DỊCH tễ học PHÂN tử VI rút DENGUE

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh sốt xuất huyết dengue (SXHD) là bệnh do muỗi Aedes aegypti và
Aedes albopictus truyền. Nguồn gốc của từ “dengue” cho đến nay cũng chưa
được rõ ràng, có giả thiết cho rằng nó có nguồn gốc của tiếng Tây Ban Nha để
mô tả dáng đi của một người bị đau xương vì sốt do vi rút dengue [12,14,25].
Mặc dù lâm sàng của SXHD được ghi nhận cách đây khoảng 200 năm, nhưng
tác nhân gây bệnh là vi rút dengue các type mới được phát hiện trong thập kỷ
50 và 60 [1,14,25].
Vi rút dengue các type được tiến hóa ở động vật linh trưởng từ một tổ
tiên chung và từng bước đi vào chu kỳ đô thị độc lập ước tính khoảng 5001000 năm trước và được Sabin A. B. phân lập lần đầu tiên vào năm 1944 từ
binh lính ở Calcutta, New Guinea và Hawaii trong chiến tranh thế giới lần thứ
II. Các vi rút phân lập ra ở Ấn Độ, Hawaii và một chủng ở New Guinea có
kháng nguyên giống nhau được gọi là chủng mẫu dengue type 1 (Hawaii). Ba
chủng còn lại ở New Guinea có kháng nguyên khác với chủng trên, được gọi
là chủng mẫu dengue type 2 (New Guinea). Sau đó hai type huyết thanh khác
là dengue type 3 và dengue type 4 lần lượt được Hammon W. McD phân lập
được từ những bệnh nhân mắc bệnh SXHD ở Manila vào năm 1956. Ngoài ra,
type vi rút dengue 1 cũng được phát hiện tại Nhật Bản, 1943 từ những ca
bệnh xâm nhập từ bên ngoài [12,13,16]. Các type vi rút dengue khác nhau về
tính chất kháng nguyên nhưng đều có khả năng gây bệnh ở người với bệnh
cảnh và các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng tương tự nhau. Nhưng vi rút
dengue type 2 vẫn được cho là có liên quan đến tình trạng lâm sàng nặng hơn
so với các type vi rút khác [17]. Trước năm 1970, chỉ có 9 quốc gia được xác


2

định có dịch SXHD trầm trọng, nhưng đến 2001đã có 69 quốc gia ghi nhận có
ca bệnh SXHD được công bố cho WHO [16]. Nhưng hiện nay vi rút dengue

được ghi nhận lưu hành trên 100 nước thuộc các khu vực có khí hậu nhiệt đới
và cận nhiệt đới ở vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Cho đến nay
vi rút dengue chưa được phát hiện lưu hành ở các nước Bắc Châu Á, Châu Âu
và nhiều nước vùng Bắc Châu Mỹ [16,19,26]. Song song với sự lan rộng
vùng lưu hành vi rút dengue là sự phát tán và lan rộng của các type vi rút
dengue giữa các châu lục [28,29.30,33,34]. Do vậy, nghiên cứu dịch tễ sinh
học phân tử vi rút dengue phân lập từ một vùng địa lý sẽ giúp cho việc xác
định nguồn gốc xuất hiện, phát tán các type vi rút dengue, định hướng cho
biện pháp dự phòng bệnh có hiệu quả. Ngoài ra, dịch tễ học phân tử của các
týp huyết thanh dengue được nghiên cứu với nỗ lực để tìm hiểu mối quan hệ
giữa các type và mức độ tiến triển dịch SXHD.


3

NỘI DUNG CHUYÊN ĐỀ
I. VI RÚT DENGUE
I.1. Phân loại
Vi rút dengue là một loại vi rút Arbo do muỗi truyền, thuộc chi Flavivirus,
họ Flaviviridae là nguyên nhân gây ra bệnh SXHD. Họ Flaviviridaecó 3 chi
virus (Genera) được phân loại dựa trên một trong những tiêu chuẩn về hình
thái học hoặc cấu trúc vật liệu di truyền hoặc có liên quan đến đặc điểm kháng
nguyên đó là chi Hepacivirus, chi Flavivirus và chi Pestivirus [1,14,27].

Hình 1.1. Mối liên quan về mặt di truyền giữa các vi rút trong họ Flaviviridae dựa
trên kết quả phân tích trình tự nucleotide gen NS3 [14]
Chi Flavivirus: Vi rút sốt vàng (yellow fever virus - YF), dengue-1
(DEN-1), dengue-2 (DEN-2), vi rút Tây song Nil (West Nile virus - WN) và vi
rút viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis - JE).
Chi Pestivirus: Bao gồm các virút gây bệnh chủ yếu cho động vật đó là

virút gây tiêu chảy ở bò (bovine viral diarrhea virus - BVDV), virút gây sốt cổ
điển ở lợn (classical swine fever - CSFV).
Chi Hepacivirus: Có virút đại diện một số chủng virút viêm gan C phân lập ở
người (Hepatitis C virus).


4

Bảng xếp loại các thành viên vi rút Arbo thay đổi theo từng giai đoạn, tuỳ
theo tiêu chuẩn được đưa ra như tiêu chuẩn lâm sàng, địa dư, môi giới truyền
bệnh, nhóm huyết thanh, type vi rút, dưới type và nhiều yếu tố khác... Căn cứ
vào tiêu chuẩn lâm sàng, các vi rút thuộc chi Flavivirus được chia ra theo ba
hội chứng chính: Nhóm các vi rút Flavi gây hội chứng não cấp tiên phát như
vi rút viêm não Nhật Bản, vi rút Tây sông Nil, vi rút viêm não do ve, viêm não
thung lũng Murray, viêm não St Louis...; Nhóm các vi rút Flavi gây sốt, viêm
khớp, phát ban tiên phát như vi rút dengue các type, vi rút Chikungunya...
[14,25,26].
I.2.

