. Bất thường số lượng nhiễm sắc thể............................................13
1.3.3. Bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể............................................14
1.3.4. Một số hội chứng ở người do bất thường NST gây ra..............15
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ 16
1.4.1.Nghiên cứu về kết quả xét nghiệm di truyền.............................16
1.4.2. Nghiên cứu về ảnh hưởng của hình thái phôi đến két quả xét
nghiệm..........................................................................................17
CHƯƠNG 2....................................................................................................19
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................19
2.1. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU...........................................19

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................19
2.2.1. Tiêu chuẩn chọn...........................................................................19
2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ......................................................................19
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................19
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả hồi cứu và tiến cứu...19
2.3.2. Cỡ mẫu.........................................................................................19
2.3.3. Kỹ thuật thu thập số liệu............................................................20
2.3.4. Các bước tiến hành......................................................................20
2.3. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ PHÔI NGÀY 3 TRONG NGHIÊN CỨU
...............................................................................................................23
2.4. CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU...........................................................25
2.4.1. Các biến số về đặc điểm mẫu nghiên cứu..................................25
2.4.2. Các biến số về kết quả xét nghiệm di truyền............................25
2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ SAI SỐ.............................................................25
2.6. KHÍA CẠNH ĐẠO ĐỨC CỦA ĐỀ TÀI.............................................26
CHƯƠNG 3....................................................................................................27
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................27
3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.........................................27
3.1.1. Đặc điểm về hình thái phôi.........................................................27
3.1.2. Đặc điểm về kết quả xét nghiệm di truyền của phôi................28
3.2. LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI VỚI KẾT QUẢ XÉT
NGHIỆM DI TRUYỀN.........................................................................28
3.2.1. Liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 với kết quả xét nghiệm 28
3.2.2. Liên quan giữa từng yếu tố của phôi ngày 3 với kết quả xét
nghiệm..........................................................................................30
3.2.3. Liên quan giữa các yếu tố của phôi ngày 3 với kết quả xét
nghiệm qua phân tích kết hợp các yếu tố hình thái.................33

CHƯƠNG 4....................................................................................................39
BÀN LUẬN....................................................................................................39
4.1. BÀN LUẬN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU....39
4.2. BÀN LUẬN VỀ TƯƠNG QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NGÀY 3
VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN.....................................41
4.3. BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA TỪNG YẾU TỐ HÌNH THÁI
ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN....................................44
Ảnh hưởng của số lượng phôi bào đến kết quả di truyền............................44
Ảnh hưởng của tỷ lệ phân mảnh bào tương đến kết quả di truyền..............45
Ảnh hưởng của độ đồng đều tế bào đến kết quả di truyền..........................46
4.4. BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG KẾT HỢP CỦA CÁC YẾU TỐ HÌNH
THÁI ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN..........................48
Ảnh hưởng của hai yếu tố hình thái đến kết quả xét nghiệm......................48
Ảnh hưởng kết hợp của ba yếu tố hình thái đến kết quả xét nghiệm..........49
KẾT LUẬN....................................................................................................51
KIẾN NGHỊ...................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................25


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Đặc điểm về hình thái của phôi sinh thiết..................................27
Bảng 3.2: Kết quả giải trình tự gen 23cặp nhiễm sắc thể của phôi ngày 3
.......................................................................................................28
Bảng 3.3: Liên quan giữa hình thái phôi với kết quả xét nghiệm.............28
Bảng 3.4: Liên quan giữa hình thái phôi với loại bất thường NST...........29
Bảng 3.5: Liên quan giữa số lượng tế bào với kết quả di truyền..............30
Bảng 3.6: Liên quan giữa tỷ lệ phân mảnh bào tương với kết quả di
truyền...........................................................................................31
Bảng 3.7: Liên quan giữa độ đồng đều tế bào với kết quả di truyền........32
G

32

Bảng 3.8: Liên quan giữa số lượng tế bào, độ đồng đều tế bào.................33
với kết quả xét nghiệm di truyền.................................................................33
Bảng 3.9: Liên quan giữa số lượng tế bào, độ phân mảnh bào tương......34
với kết quả xét nghiệm di truyền.................................................................34
Bảng 3.10: Liên quan giữa độ đồng đều của tế bào, độ phân mảnh bào
tương với kết quả xét nghiệm di truyền....................................35
Bảng 3.11: Liên quan giữa số lượng tế bào, độ đồng đều tế bào và tỷ lệ
phân mảnh bào tương với kết quả xét nghiệm di truyền........37


