NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT BOBS TRONG CHẨN đoán TRƯỚC SINH một số hội CHỨNG bất THƯỜNG NHIỄM sắc THỂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT BOBS
TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH MỘT SỐ
HỘI CHỨNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ

HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT BOBS
TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH MỘT SỐ
HỘI CHỨNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
Chuyên ngành: Y sinh học - Di Truyền
Mã số: NT 62726201

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Hoàng Thị Ngọc Lan

HÀ NỘI – 2015


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribonucleic

AFP

Alpha fetoprotein

AS

Angelman Syndrome

BoBs

Bacterial artificial chromosome – on – beads

CGH

Microarray – based comparative genomic hybridization

DGS

DiGeorge Syndrome

FISH

Fluorescent in stitu hybridization

LGS

Langer – Giedion Syndrome

MDS

Miller – Dieker Syndrome

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

NST

Nhiễm sắc thể

PAPP – A

Pregnancy – associated plasma protein A

PCR

Polymerase chain reaction

PWS

Prader – Willi Syndrome

QF – PCR

Quantitative fluorescent - polymerase chain reaction

SMS

Smith – Magenis Syndrome

uE3

Unconjugate Estriol

WBS

William – Beuren Syndrome

WHS

Wolf – Hirschhorn Syndrome

βhCG

Beta – Human chronic gonadotropin


MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dị tật bẩm sinh là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây chết
sơ sinh và hiện đang là vấn đề rất được quan tâm của xã hội. Vì vậy, sự ra đời
của các phương pháp chẩn đoán trước sinh là một nhu cầu vô cùng cấp thiết.
Trước kia, siêu âm và lập karyotype từ tế bào thai nhi trong nước ối là hai
phương pháp truyền thống được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Tuy
nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp siêu âm phụ thuộc nhiều vào
máy móc và kinh nghiệm người làm. Nhiều dị tật được phát hiện ngay từ thời
kỳ bào thai nhưng không giải thích được cơ chế di truyền, từ đó người bác sĩ
gặp khó khăn trong việc đưa ra lời khuyên di truyền. Khiếm khuyết của
phương pháp siêu âm được giải quyết khi kết hợp cùng với phương pháp di
truyền tế bào nhưng vấp phải một số vấn đề: thời gian xét nghiệm kéo dài gây
căng thẳng, lo âu cho thai phụ, cần nguồn nhân lực lớn, có thể gặp thất bại
nếu quá trình nuôi cấy không thành công.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của ngành di truyền phân tử, các nhà
khoa học đã thiết kế được nhiều hơn các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh ở mức
độ phân tử như kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH), QF – PCR và MLPA
đem lại nhiều thành tựu trong công tác chẩn đoán trước sinh, góp phần nâng
cao chất lượng dân số. Mặc dù vậy, vì những kỹ thuật nói trên còn nhiều hạn
chế nên trên thực tế lâm sàng ứng dụng của chúng mới chỉ dừng lại ở mức độ
chẩn đoán đột biến dạng lệch bội của nhiễm sắc thể 13, 18, 21 và nhiễm sắc
thể giới tính. Một số hội chứng do đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn với kích


thước nhỏ dưới mức quan sát được bằng kính hiển vi quang học còn bị bỏ sót.
Hậu quả của các đột biến vi mất đoạn này vô cùng nặng nề, hầu hết các hệ cơ

quan quan trọng như thần kinh, tim mạch, xương khớp đều bị ảnh hưởng
nghiêm trọng. Chậm phát triển vận động, tâm thần, khiếm khuyết trí tuệ và
biến dạng vùng đầu mặt cổ là những tình trạng thường được quan sát thấy ở
các bệnh nhân mắc hội chứng vi mất đoạn. Hơn nữa, kiểu hình của chúng trên
lâm sàng rất đa dạng, mức độ biểu hiện biến thiên từ nhẹ đến nặng và không
giống nhau hoàn toàn giữa các bệnh nhân. Cho đến nay chưa có biện pháp
điều trị triệt để nào đối với bệnh, tật di truyền nói chung và hội chứng vi mất
đoạn nói riêng, chính vì vậy việc phát hiện sớm từ thời kỳ bào thai để giảm
bớt gánh nặng cho gia đình và xã hội là việc làm cần thiết.
Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần một phương pháp chẩn đoán trước sinh có
thể xác định được toàn bộ các dạng bất thường nhiễm sắc thể thường gặp
trong thời gian ngắn với độ chính xác cao và giá thành hợp lý. Trong những
năm gần đây, sự ra đời của kỹ thuật BACs – on – bead (BoBs) đã đáp ứng
được nhu cầu đó. Kỹ thuật BoBs không những phát hiện được chính xác các
đột biến lệch bội tương tự như các kỹ thuật khác đang thịnh hành mà còn cho
phép chẩn đoán tình trạng mất đoạn nhiễm sắc thể với kích thước nhỏ nằm
ngoài khả năng quan sát của kính hiển vi điện tử. Chín hội chứng vi mất đoạn
có tỷ lệ mắc khá cao được lựa chọn là: Wolf – Hirschhorn, Cri – du Chat,
Smith – Magenis, DiGeorge, William – Beuren, Langer – Giedion, Prader –
Willi/Angelman và Miller – Dieker. Ưu điểm của phương pháp mới này là có
khả năng đánh giá đồng thời toàn bộ các bất thường nhiễm sắc thể trên với
nhiều mẫu bệnh nhân trong một lần xét nghiệm. Do đó, giúp giảm thiểu thời
gian, nhân công và chi phí hơn so với các phương pháp khác. Trên thế giới đã
có nhiều phòng di truyền tiến hành thử nghiệm và đưa kỹ thuật BoBs vào ứng
dụng chẩn đoán trên lâm sàng với kết quả đầy khả quan. Trái lại, ở Việt Nam
chưa có một công trình nghiên cứu nào tương tự được thực hiện. Vì vậy, để
góp phần tìm hiểu kỹ thuật BoBs chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu


ứng dụng kỹ thuật BoBs trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng bất

thường nhiễm sắc thể” với hai mục tiêu:
1.

Hoàn chỉnh quy trình BoBs để chẩn đoán một số bất thường nhiễm
sắc thể.

2.