Hình thái

Hình 1.2. Hình dạng bên ngoài của vi rút dengue

Hình 1.3. Cấu trúc bên trong
của vi rút dengue

Về hình thái, quan sát bằng kính hiển vi điện tử xác định vi rút dengue
hoàn chỉnh hình cầu, có kích thước tương đối đồng nhất với đường kính hạt vi
rút khoảng 45nm-50nm [1,14,26].
Cấu trúc phân tử

Vật liệu di truyền (genome) của vi rút dengue là ARN sợi đơn, dương, có


5

chiều dài khoảng 11Kb mã hóa cho 3 loại protein cấu trúc, 7 loại protein phí
cấu trúc và hai vùng không dịch mã UTR ở hai đầu. Genome của bốn type vi
rút dengue có trình tự axit amine giống nhau khoảng 65%, trong từng type
huyết thanh vẫn có sự thay đổi về di truyền do có các genotype khác nhau. Các
protein cấu trúc của vi rút dengue bao gồm protein C (protein lõi - Capsid),
protein M (protein màng - membrance) và protein E (protein envelop -vỏ bao),
đây là các protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và tính độc
lực của vi rút. Các protein phi cấu trúc gồm có NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4A, NS4B và NS5 liên quan đến quá trình sao chép ARN và nhân lên của vi
rút [1,20,24].
M

C

prM

E

Gen mã hóa protein không câu trúc

Gen mã hóa protein cấu trúc

NS2a

NS2b

NS1

NS4a

NS3

NS4b

NS5

Hình 1.4. Sơ đồ bộ gen của virus Dengue [1,14]
I.3.

Đặc tính kháng nguyên
Các vi rút dengue có kháng nguyên gần giống các Flavivirus khác như

vi rút Tây sông Nile, viêm não Nhật Bản, sốt vàng. Tương tự như các vi rút
thuộc giống Flavivirus, vi rút dengue có 3 loại protein cấu trúc liên quan với


6

các đặc tính kháng nguyên của vi rút dengue [1,4,14].
- Protein E: Là một glycoprotein tương ứng với kháng nguyên đặc hiệu
riêng của từng type vi rút dengue.
- Protein màng M: Là một polypeptid tương ứng với kháng nguyên chung
của vi rút dengue.
- Protein lõi C: Là kháng nguyên đặc trưng cho toàn bộ các vi rút thuộc
nhóm Flavivirus.

Vi rút dengue còn có kháng nguyên kết hợp bổ thể, kháng nguyên trung
hòa và kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu. Dựa vào sự khác biệt giữa các
điểm quyết định kháng nguyên, người ta chia vi rút dengue ra làm 4 type khác
nhau là dengue type 1, type 2, type 3 và type 4 được ký hiệu lần lượt là DEN1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. Mặc dù 4 type vi rút dengue có tính kháng nguyên
khác nhau, nhưng chúng cũng có một số quyết định kháng nguyên chung đó là
kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu, khả năng ngưng kết hồng cầu thích
hợp nhất là ở pH 6,4 nên có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các type vi rút
dengue bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, nhưng tính kháng nguyên của vi rút
dengue type 4 không cao như các type vi rút khác [14].
I.4.

Độc lực của vi rút
Nhiễm vi rút dengue có thể biểu hiện ở dạng có triệu chứng hoặc không có

triệu chứng; Đối với những trường hợp nhiễm vi rút dengue có triệu chứng,
biểu hiện của bệnh cũng khác nhau từ thể nhẹ, chỉ có sốt đơn thuần, hoặc thể
sốt dengue cổ điển có sốt 5 – 7 ngày, nhức đầu, đau sau hố mắt, phát ban hoặc
thể sốt xuất huyết dengue điển hình với hiện tượng chảy máu nhiều nơi, giảm
tiểu cầu, tăng tính thấm thành mạch và có dấu hiệu suy tuần hoàn và có thể
dẫn đến hội chứng sốc dengue, trầm trọng hơn có thể dẫn đến tử vong


7

[6,32,33]. Nhiễm vi rút Dengue gây sốc được cho là do độc lực của vi rút có
thể xảy ra trong nhiễm virus tiên phát nếu là chủng có độc lực mạnh. Nhiều
quan điểm cho là độc lực của vi rút là yếu tố quan trọng quyết định mức độ
nặng nhẹ của bệnh. Độc lực của vi rút thể hiện ở tốc độ phát triển nhanh của
vi rút góp phần thúc đẩy sốt xuất huyết dengue hay sốc sốt xuất huyết dengue.
Một người có thể nhiễm 4 lần bởi 4 type huyết thanh vi rút dengue khác nhau,