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sự phát triển của phôi ngày 2, ngày 3 (2, 4, 6, và 8 tế bào)[23]..4
Hình 1.2 : Phôi dâu ngày 4 (từ lúc bắt đầu kết khối đến khi hoàn tất
thành một khối đặc không thấy ranh giới tế bào)[23]...............4
Hình 1.3: Phôi nang (từ lúc mới xuất hiện xoang phôi nang đến khi hình
thành phôi nang hoàn chỉnh) [23]................................................5
Hình 1.4: Đánh giá độ đồng đều của phôi.....................................................7
Hình 1.5: Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ......................................8
Hình 1.6: Sinh thiết tế bào ở phôi ngày 3 (8 tế bào).....................................9
Hình 1.7: Sinh thiết phôi nang.....................................................................10
Hình 1.8: Bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của người.......................................13
Hình 1.9: Cơ chế tạo thể lệch bội trong nguyên phân và giảm phân........14
Hình 1.10: Cơ chế hình thành bất thường cấu trúc NST...........................15
Hình 2.1: Kỹ thuật sinh thiết tế bào ngày 3................................................21
Hình 2.2: Kỹ thuật rửa tế bào sau sinh thiết...............................................21
Hình 2.3: Quy trình phân tích mẫu (bộ kit VeriSeq PGS – Illumina)......22
Hình 2.4: Phần mềm phân tích kết quả trong kỹ thuật NGS....................22

Hình 2.5: Phôi có kích thước các tế bào tương đối đồng đều....................24
Hình 2.6: Phôi có kích thước tế bào không đồng đều.................................24
Hình 2.7: Mức độ phân mảnh bào tương của phôi....................................24


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển và ngày càng hoàn thiện của các kĩ thuật thụ tinh trong
ống nghiệm tạo phôi đã giúp bệnh nhân tạo được nhiều phôi hơn trong mỗi
chu kì IVF, nhờ vậy càng có nhiều cơ hội để lựa chọn phôi chuyển vào buồng
tử cung. Việc lựa chọn được phôi “chất lượng tốt” để chuyển vào buồng tử
cung là bước quan trọng đầu tiên giúp tăng tỷ lệ có thai và cho ra đời những
em bé khỏe mạnh, không bị dị tật. Hiện nay, ở các trung tâm thụ tinh trong
ống nghiệm, việc lựa chọn phôi thường chỉ dựa trên những tiêu chuẩn về hình
thái như: kích thước, số lượng tế bào và tỷ lệ các mảnh vụn bào tương của
phôi…không phản ánh đầy đủ chất lượng thực của phôi [1]. Rất nhiều kĩ thuật
mới ra đời giúp lựa chọn được những phôi có tiềm năng để chuyển vào buồng
tử cung nhằm tăng cơ hội có thai. Kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ
(Preimplantation genetic screening – Sàng lọc di truyền tiền làm tổ - PGS) là
một trong những kỹ thuật đó với cơ sở khoa học rằng: nguyên nhân chính gây
thất bại làm tổ hoặc sẩy thai nhiều lần là do phôi bị bất thường về nhiễm sắc
thể. Kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ giúp sàng lọc bất thường của phôi
ở giai đoạn sớm trước khi làm tổ nhằm phát hiện những phôi bất thường, chọn
những phôi bình thường có tiềm năng làm tổ cao nhất để chuyển vào buồng tử
cung cho bệnh nhân giúp cải thiện tỷ lệ có thai và giảm tỷ lệ thai dị tật cũng
như tăng cơ hội sinh ra những em bé khỏe mạnh [4].
Sau một thời gian chuẩn bị kĩ lưỡng về trang thiết bị, nhân lực, kĩ thuật,
tháng 10/2015, khoa Hỗ trợ sinh sản – Bệnh viện Phụ sản Hà Nội bắt đầu
triển khai kĩ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ và đã thu được một số kết quả

đáng khích lệ. Tuy nhiên, chi phí cho một chu kì PGS tương đối cao đối với
phần lớn các cặp vợ chồng hiếm muộn. “Làm sao để giúp các cặp vợ chồng
không có điều kiện làm PGS có thể lựa chọn được những phôi có tiềm năng


2

cao và tỷ lệ bất thường NST thấp” luôn là trăn trở của chúng tôi. Nhiều
nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy mối liên quan giữa hình thái phôi
ngày 3 và kết quả xét nghiệm di truyền. Đây là động lực để nhóm tác giả
chúng tôi, dựa vào kết quả của những chu kỳ PGS, quyết định thực hiện đề
tài: “Đánh giá mối liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 với kết quả xét
nghiệm di truyền bằng kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ” với hai
mục tiêu:
1. Xác định mối liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 với kết quả xét
nghiệm di truyền.
2. Xác định mối liên quan giữa từng yếu tố hình thái phôi ngày 3 với
kết quả xét nghiệm di truyền qua phân tích đơn biến và đa biến.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TTTON VÀ TIÊU CHUẨN ĐÁNH
GIÁ HÌNH THÁI PHÔI ĐANG PHÂN CHIA
Giai đoạn phát triển phôi sớm ở người kéo dài khoảng 5-6 ngày bắt đầu
từ khi noãn thụ tinh đến khi hoàn tất giai đoạn phôi nang (blastoyst), sẵn sàng
cho quá trình làm tổ. Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ được chia làm 4
giai đoạn: giai đoạn tiền nhân, giai đoạn phân chia (cleavage); giai đoạn phôi