Đánh giá giá trị kỹ thuật BoBs trong chẩn đoán trước sinh một số
bất thường nhiễm sắc thể.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tầm quan trọng của chẩn đoán trước sinh
Bất thường bẩm sinh (BTBS) hay còn có thể gọi là dị tật bẩm sinh hoặc
rối loạn bẩm sinh hoặc khiếm khuyết lúc sinh, theo Tổ chức Y Tế Thế Giới
(TCYTTG), là tất cả những bất thường về cấu trúc, chức năng hoặc sinh hóa
xảy ra khi phôi, thai còn trong tử cung, được chẩn đoán trong giai đoạn thai
nghén hoặc thời điểm đứa trẻ được sinh ra hay giai đoạn về sau của cuộc sống.
Trong khi trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu với quy mô lớn về BTBS cho
thấy tỷ lệ BTBS là 1,73% tương đương với 8 triệu trẻ mỗi năm thì ở Việt Nam
hiện chưa có điều tra toàn quốc về BTBS. Tuy nhiên, cũng đã có một số thống
kê về BTBS tại một số vùng miền và bệnh viện. Phan Thị Hoan (2001) điều tra
phát hiện tần số dị tật ở đồng bằng sông Hồng với cỡ mẫu n=36978 cho thấy có
tới 19,63‰ trẻ sơ sinh có dị tật. Theo Trịnh Văn Bảo và Nguyễn Việt Hùng từ
năm 1999 đến năm 2003 tỷ lệ BTBS tại khoa sản Bệnh viện Bạch Mai là
1,31%. Nghiên cứu với cỡ mẫu tương đối lớn gần đây của Nguyễn Đức Vy trên
đối tượng tất cả các bà mẹ mang thai đến khám và sinh tại Bệnh viện Phụ sản
Trung ương trong thời gian từ 1/1/2001 đến 31/12/2003 cho thấy trong số
33816 phụ nữ mang thai có 933 trường hợp có dị tật bẩm sinh, chiếm 2,7%. Từ

những số liệu thống kê của quốc tế và trong nước, có thể ước tính tỷ lệ dị tật bẩm


sinh ở Việt Nam là 1,5% - 2% số trẻ sinh ra hàng năm tương đương 22.000 đến
30.000 trẻ đẻ ra có BTBS. Với số lượng trẻ có BTBS lớn như vậy sẽ để lại
những hậu quả và gánh nặng lớn cho gia đình trẻ nói riêng và xã hội nói chung.
Theo thống kê của TCYTTG, trong tổng số 2,761 triệu trẻ chết trong giai đoạn
sơ sinh năm 2013 trên toàn thế giới có tới 276.000 là do BTBS. Riêng tại Việt
Nam, cũng theo công bố của TCYTTG năm 2013 tỷ lệ chết sơ sinh do BTBS là
16%. Con số này cao hơn số trẻ sơ sinh chết do nhiễm trùng đường hô hấp dưới
(7,1%) và chết do nhiễm trùng máu và các loại nhiễm trùng khác (11,8%).
Một nghiên cứu gánh nặng bệnh tật toàn cầu đã đưa ra 10 nguyên nhân hàng
đầu gây tử vong ở nhiều nước và khu vực trên toàn thế giới, trong đó có BTBS.
Thêm vào đó, theo một báo cáo của CDC (Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa
bệnh tật của Mỹ) năm 2004, 2,6 tỷ đô la Mỹ là con số hàng năm chính phủ Mỹ
phải chi cho hơn 139.000 bệnh viện trên toàn nước Mỹ cho việc chăm sóc và
điều trị trẻ có BTBS, trong đó, ngân sách cho việc điều trị dị tật tim bẩm sinh là
1,4 tỷ đô la Mỹ. Chi phí điều trị cho trẻ mắc tật nứt đốt sống bẩm sinh của bang
Florida là 21.900 đô la Mỹ là kết quả một nghiên cứu dựa trên cơ sở dữ liệu
của bang này vào năm 2012. Cũng theo cơ quan này, một trẻ bị Down ở Mỹ sẽ
cần số tiền gấp 12 đến 13 lần so với một đứa trẻ không mắc phải hội chứng
này. Từ những số liệu trên có thể thấy đằng sau BTBS là những thiệt hại về cả
vật chất và tinh thần không những cho cả gia đình mà còn cả xã hội. Mặt khác,
hiện nay hầu hết các BTBS đều chưa có biện pháp điều trị triệt để, phần lớn
vẫn chỉ dừng lại ở mức điều trị triệu chứng, do đó trẻ sinh ra với BTBS thường
kém phát triển về cả thể lực và trí tuệ, giảm khả năng lao động, khả năng tự
chăm sóc và kém hòa nhập với cộng đồng.
Sinh ra một đứa trẻ khỏe mạnh cả thể chất và trí tuệ là nguyện vọng của
mọi phụ nữ mang thai, là niềm phúc của riêng bản thân họ và gia đình. Tuy
nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, vẫn có một tỷ lệ trẻ sinh ra mang các

khiếm khuyết bẩm sinh. Chính vì vậy, sự ra đời của các phương pháp chẩn
đoán trước sinh là một nhu cầu có tính cấp thiết nhằm mục đích phát hiện sớm


những trường hợp thai dị tật ngay từ khi còn trong tử cung, qua đó trực tiếp
làm giảm gánh nặng bệnh tật cho gia đình và xã hội.
Chẩn đoán trước sinh bao gồm nhiều kỹ thuật đặc hiệu khác nhau được
thực hiện trong thời gian mang thai để chẩn đoán xác định tình trạng bất
thường của thai nhi trong những trường hợp nghi ngờ mắc bệnh thông qua
sàng lọc. Nếu công việc này được thực hiện tốt thì nó sẽ là kim chỉ nam cho
các cặp vợ chồng và các chuyên gia y tế trong quản lý thai nghén.
Từ những phân tích trên, có thể thấy rõ ràng rằng chẩn đoán trước sinh
có vai trò quan trọng và thật sự cần thiết góp phần nâng cao chất lượng dân số
và cải thiện chất lượng giống nòi.
1.2. Đối tượng cần làm chẩn đoán trước sinh
Với rất nhiều lợi ích của chẩn đoán trước sinh thì điều kiện lý tưởng là
100% phụ nữ mang thai được tiến hành chẩn đoán trước sinh. Tuy nhiên, với
điều kiện hiện nay, nguồn kinh phí còn hạn chế, nhận thức của người dân
chưa đồng đều, các kỹ thuật phức tạp đòi hỏi trình độ chuyên môn cao và
nhiều trang thiết bị nên rất khó để đưa chương trình chẩn đoán trước sinh tới
từng thai phụ. Thay vào đó, các biện pháp sàng lọc sẽ được thực hiện để xác
định những đối tượng có nguy cơ cao mang thai dị tật, nhóm này sẽ được ưu
tiên thực hiện các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh.
Nhóm các cặp vợ chồng mang các yếu tố sau được xác định là đối
tượng có nguy cơ cao:
(1)