người bị nhiễm nhiều hơn một lần với type huyết thanh vi rút dengue khác có
nguy cơ cao hơn phát triển thể bệnh xuất huyết. Do vậy đặc điểm di truyền
của vi rút và tình trạng miễn dịch ở vật chủ là những yếu tố chính trong việc
xác định hậu quả của bệnh ở người sau khi nhiễm vi rút dengue. Khi phân tích
sự lan rộng và sự tiến hoá của vi rút dengue cho thấy các kiểu gene đặc hiệu
của một type huyết thanh vi rút dengue thường kết hợp với mức độ nặng hơn
hoặc nhẹ hơn của bệnh. Đối với type huyết thanh 2 và 3, thì kiểu gene tương
ứng có nguồn gốc từ Đông Nam Á và từ tiểu lục địa Ấn Độ, đã từng được
phát hiện như là nguyên nhân của nhiều vụ dịch sốt xuất huyết dengue và hoặc
kết hợp hội chứng sốc dengue và ngay cả khi nhiễm nguyên phát có khả năng
phát triển thể bệnh nặng [7,8,9,11,15]. Trong khi đó một số khu vực khác như
Peru, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, thậm chí khi nhiễm thứ phát thì các bệnh
nhân vẫn không bị sốt xuất huyết dengue và hoặc hội chứng sốc dengue khi
chỉ có sự lưu hành của vi rút dengue mang kiểu gene ít độc lực hơn
[14,21,34].
Các kiểu gene vi rút độc hơn cũng từng thay chỗ cho các kiểu gene bản địa
ở Châu Mỹ, dẫn đến những vụ dịch dengue nặng nề hơn, với sự xuất hiện sốt
xuất huyết dengue có sốc ở lục địa này. Các chủng vi rút dengue Đông Nam Á
từng đang thay thế vi rút dengue mang kiểu gene Châu Mỹ ít độc lực hơn (ví
dụ, không biểu hiện sốt xuất huyết dengue và hoặc hội chứng sốc dengue,
nhưng vẫn gây ra sốt dengue) ở tại nhiều quốc gia. Ở khu vực bắc Mexico


8

giáp ranh với bang Texas (Reynosa, Mexico, giáp biên giới McAllen, Texas và
Matamoros, Mexico, giáp biên giới Brownsville, Texas), bằng chứng vi rút
lưu hành mới đây của chủng vi rút mang ít độc tính có nguồn gốc từ Châu Mỹ
được xác định vào năm 1995, nhưng đến cuối năm 2005, chủng vi rút dengue
Đông Nam Á mang độc tính cao hơn đã thay thế chủng vi rút dengue Châu

Mỹ, cũng như các nước khác ở Châu Mỹ. Với minh chứng chủng vi rút
dengue Đông Nam Á đã từng đựơc phân lập từ các bệnh nhân ở Bắc Mexico
(bang Oaxaca) vào năm 2000, nơi mà chủng vi rút dengue phân lập mang kiểu
gene Châu Mỹ của type huyết thanh 2 ở Peru năm 1996 [10,12,15,18,31].
Liệu rằng sự lan truyền vi rút dengue ở Texas có thể sẽ nhanh chóng bị thay
thế bằng kiểu gene của type huyết thanh 2 Đông Nam Á không (cùng với các
type huyết thanh khác, bao gồm kiểu gene độc của type huyết thanh 3 được
tìm thấy ở Mexico)? Nên có dự đoán rằng có thể sẽ thấy gia tăng của những
ca sốt xuất huyết dengue hoặc hội chứng sốc dengue ở Hoa Kỳ trong tương
lai, khi vai trò của các biến thể gene vi rút dengue được cho là có liên quan
đến mức độ nặng nhẹ của bệnh khi nhiễm vi rút dengue mang gene độc tính
cao. Nhưng cho đến nay, kết quả điều tra cho thấy các trường hợp SXHD nặng
ở Châu Á vẫn cao hơn gấp 17 lần so với Châu Mỹ [32].


9

II. KHÁI NIỆM VỀ DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ
2.1. Khái niệm chung về dịch tễ sinh học phân tử [14]
Dịch tễ sinh học phân tử tập trung khai thác về khía cạnh di truyền, là
sự so sánh trình tự nucleotide/axit amine của một gen đích hoặc toàn bộ
genome của các chủng vi sinh vật được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau,
trong các khoảng thời gian khác nhau ở những phân vùng địa lý khác nhau
để nghiên cứu quá trình lan truyền của một tác nhân gây bệnh, hoặc để xác
định có bao nhiêu loại type huyết thanh/nhóm genotype/genotype/phân
nhóm genotype (clade)/tiểu phân nhóm genotype (cluster) đang lưu hành tại
một vùng địa lý nhất định, trong những khoảng thời gian nhất định.
Khái niệm phylogeography: Là sự kết hợp giữa phát sinh loài
(phenlogenetics) và vùng địa lý (geography) để hiểu được các chủng vi sinh
phân lập có sự riêng biệt về phát sinh loài do di cư, do sự đi lại của con

người trên toàn cầu nhằm đưa ra bằng chứng về nguồn gốc sự chuyển của
chúng là từ đâu.
Khái niệm clade (phân nhóm genotype): Là một nhóm bao gồm có tổ
tiên chung (cùng nguồn gốc) và tất cả thế hệ sau (đang sống và tồn tại) của
tổ tiên này. Nên khi sử dụng cây phát sinh loài để xác định mối liên quan
của phân nhóm genotype của bất kỳ một vi sinh nào, rất dễ dàng để chỉ ra
mối liên quan này.
Khái niệm cluster (tiểu phân nhóm genotype): Là một tập hợp của hai
hay nhiều thế hệ giống nhau hoặc tương tự từ một tổ tiên chung (cùng


10

nguồn gốc) có những đặc điểm đa dạng như nhau, điều này rất hữu ích để
quay trở lại tìm dấu vết của lịch sử tiến hóa gần đây.