dâu (morula); giai đoạn phôi nang (blastocyst).
1.1.1. Giai đoạn tiền nhân
Sự hợp nhất của tinh trùng với noãn kèm theo giải cô đặc nhiễm sắc thể
thường xảy ra trong tế bào chất của noãn trưởng thành. Noãn thụ tinh có hình
thành 2 tiền nhân quan sát được vào thời điểm 16-20 giờ sau ICSI. Tiền nhân
có nguồn gốc từ tinh trùng thường ở trung tâm, tiền nhân có nguồn gốc từ
noãn ở gần thể cực. Hai tiền nhân thường nằm sát nhau thành hình số 8 và
phần tiếp xúc sát nhau tạo thành một mặt phẳng. Mỗi tiền nhân có 1 đến 9 hạt
nhân. Những đặc điểm của 2 tiền nhân như kích thước và vị trí 2 tiền nhân
trong bào tương noãn, số lượng và sự phân bố của hạt nhân có giá trị tiên
lượng chất lượng phôi [11].
1.1.2. Giai đoạn phân chia (Cleavage)
Giai đoạn phân chia của phôi bắt đầu từ giai đoạn phôi 2 tế bào đến ki
phôi bắt đầu nén. Sự phân chia của hợp tử giai đoạn này không kèm theo sự
tăng kích thước của hợp tử. Từ hợp tử lớn ban đầu tạo ra nhiều tế bào con
(blastomeres) và vẫn được bao ngoài bởi màng trong suốt. Các tế bào đều
hình cầu, có tính đồng nhất về mặt hình thái, sinh hóa và có “tính toàn năng”,
tức là đều có tiềm năng phát triển thành bất kỳ loại mô nào của cơ thể.


4

Hình 1.1: Sự phát triển của phôi ngày 2, ngày 3 (2, 4, 6, và 8 tế bào)[23]
1.1.3. Giai đoạn phôi dâu (morula)
Khoảng giai đoạn 8 tế bào, các tế bào biến đổi hình dạng từ hình cầu
sang hình dẹt, có cạnh và tựa lên nhau, tiếp xúc khăng khít với nhau, giảm
khoảng gian bào và đường viền quanh tế bào cũng mờ đi. Quá trình này gọi là
giai đoạn kết khối (compaction). Phôi dâu hình thành cuối giai đoạn này,
thường vào khoảng giữa ngày 3 và ngày 4, có dạng một khối tế bào đặc hình
cầu khoảng 16-32 tế bào.

Phôi giai đoạn 16 tế bào mà không có các dấu hiệu của sự kết khối sẽ bị
giảm tiềm năng và sẽ khó đạt đến giai đoạn phôi nang [2].

Hình 1.2 : Phôi dâu ngày 4 (từ lúc bắt đầu kết khối đến khi hoàn tất thành
một khối đặc không thấy ranh giới tế bào)[23]
1.1.4. Giai đoạn phôi nang (blastocyst)
Sau ngày thứ 4 của sự phát triển, phôi lúc này khoảng 30 tế bào, bắt
đầu có sự hình thành xoang chứa dịch gọi là khoang phôi nang (blastocyst
cavity) ở trong phôi. Khoảng ngày 5 sau thụ tinh, phôi nang có khoảng 100 tế
bào, và biệt hóa thành 2 dòng tế bào khác biệt: tế bào bên ngoài là tế bào dẹt,
lớn, gọi là “lá nuôi” (trophectoderm - TE) giúp hỗ trợ quá trình làm tổ của


5

phôi, hình thành nhau thai và các phần phụ, trao đổi chất; khối tế bào bên
trong (ICM, inner cell mass) tiếp tục phân chia và co lại tạo thành một khối ở
vị trí lệch tâm chịu trách nhiệm tạo nên toàn bộ cơ thể của thai nhi sau này.
Sự hình thành và phát triển của phôi nang phụ thuộc vào nhiều yếu tố
liên quan như: chất lượng tinh trùng, tuổi người phụ nữ, số noãn chọc hút
được, số noãn thụ tinh, chất lượng phôi ngày 3.

Hình 1.3: Phôi nang (từ lúc mới xuất hiện xoang phôi nang đến khi hình
thành phôi nang hoàn chỉnh) [23]
Chất lượng phôi nang được đánh giá dựa trên 3 tiêu chuẩn là: sự tạo
nang và độ nở rộng của phôi; khối tế bào bên trong (ICM) và lớp tế bào lá
nuôi (TE). Một phôi ngày 5 đánh giá vào thời điểm 116 ± 2h sau ICSI được
xem là có chất lượng tốt khi có độ nở rộng tối đa, hay đã phát triển đến giai
đoạn thoát màng; có khối ICM nổi bật, thấy rõ giới hạn, bên trong có chứa
nhiều tế bào liên kết chặt chẽ với nhau; các tế bào TE có nhiều, ép dẹt vào

màng trong suốt và dính liền với nhau [12].