Mẹ lớn tuổi

Đây là yếu tố nguy cơ hay gặp nhất và là chỉ định phổ biến nhất của

chẩn đoán trước sinh. Từ lâu nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong
nước đã chứng minh tần số thai mang bộ nhiễm sắc thể bất thường tăng lên
khi tuổi mẹ tăng, đặc biệt sau 35 tuổi. Các nghiên cứu này chỉ ra rằng khả
năng điều chỉnh các quá trình sinh học có thể sai lệch, trong đó có quá trình
sinh trứng, dẫn tới không phân ly nhiễm sắc thể trong giảm phân II, kết quả là
tạo ra các giao tử lệch bội. Về mặt lý thuyết, hiện tượng không phân ly có thể


xảy ra ở bất kỳ cặp nhiễm sắc thể nào hoặc toàn bộ bộ nhiễm sắc thể, tuy
nhiên, trên thực tế người ta hay gặp các trường hợp thai trisomy 13, 18, 21 và
cặp nhiễm sắc thể giới tính.
(2)

Mẹ có tiền sử sảy thai, thai chết lưu liên tiếp nhiều lần (≥3 lần)

Nguyên nhân của sảy thai liên tiếp có thể xuất phát từ nhiều phía, ví dụ
như rối loạn miễn dịch, thiểu năng nội tiết tố, mẹ có bất thường về giải phẫu
tử cung hay do rối loạn di truyền. Theo Gardner và Sutherland (1996) thì
khoảng một nửa các trường hợp sảy thai liên tiếp là do bất thường nhiễm sắc
thể, trong số này có 2% là thai mang chuyển đoạn không cân bằng.
(3)

Có tiền sử sinh con dị tật.

(4)

Tiền sử gia đình một trong hai bên bố hoặc mẹ hoặc cả hai có người
mắc bệnh, tật do rối loạn di truyền.

Nếu một bệnh, tật được xác định là di truyền đơn gen, đa gen hay đa

nhân tố xuất hiện trong tiền sử gia đình của cặp vợ chồng thì có nguy cơ lần
mang thai này người phụ nữ sẽ bị ảnh hưởng. Phân tích gia hệ thường sẽ là
phương pháp cần thiết để đánh giá nguy cơ của thai, bên cạnh đó các kỹ thuật
di truyền đóng vai trò là chìa khóa trong chẩn đoán trước sinh.
(5)

Bản thân bố hoặc mẹ hoặc cả hai đã được xác định là người có rối
loạn cấu trúc NST di truyền được.

Bố mẹ có thể là người mắc bệnh di truyền hoặc chỉ mang đột biến như
chuyển đoạn, đảo đoạn với kiểu hình hoàn toàn bình thường nhưng nếu những
đột biến này được di truyền cho con thì con sẽ có biểu hiện bất thường. Ví dụ
bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne tuân theo cơ chế di truyền lặn liên kết nhiễm
sắc thể giới tính X, nếu mẹ mang gen bệnh sẽ có 50% khả năng sinh con gái
mang gen bệnh và 50% khả năng sinh con trai mắc bệnh.
(6)

Kết quả sàng lọc bằng huyết thanh mẹ xác định có nguy cơ cao sinh
con dị tật.


Siêu âm kết hợp với các dấu hiệu sinh hóa trong máu mẹ đang được sử
dụng rộng rãi để sàng lọc ra các đối tượng có nguy cơ cao sinh con trisomy
13, 18, 21 và tật nứt đốt sống bẩm sinh. Vào ba tháng đầu, khi kết hợp đo
chiều dày da gáy bằng siêu âm cùng với định lượng hai chất trong huyết thanh
mẹ là PAPP-A và fbhCG thì tỷ lệ phát hiện thai Down lên đến 90% với tỷ lệ
dương tính giả 5%. Trong quý hai của thai kỳ, việc sàng lọc tiếp tục được
thực hiện nhờ siêu âm và định lượng ba chất trong huyết thanh mẹ là AFP,
βhCG và uE3. Sử dụng test lồng ghép kết hợp ba tháng đầu và ba tháng giữa
sẽ tăng tỷ lệ phát hiện hơn bất kỳ test riêng rẽ nào khác. Hiệu quả lồng ghép

test được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 1.1. Giá trị của việc lồng ghép các test trong phát hiện
hội chứng Down
Phương pháp
Tuổi mẹ
Tuổi mẹ, AFP
Tuổi mẹ, AFP, βhCG
Tuổi mẹ, AFP, βhCG, uE3
Tuổi mẹ, AFP, βhCG, uE3, Inhibin A
Tuổi mẹ, độ mờ da gáy, βhCG, PAPP-A
(7)

Tuần thai
14-22
14-22
14-22
14-22
14-22
11-13

Tỷ lệ phát hiện
30%
37%
59%
69%
76%
80%

Tiếp xúc với các tác nhân vật lý, hóa học, sinh vật học trước và
trong thời gian mang thai.

Từ lâu, tia Rownghen được sử dụng trong chụp X-quang đã được
khẳng định là nhân tố gây ra dị tật ở thai nếu người phụ nữ có tiếp xúc với tia
này trong thai kỳ.
Trong số các thuốc an thần, chống co giật mà ví dụ điển hình là
Thalidomid với sự kiện năm 1959 ở thành phố Stolberg đã làm cho cả thế giới
biết đến Thalidomid như một tác nhân gây dị dạng thai nặng nề. Người ta ước
tính có khoảng 10.000 trẻ sinh ra tại 40 quốc gia trên khắp thế giới đã phải
chịu hậu quả của loại thuốc này như chi ngắn, không có chi, tật thiểu chi,


cẳng tay ngắn. Khoảng 7.500 trẻ đã chết ngay sau khi ra đời hoặc trong giai
đoạn sớm của cuộc đời.
Một vụ đại dịch Rubella xảy ra 1964-1965 để lại hậu quả 20.00030.000 trẻ sinh ra với hội chứng Rubella do mẹ bị nhiễm virus này trong khi
có thai. Người mẹ khi mang thai bị nhiễm Rubella sẽ sinh ra những đứa trẻ đa
dị tật: mắt nhỏ, đục nhân mắt, dị tật tim (còn ống động mạch, thông liên thất,
thông liên nhĩ), chậm phát triển trí tuệ,…
(8)

Kết quả siêu âm trả lời có bất thường.

Có một số bất thường hình thái được phát hiện qua siêu âm là gợi ý cho
tình trạng bất thường nhiễm sắc thể ở thai.
Tăng chiều dày da gáy, xương đùi ngắn, không có xương sống mũi, dị
tật tim, gợi ý thai trisomy 21. Thể ba nhiễm 18 thường gặp tình trạng đa ối,
bàn tay gấp, bàn chân vẹo, thoát vị hoành, thoát vị rốn.
(9)

Mẹ mắc các bệnh rối loạn quá trình trao đổi chất: mẹ bị đái tháo
đường, mẹ bị nghiện rượu, thuốc lá, ma túy.