Trong lĩnh vực vi sinh y học, dịch tễ sinh học phân tử là phương pháp
hiện đại nhất để xác định về đặc điểm phân tử của tác nhân gây bệnh trên
cơ sở đó xác định được nguồn gốc của căn nguyên gây bênh, sự lan truyền
của tác nhân gây bệnh theo không gian, thời gian ở mức độ phân tử. Dịch tễ
sinh học phân tử hiện nay đã trở thành một công cụ chính xác và cần thiết
trong công tác giám sát dịch tễ học vì nó có thể:
- Xác định được nguồn gốc, sự mới xuất hiện và sự lan rộng của tác
nhân gây bệnh;
- Theo dõi được sự thay đổi các chủng gây bệnh ở mức phân tử theo
thời gian và phân vùng địa lý;
- Theo dõi sự tiến hóa của các chủng vi sinh gây bệnh;
- Xác định được xu hướng của bệnh dịch liên quan đối với những tác
nhân gây bệnh mang gene độc lực ở mức độ cao hoặc thấp.
- Trong một số trường hợp là cơ sở để phân biệt chủng phân lập có

nguồn gốc từ vắc xin hay từ trong tự nhiên (hoang dại).
2.2. Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen
2.2.1. Giải trình tự nucleotide [2,3,4,5,6]
2.2.1.1. Thế hệ thứ nhất (Phương pháp Sanger)
Phương pháp giải trình tự gen được sử dụng phổ biến nhất được gọi là
phương pháp Sanger kết thúc chuỗi bằng dideoxy do Sanger F. phát minh vào
năm 1977. Phương pháp này được xác định là “chuẩn vàng” vì nó cho phép


11

xác định chính xác trình tự ADN của các mẫu phân tích khi so sánh sự tương
đồng về trình tự nucleotide của chúng với nhau.

Nguyên lý của phương pháp này là dựa trên cơ chế tổng hợp ADN
trong cơ thể sinh vật nhưng có sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) bị mất
nhóm –OH ở cả hai vị trí cacbon 2’ và 3’. Trong phản ứng tổng hợp ADN, khi
ADN polymerase gắn ngẫu nhiên một ddNTP vào sợi ADN đang tổng hợp nó
sẽ làm ngừng quá trình này lại, do nhóm –OH bị mất ở vị trí 3’ là nơi để
nucleotide tiếp theo gắn vào hình thành nên cầu nối phosphodiester trong quá
trình kéo dài chuỗi.
Để thực hiện phương pháp này, trước hết sợi ADN khuôn được biến
tính và được lai với mồi, sau đó phản ứng tổng hợp các sợi đơn ADN được
thực hiện, các sợi đơn ADN được tổng hợp có độ dài ngắn khác nhau do
ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Như vậy, có bốn phản ứng với
bốn loại ddNTP khác nhau, kết quả sẽ có hàng loạt các chuỗi kết thúc là A, T,
C hoặc G. Kết quả của phản ứng giải trình tự gen được đọc dựa trên kết quả
chụp ảnh sự phân ly sản phẩm ADN hơn kém nhau một nucleotide trên gel
polyacrylamide. Việc phân biệt hai sợi đơn ADN hơn kém nhau một
nucleotide căn cứ vào các vạch ADN quan sát được nhờ có gắn phóng xạ P 32

vào một trong bốn loại nucleotide bình thường. Với cách xác định kết quả giải
trình tự gen này, rất khó khăn cho việc giải trình tự những đoạn gen có kích
thước lớn trên 500bp [14].
Đến những năm cuối thể kỷ XX, trình tự nucleotide đã được xác định trên
bằng máy đọc tự động (Sequenser) dựa trên nguyên lý của phương pháp sắc
ký. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đọc trực tiếp kết quả, giảm các
thao tác, tiết kiệm hóa chất và thời gian. Hơn thế nữa, trình tự nucleotide đọc
cũng dài hơn so với phương pháp trước đây. Trong phương pháp sử dụng máy


12

đọc trình tự gen tự động, thay vì ddNTP đánh dấu phóng xạ sẽ được đánh dấu
bằng huỳnh quang, bốn loại ddNTP sẽ được đánh dấu bằng bốn chất màu
huỳnh quang tương ứng khác nhau. Sản phẩm giải trình tự sau khi được tinh
sạch để loại bỏ các nucleotide và mồi thừa sẽ được đưa vào máy đọc tự động,
kết quả được phân tích bằng các phần mềm tính toán trên máy tính do đó kiểm
soát được sai sót, đảm bảo độ chính xác cao [14].
Mẫu virus đã sàng lọc

Tách chiết ARN của vius

Kiểm tra chất lượng

Thực hiện phản ứng RT-PCR để nhân đoạn genXác
đặcđịnh
hiệuđộ tinh sạch và nồng

Tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Điện di kiểm tra

Thực hiện phản ứng PCR
giải trình tự

Xác định nồng độ

Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự
giải trình tự

Đọc trình tự nucleotide của gen trên máy giải trình tự gen


13

Hình 2.1. Trình tự thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ thứ nhất
2.2.1.2. Thế hệ thứ hai (Next Generation Sequencing-NGS) [24]
Mặc dù có rất nhiều genome của nhiều loài động vật và người đã được
giải trình tự bằng phương pháp Sanger, nhưng phương pháp này bộc lộ rất
nhiều hạn chế như thời gian thực hiện phản ứng dài, thông lượng của một lần
giải trình tự thấp (1 trình tự/1 phản ứng). Nên phương pháp sequencing thế hệ
thứ hai đã phát triển và dự kiến có thể sẽ thay thế phương pháp Sanger trong
thời gian tới. Một yêu cầu đặt ra để giải trình những genome có kích thước lớn
là cần phải phát triển phương pháp giải trình tự mới có thông lượng cao, nó
cho phép thực hiện giải trình tự của nhiều mẫu cùng một lúc, phương pháp
giải trình tự này được gọi là phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NextGeneration Sequencing - NGS).
Đối với sequencing thế hệ thứ hai, có 4 điểm chính tiến bộ hơn so với
phương pháp sequencing cổ điển của Senger đó là: Nhanh hơn, giá thành thấp
hơn, có thể thực hiện với nhiều mẫu hơn trong cùng một thời gian và chính
xác hơn khi với lượng ADN không nhiều. Đối với kỹ thuật sequencing của