6

1.1.5. Các yếu tố hình thái của phôi ngày 3
Phôi giai đoạn đang phân chia được đánh giá dựa vào 3 tiêu chuẩn:
số lượng tế bào, độ đồng đều về kích thước giữa các tế bào và độ phân
mảnh bào tương.
 Đánh giá số lượng tế bào
Số lượng tế bào là đặc điẻm chính có giá trị tiên lượng cao nhất trong
đánh giá chất lượng phôi. Số lượng tế bào đại diện cho tốc độ phát triển của
phôi. Phôi ngày 3 (68h±1) thường có 7-9 tế bào. Những phôi có tốc độ phân
chia chậm hơn mong đợi có khả năng làm tổ thấp trong khi những phôi có tốc
độ phân chia nhanh hơn mong đợi có thể mang bất thường di truyền và làm
giảm tỷ lệ làm tổ [2].
 Đánh giá độ đồng đều của các tế bào
Theo lý thuyết, quá trình phân cắt sẽ tạo ra 2 tế bào kích thước bằng
nhau. Khi quá trình phân chia diễn ra bất thường, một tế bào nhận được ít tế
bào chất hơn tế bào còn lại. Tế bào này sẽ tiếp tục phân chia và tạo ra những
dòng tế bào kích thước nhỏ hơn và nhiều khiếm khuyết hơn.
Kích thước tế bào được đánh giá ở 3 mức độ: lớn, trung bình, nhỏ. Phôi
có kích thước đồng đều khi kích thước của mỗi tế bào tương đối bằng nhau.
Phôi có kích thước không đồng đều khi đường kính giữa tế bào lớn nhất và tế
bào nhỏ nhất khác biệt từ 20% trở lên. Những phôi có kích thước tế bào
không đồng đều thường có tỷ lệ lệch bội và đa nhân cao hơn cũng như khả
năng phát triển và làm tổ kém hơn [12].
Kích thước tế bào của phôi dựa vào số lần phân chia và độ đồng đều
của mỗi lần phân chia. Thông thường những phôi có số tế bào chẵn (2, 4,
hoặc 8) có kích thước tế bào tương đối đồng đều. Các phôi có số tế bào lẻ nên

có kích thước không đồng đều do sự phân chia không đồng đều của 1 hoặc
nhiều tế bào [2].


7

Hình 1.4: Đánh giá độ đồng đều của phôi
 Đánh giá độ phân mảnh của bào tương
Mảnh vỡ bào tương là những khối bào tương có màng bao, không có
nhân nằm ngoài tế bào, có kích thước < 45µm đối với phôi ngày 2 và < 40µm
đối với phôi ngày 3 [2]. Đây là một hiện tượng thường gặp ở phôi trong ống
nghiệm. Kích thước và sự phân bố mảnh vỡ bào tương thường khác nhau giữa
các phôi. Lượng mảnh vỡ bào tương thường được sử dụng để dự đoán khả
năng làm tổ và mức độ lệch bội của phôi [12]. Mức độ phân mảnh bào tương
được chia thành 3 cấp độ: nhẹ (< 10%), vừa (10 – 19%) và nặng (>20%).
Nhiều mảnh vỡ bào tương ngăn cản và làm giảm sự tiếp xúc giữa các tế bào
với nhau, gây ảnh hưởng tới quá trình phân chia của phôi, đặc biệt là quá trình
nén cũng như hình thành phôi nang. Những phôi tốt, có khả năng phát triển và
làm tổ cao được ghi nhận là những phôi không có hoặc ít phân mảnh. Phân
mảnh lớn, xuất hiện sớm sau chu kì phân bào đầu tiên ảnh hưởng nhiều đến
sự phát triển của phôi. Ngược lại, những mảnh vỡ nhỏ, xuất hiện muộn ít ảnh
hưởng đến sự phát triển của phôi [12].