Một nghiên cứu của Chung và Myrianthopoulos (1975) được thực hiện
trên 48.437 trẻ dưới 1 tuổi. Trong số đó, nhóm trẻ da trắng được sinh ra từ
những bà mẹ đái tháo đường phụ thuộc insulin có 17,7% là có dị tật bẩm sinh
so với chỉ 8,3% của nhóm trẻ có mẹ không mắc bệnh này. Đối với nhóm trẻ
da đen, tỷ lệ giữa hai nhóm có mẹ đái tháo đường phụ thuộc insulin và khỏe
mạnh tương ứng là 17,3% và 8,5%. Sự tăng tỷ lệ của nhóm các bà mẹ mắc đái
tháo đường phụ thuộc insulin được đánh giá là có ý nghĩa thống kê[1].
Tác hại của ethyl alcohol gây nên quái thai đã được biết rõ. Theo Jones và
CS (1974) thì 30% con của các bà mẹ nghiện rượu mãn tính bị dị tật bẩm sinh.
1.3. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh
Chẩn đoán trước sinh nhằm mục đích phát hiện các bất thường di
truyền của thai, do đó, cần phải thu được tế bào có nguồn gốc từ thai. Có thể
thu tế bào trực tiếp từ thai nhi hoặc gián tiếp qua máu mẹ. Phương pháp gián


tiếp không can thiệp vào tử cung, buồng ối hay thai, vì vậy an toàn và tiện lợi
cho các cặp vợ chồng hơn phương pháp trực tiếp. Mặc dù vậy phương pháp
gián tiếp vẫn chưa được áp dụng trong thực tế một cách phổ biến do tính phức
tạp và độ chính xác của kỹ thuật. Hiện nay, chủ yếu lấy tế bào thai từ chọc hút
dịch ối và sinh thiết tua rau.
1.3.1. Phương pháp lấy tế bào trực tiếp
1.3.1.1. Chọc hút dịch ối
Chọc ối lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1952 để chẩn đoán thai bị
tan máu. Nhưng cho đến tận giữa những năm 1970, kỹ thuật này mới được coi
là tiêu chuẩn để phân tích karyotype thai nhi. Ngày nay, chọc ối để chẩn đoán
trước sinh là phương pháp được lựa chọn nhiều nhất để làm xét nghiệm di
truyền tế bào vì cho kết quả chính xác đến 99,4% - 99,8% và tỷ lệ tai biến
thấp, chỉ có 0,5% - 1% thai phụ sảy thai do chọc ối. Chọc hút dịch ối thường
được tiến hành ở tuần thai thứ 15 -18 của thai kỳ dưới hướng dẫn của siêu âm,

rút khoảng 15 – 20ml dịch ối.
Người ta có thể chọc ối theo hai phương pháp: chọc qua thành bụng và
chọc qua cổ tử cung trong đó qua thành bụng là con đường phổ biến hơn. Bên
cạnh phân tích karyotype, dịch ối và tế bào trong dịch ối có thể được sử dụng
cho những xét nghiệm sinh hóa, dùng trong kỹ thuật FISH hoặc những xét
nghiệm ở mức độ phân tử. Thời gian gia đình thai phụ nhận được kết quả
karyotype là từ hai đến ba tuần.
1.3.1.2. Sinh thiết tua rau
Trên thế giới, từ những năm 1970, 1980 sinh thiết tua rau đã được thực
hiện cho mục đích chẩn đoán trước sinh. Mẫu tua rau có thể dùng để phân tích
bộ nhiễm sắc thể thai, xác định các đột biến gen nhờ kỹ thuật FISH hoặc chẩn
đoán các rối loạn sinh hóa. Thời gian tốt nhất để chọc hút tua rau là tuần 10 –
12 của thai kỳ. Mẫu bệnh phẩm sau khi thu về có thể tiến hành nuôi cấy ngắn


hạn qua đêm hoặc phân tích nhiễm sắc thể trực tiếp, sau 7 – 10 ngày sẽ cho
kết quả. Đây là một lợi thế của sinh thiết tua rau so với chọc hút dịch ối. Vì
tình trạng của thai được xác định sớm hơn nên gia đình thai phụ có nhiều thời
gian suy nghĩ đưa ra quyết định liệu có đình chỉ thai nghén hay không ngay
trong quý đầu nếu kết quả trả về có bất thường. Tuy nhiên, sinh thiết tua rau
cũng có một số hạn chế. Thứ nhất, hiện tượng khảm rau thai do lẫn tế bào mẹ
hoặc sự phát triển quá nhanh của lớp tế bào cytotrophoblast, gặp trong khoảng
2% mẫu tua rau được nghiên cứu. Thứ hai, sinh thiết tua rau không thể chẩn
đoán được tật nứt đốt sống như chọc hút dịch ối và các bất thường thành bụng,
do đó vào quý hai của thai kỳ thai phụ vẫn cần được làm các test sàng lọc.
Tương tự như chọc hút dịch ối, sinh thiết gai rau cũng được thực hiện dưới
hướng dẫn của siêu âm qua một trong hai đường là thành bụng hoặc âm đạo,
lượng tua rau cần lấy ít nhất 5mg trọng lượng ướt. Tùy theo từng nghiên cứu
mà tỷ lệ tai biến của thủ thuật như sảy thai, khuyết tật chi từ tương đương chọc
ối đến cao hơn chọc ối là 2% – 3% .

1.3.1.3. Sinh thiết mô thai
Khi phương pháp chọc hút dịch ối và sinh thiết tua rau thất bại, sinh thiết
mô thai sẽ được sử dụng chẩn đoán hỗ trợ. Da, gan hoặc cơ thường là mô được
sinh thiết. Phương pháp tiến hành khi tuổi thai khá lớn 19 – 20 tuần và tỷ lệ tai
biến là khá cao, 10% đẻ non, sảy thai 5%– 7%. Vì vậy, chỉ định sinh thiết mô
thai không rộng rãi, chỉ giới hạn trong một số bệnh đặc biệt như bệnh về da.
1.3.1.4. Chọc hút máu cuống rốn
Được tiến hành sau 18 tuần thai, dưới hướng dẫn của siêu âm, một kim
chọc tủy chọc qua thành bụng thai phụ vào mạch máu dây rốn để lấy khoảng
15ml máu. Tỷ lệ mất thai là 1 – 2%. Phương pháp này dùng để chẩn đoán các
bệnh máu, tình trạng nhiễm trùng, bất thường chuyển hóa của thai,….Do tỷ lệ
tai biến cao, điều kiện tuổi thai lớn, kỹ thuật đòi hỏi người thực hiện có kỹ


năng và kinh nghiệm tốt nên chỉ định chọc hút máu cuống rốn rất hạn chế, chỉ
trong trường hợp nghi ngờ thai mắc các bệnh về máu.
1.3.2. Phương pháp lấy tế bào gián tiếp
Được xem là một trong những bước đi có tính đột phá trong lĩnh vực y
sinh học phân tử, phương pháp lấy tế bào gián tiếp hay còn gọi là phương
pháp chẩn đoán trước sinh không can thiệp (Noninvasive prenatal diagnosis –
NIPD) là phân tích vật liệu di truyền của thai nhi mà không can thiệp vào tử
cung, thay vào đó là từ vật liệu di truyền thai nhi có trong máu ngoại vi của
người mẹ. Bằng cách phân biệt tính kháng nguyên giữa mẹ và thai có thể thu
được hai sản phẩm của thai từ máu người mẹ, đó là:
(1)

ADN tự do phôi thai lưu hành trong máu mẹ.