Sanger, cần một lượng lớn ADN để đọc ví dụ cho một trình tự 100bp, lượng
ADN cần trên vài trăm bản sao... Nhưng đối với NGS, một trình tự có thể thu
nhận được từ một bản sao (sợi đơn) nên nó có thể áp dụng trực tiếp để phát
hiện trình tự của một vi sinh từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. NGS cho kết quả
nhanh hơn kỹ thuật sequencing Sanger nhờ hai cách: (1) Phản ứng hóa học có


14

thể kết hợp với sự phát hiện tín hiệu trong một vài chuyển đổi của NGS,
ngược lại Sanger sequencing là hai quá trình tách biệt. (2) Một điều có ý nghĩa
hơn nữa là với một lần đọc tối đa khoảng 1Kb có thể mất một khoảng thời
gian khi sử dụng Sanger sequencing, nhưng ngược lại với NGS thì có thể đọc
ADN đồ sộ tương đương tới 300Gb trong một lần chạy trên một chip với
phương cách để đọc trình tự nucleotide dài được kiến tạo từ rất nhiều phần
đọc ngắn kế tiếp nhau kết hợp lại bằng phần mềm được thiết kế.Giá thành của
NGS thấp hơn rất nhiều khi thời gian, sức người và sinh phẩm được giảm
xuống, ví dụ để hoàn tất giải trình tự bộ gene người bằng Sanger sequencing
được bổ sung số liệu từ trình tự đã biết có giá thành là 6 triệu bảng Anh,
nhưng bằng NGS (với kỹ thuật Illumina) chỉ giá có 6.000 bảng Anh.
NGS cũng được biết như là công cụ để giải trình tựvới sản lượng cao (highthroughput sequencing), những công nghệ gần đây cho phép chúng ta giải
trình tự ADN và ARN nhanh hơn và rẻ hơn so với khi sử dụng kỹ thuật
sequencing của Sanger, nó thực sự là một cuộc cách mạng hóa nghiên cứu về
genome và sinh học phân tử với một số công nghệ hiện đại khác nhau bao
gồm:
- Illumina (Solexa) sequencing
- Roche 454 sequencing
- Ion torrent: Proton / PGM sequencing
- SOLID sequencing
a) llumina sequencing

Nguyên lý của phương pháp giải trình tự Illumina cũng dựa theo nguyên lý
của phương pháp giải trình bằng cách tổng hợp trước hết mẫu đưa vào phải
được tách ra thành những phần ngắn, độ dài của những phần này sẽ phụ thuộc


15

vào máy sequencing được sử dụng có thể là từ 100- 150bp.
Những đoạn là dài một chút được gắn vào những bộ chuyển đổi đặc chủng
và được ủ trong slide sử dụng thiết bị chuyển đổi. Slide bị tràn ngập với các
nucleotide và enzyme tổng hợp ADN, trong đó những nucleotide này được
gắn với chất huỳnh quang bằng những màu tương ứng với từng loại nucleotide
ở một điểm kết thúc và chỉ có một nucleotide được thêm vào tại một thời
điểm.
b) 454 sequencing
Roche 454 sequencing có thể giải trình tự nucleotide dài hơn Illumina bằng
cách đọc rất nhiều lần một trình tự nucleotid qua các tín hiệu huỳnh quang khi
các nucleotide được thêm vào và tương tự như Illumina, nếu ADN hoặc ARN
trên 1Kb được chia nhỏ thành những đoạn để đọc ngắn hơn. Các bộ chuyển
đổi phù hợp được bổ sung đến phần cuối và được gắn với các hạt với tỷ lệ một
đoạn ADN/hạt. Các đoạn ADN được khuếch đại bằng PCR sử dụng các mồi
chuyển đổi đặc hiệu, mỗi một hạt được đặt trong một giếng duy nhất của một
slide, như vậy mỗi một giếng sẽ có một hạt duy nhất,
c) Ion Torrent: Proton / PGM sequencing
Ion torrent và Ion proton sequencing không sử dụng tín hiệu quang học mà
chúng khai thác khi có sự bổ sung thêm dNTP với sự có mặt của enzyme tổng
hợp ADN bằng cách giải phóng một ion H +. Đầu vào của ADN vàARN là
những phân đoạn khoảng 200 bp, các bộ chuyển đổi được thêm vào và một
phân tử được đặt trong một hạt, mỗi một hạt được đặt trong một giếng duy
nhất của một slide được làm ngập với một loại dNTP duy nhất cùng với dung

dịch đệm và enzyme tổng hợp ADN. Độ pH được xác định tại mỗi giếng, khi
mỗi một ion H+ được giải phóng sẽ làm giảm độ pH, sự thay đổi về pH giúp
chúng ta xác định nếu đó là nucleotide và từ đó xác định được bao nhiêu