8

1.2. SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ
1.2.1. Khái niệm, chỉ định
Kỹ thuật sinh thiết phôi để sàng lọc di truyền tiền làm tổ được báo cáo
đầu tiên năm 1989 bởi Handyside và cs. Sàng lọc di truyền tiền làm tổ (PGS:

Preimplantation genetic screening) là kĩ thuật áp dụng cho bệnh nhân TTTON
nhằm xác định những phôi bất thường (nguyên nhân chính gây thất bại làm tổ
hay sảy thai nhiều lần sau chuyển phôi), chọn những phôi bình thường có
tiềm năng làm tổ cao nhất để chuyển vào buồng tử cung cho bệnh nhân do đó
cải thiện trực tiếp tỷ lệ có thai [5].
PGS được chỉ định cho các trường hợp TTTON tiên lượng kém như: phụ
nữ lớn tuổi, tiền căn sẩy thai liên tiếp nhiều lần (trên 2 lần), thất bại làm tổ
nhiều lần (trên 3 lần). Trong các trường hợp này đều tìm thấy sự liên quan đến
các bất thường NST: 70% noãn bất thường phát hiện ở phụ nữ >40 tuổi, 5090% sảy thai tự nhiên và 41,3% thất bại làm tổ [22].
1.2.2. Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ
Như vậy một chu kì PGD/PGS gồm các giai đoạn: kích thích buồng
trứng làm TTON, sinh thiết phôi, xét nghiệm di truyền và chuyển phôi. So với
một chu kỳ IVF thông thường, chu kì PGS có thêm hai giai đoạn nữa là sinh
thiết phôi và xét nghiệm di truyền.

Hình 1.5: Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ


9

1.2.2.1. Sinh thiết phôi
Đây là giai đoạn quan trọng nhằm thu nhận tế bào để phục vụ cho quá
trình xét nghiệm. 3 nguồn vật liệu cung cấp cho sinh thiết là tế bào thể cực ở
noãn trưởng thành, tế bào ở giai đoạn phôi đang phân chia và tế bào lá nuôi ở
giai đoạn phôi nang. Mỗi thời điểm sinh thiết đều có ưu, nhược điểm khác
nhau trong đó sinh thiết tế bào giai đoạn đang phân chia và giai đoạn phôi
nang được thực hiện rộng rãi nhất.
 Sinh thiết tế bào ở giai đoạn phôi đang phân chia (cleavage-embryo
biopsy)
1-2 tế bào sẽ được sinh thiết vào sáng ngày thứ 3 sau thụ tinh (giai đoạn 6-8

tế bào) để làm xét nghiệm di truyền mà không gây ảnh hưởng đến khả năng sống
và phát triển tiếp của phôi. Phôi sau sinh thiết sẽ tiếp tục được nuôi, chờ kết
quả xét nghiệm di truyền (khoảng 24h – 36h) và được chọn lựa để chuyển vào
buồng tử cung [8], [10].
Ở thời điểm sinh thiết phôi ngày 3 sau thụ tinh, liên kết giữa các tế bào
bắt đầu chặt chẽ có thể gặp khó khăn trong quá trình sinh thiết. Ngoài ra, khả
năng tự tái sắp xếp cấu trúc của phôi ngày 3 cũng như hiện tượng khảm
(mosaicism) vẫn có thể xảy ra gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. Việc sử
dụng hai tế bào để sàng lọc, chẩn đoán được đề xuất cho kết quả chính xác
hơn. Tuy nhiên, sinh thiết 2 tế bào được ghi nhận ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh
cũng như giảm tỷ lệ phôi làm tổ hơn so với sinh thiết 1 tế bào [9].

Hình 1.6: Sinh thiết tế bào ở phôi ngày 3 (8 tế bào)


10

 Sinh thiết tế bào ở giai đoạn phôi nang (blastocyst biopsy)
Phôi sẽ được nuôi cấy đến ngày thứ 5 sau khi thụ tinh và sinh thiết 5-10 tế
bào thuộc lớp tế bào lá nuôi (trophectoderm – TE) để làm xét nghiệm [8]. Phôi
sau sinh thiết được đông lại và chuyển vào chu kì sau. Phôi sinh thiết ở giai
đoạn này thường có sức sống cao hơn so với phôi giai đoạn đang phân chia.
Do khối tế bào nội phôi (inner cell mas - ICM) vẫn được bảo tồn nên sự phát
triển tiếp theo của phôi không bị ảnh hưởng. Kỹ thuật này giúp thu được
nhiều tế bào hơn, có thể khắc phục được nhược điểm về hiện tượng thể khảm
và tái sắp xếp cấu trúc di truyền của phôi ngày 3 nên kết quả đáng tin cậy.
Tuy nhiên, sinh thiết phôi nang tương đối khó thao tác, ít phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang và phải đông phôi lại để chuyển ở chu kỳ sau nhằm
tránh hiện tượng thoát màng [6].