(2)

Tế bào phôi thai lưu hành trong máu mẹ.

1.3.2.1. Tế bào phôi thai trong máu mẹ
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự có sự lưu hành tế bào thai nhi trong
máu ngoại vi của người mẹ và vào năm 1997, Bianchi và cộng sự đã phân tách
được tế bào thai nhi từ mẫu máu của mẹ[2]. Có bốn loại tế bào trong máu
người mẹ, đó là: trophoblast (tế bào của lá nuôi phôi), bạch cầu lympho, hồng
cầu có nhân (nucleated red blood cells – NRBCs) và tế bào gốc, song số lượng
những tế bào này rất thấp, 350.000 tế bào mẹ mới có 1 tế bào thai [3].
Bốn loại tế bào trên xuất hiện trong máu mẹ với các đặc tính khác nhau.
Trophoblast xuất hiện sớm nhất, mất đi nhanh, không có kháng nguyên bề
mặt đặc hiệu. Ngược lại, tế bào bạch cầu lại tồn tại rất lâu, nhiều năm sau khi
sinh, điều này dễ gây kết quả nhầm lẫn giữa hai lần mang thai. Dường như chỉ
có hồng cầu có nhân là hứa hẹn mang lại hiệu quả với đầy đủ các đặc tính cần
thiết như xuất hiện sớm, tồn tại trong suốt thai kỳ nhưng không kéo dài nhiều
năm sau đó, có tính kháng nguyên bề mặt đặc hiệu và đặc biệt số lượng của
loại tế bào này còn tăng lên nếu thai mang đột biến lệch bội [2].


1.3.2.2. ADN tự do thai nhi trong máu mẹ
Cũng vào năm 1997, Lo và cộng sự đã phát hiện ADN tự do thai nhi
(free fetal DNA – ffDNA) có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể giới tính Y trong
80% trường hợp từ huyết tương và 70% trường hợp từ huyết thanh của những
bà mẹ mang thai là con trai[4]. Đây là nguồn vật chất di truyền quý giá phục
vụ cho chẩn đoán các rối loạn di truyền mà không xâm phạm vào thai. Sử
dụng phương pháp NIPD trong việc tìm các locus gen đặc hiệu được ứng
dụng thành công chẩn đoán bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X
và thai mang nhóm máu Rh dương[5]. Tuy nhiên, việc xác định các bệnh bất
thường số lượng nhiễm sắc thể như lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21 và
cặp nhiễm sắc thể giới tính còn gặp nhiều thách thức[6-7].

Mặc dù với ưu thế nổi trội của NIPD so với phương pháp chẩn đoán
trước sinh có xâm lấn là không còn tai biến cho thai và mẹ nữa nhưng bên
cạnh đó, NIPD lại tiềm tàng một nguy cơ khác về mặt đạo đức xã hội. Lấy
máu thai phụ là một cách thu mẫu rất dễ dàng và nhanh chóng mà xét nghiệm
này có thể bị lạm dụng để sàng lọc, lựa chọn giới tính thai nhi. Ngoài ra, chi
phí cho xét nghiệm cao hơn so với các phương pháp khác cũng là một vấn đề
cần xem xét.
1.4. Những kỹ thuật di truyền đã được áp dụng trong chẩn đoán trước sinh
1.4.1. Chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật di truyền tế bào.
Tế bào ối và tế bào tua rau được nuôi cấy, thu hoạch rồi đem phân tích
karyptype từ lâu đã được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh. Kỹ
thuật này lần đầu tiên được thực hiện thành công bởi Steele và Breg vào năm
1966. Hai năm sau đó, 1968, nhóm nghiên cứu của Nadler công bố lần đầu tiên
chẩn đoán thành công một trường hợp trisomy 21 nhờ phân tích karyotype từ tế
bào ối qua nuôi cấy. Từ đó cho đến năm 1970, kỹ thuật mới chỉ dừng lại ở
phương pháp nhuộm giemsa thông thường, điều này không cho phép phân biệt


chính xác từng nhiễm sắc thể, dẫn tới hạn chế trong phát hiện các đột biết cấu
trúc, hình thái nhiễm sắc thể. Sau năm 1970, sự ra đời của kỹ thuật nhuộm băng
G và băng R đã loại bỏ được điểm yếu trên của phương pháp di truyền tế bào.
Nhuộm băng G cho phép phân biệt rõ từng vùng của từng chiếc nhiễm sắc thể,
qua đó các đột biến dạng chuyển đoạn, đứt đoạn, trisomy hay monosomy từng
phần đều được phát hiện. Sau này, các nhà di truyền học tiếp tục nghiên cứu và
phát triển thêm nhiều cách nhuộm băng khác nhau tùy theo từng mục đích chẩn
đoán và nhuộm với độ phân giải cao phát hiện các đột biến cấu trúc với kích
thước nhỏ hơn nữa (trên 2Mb). Tuy nhiên, cho đến ngày nay, mất đoạn nhỏ
(microdeletion) tức những mất đoạn dưới 2Mb (x106 bases) vẫn chưa thể phát
hiện được qua kỹ thuật nuôi cấy và nhuộm băng nhiễm sắc thể. Ngoài ra,
phương pháp kinh điển này có hai hạn chế là:

•

Thời gian thực hiện kéo dài, trả lời kết quả cho bệnh nhân muộn, sau
10 – 14 ngày kể từ ngày chọc ối.

•

Các bước của quy trình từ chọc ối, nuôi cấy đến thu hoạch và đọc kết
quả đều cần người làm trực tiếp tiến hành, không sử dụng máy móc
nên rất cần nguồn nhân lực lớn. Đây sẽ là yếu tố làm chậm trễ thêm
việc đưa ra chẩn đoán cho thai phụ ở những nơi không có đủ nhân lực.