16

nucleotide được thêm vào trong trình tự xác định.
d) SOLID sequencing
SOLID là từ viết tắt của cụm từ “Sequencing by Oligonucleotide Ligation
and Detection” là công nghệ giải trình tự ADN thế hệ kế tiếp được phát triển
bởi các công nghệ cuộc sống (Life Technologies) và được thương mại dễ dàng
từ 2006. Công nghệ thế hệ kế tiếp này tạo ra hàng trăm triệu đến hàng tỷ của
nhữngđoạn đọc có trình tự nhỏ trong cùng một thời gian.
Phương pháp này không nên lẫn lộn với “giải trình tự bằng tổng hợp”, một
nguyên lý được sử dụng bởi Roche-454 pyrosequencing (được đưa vào sử
dụng từ 2005, tạo ra hàng triệu các đoạn đọc 200-400bp trong 2009 và hệ
htoongr Solexa (bây giờ mang tên là Illumina, được đưa vào sử dụng 2006,
tạo ra hàng trăm triệu các đoạn đọc 50-100bp từ 2009.
Phương pháp này giảm giá thành từ 0,01 USD/bp năm 2004 xuống còn
0,0001 USD/bp năm 2006 và tăng khả năng sequencing từ 1.000.000 bp/máy
giải trình tự/ngày vào năm 2004 đến hơn 5.000.000 bp/máy giải trình tự/ngày
vào năm 2009.
2.2.1.3. Những ứng dụng của kỹ thuật giải trình tự nucleotide
a) Để xác định đặc điểm phân tử của vi sinh
b) Để nghiên cứu về dịch tễ sinh học phân tử của vi sinh
c) Để phát hiện tác nhân gây bệnh mới có thể từ chủng phân lập hoặc từ mẫu
bệnh phẩm lâm sàng.
2.2.2. Giải trình tự axit amine [22]
2.2.2.1. Giải trình tự protein

Giải trình tự protein là kỹ thuật xác định trình tự các axit amine, cấu tạo


17

nên protein có hoạt tính và mức độ tạo phức với phân tử khác. Khám phá cấu
trúc và chức năng của protein trong cơ thể sống là công cụ quan trọng để tìm
hiểu những chu trình tế bào với mục đích tìm ra con đường chuyển hóa và
đích đến cho các loại thuốc.
Có hai phương pháp giải trình tự trực tiếp protein là (1) phương pháp
khối phổ và (2) phản ứng Edman sequencing. Có thể tạo ra một chuỗi axit
amine suy biến từ các trình tự ADN hoặc mARN mã hóa các protein. Tuy
nhiên, có rất nhiều phương pháp khác có thể được sử dụng tìm ra trình tự
protein và được sử dụng rộng rãi so với mục đích giải trình tự hoặc để khắc
phục những bất cập của các phương pháp trên.
Máy giải trình tự protein sử dụng để xác định trình tự các axit amine
cấu tạo nên protein, bằng phương pháp gắn thẻ và loại bỏ một axit amine tại
một thời điểm khác nhau, sau đó phân tích, xác định loại protein đó. Việc loại
bỏ này diễn ra cho đến khi kết thúc chuỗi polypeptide, đồng thời toàn bộ trình
tự hoàn chỉnh được thiết lập.Phương pháp này được thay thế bằng phương
pháp giải trình tự acid nucleic (là một phương pháp đơn giản, khi xác định
được trình tự ADN có thể dự đoán trình tự protein suy biến một cách dễ dàng).


18

Hình 2.2. Mô phỏng từ trình tự peptide đến giải mã genome
(Nguồn ảnh: />
Xác định thành phần axit amine của một protein với mục đích tìm ra trình
tự của protein, nhờ đó có thể phát hiện ra sai sót trong quá trình giải trình tự

hoặc để phân biệt giữa các kết quả không rõ ràng. Hiểu biết về tần số của các
axit amine nhằm chọn protease sử dụng để phân cắt protein. Phương pháp
phân tích axit amine được thực hiện với các bước như sau:
1. Thủy phân một lượng đã biết của protein tạo ra các axit amine cấu
thành của nó.
2. Sử dụng nhiều phương pháp phân tách và định lượng các axit amine
được thủy phân.
Việc xác định axit amine tạo thành đầu N của một chuỗi peptide có vai
trò quan trọng trong để hỗ trợ việc xác định các trình tự các đoạn peptide


19

thành một chuỗi protein hoàn chỉnh, vì vòng đầu tiên của sự thoái hóa Edman
(Edman degradation) thường bị lẫn bởi các tạp chất và do đó không thể xác
định chính xác các axit amine đầu N. Phương pháp phân tích axit amine đầu N
như sau:
1. Peptide phản ứng với một thuốc thử, chất này sẽ là chất đánh dấu chọn
lọc cho các axit amine ở phía cuối.
2. Thủy phân protein.
3. Xác định các axit amine bằng phương pháp sắc ký và so sánh với các
thang chuẩn.
Phương pháp phân tích axit amine đầu C ít hơn so với số lượng các phương
pháp phân tích đầu N. Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là khử nhóm
carboxyl của các acid amine đầu C của protein bằng enzyme
cacboxypeptidase, tiến hành thực hiện phản ứng khử mẫu lấy ra trong các
khoảng thời gian khác nhau đều đặn và xác định các axit amine đầu cuối bằng
cách phân tích đồ thị của nồng độ axit amine theo thời gian. Phương pháp này
rất hữu ích trong trường hợp polypeptide và protein được khóa bởi đầu
N. Trình tự axit amine đầu C góp phần quan trọng trong việc xác định các cấu

trúc cơ bản của protein đã dự đoán từ các trình tự ADN và phát hiện các sai
khác trong quá trình sau dịch mã (Post-translational) từ chuỗi codon đã biết.
a) Sự thoái biến Edman:
Sự thoái biến Edman là một phản ứng rất quan trọng đối với trình tự
protein đểgiải mã các thành phần axit amine của một protein vớiđộ dài chuỗi
polypeptide đọc được là 50 axit amine, vớinhững peptide dài hơn 50-70 axit
amine khó có thể xác định trình tự đáng tin cậy. Nên các protein có kích thước