Hình 1.7: Sinh thiết phôi nang
1.2.2.2. Các kỹ thuật xét nghiệm di truyền trong PGS
 Kỹ thuật FISH (Fluorescent insitu hybridization)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent insitu hybridization - FISH)
là kỹ thuật sử dụng một đoạn dò đặc hiệu (probe) có bản chất nucleid acid được
gắn tín hiệu huỳnh quang, lai với nhiễm sắc thể (NST) hoặc vùng NST ở kỳ
giữa, hoặc nhân tế bào ở kỳ trung gian của quá trình phân bào. Mẫu dò đặc hiệu
có thể là những trình tự ADN đặc hiệu cho các bệnh di truyền cần phát hiện, sẽ
gắn với những trình tự tương đồng trong gen đích để phát hiện bất thường. Quan


11

sát vị trí gắn kết của mẫu dò bằng kính hiển vi huỳnh quang. Như vậy, FISH
giúp xác định bất thường về số lượng và bất thường chuyển đoạn NST.
Kể từ lần đầu tiên được đưa vào xét nghiệm phôi người năm 1992 đến nay,
kỹ thuật FISH đã được cải tiến nhiều để có thể khảo sát được nhiều NST hơn.
Các đầu dò sử dụng tập trung vào các NST có ý nghĩa về mặt lâm sàng như:
X, Y, 13, 18, 21, 14, 15, 16 và 22 [18].
 Kỹ thuật CGH-microarray (lai so sánh bộ gen)
Kỹ thuật lai so sánh bộ gen cho phép đánh giá đồng thời tất cả 24NST
trong một tế bào đơn lẻ ở bất kỳ giai đoạn phân chia nào mà không cần cố
định tế bào. Trong kỹ thuật này, ADN cần xét nghiệm được đánh dấu huỳnh
quang màu xanh lai so sánh với ADN bình thường đánh dấu huỳnh quang
màu đỏ. Tỷ lệ giữa phần huỳnh quang màu xanh/ phần huỳnh quang màu đỏ
dọc theo nhiễm sắc thể sẽ thể hiện số lượng nhiễm sắc thể của mẫu thử với
mẫu chứng. Nếu màu huỳnh quang xanh đặc hiệu cho ADN đang xét nghiệm
tăng hơn chứng tỏ có sự tăng nhiễm sắc thể, ngược lại nếu màu huỳnh quang
đỏ tăng hơn là biểu hiện của thiếu nhiễm sắc thể [19].
Phương pháp này lần đầu tiên được sử dụng để tầm soát phôi người vào

năm 1996 và đã phát hiện chính xác, đầy đủ rối loạn của phôi dị bội, làm tăng
sự chính xác trong việc lựa chọn phôi để chuyển vào buồng tử cung. Tuy
nhiên, đây là một kĩ thuật khó, cần người thực hiện phải được đào tạo chuyên
sâu và thời gian trả lời kết quả cũng tương đối lâu.
 Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing)
Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở châu Âu và Mỹ để phân tích
nhiễm sắc thể của phôi nang. Nguyên lý của kỹ thuật này là chia nhỏ bộ gen
thành hàng trăm nghìn đoạn nhỏ; các đoạn nhỏ này sẽ được đọc trình tự song
song và nhiều lần. Cuối cùng, chúng được ghép lại với nhau và được so sánh


12

với một bộ gen chuẩn. Kỹ thuật này không chỉ phát hiện bất thường về số
lượng nhiễm sắc thể mà còn giúp phát hiện đột biến có độ lớn >20Mb [5].
Ưu, nhược điểm của mỗi kỹ thuật được thể hiện trong bảng tổng hợp sau:
Công

FISH
BOB
Microarray
NGS
Công nghệ dựa Công nghệ Công
nghệ Công nghệ dựa

nghệ

vào tín hiệu hình dựa vào tín dựa vào tín vào số liệu về
ảnh.

hiệu

Đầu dò lai trực ảnh.

hình hiệu hình ảnh. trình tự ADN.
Đoạn dò gắn

tiếp lên tế bào Đoạn dò gắn trên bản lam
cố định trên lam trên
kính.
Độ phân 1NST/1 đầu dò
giải
Lượng
ADN

hạt kính

bead.
1NST/4 đầu 3000 đầu dò

3000 đầu dò đọc

Hiện chỉ đánh dò

đi đọc lại hàng

giá 5-9 NST
1 tế bào nguyên 50ng

>100ng

nghìn lần
1ng

Thêm/

mất Thêm/mất đoạn

vẹn

đầu vào
Bất
Không

Không

thường

đoạn >20MB

> 20MB

cấu trúc
1.3. BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI VÀ BẤT THƯỜNG NST
1.3.1. Bộ nhiễm sắc thể người
Ở người bình thường, mỗi tế bào lưỡng bội (2n) (diploid) mang 46
nhiễm sắc thể (NST) chia thành 23 cặp, trong đó có 22 cặp NST thường
(autosome) mang hai bộ gen giống nhau và 1 cặp NST giới tính XX/XY (sex
chromosome). Tinh trùng và noãn được hình thành qua giảm phân mang bộ
NST đơn bội (n) với 23 NST. Nhờ quá trình thụ tinh, bộ NST của noãn và tinh

13

trùng có sự kết hợp và tái tổ hợp nên phôi mang bộ NST lưỡng bội đặc trưng
của loài.
Các bất thường nhiễm sắc thể bao gồm 2 loại: bất thường về số
lượng và bất thường về cấu trúc. Những bất thường này gặp với tỉ lệ 1/150
trẻ sinh sống và là nguyên nhân hàng đầu của các trường hợp chậm phát
triển trí tuệ và sẩy thai. Bất thường số lượng NST xảy ra gây nhiều hậu quả
nghiêm trọng: gây sẩy thai sớm, dị tật thai nhi. Bất thường cấu trúc NST
thường ít gây chết thai nhưng có thể gây ra nhiều hội chứng bệnh lý cho
những đứa trẻ được sinh ra.