1.4.2. Chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật di truyền tế bào – phân tử, kỹ thuật
lai tại chỗ huỳnh quang (Fluorescent in stitu hybridization – FISH)
Lai tại chỗ là sự kết hợp giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử. Có
nghĩa là sử dụng một đoạn ADN được đánh dấu bằng chất đánh dấu trước đó
để phát hiện một đoạn ADN cần tìm ngay trên chính nhiễm sắc thể cần thăm
dò. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật bắt đầu từ khám phá của James Watson và
Francis Crick năm 1953 khi họ công bố phát hiện của mình về cấu trúc hoàn
chỉnh của chuỗi ADN gồm hai mạch đơn song song liên kết với nhau ổn định
nhờ liên kết hydro giữa hai loại acid nuclecic. Ứng dụng đặc điểm ấy, kỹ thuật


lai tại chỗ lần đầu tiên được thực hiện thành công vào năm 1969 bởi hai nhà
khoa học Joseph Gall và Lou Pardue. Họ sử dụng một trình tự ADN biết trước
được đánh dấu phóng xạ (gọi là ADN dò) và tìm ra đoạn ADN đích trong
nhân của trứng ếch. Sau thành công của hai nhà khoa học, chất đánh dấu
phóng xạ nhanh chóng được thay thế bằng chất đánh dấu huỳnh quang vì sự
an toàn, ổn định và dễ phát hiện hơn của nó. Từ đó kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh
quang ra đời. Kết quả sẽ được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang. Một mẫu

ADN dò sẽ lai với hai vị trí trên hai nhiễm sắc thể của cặp nhiễm sắc thể
tương đồng. Nếu số tín hiệu thu được nhiều hoặc ít hơn hai thì tức là nhiễm
sắc thể cần đánh giá bị đột biến. Hơn thế nữa, kỹ thuật FISH không chỉ phát
hiện đột biến một cặp nhiễm sắc thể mà còn có thể đánh giá toàn bộ bộ nhiễm
sắc thể nhờ sử dụng multicolor. Theo đó, mỗi nhiễm sắc thể khác nhau sẽ
được đánh dấu bằng một màu khác nhau để phân biệt. Trong chẩn đoán trước
sinh, FISH là một công cụ hữu hiệu để chẩn đoán các đột biến nhiễm sắc thể
dạng cấu trúc (mất đoạn, nhân đoạn và chuyển đoạn) hoặc số lượng như lệch
bội nhiễm sắc thế số 13, 18, 21 và cặp nhiễm sắc thể giới tính với độ chính
xác 100%[8]. Đặc điểm nổi trội của FISH so với di truyền tế bào là có khả
năng phát hiện ra những đột biến kích thước nhỏ mà không cần qua nuôi cấy
và nhuộm băng, cho phép trả kết quả sớm cho bệnh nhân. Điều này không xảy
ra với kỹ thuật Multicolor FISH, nó chỉ chẩn đoán được các mất đoạn và nhân
đoạn lớn.
Nếu so sánh với phương pháp di truyền tế bào thì FISH tỏ ra là một
phương pháp ưu điểm hơn nhưng trên thực tế FISH không thể thay thế được
vai trò của phương pháp truyền thống này vì những lý do sau:
•

Chỉ chẩn đoán được một số nhiễm sắc thể nhất định.

•

Các nhiễm sắc thể chồng lên nhau, khó phân biệt.


•

Có thể gặp thất bại trong phản ứng lai.

•

Không thể thiết kế ADN dò nếu không biết trước đột biến cần tìm.

•

Đòi hỏi thiết bị phức tạp, khả năng chuyên môn tốt nên giá thành cao,
không phù hợp với mọi đối tượng.

1.4.3. Chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật di truyền phân tử
1.4.3.1. Kỹ thuật QF – PCR
Ra đời sau kỹ thuật FISH, năm 1993, kỹ thuật QF – PCR chẩn đoán
nhanh thành công hội chứng trisomy 21 được công bố lần đầu tiên bởi
Manfeild ES. Rất nhanh chóng, chỉ vài năm sau, phương pháp di truyền phân
tử này liên tục được nghiên cứu và ứng dụng thành công trong chẩn đoán các
hội chứng lệch bội khác trên hàng trăm mẫu dịch ối và gai rau. Hiện nay, sử
dụng kỹ thuật QF – PCR trong chẩn đoán trước sinh đã được chấp nhận ở rất
nhiều trung tâm di truyền trên thế giới và người ta đánh giá cao giá trị tin cậy
của phản ứng [8-9].
Nguyên lý của kỹ thuật là nhờ các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang
trước đó khuếch đại các marker đa hình là các trình tự lặp lại ngắn (Short
tandem repeat – STR) của nhiễm sắc thể cần đánh giá qua phản ứng khuếch
đại chuỗi, sau đó định lượng các sản phẩm marker này bằng điện di mao quản
trên hệ thống máy quét, kết quả thể hiện dưới dạng các đỉnh (peak). Qua đó
đánh giá biến đổi nhiễm sắc thể thông qua biến đổi liều lượng gen phát hiện
các trường hợp lệch bội trisomy hoặc monosomy. Những người có kiểu gen dị
hợp tử sẽ có hai đỉnh khác nhau với tỉ lệ 1:1 cho mỗi một nhiễm sắc thể trong
khi đó, người đồng hợp tử sẽ chỉ có một đỉnh duy nhất. Với trường hợp bị hội
chứng lệch bội trisomy, số đỉnh sẽ theo tỷ lệ 2: 1 hoặc 1:1:1 tùy theo người đó
mang alen dị hợp hay không.

Cùng là phương pháp di truyền phân tử cho kết quả nhanh (1 – 2 ngày)
nhưng QF – PCR tỏ ra có nhiều ưu điểm hơn so với FISH:


•

Thực hiện được với lượng dịch ối ít (≤ 1ml) so với FISH cần 5 – 10ml.

•

Là quy trình tự động hóa, cần ít nhân lực nên có thể thực hiện một
lúc nhiều mẫu.

•

Có thể phân tích cả bất thường nhiễm sắc thể hoặc bất thường gen
trên cùng vật liệu ADN thu được.

•

Có thể sử dụng các trình tự STR để kiểm soát sự nhiễm chéo hoặc
sự mất alen trong phản ứng PCR.

•

Có độ nhạy cao hơn kỹ thuật FISH.

•

Độ chính xác cao do sử dụng mồi để bắt cặp với đoạn marker dọc

theo chiều dài của nhiễm sắc thể. Trái lại FISH chỉ sử dụng mồi để
lai với một locus gen trên nhiễm sắc thể.