20

lớn được chia thành các mảnh nhỏ bằng phản ứng thủy phân sử dụng các chất
có hoạt tính endopeptidases (Peptide hóa bên trong) như trypsin, pepsin, thuốc
thử hóa học … để giải trình tự những đoạn này để xây dựng hoàn chỉnh chuỗi
protein.
b) Khối phổ
Khối phổ là phương pháp phân tích protein được phổ biến trong những
năm gần đây để xác định các vùng trình tự protein khác nhau để xác định
chính xác khối lượng của các các phân tử nhỏ do John Bennett Fenn phát
minh, 2002. Phổ khối lượng được phân tích bằng máy tính và thường được so
sánh với dữ liệu của protein xếp theo trình tự trước đó để xác định trình tự của
các đoạn. Quá trình này được lặp đi lặp lại với enzyme cắt ở các đoạn khác
nhau và chồng chéo lên nhau trong chuỗi với mục đích xây dựng trình tự
chuẩn của protein cần nghiên cứu.
2.2.2.2. Ứng dụng của các kỹ thuật giải trình tự axit amine
- Xác định mức biểu hiện của các protein tại các thời điểm khác nhau: Các
thay đổi trong biểu hiện protein trong các quá trình biệt hoá, tăng sinh và
truyền tín hiệu của các tế bào cả về mặt chất lượng và định lượng. Trên cơ sở
này, thuật ngữ proteomics đã xuất hiện sau năm 1970, để xây dựng các cơ sở
dữ liệu protein. Tuy nhiên, việc xác định protein đã gặp nhiều khó khăn do

thiếu những phương pháp phân tích nhanh và nhạy ví dụ như phương pháp
PCR hay phân tích trình tự ADN tự động với sự ra đời của phương pháp khối
phổ (1990), nó đã chứng tỏ nó thật sự là một công cụ phân tích hữu hiệu đối
với protein. Thuật ngữ proteomics được dùng để đề cập về việc phân tích chức
năng của các sản phẩm gene với sự đồng nhất của các protein cũng như sự
tương tác của chúng, vì lý do đó mà proteomics đóng góp trực tiếp lên việc


21

khám phá và phát triển thuốc do bởi hầu hết các thuốc dùng để điều trị đều tác
dụng trực tiếp lên protein. Phương pháp proteomics không thể “nhìn” trên
trình tự ADN để phán đoán, mà là mối tương quan giữa mức độ mRNA và
mức độ biểu hiện protein giữa hai yếu tố này, thông tin trình tự gene không
thể nào cung cấp cho nhà nghiên cứu đó là sự định vị của sản phẩm gene tức
là vị trí mà protein sẽ thể hiện chức năng trong tế bào. Mở rộng vấn đề, rõ
ràng, các cơ chế điều hòa chức năng protein thông qua sự phân giải
(proteolysis), sự tái chế (recycling) hay sự cô lập (sequestration) trong tế bào
không thể được “nhìn thấy” nếu chỉ căn cứ trên thông tin của bộ gene, mà dựa
vào sự tương tác protein-protein và các thành phần cắu trúc nên tế bào để xác
định ở mức độ protein. Một gene sau khi xảy ra quá trình cải biên sau dịch mã
(postranslationally modified) sẽ tạo ra nhiều loại protein khác nhau, cơ thể
người có khoảng 30.000 gene, nhưng có tới 1000.000 protein. Do vậy, cần có
nhiều công cụ để phân tích protein ở dạng biến đổi và không biến đổi. Để
phân tích protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ của 4 loại công cụ
phân tích sau:
1. Cơ sở dữ liệu: Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện.
2. Khối phổ (Mass spectrometry - MS)
3. Phần mềm: Hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ liệu khối
phổ với các trình tự protein đặc trong trong cơ sở dữ liệu.

4. Công cụ phân tích protein nhằm mục đích (1). Làm đơn giản các phức
hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hay
nhóm nhỏ protein độc lập; (2). Việc phân tách này cho cái nhìn tổng
quan về sự khác biệt của hệ protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác
định được các protein đặc trưng để phân tích. Ngày nay, hai dạng phân
tích protein được sử dụng là điện di hai chiều kết hợp với khối phổ và


22

sắc ký hai chiều kết hợp với khối phổ để nhận dạng toàn bộ protein
trong mẫu.
- Nhận dạng và định lượng protein: Phân tích thành phần các protein riêng biệt
có trong hỗn hợp protein phức tạp, nhận biết các yếu tố cấu thành và phân tích
số lượng tổng hợp.
- Xác định cấu trúc và chức năng của protein: Nhận biết cấu trúc phân tử của
protein, từ trình tự axit amine để nhận biết trình tự gene tương ứng. Phương
pháp này đã được ứng dụng để phát hiện rất nhanh tác nhân gây bệnh là vi rút
SARS Corona trong vụ dịch năm 2002.
- Xác định cấu trúc tương tác protein – protein, hoặc protein với các phân tử
khác không phải là protein: Mục đích để nghiên cứu tính di truyền và các
tương tác lý học giữa các protein cũng như các tương tác giữa các protein và
axit nucleic hoặc các phân tử nhỏ.
III. DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VI RÚT DENGUE
3.1. Sự lan rộng và xuất hiện mới các type vi rút dengue