Hình 1.8: Bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của người
1.3.2. Bất thường số lượng nhiễm sắc thể
Bất thường số lượng nhiễm sắc thể bao gồm đa bội và lệch bội. Đa bội
là hiện tượng số lượng NST của bộ NST đa bội là bội số của n và lớn hơn 2n.
Đa bội hiếm gặp ở người.
Lệch bội là hiện tượng bất thường số lượng của một hoặc một số NST
trong bộ NST của tế bào. Sự mất cân bằng này có thể dẫn đến tình trạng phôi
ngừng phát triển trước khi làm tổ, sẩy thai hoặc thai chết lưu. Tuy nhiên, vẫn
có phôi lệch bội nhiễm sắc thể có thể sống nhưng phát triển thành thai bất
thường như hội chứng Down hoặc hội chứng Klinefelter.
Trường hợp tăng thêm một NST gọi là thể tam nhiễm (trisomy), trường
hợp mất một NST được gọi là thể đơn nhiễm (monosomy). Thể đơn nhiễm của


14

NST gặp rất ít ở trẻ sinh sống do đa số không sống được tới khi sinh. Thể tam
nhiễm được gặp ở trẻ sinh sống với tần số cao hơn do cơ thể có thể dung nạp
tình trạng thừa vật liệu di truyền tốt hơn trường hợp thiếu vật liệu di truyền.
Bất thường lệch bội xảy ra do rối loạn phân ly của các NST trong quá
trình nguyên phân hoặc giảm phân. Sự không phân ly của một cặp NST nào
đó trong quá trình giảm phân có thể xảy ra ở lần phân bào thứ nhất hoặc thứ
hai của giảm phân và tạo ra các hậu quả khác nhau.

Hình 1.9: Cơ chế tạo thể lệch bội trong nguyên phân và giảm phân
1.3.3. Bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể
Bất thường cấu trúc NST có thể ảnh hưởng đến 1, 2 NST hoặc nhiều
hơn. Các bất thường này xảy ra do bất thường quá trình tiếp hợp và trao đổi
chéo giữa các NST tương đồng trong quá trình giảm phân hoặc do đứt gãy
xảy ra trên NST trong nguyên phân hoặc giảm phân. Bình thường những
đứt gãy này được sửa chữa tuy nhiên trong một số trường hợp những tổn


15

thương không thể sửa chữa, làm thay đổi cấu trúc của NST và truyền cho
thế hệ sau. Bất thường mất đoạn và thêm đoạn là hai dạng bất thường gây
hậu quả lớn nhất.
Mất đoạn: Một đoạn NST bị mất, có thể ở một đầu cùng hoặc nằm
trong một nhánh của NST (không bao gồm tâm động). Đôi khi mất đoạn xảy
ra ở cả hai đầu cùng của NST dẫn đến tạo NST hình nhẫn (ring chromosome).
Đột biến mất đoạn làm giảm số lượng gen trên NST nên thường làm giảm sức
sống hoặc gây chết. Ví dụ: ở người mất đoạn NST21 gây ung thư máu, mất
đoạn nhỏ ở NST 5 gây hội chứng tiếng mèo kêu.
Thêm đoạn: Một đoạn gen được thêm vào NST. Đoạn gen này có thể là
từ NST khác bị đứt gãy hoặc từ những chuyển đoạn giữa các NST. Kết quả là

làm tăng số lượng gen trên NST. Chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal trans.)
khi có sự trao đổi đoạn giữa 2 NST không tương đồng. Chuyển đoạn
Robertson (Robertsonian trans.) còn gọi là chuyển đoạn hòa hợp tâm
(centrifusion trans.) là chuyển đoạn xảy ra giữa 2 nhánh dài của 2 NST tâm
đầu, phần vệ tinh bị mất.