•

Có khả năng phân biệt được tế bào nguồn mẹ bị nhiễm trong quá
trình chọc hút dịch ối bất kể thai nhi là trai hay gái trong khi FISH
chỉ phân biệt được khi người mẹ mang thai bé trai [10].

•

Giá thành thấp.

Mặc dù có nhiều ưu việt, QF – PCR vẫn chưa thể phát hiện được các
nhiễm sắc tái cấu trúc như chuyển đoạn, mất đoạn, nhân đoạn, đảo đoạn, thêm
đoạn, nhiễm sắc thể hình vòng hay các trường hợp là thể khảm với tỷ lệ thấp
(15% - 20%) [11-13].
1.4.3.2. Kỹ thuật sử dụng mẫu dò đặc hiệu được khuếch đại từ phản ứng PCR
(Multiplex ligation-dependent probe amplification – MLPA)
Được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Shouten JP và cộng sự,
MLPA là một kỹ thuật di truyền phân tử rất mới so với FISH và QF – PCR.
Tuy nhiên, đến nay MLPA đã xuất hiện trong hơn 750 báo cáo y học, trở
thành xét nghiệm thường quy của 800 phòng thí nghiệm ở hơn 80 quốc gia
trên toàn thế giới. MLPA được ứng dụng rộng rãi với tốc độ nhanh là nhờ
những ưu điểm nổi bật: có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu trong thời gian


ngắn với thao tác đơn giản trên một thể tích mẫu nhỏ. Thêm vào đó, hiệu quả
của kỹ thuật này so với FISH và QF – PCR là tương đương [14-15]. Slater và
cộng sự (2003) công bố tỷ lệ âm tính giả là 0% và tỷ lệ dương tính giả là 5%

qua phân tích 492 mẫu nước ối bằng kỹ thuật MLPA[16] .
Trong kỹ thuật MLPA, người ta sử dụng một cặp mẫu dò cho một trình
tự ADN đích gồm mẫu dò trái (Left Probe Oligonucleotide – LPO) và mẫu dò
phải (Right Probe Oligonucleotide – RPO). Mỗi mẫu dò gồm hai vùng chính:
vùng lai với ADN và vùng bắt cặp với mồi trong phản ứng PCR. Hai mẫu dò
có trình tự liền kề nên khi phản ứng lai xảy ra đầu 5’OH của RPO sẽ bắt cặp
với đầu 3’OH của LPO trong khi đầu 3’OH của RPO bắt cặp với mồi ngược
và đầu 5’OH của LPO bắt cặp với mồi xuôi trong phản ứng PCR. Sau phản
ứng PCR, sản phẩm nối được nhân lên sẽ đi vào hệ thống điện di tự động
hoặc điện di mao quản. Kết quả thể hiện dưới dạng các đỉnh (peak) với vị trí
của đỉnh tương ứng với độ dài NST và diện tích đỉnh tương ứng với hàm
lượng NST. Tóm lại, quy trình kỹ thuật MLPA gồm 5 bước chính: (1) Biến
tính mẫu ADN và lai với mẫu dò; (2) Nối mẫu dò LPO và RPO bằng ligase;
(3) Phản ứng PCR nhân bản cặp mẫu dò đã nối với nhau; (4) Phân tách sản
phẩm PCR bằng hệ thống điện di; (5) Phân tích kết quả trên máy tính.
Với quy trình như trên thì để tiến hành phản ứng không đòi hỏi nhiều
máy móc phức tạp, yêu cầu tay nghề người thực hiện không quá khắt khe, do
đó giá thành xét nghiệm hợp lý. Mặt khác, hóa chất sử dụng cho kỹ thuật
MLPA phụ thuộc hoàn toàn vào nhà sản xuất và phân phối độc quyền MCR –
Holland trong đó quan trọng nhất là ADN mẫu dò có chiều dài lớn (200 – 400
nucleotide). Để tạo ra những mẫu dò cần một lượng lớn thư viện các phage
M13 tái tổ hợp, công việc này phức tạp và cần rất nhiều thời gian. Hiện nay,
hãng MCR – Holland đã xây dựng bộ kit SALSA MLPA kit P245 gồm các mẫu
dò cho phép chẩn đoán những hội chứng vi mất đoạn: DiGeorge, Smith –
Mangenis, Cri – du Chat, Prader Willi/Angelman, Langer – Giedion, Miller –


Dieker, Wolf – Hirschhorn. Tuy nhiên, bộ kit này chưa được chứng nhận bởi cơ
quan kiểm định liên minh Châu Âu cho phép sử dụng trên lâm sàng mà mới chỉ
dừng lại ở mục đích nghiên cứu. Đây là những trở ngại cho việc ứng dụng kỹ

thuật MLPA cho mục đích chẩn đoán trước sinh các hội chứng vi mất đoạn.
1.4.3.3. Phương pháp lai gen so sánh (Microarray – based comparative
genomic hybridization – Array CGH)
Hoạt động dựa theo nguyên lý tương tự như kỹ thuật FISH nhưng array
CGH ưu việt hơn ở chỗ cho phép đánh giá tình trạng mất cân bằng NST trên
toàn bộ genome. Đây là điều mà các kỹ thuật sinh học phân tử khác hiện nay
chưa thực hiện được.
Trong kỹ thuật array CGH, hàng nghìn các mẫu ADN dò sau khi được
nhuộm màu huỳnh quang (thường là màu xanh lục) sẽ được sắp xếp vào
những vị trí nhất định trên lam kính thành một hệ thống lưới gọi là “con
chip”. Tương tự như vậy, mẫu ADN cần phân tích được cắt ra thành các đoạn
ngắn nhờ hệ thống enzyme rồi nhuộm màu huỳnh quang khác với màu huỳnh
quang của mẫu dò (thường là màu đỏ). Các đoạn ADN này sẽ lai với mẫu dò
tương ứng trên con chip theo nguyên tắc bổ sung giữa Adenine và Tymine,
Guanine và Cytosine. Hệ thống máy quét sẽ đo lượng huỳnh quang xanh và
đỏ trên con chip, kết quả tiếp tục được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng để
cho ra tỷ lệ giữa hai màu huỳnh quang tại từng vị trí nhất định của mỗi mẫu
dò trên con chip. Nếu mẫu cần đánh giá có lượng bất thường, kết quả hiển thị
tại mỗi vị trí của mẫu dò sẽ thể hiện màu đỏ trong trường hợp nhân đoạn và
màu xanh lục thể hiện tình trạng mất đoạn. Sự cân bằng giữa hai mẫu ADN sẽ
cho kết quả màu vàng tại vị trí tương ứng.
So với FISH, array CGH còn có một lợi thế khác, đó là cho phép phát
hiện các đột biến NST ngay cả khi không có định hướng trên lâm sàng. Ngoài
ra, array CGH có thể thực hiện với một lượng mẫu rất nhỏ mà không cần qua


nuôi cấy tế bào, điều này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, phù hợp với yêu
cầu của chẩn đoán trước sinh. Thêm vào đó, so với kỹ thuật lập karyotype
truyền thống thì array CGH cho phép đánh giá các trường hợp bất thường với
độ phân giải cao, tự động hóa và cho kết quả trong thời gian ngắn hơn.