23

Hình 3.1.A. Sự phân bố và phát tán của các type vi rút dengue 1970

Hình 3.1.B. Sự phân bố và phát tán của các type vi rút dengue 2004 [16]
Tất cả 4 type huyết thanh của vi rút dengue hiện đang lưu hành ở châu Á
Thái Bình Dương, châu Phi và châu Mỹ hoàn toàn khác với bức tranh của
chúng cách đây 20 – 30 năm (hình 3.1 A và 3.1.B.).
3.1.1. Sự lan rộng của vi rút dengue ở châu Âu, vùng Điạ Trung Hải và
Trung Đông
Bệnh SXHD đã được mô tả từ các năm 1784 và 1788 ở các vùng Cadiz và
Seville của Tây Ban Nha. Dịch bệnh xảy ra suốt các năm 1980 ở các vùng
Trung Đông của Suez vào năm 1824, vùng bở biển Arabian vào năm 1835, ở
Yemen từ 1870 0 1873 và ở Israel 1889 – 1990 [12]. Trong khoảng thời gian
từ 1927 – 1928, một vụ dịch lớn SXHD đã xảy ra ở Hy Lạp với hơn một triệu
ca mắc. Điều tra hồi cứu huyết thanh học đã đưa ra bằng chứng về vai trò gây
bệnh của vi rút dengue type 1 và có thể cả vi rút dengue type 2 [25]. Trong các


24

năm 2009 và nửa đầu năm 2010, các vụ dịch SXHD được báo cáo ở Saaudi
Arabia, Sudan và Yemen. Các vụ dịch SXHD này có liên quan đến các vùng
nội thành và thành phố dọc theo bở biển Đỏ và bờ biển Arabian và Pakistan
[33].
3.1.2. Sự lan rộng của vi rút dengue ở châu Mỹ
Ở châu Mỹ, có rất nhiều nước ở châu lục này không có dịch SXHD trong
khoảng từ 35 đến 130 năm. Ví dụ như Hoa Kỳ cho đến nay vẫn là nước chưa
xác định sự có lưu hành của vi rút dengue, ngoại trừ những trường hợp bị
nhiễm vi rút dengue từ bên ngoài, trong khi đó ở quốc gia láng giềng như
Canada hoặc ở nhiều nước thuộc khu vực trung Mỹ nam Mỹ cũng như Cu Ba
xác nhận có sự lưu hành của vi rút dengue từ những thập kỷ 70 [13]. Trong
những năm 1960 – 1970, dịch SXHD được xác định chủ yếu do một type vi

rút dengue duy nhất trong một vùng ở bất kỳ thời điểm nào. Tương tự như
vậy, ở Cu Ba trong những năm 1977 – 1978 chỉ có vi rút dengue type 1 là tác
nhân gây dịch SXHD. Nhưng tiếp đó là có sự xuất hiện của vi rút dengue type
2 ở Cuba, là chủng vi rút có nguồn gốc từ Nam Á [19]. Tiếp đó, năm 1981 vụ
dịch SXHD nghiêm trọng đã xảy ra ở Cu Ba. Vi rút dengue type 2 được ghi
nhận là tác nhân gây các vụ dịch SXHD ở Venezela 1989, ở Cu Ba 1997 [31].
Nhưng đến đầu thế kỷ XXI, cả bốn type vi rút dengue đã được xác định là
nguyên nhân gây các vụ dịch SXHD với 3.419.999 ca bệnh trong giai đoạn
2001 – 2006 [34].
3.1.3. Sự lan rộng của vi rút dengue ở châu Phi
Thông tin liên quan đến lịch sử của bệnh SXHD ở châu Phi rất nghèo
nàn, những ca bệnh SXHD được ghi nhận trong những năm đầu thế kỷ XX.
Trong chương trình giám sát SXHD khởi động từ 1964, vi rút dengue type 1


25

và type 2 đã được phát hiện ở Ibaden, Nigeria. Các vụ dịch SXHD ở Camoros
ở các năm khác nhau 1948, 1984 và 1993 cũng được xác định do vi rút dengue
type 1 và type 2 [8]. Trong các năm 1983, 1984 vi rút dengue type 3 được xác
định lưu hành ở Senegal và Mozambique [11]. Mặc dù giám sát SXHD ở châu
Phi chưa được quan tâm, nhưng một điều hiển nhiên được ghi nhận hiện nay
là cả bốn type vi rút dengue được ghi nhận lưu hành ở châu lục này từ 1984
với hầu hết các vụ dịch xảy ra ở đông Phi, một số các vụ dịch nhỏ hơn được
ghi nhận ở tây Phi [32].
3.1.4. Sự lan rộng của vi rút dengue ở khu vực Thái Bình Dương
Bệnh SXHD được mô tả ở khu vực Thái Bình Dương cách đây trên 100
năm. Trong chiến tranh thế giới lần thứ II, vi rút dengue lan rộng ở phần lớn
các đảo ở vùng Thái Bình Dương [17,30,34]. Chỉ trong những năm 1990 có
hơn một triệu trường hợp SXHD lâm sàng được báo cáo ở khu vực Tây Thái

Bình Dương ở Malaysia, đảo Cook, các nhóm đảo thuộc Cộng hòa Pháp
(Frenche Polynesia), New Guinea và Úc với tác nhân gây bệnh được xác định
là do vi rút dengue các type. Trong các năm 1998 và 1999 ghi nhận có
356.554 và 64.066 các trường hợp sốt dengue và SXHD tương ứng với 1470
và 112 ca tử vong [16,25,34]. Vi rút dengue tiếp tục lưu hành rộng khắp các
đảo ở khu vực Thái Bình Dương và tỷ lệ mắc SXHD có thể tăng do giao thông
đi lại giữa các đảo ngày càng phát triển vì kinh tế, thương mại, đô thị hóa và
du lịch... dẫn đến sự xâm nhập mới và lan rộng của các type vi rút dengue từ
nước này sang nước khác trong khu vực cũng như sang các châu lục khác.
3.1.5. Sự lan rộng của vi rút dengue ở khu vực châu Á
Đối với khu vực châu Á, bệnh SXHD được ghi nhận đầu tiên vào những
năm 1950s với những vụ dịch SXHD ở các nước như Philippines, Thái Lan