Hình 1.10: Cơ chế hình thành bất thường cấu trúc NST
1.3.4. Một số hội chứng ở người do bất thường NST gây ra
Bất

Biểu hiện


16

thường
Thể đơn
nhiễm

XO

Hội chứng Turner: nữ lùn, màng da cổ, vòm miệng cao,
vô sinh

XXY

HC Clinefelter: Nam, tinh hoàn nhỏ, cao, chi dài, vô sinh

XYY

Nam, cao, ngoại hình bình thường, có các hành vi nổi
loạn gây chú ý

XXX

Nữ, ngoại hình bình thường, chậm phát triển tâm thần,
vô sinh (đa số)

Trisomy HC Patau: nhiều di tật: nhiều ngón, dị tật tim, thận, thần
13
kinh, bộ mặt bất thường, sứt môi, hở hàm ếch…95%
thai trisomy 13 bị sẩy ngẫu nhiên trong thai kỳ. 90% trẻ
chết trong năm đầu sau sinh.
Trisomy HC Edwards: 90% trẻ chết một năm sau sinh. Trẻ rối
18
loạn chức năng bú, nuốt, thở và thiểu năng trí tuệ. Nhiều
dị tật bẩm sinh: đầu nhỏ, cằm nhỏ, tai đóng thấp; cột
sống bị chẻ đôi và thoát vị tủy sống ra ngoài; hẹp động
mạch chủ; thoát vị rốn, hở thành bụng, teo thực quản,
thận hình móng ngựa, tinh hoàn ẩn; bàn tay co quắp,
Thể tam
thiểu sản móng tay, lòng bàn chân dầy.
nhiễm
Trisomy HC Down: mặt dẹt, mắt xếch, tai nhỏ, rãnh khỉ, lưỡi dầy
21
và dài và khuôn mặt đặc trưng, dễ nhận biết. Trẻ sơ sinh
nhược cơ gây khó khăn trong bú, ăn, táo bón. Trẻ lớn
chậm phát triển ngôn ngữ và nhận thức; dị tật tim, thính
giác, thị giác, rối loạn tuyến giáp, bất thường về tiêu
hóa, động kinh, các vấn đề về hô hấp, béo phì, dễ bị

nhiễm trùng và ung thư bạch huyết.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ
1.4.1.Nghiên cứu về kết quả xét nghiệm di truyền
Năm 2012 Al-Asma và cs dùng phương pháp FISH 9 đầu dò (13, 15,
16, 17, 18, 21, 22, XY) đánh giá 393 phôi ngày 3 của 70 bệnh nhân (tuổi trung


17

bình 34,6), có tiền sử sẩy thai cho thấy tỷ lệ lệch bội NST là 67,8% [1]. Rubio
và cs năm 2013 sử dụng phương pháp FISH 9 đầu dò (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22,
XY) nghiên cứu 265 phôi ngày 3 của 91 phụ nữ có phôi thất bại làm tổ liên tiếp
(tuổi trung bình 35,2), và 485 phôi của 93 phụ nữ lớn tuổi (41-44 với tuổi trung
bình là 41,8), tỷ lệ lệch bội tương ứng là 57,3% và 69,2% [20].
Rubio và cs năm 2013 sử dụng phương pháp a-CGH kiểm tra phôi của
556 bệnh nhân có tiền sử sảy thai liên tiếp, phôi thất bại làm tổ nhiều lần, vô
sinh nam và phụ nữ lớn tuổi thì thấy tỷ lệ lệch bội là 73,5% [21].
Ở Việt Nam, nghiên cứu sơ bộ, Nguyễn Viết Tiến và cs năm 2014 sử
dụng phương pháp FISH đánh giá 5 NST 13, 18, 21, XY đã công bố tỷ lệ lệch
bội NST của 37 phôi ngày 3 là 45,9% [18].
Năm 2015, Phan Thị Khánh Vy đã sử dụng phương pháp a-CGH để
đánh giá 23 cặp NST đã công bố tỷ lệ lệch bội NST của 1257 phôi ngày 3 là
62,3% [19].
Năm 2017, nghiên cứu bước đầu của nhóm chúng tôi thực hiện sử dụng
phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới đánh giá 577 phôi sinh thiết ngày 3
cho tỷ lệ bất thường NST là 66%.
1.4.2. Nghiên cứu về ảnh hưởng của hình thái phôi đến két quả xét nghiệm
Finn và cộng sự (2010) tìm thấy phôi bình thường về số lượng nhiễm
sắc thể gặp nhiều nhất ở phôi có 7-8 tế bào ở thời điểm 64h sau thụ tinh khi so
với phôi có ≤6 tế bào hay phôi có ≥ 9 tế bào [7]. Magli và cộng sự trong

nghiên cứu của mình phát hiện phôi ngày 3 có 7-8 tế bào ở thời điểm 62 giờ
sau thụ tinh có tỷ lệ bất thường NST thấp nhất [13]. Campbell và cộng sự
(2014), sử dụng phương pháp theo dõi phôi liên tục (time-lapseimaging) cũng
khẳng định rằng phôi lệch bội nhiễm sắc thể phát triển chậm hơn phôi bình
thường [3]. Trong nghiên cứu của Phan Thị Khánh Vy (2015), tác giả nhận
thấy tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể cao nhất ở những phôi phát triển chậm (≤ 6