Mặc dù vậy, array CGH chỉ định trong chẩn đoán trước sinh còn hạn
chế và tồn tại nhiều vấn đề cần thảo luận. Hạn chế của array CGH nằm chính
trong ưu điểm của kỹ thuật này. Array CGH có khả năng phát hiện các nhiễm
sắc thể đánh dấu nhỏ bổ sung (Small supernumerary marker chromosome –
sSMC) là một đoạn NST có nguồn gốc từ một trong 24 NST người, có thể
được xem là chiếc thứ 47 trong bộ NST. sSMC có kích thước nhỏ đến mức kỹ
thuật lập karyotype không thể phát hiện được. Có khoảng 70% trường hợp
mang sSMC là đột biến mới (de novo), 30% di truyền trong gia đình. Trong
số này chỉ có 30% có biểu hiện bất thường trên lâm sàng. Nếu sSMC được
phát hiện trong chẩn đoán trước sinh thì lời khuyên di truyền về tiên lượng
của thai nhi sẽ là vấn đề khó khăn đối với các nhà di truyền học. Điều tương
tự cũng xảy ra đối với các biến dị số lượng bản sao của NST (Copy number
variant – CNV), là loại biến dị xảy ra khi có một đoạn ADN bị mất đi hoặc
nhân lên một hoặc nhiều lần, kích thước biến thiến từ 1Kb đến nhiều Mb và
chiếm khoảng 13% genome [17]. CNV là dạng biến dị phổ biến trong quần
thể và chúng có vai trò cả trong tiến hóa và một số bệnh tật rối loạn tâm thần
và bệnh tự miễn [18-19]. Sự xuất hiện của các CNV khiến cho việc phiên giải
kết quả gặp trở ngại, trong trường hợp này cần thiết phải xét nghiệm ADN của
bố mẹ để xác định ý nghĩa của các đoạn bản sao NST. Một vài hạn chế khác
của array CGH là:
•

Không phát hiện được các trường hợp tái cấu trúc cân bằng: đảo
đoạn, chuyển đoạn tương hỗ, chuyển đoạn Robertson.

•

Không phát hiện được tình trạng khảm với tỷ lệ thấp (<20%).

•

Không phát hiện được các đột biến điểm và các trường hợp đột biến
gen có kích thước nhỏ hơn kích thước mẫu dò.

•

Giá thành cao, khó áp dụng rộng rãi với mọi đối tượng cần làm chẩn
đoán trước sinh.

1.5. Giới thiệu kỹ thuật BACs – on – Beads (BoBs)
BoBs là phương pháp chẩn đoán trước sinh cho kết quả nhanh trong
vòng 48 giờ được phát triển bởi công ty Perkin Elmer, Phần Lan. Ngoài khả
năng phát hiện các đột biến lệch bội của NST 13, 18, 21, X và Y, kỹ thuật này
cho phép loại trừ 9 hội chứng vi mất đoạn hay gặp nhất bao gồm: Wolf –
Hirschhorn, Cri – du Chat, Smith – Magenis, DiGeorge, William – Beuren,
Langer – Giedion, Prader – Willi/Angelman và Miller – Dieker. So với FISH,
QF – PCR và MLPA là những kỹ thuật mà vì nhiều giới hạn mà ứng dụng trên
lâm sàng của chúng mới chỉ dừng lại ở mức độ chẩn đoán các đột biến lệch
bội phổ biến thì đây là một lợi thế mạnh của kỹ thuật BoBs. Từ năm 2011 cho
đến nay, cơ sở dữ liệu của PubMed cho thấy đã có 22 báo cáo về kỹ thuật này
được công bố, điều này cho thấy đây thực sự là một phương pháp rất mới. Và
các tác giả đều có chung nhận định về tính hiệu quả và kinh tế của kỹ thuật
BoBs[20-22] .
1.5.1. Nguyên lý kỹ thuật BoBs
Kỹ thuật BoBs thực hiện việc so sánh mẫu ADN cần phân tích với mẫu
ADN chứng và thông qua sự khác biệt giữa 2 ADN này để phát hiện các
trường hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn nếu có trên ADN. Nguyên lý của kỹ
thuật BoBs được dựa trên khả năng bắt cặp giữa ADN dò với một mạch đơn
của ADN mẫu theo nguyên tắc bổ sung giữa các base adenine (A) với tymine

(T) và guanine (G) với cytosine (C) khi phản ứng lai xảy ra. Trong kỹ thuật
BoBs mẫu dò là các dòng nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (Bacterial artificial
chromosome – BAC) chứa các đoạn ngắn ADN của người được sử dụng để


phát hiện các thay đổi trong genome với độ nhạy khá cao. Đoạn ADN được
lựa chọn để nhân bản là đoạn ADN đặc trưng cho các hội chứng cần khảo sát.
Tuy nhiên, BACs có nhược điểm là không cho phép đánh giá những bất
thường có kích thước bé hơn kích thước của các đoạn dò. ADN dò sau đó sẽ
được gắn lên các hạt microsphere (bead). Người ta sử dụng hai màu là hồng
ngoại và đỏ để nhuộm các beads theo những tỷ lệ khác nhau tạo ra 100 loại
hạt khác nhau. Các beads khác nhau được gắn ADN dò khác nhau.

Hình 1.1. Sự tạo thành các beads
ADN mẫu sau khi được tách chiết sẽ cùng với ADN chứng đi qua bước
gắn chất đánh dấu biotin, làm sạch rồi được lai với các ADN dò trên các
beads. Cuối cùng là bước gắn các phân tử đánh dấu vào ADN mẫu.
Sau khi hoàn tất những bước trên, các hạt microsphere sẽ được đọc trên
hệ thống máy quét Luminex 100/200 để đo lượng tín hiệu huỳnh quang của
ADN chứng và ADN mẫu. Hệ thống Luminex phát ra hai loại tia laser là tia
màu đỏ để đếm số lượng beads của mỗi loại mẫu dò và tia màu xanh lá cây để
đếm số lượng mẫu dò trên beads có lai ADN mẫu. Số liệu sẽ được phân tích
bởi phần mềm chuyên dụng BoBsoft, kết quả cuối cùng thể hiện dưới dạng tỷ
lệ giữa số lượng tín hiệu huỳnh quang của ADN mẫu trên số lượng tín hiệu
huỳnh quang của ADN chứng: