Đánh giá tính đa hình rs2070803 và rs4072037 gen MUC1 trên bệnh nhân ung thư dạ dày

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày (UTDD), trong đó chủ yếu là ung thư biểu mô dạ dày, là một
trong những bệnh ung thư phổ biến nhất, với số lượng mắc mới trên thế giới lên tới
952.000 ca mỗi năm. Năm 2012, UTDD là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ
ba trên thế giới; 70% số ca được báo cáo đó là ở những nước đang phát triển, một
nửa trong số này là ở Đông Á [1]. Việt Nam thuộc khu vực nguy cơ UTDD trung
bình cao, với tỷ lệ mắc mới chuẩn hóa theo tuổi là 21,8 ở nam và 10,0 ở nữ mỗi
100.000 dân [2].
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị nhưng tiên lượng UTDD
hiện nay vẫn còn xấu, đặc biệt là ung thư dạ dày tiến triển, với tỷ lệ sốngthêm 5
năm chỉ khoảng 28% [3]. Các liệu pháp hóa trị là cần thiết ở đa số bệnh nhân ung
thư dạ dày tiến triển, nhưng chúng chỉ cải thiện tiên lượng ở một số ít bệnh nhân có
chọn lọc với thời gian sống thêm tối đa không quá 12 tháng và độc tính cao [4]. Bên
cạnh đó, hiện nay, vẫn chưa có dấu ấn sinh học nào giúp lựa chọn bệnh nhân vào
các liệu pháp hóa trị này.
Chính vì vậy, việc xác định các yếu tố nguy cơ để dự phòng và phát hiện sớm
UTDD sẽ là một hướng nghiên cứu mới của nền y học hiện đại. Bên cạnh các yếu tố
nguy cơ liên quan đến môi trường và lối sống thì yếu tố di truyền đóng vai trò khá
quan trọng đối với sự hình thành và phát triển ung thư. Trong những năm gần đây,
cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành Y sinh học phân tử, nhiều phương pháp
mới ra đời đã giúp việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại ung thư nói chung
và UTDD nói riêng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật
phân tích DNA xác định các gen gây ung thư. Các gen này có thể được phát hiện ở
trong các mô ung thư, hạch lympho hoặc tủy xương và thậm chí ở cả máu ngoại vi.
Dựa vào việc phân tích tính đa hình thái trên một số gen chủ chốt có thể xác định
được nguy cơ gây UTDD thông qua sự phân bố kiểu gen của từng cá thể.
Gen mucin 1 (MUC1) là một thành viên trong họ mucin, mã hóa chất nhầy
glycoprotein bám trên màng tế bào, có ở nhiều cơ quan như phổi, tuyến vú, thực
quản, tá tràng, mắt,…. Tại dạ dày, protein nhầy này tạo ra một rào cản vật lý có vai

2
trò bảo vệ các tế bào biểu mô khỏi các tác nhân gây viêm, dẫn tới ung thư từ môi
trường bên ngoài. Trước đây, MUC1 được coi là một gen sinh ung thư với vai trò
chống lại quá trình chết theo chương trình tại tế bào ung thư [5]. Một vài nghiên
cứu đã chứng minh có sự tương quan của biểu hiện gen MUC1 với tiên lượng xấu
của bệnh nhân ung thư [6] [7] [8].
Gần đây, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa
tính đa hình thái đơn (SNP) tại các vị trí rs2070803 và rs4072037 trên gen MUC1
tới nguy cơ mắc UTDD như: Saeki N (2011) [9]; Li F (2012) [10]; Hiromi
Sakamoto (2014) [5]; Li-Xin Qiu (2016) [11];….
Tuy nhiên tại Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố
về đánh giá về tỷ lệ mắc SNP cũng như đánh giá về sự nhạy cảm tại các vị trí này
của gen MUC1 tới UTDD.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá tính đa hình
rs2070803 và rs4072037 gen MUC1 trên bệnh nhân ung thư dạ dày” nhằm phục
vụ cho các nghiên cứu sâu hơn với 2 mục tiêu:
1.

Xác định tính đa hình rs2070803 và rs4072037 của gen MUC1 trên bệnh
nhân ung thư dạ dày.

2.

Xác định mối liên quan giữa đa hình rs2070803 và rs4072037 với một số
yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày.


3
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về ung thư dạ dày
1.1.1. Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ ung thư dạ dày
1.1.1.1. Dịch tễ học
Ung thư dạ dày (UTDD) là một loại ung thư thường gặp, với khoảng 989.000
trường hợp mắc mới mỗi năm trên toàn thế giới [12]. Tổ chức Y tế Thế giới ước tính
trong năm 2012, UTDD chiếm 723.000 trường hợp tử vong trên toàn thế giới [13].
UTDD phân bố không đồng đều trên thế giới, sự biến đổi địa lý ảnh hưởng lớn đến đến
tỷ lệ mắc bệnh này trên toàn thế giới, có tới khoảng hai phần ba số bệnh nhân UTDD là
ở các nước đang phát triển. Tỷ lệ mắc cao nhất được thấy ở Nhật Bản, Nam Mỹ, Đông
Âu, tỷ lệ mắc thấp nhất ở Bắc Mỹ, Ấn Độ, Nigieria và Úc [14].

Hình 1.1: Tỷ lệ mắc UTDD chuẩn hóa theo tuổi trên thế giới
(trên 100.000 người) [11]
Việt Nam thuộc khu vực có tỷ lệ mắc UTDD trung bình cao, với tỷ lệ mắc
UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở nam là 21,8 và ở nữ là 10,0 mỗi 100.000 dân [2].
Theo nghiên cứu của Trần Văn Huy tại Bệnh viện Trung ương Huế, trong nhóm
bệnh ung thư tiêu hóa, UTDD chiếm tỉ lệ cao nhất (52,4%) [15].


4
1.1.1.2. Các yếu tố nguy cơ
UTDD là hậu quả của tương tác phức tạp giữa yếu tố vật chủ với môi trường.
 Yếu tố môi trường
Nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm nguy cơ môi trường quan trọng nhất là
chế độ ăn uống, hút thuốc lá và nhiễm H. pylori.
- Chế độ ăn uống có nhiều nitrat như các loại cá, thịt chế biến sẵn, các loại
thức ăn xông khói, ướp muối, sẽ làm tăng nguy cơ UTDD. Nitrosamin có trong thức
ăn hoặc do một số loại thức ăn chứa nitrat tạo ra là một chất gây UTDD [16], [3].
Ăn ít rau và trái cây cũng làm tăng nguy cơ UTDD [16].

- Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 lần [17]. Theo Gonzalez,
xấp xỉ 18% trường hợp UTDD được quy cho hút thuốc lá. Nguy cơ UTDD tăng
theo thời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thuốc [18].
- H. pylori được Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) xếp vào tác nhân gây ung
thư nhóm I [3]. Có khá nhiều bằng chứng dịch tễ về mối liên quan giữa nhiễm H.
pylori với UTDD, đặc biệt là UTDD không thuộc tâm vị. Nhiễm H. pylori làm tăng
nguy cơ UTDD không thuộc tâm vị xấp xỉ 6 lần. Người ta ước tính H. pylori là
nguyên nhân của khoảng 63% các trường hợp UTDD không thuộc tâm vị trên toàn
thế giới [19]. Tại Việt Nam, Phạm Quang Cử nhận thấy có mối liên quan giữa
nhiễm H. pylori với viêm dạ dày teo, dị sản ruột, loạn sản niêm mạc dạ dày [20]. Tỷ
lệ UTDD ở người nhiễm H. pylori cao hơn người không nhiễm H. pylori với tỷ số
chênh (Odds Ratio: OR) = 3,3-3,6 [20], [21]. Do vậy, người ta cho rằng viêm dạ
dày teo mạn tính, dị sản ruột là các tổn thương tiền ác tính của UTDD [3].
- Tiền sử có phẫu thuật cắt dạ dày: Tỷ lệ mắc UTDD ở phần dạ dày còn lại
tăng lên sau phẫu thuật cắt dạ dày. Sau 20 năm, tỷ lệ mắc mới UTDD hàng năm ở
bệnh nhân cắt bán phần dạ dày khoảng 3% [22].
- Nội tiết tố sinh dục nữ: Trên toàn thế giới, tỷ lệ mới mắc UTDD ở phụ nữ
thấp hơn hằng định so với nam giới đối với cả ung thư tâm vị lẫn UTDD không
thuộc tâm vị [23], [24], [22]. Nghiên cứu của Freedman cho thấy có sự liên quan chặt
chẽ giữa UTDD với tuổi mãn kinh, tuổi sinh đẻ, số năm sau mãn kinh. Tỷ lệ nguy cơ


5
UTDD giảm còn 0,80 mỗi khi tăng tuổi mãn kinh 5 năm. Người sinh đẻ khi nhỏ hơn
30 tuổi có nguy cơ UTDD tăng hơn 1,9 lần so với người sinh đẻ lúc lớn hơn 30 tuổi.
Sau khi mãn kinh, tỷ số nguy cơ UTDD tăng 1,26 lần mỗi 5 năm [25].

 Yếu tố nguy cơ liên quan với vật chủ
- Yếu tố di truyền: UTDD thường xảy ra trên người có nhóm máu A và
cũng thường gặp trong cùng gia đình và anh em sinh đôi [16]. UTDD thể lan tỏa

di truyền là một loại UTDD di truyền được xác định rõ là do đột biến dòng phôi
trong gen E-cadherin (CDH1) [26].
- Polyp dạ dày: U tuyến chiếm khoảng 10% polyp dạ dày, là các khối u xuất
phát từ tổ chức tuyến của dạ dày, có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao nhất.
Khoảng 2% polyp tăng sản cũng có thể phát triển thành ung thư. Các polyp tuyến
đáy vị thường gặp ở phần đáy dạ dày, không diễn biến thành ác tính trừ những
người có hội chứng đa polyp tuyến gia đình [22].
- Loét dạ dày tá tràng: Nghiên cứu thuần tập lớn nhất của Hansson theo dõi
gần 60.000 bệnh nhân Thụy Điển vào viện vì loét dạ dày hoặc loét tá tràng trong
thời gian trung bình 9 năm cho thấy nguy cơ UTDD tăng 1,8 lần ở những bệnh nhân
loét dạ dày lành tính và giảm 0,6 lần ở những bệnh nhân loét tá tràng lành tính [27].
1.1.2. Phân loại ung thư dạ dày
1.1.2.1. Theo vị trí
Hiện nay, người ta có khuynh hướng chia UTDD thành 2 loại là ung thư tâm vị
và ung thư không thuộc tâm vị bởi lẽ dịch tễ, bệnh nguyên, mô bệnh học, điều trị và
tiên lượng của UTDD từ hai vị trí này khác nhau rất rõ [28], [29], [30], [31].
+ Tâm vị: là ung thư trong khoảng 1cm trên đến 2 cm dưới đường nối thực
quản dạ dày.
+ Không thuộc tâm vị gồm các vị trí sau:
o Phình vị, thân vị
o Bờ cong lớn, bờ cong nhỏ
o Hang, môn vị
o Vị trí khác như khi tổn thương ảnh hưởng lên toàn bộ dạ dày hoặc


6
chồng lấn giữa các khu vực không thuộc tâm vị.

Hình 1.2: Vị trí tổn thương trong ung thư dạ dày
UTDD không thuộc tâm vị thường gặp hơn ở những khu vực có tỷ lệ mắc

UTDD cao, ngược lại ung thư tâm vị thường gặp ở khu vực có tỷ lệ mắc UTDD
thấp. Tại các nước phát triển, ung thư tâm vị đã tăng đáng kể trong 50 năm qua [32].
Tại một số nước Châu Á có điều kiện kinh tế phát triển, tỷ lệ ung thư tâm vị cũng
đang tăng. Deans ghi nhận tại Singapore ung thư tâm vị tăng từ 6,3% lên 20,1%
trong vòng 25 năm [33]. UTDD không thuộc tâm vị có liên quan khá chặt chẽ với tình
trạng nhiễm H. pylori mạn tính, ngược lại ung thư tâm vị thường là hậu quả của trào
ngược dạ dày thực quản mạn tính [32]. Tiên lượng ung thư tâm vị thường xấu hơn
UTDD không thuộc tâm vị (Biểu đồ 1.1) [33], [29]. Deans nhận thấy thời gian sống
thêm trung bình của ung thư tâm vị sau phẫu thuật triệt để là 26 tháng, thấp hơn có ý
nghĩa so với 69 tháng trong UTDD không thuộc tâm vị (p < 0,001) [33].


7

Biểu đồ 1.1. Đường cong sống thêm của bệnh nhân ung thư tâm vị
và ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [29].
1.1.2.2. Phân loại của Borrmann
Dựa trên hình ảnh đại thể, Borrmann chia UTDD thành 4 týp (Hình 1.2) áp
dụng cho các trường hợp UTDD tiến triển [34].
- Týp I (dạng polyp): là những tổn thương lồi vào lòng dạ dày, không có hoại
tử hoặc loét lớn.
- Týp II (dạng nấm): là những khối u lồi lên, kích thước thay đổi, hình dáng
không đều, có những vùng loét.
- Týp III (dạng loét): là những tổn thương loét không đều, kích thước thay
đổi, với bờ rõ, cứng, chắc, gồ lên thẳng góc chứ không xuôi như bờ của týp II.
- Týp IV (dạng thâm nhiễm): là những khối u thâm nhiễm lan tỏa hoặc là
những tổn thương dạng xơ đét (linitis plastica). Tổn thương dạng thâm nhiễm lan tỏa
không có giới hạn rõ rệt giữa phần tổn thương và niêm mạc dạ dày bình thường. Ung
thư thể xơ đét là một khối u thâm nhiễm mạnh gồm những tế bào rất ác tính kèm
theo phản ứng tạo xơ rõ rệt làm cho dạ dày cứng, giống như chiếc lọ bằng da (leather

bottle). Ở giai đoạn đầu, ung thư thể xơ đét dễ nhầm với viêm dạ dày.


8

Hình A: Dạng polyp

Hình B: Dạng nấm

Hình C: Dạng loét
Hình D: Dạng thâm nhiễm
Hình 1.3: Phân loại hình ảnh đại thể theo Borrmann
Các thầy thuốc nội soi và phẫu thuật viên thường dùng bảng phân loại này
để mô tả hình ảnh đại thể của khối u vì nó là cách phân loại đơn giản, dễ sử
dụng và cũng có giá trị tiên lượng nhất định trong UTDD.
1.1.2.3. Theo mô bệnh học
Về mặt vi thể, phân loại UTDD rất đa dạng và phức tạp, chủ yếu dựa trên
kiểu hình mô học chiếm ưu thế nhất [35]. Hiện nay, hai cách phân loại đang được áp
dụng nhiều nhất dùng để tiên lượng cho bệnh nhân đó là phân loại của Lauren
(1965) và của WHO (2010).


9
Bảng 1.1: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày [36], [37]
Lauren 1965
Typ ruột
Typ lan tỏa

Typ hỗn hợp

WHO (2010)
Ung thư biểu mô tuyến nhú
Ung thư biểu mô tuyến ống
Ung thư biểu mô tuyến nhầy
Ung thư biểu mô tế bào nhẫn
Các ung thư biểu mô kém kết dính khác
Ung thư biểu mô hỗn hợp
Ung thư biểu mô tuyến vảy
Ung thư biểu mô tế bào vảy
Ung thư biểu mô tuyến dạng tế bào gan
Ung thư biểu mô với chất nền lympho
Ung thư biểu mô nhau thai
Sacôm ung thư biểu mô

Ung thư biểu mô tuyến ống là thể ung thư biểu mô dạ dày thường gặp nhất
[22]. Các bệnh nhân UTDD thể ống nhỏ, thể nhú thường có tiên lượng tốt hơn
bệnh nhân thể nhầy, thể tế bào nhẫn hoặc thể không biệt hóa [38], [39].
1.1.3. Tiên lượng ung thư dạ dày
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên tiên lượng UTDD. Các yếu tố tiên lượng
kinh điển là toàn trạng, tuổi, giới tính, vị trí, kích thước, phân loại mô bệnh học của
khối u [40].
Phân độ biệt hóa của TCYTTG chia UTDD thành có 3 mức độ biệt hóa [41]:
- Biệt hóa tốt: Cấu trúc tuyến hình dáng rõ ràng, thường giống với biểu
mô ruột dị sản;
- Biệt hóa kém: gồm các tuyến hình dáng không rõ, không đều hoặc thâm
nhiễm gồm các tế bào đơn lẽ hoặc những chuỗi tế bào nhỏ;
- Biệt hóa vừa: có hình ảnh trung gian giữa biệt hóa tốt và biệt hóa kém.
Tiên lượng UTDD biệt hóa kém thường xấu hơn so với UTDD biệt hóa tốt.
Lazăr thấy thời gian sống thêm trung bình của các bệnh nhân UTDD biệt hóa tốt là
60 tháng, biệt hóa vừa là 22,3 tháng và biệt hóa kém là 11,2 tháng và tỷ lệ sống

thêm 5 năm của 3 thể trên lần lượt là 100%, 25% và 7,7% [38].
Tuy nhiên, quan trọng nhất vẫn là độ sâu xâm lấn (giai đoạn T), tình trạng di


10
căn hạch vùng (giai đoạn N) và di căn xa (giai đoạn M) [42]. UTDD càng sớm tiên
lượng càng tốt [3]. Những kết quả này ủng hộ cho sự ra đời phương pháp đánh giá
giai đoạn UTDD dựa trên đánh giá giai đoạn TNM của AJCC/UICC được sử dụng
trên phạm vi toàn thế giới (Bảng 2.2) [31].
Bảng 1.2. Hệ thống đánh giá giai đoạn ung thư dạ dày của Ủy ban Hợp nhất
Hoa Kỳ về Ung thư và Liên minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế lần thứ 7 [31]
Giai đoạn
T
Tis (T0)
T1
T2
T3
T4a
T4b
N
N0
N1
N2
N3
M
M0
M1
Bệnh
0
I

II
III
IV

Mô tả
Khối u
Ung thư biểu mô tại chỗ, không có xâm lấn lớp mô đệm
Khối u xâm lấn vào lớp mô đệm, cơ niêm hoặc lớp dưới niêm mạc
Khối u xâm lấn vào lớp cơ
Khối u xâm lấn lớp dưới thanh mạc
Khối u xâm lấn vào lớp thanh mạc (phúc mạc tạng)
Khối u xâm lấn vào cấu trúc kế cận
Hạch bạch huyết vùng
Không có di căn hạch bạch huyết vùng
Di căn 1-2 hạch bạch huyết vùng
Di căn 2-6 hạch bạch huyết vùng
Di căn ≥ 7 hạch bạch huyết vùng
Di căn xa
Không có di căn xa
Di căn xa
Giai đoạn ung thư dạ dày
TisN0M0
T1N0M0, T2N0M0, T1N1M0
T3N0M0, T2N1M0, T1N2M0, T4aN0M0, T3N1M0, T2N2M0,
T1N3M0
T4aN1M0, T3N2M0, T2N3M0, T4bN0M0, T4bN1M0, T4aN2M0,
T3N3M0, T4bN2M0, T4bN3M0, T4aN3M0
Bất kỳ T, bất kỳ N, M1

1.2. Vị trí, cấu trúc gen và protein MUC1

1.2.1. Vị trí gen
Ở người, gen MUC1 nằm ở nhánh dài nhiễm sắc thể số 1, vùng 2, băng 2
(ký hiệu: 1q22), kích thước 4407 bp, gồm 7 exon và 6 intron.


11

Hình 1.4: Vị trí của gen MUC1 [43]
1.2.2. Cấu trúc gen và các biến thể
MUC1 chứa 7 exon, exon 1-4 mã hóa cho MUC1-N và exon 4-7 mã hóa
MUC1-C (Hình 1.4).

Hình 1.5: Cấu trúc gen MUC1 và các biến thể [44]
Ở người, có một số biến thể của MUC1 là kết quả trong luân chuyển cắt bỏ
exon và nối intron. Một nghiên cứu gần đây xác định được 78 biến thể của MUC1
[45] với các biến thể phổ biến nhất là MUC1/A, MUC1/B, MUC1/C, MUC1/D,


12
MUC1/X (hoặc MUC1/Z), MUC1/Y, và MUC1/ZD. MUC1/A, MUC1/B, MUC1/C,
và MUC1/D mã hóa toàn bộ chiều dài MUC1, qua sự cắt nối intron I và exon 2
(Hình 1.4B), chúng chỉ khác nhau bởi chiều dài VNTR [46] [47]. MUC1/B là được
gọi là mRNA MUC1 bình thường. Biến thể MUC1/X (hoặc MUC1/Z), MUC1/Y, và
MUC1/ZD được tạo ra từ các vị trí cắt nối thay thế nằm trong exon 2, nơi VNTR
mã hóa trong exon 2 được bỏ qua (Hình 1.4C) [48], [49]. Dạng MUC1/Y 54 bp
ngắn hơn MUC1/X và thể hiện rõ hơn trong ung thư vú, buồng trứng và tiền liệt
tuyến [50], [51]. MUC1/ZD cũng thiếu vùng VNTR và trình tự thoái hóa phụ,
nhưng có chứa một miền C đặc biệt (43 acid amin), đó là kết quả của sự dịch khung
[52]. Một dạng tiết của MUC1 được gọi là MUC1/SEC mà thiếu cả hai TMD và
CT, liên kết với MUC1/Y gây phosphoryl hóa tyrosine của MUC1/Y [53]. Hiện nay

vẫn chưa có sự hiểu biết rõ ràng về ý nghĩa chức năng của mỗi của các biến thể
MUC1.
1.2.3. Protein mucin 1
1.2.3.1. Cấu trúc
Protein MUC1 được tổng hợp bao gồm 1255 acid amin (aa) có trọng lượng
phân tử 122 kDa, thuộc họ mucin, có nhiều trong ống tiêu hóa, mắt, tử cung, tiền
liệt tuyến [54], có cấu trúc như hình 1.6.


13

Hình 1.6: Cấu trúc của protein MUC1, chia tách bởi protease
và vùng nhận liên kết đuôi tế bào chất trên MUC1 (CT) [44].
(A) Tiểu đơn vị N (MUC1-N) và C (MUC1-C) của MUC1 liên kết xung quanh
miền SEA, tạo thành một phức hợp dị dimer ổn định. MUC1-N gồm tín hiệu peptid,
trình tự lõi lặp lại (VNTR) và miền SEA. Các khu vực VNTR của MUC1-N gồm 20
acid amin, được O-glycosyl hóa (màu đỏ) tại serine và threonine. MUC1-N và
MUC1-C được N-glycosyl hóa (màu tím) sơ sài tại asparagin. Tiểu đơn vị C
(MUC1-C) bao gồm các miền ngoại bào (ECD), vùng màng (TMD) và vùng đuôi tế
bào chất (CT).
(B) Các ECD của MUC1-C có chứa vị trí N-glycosyl hóa (asparagin). Tùy vào
mức độ của N-glycosyl hóa, trọng lượng của MUC1-C có thể dao động từ 23 đến 25
kDa. MUC1-C thiếu N-glycosyl hóa có trọng lượng phân tử 17 kDa.
(C) Trong điều kiện phát triển bình thường, MUC1 vẫn còn ở dạng dị dimer
(giai đoạn 1). MUC1-C chứa một vùng ngoại bào ngắn (53 acid amin), vùng màng
(28 acid amin) và đuôi tế bào chất (72 acid amin). Vùng ECD của MUC1- C được
phân cắt (giai đoạn 2) bởi enzym như yếu tố hoại tử khối u (TNF)- enzym chuyển α


14

(TACE), còn gọi là ADAM17 hay MMP-MT1, để tạo ra các đoạn peptid: MUC1*
(16 kDa) hoặc MUC1-CTF15 (15 kDa) với ECD ngắn hơn. Về chức năng, MUC1*
hoạt động như một thụ thể yếu tố tăng trưởng cho NM23-H1 và MUC1-CTF 15 đóng
vai trò như một chất nền cho γ-secretase.
(D) Trình tự acid amin của MUC1 CT, nổi bật những vị trí tiềm tàng
phosphoryl hóa và gắn các protein. Các tyrosin (màu đỏ), threonin (màu xanh lá
cây) và serine (màu xanh nước biển) của MUC1 CT được phosphoryl hóa bởi thụ
thể yếu tố tăng trưởng và kinase nội bào. Các tiểu đơn vị P85 của PI3K, PKC-δ,
GSK-3β và c-Src phosphoryl hóa gốc tyrosine của trình tự YHPM, threonin của
trình tự TDR, serine của trình tự SPY và tyrosin của trình tự YEKV tương ứng. βcatenin liên kết trực tiếp với các trình tự SAGNGGSSLS giàu serine. Những gốc
được phosphoryl hóa trở thành các vị trí liên kết tiềm năng cho các phân tử tín hiệu
nội bào và do đó có thể tích hợp thác tín hiệu khác nhau hoặc điều chỉnh tình trạng
kích hoạt của chúng. Ví dụ, phosphotyrosin của trình tự SANL hoạt động như một
vị trí bám cho protein Grb-2 [55]. MUC1-C monomer được dimer hóa quanh trình
tự CQC để tạo thành một dimer có chức năng [56].
MUC1-N gồm miền giàu prolin, threonin và serine (PTS) và miền SEA. Tên
miền PTS, cũng chính là trình tự lõi lặp lại (VNTR), được một exon mã hóa rất đa
hình cho nhiều chuỗi 20-21 acid amin lặp đi lặp lại [57].
Ở Bắc Âu, các VNTR gồm 20-120 lần lặp đi lặp lại, với 40-80 lần lặp đi lặp
lại là phổ biến nhất [58]. Trình tự acid amin của vùng VNTR có thể thay đổi trong
các dòng tế bào ung thư khác nhau, phù hợp với tính chất đa hình cao của trình tự
này [59]. MUC1 được O-glycosyl hóa và N-glycosylated rộng rãi tạo nên mucin
chức năng trưởng thành [60].
1.2.3.2. Chức năng
 Ở tế bào bình thường:
Trong các tế bào biểu mô bình thường, MUC1 nằm ở đỉnh bề mặt của các tế
bào và đóng vai trò như một hàng rào chống lại những tác nhân ngoại sinh tới tế bào
[61]. Các protein MUC1 trên bề mặt tế bào bao gồm tiểu đơn vị đầu N và C, được
xem như MUC1-N và MUC1-C tương ứng. Sau khi được dịch, protein MUC1 đơn

15
được phân tách thành hai tiểu đơn vị. Hai tiểu đơn vị này liên kết không cộng hóa
trị và được cố định trên màng tế bào.
Bên cạnh chức năng bảo vệ như một hàng rào niêm mạc, MUC1 có đóng một
vai trò chống ung thư theo cách khác. MUC1-C có một miền màng và một cái đuôi
tế bào chất (CT), nơi có nhiều vị trí phosphoryl hóa và một vị trí gắn β-catenin .
Phosphoryl hóa threonin ở CT thúc đẩy sự tương tác giữa MUC1 và β-catenin và
tác động tới nhân tế bào, để điều hòa gen trong đó có p53 [56], [62].
 Ở tế bào ung thư:
MUC1 đã được coi là một protein sinh ung thư, bởi vì có nhiều bằng chứng
cho thấy chức năng thúc đẩy ung thư của nó. Nó tương tác với các yếu tố giống
Kruppel 4 (Klf4), một tiểu đơn vị MUC1-C chiếm phần PE21 của vùng khởi động
gen p53, nơi gắn các histon deacetylase, ức chế sự phiên mã của gen p53 [63].
MUC1 hoạt hóa protein Bcl-XL chống lại chết theo chương trình và làm suy yếu
màng ty thể, ức chế giải phóng cytochrom c và hoạt hóa caspase-9 dẫn đến sự thất
bại của quá trình cảm ứng chết theo chương trình [64]. Trong đáp ứng với tổn
thương DNA, c-Abl tyrosine kinase không thụ thể được chuyển tới nhân và gây
chết theo chương trình nhưng protein MUC1 làm giảm con đường tín hiệu này [65].
Như vậy, MUC1 là một protein sinh ung thư lớn phá hủy con đường tín hiệu chết
theo chương trình của tế bào, một trong những chương trình chống ung thư quan
trọng nhất trong các tế bào. Chức năng này ở các tế bào ung thư giúp chúng có khả
năng kháng thuốc chống ung thư.
MUC1 cũng có thể tham gia vào sự di căn vì nó đã được chứng minh in vitro
rằng protein MUC1 có thể liên kết với phân tử bám dính gian bào (ICAM-1), tạo
điều kiện bám dính của các tế bào ung thư vú đến nội mô tế bào, dẫn đến độ bám
dính và di cư tiếp theo thông qua thành mạch [66].
Hơn nữa, MUC1 có thể có một số vai trò trong các tế bào gốc UTDD vì nó
đóng vai trò như một thụ thể yếu tố tăng trưởng trên các tế bào gốc phôi người chưa
biệt hóa và được thể hiện trong các tế bào gốc ung thư bạch cầu dòng tủy cấp tính

16
[8], [67]. Nó còn giúp tế bào ung thư tồn tại trong điều kiện thiếu oxy và dinh
dưỡng bởi điều chỉnh chuyển hóa lipid và đường, trạng thái năng lượng tế bào [68].
1.3. Đa hình thái đơn nucleotid của gen MUC 1
1.3.1. Đa hình thái đơn nucleotide
Hiện tượng đa hình thái đơn (SNPs) là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi
một nucleotid đơn A, T, G, C ở trong bộ gen bị thay đổi so với bộ gen chung của
loài. Một biến thể để được coi là 1 SNP thì nó phải xảy ra ở ít nhất 1% dân số [69].
SNPs là một hiện tượng tương đối phổ biến diễn ra trong suốt chiều dài DNA
của 1 người, trung bình xảy ra 1 lần sau mỗi 300 nucleotid nghĩa là bộ gen người có
khoảng 3 tỷ bp sẽ có khoảng 10 triệu SNPs. Nó có thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nào
trên hệ gen, ở vùng mã hóa hay không mã hóa, tuy nhiên người ta tìm thấy SNPs
với tần suất cao ở các đoạn DNA giữa các gen [69], [70].
Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con người là giống nhau, nhưng chỉ một
sự thay đổi nhỏ trong hệ gen cũng có thể tác động lớn đến việc làm thế nào mà con
người bị bệnh cũng như khả năng thích nghi với các yếu tố từ môi trường như: chất
độc, vi khuẩn, virus… và đáp ứng với các liệu pháp điều trị. Điều này làm cho
SNPs có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực y sinh học. Tuy vậy, cho đến nay
ứng dụng quan trọng nhất của tính đa hình thái đơn nucleotid là so sánh vùng gen
giữa các nhóm người với nhau để xác định mối liên quan giữa SNPs với sự hình
thành và phát triển ung thư [69] ,[71].


17

Hình 1.7. Hình ảnh minh họa hiện tượng SNP
(Nguồn: )
1.3.2. Đa hình thái đơn nucleotid của gen MUC 1

Theo dữ liệu của NCBI, đến nay đã phát hiện khoảng 712 SNP của gen
MUC1, tuy nhiên chỉ có 11 SNP thực sự được xác nhận trên cơ sở dữ liệu
HapMap [11]. Một số SNP có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh cũng như khả
năng đáp ứng của cơ thể với môi trường bên ngoài đã được thực hiện qua nhiều
nghiên cứu, thể hiện trong hình sau:
Bảng 1.3: Một số SNP MUC1
Cỡ mẫu
Tác giả

Địa điểm

Bệnh

Năm

Bệnh
-chứng

Nhật Bản
Saeki [9]

Nhật Bản

UTDD

Hàn

lan tỏa

2011

Xu [72]
Jia [73]

Trung
Quốc
Ba lan

hình

606/1264

Rs407203

304/1465

7,

452/372

Quốc

Vùng đa

UTDD

2009

138/241

UTDD

2010

273/377

Rs207080

Mối
tương
quan

Có

3
Rs407203
7
Rs407203

Có
Có


18

7
Zhang [74]
Palmer [75]
Sun [76]
Zhang [54]

Jia [73]
Zhang [54]
Li [10]

Trung

UTDD

2011

1681/1858

UTDD

2012

596/587

Mỹ

UTDD

2014

132/125

Trung

UTDD

Quốc

trừ tâm vị

2013

288/281

2010

320/57

2013

122/159

2012

300/300

Quốc
Người da
trắng

Ba lan

Nhiễm
HP

Trung

Nhiễm

Quốc

HP

Trung
Quốc

UTDD

Rs407203
7
Rs407203
7
Rs407203
7
Rs407203
7
Rs407203
7
Rs407203
7
Rs207080
3
Rs642718

Có
Có

Không
Không
Không
Không
Có

4
Rs497105
2
Rs427691
Jia [73]

Ba Lan

UTDD

2010

273/377

3
Rs497108

Có

8
Rs497109
2
Rs407203
7

1.4. Tình hình nghiên cứu về SNP rs2070803 và rs4072037
Trong những thập kỷ gần đây, nhờ những tiến bộ trong hiểu biết sâu sắc, đầy đủ
hơn về cơ chế gen nguy cơ gây ung thư dạ dày, sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ


19
thuật, đặc biệt là ngành Y sinh học phân tử, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để
điều tra về vai trò tiềm năng của các biến thể di truyền MUC1 trong UTDD và gần đây
đã xác định được biến thể tiềm năng liên quan đến tính nhạy cảm ung thư.
Năm 2010, Abnet và cộng sự [77] đã tiến hành nghiên cứu trên 1625 bệnh
nhân UTDD và 2100 nhóm chứng. Họ đã xác định một SNP đáng chú ý rs4072037
A/G gen MUC1 trong đó alen A sẽ tăng nhạy cảm UTDD. Một nghiên cứu khác
trên bệnh nhân UTDD tại Nhật Bản tiết lộ 10 SNP hàng đầu được xác định liên
quan có ý nghĩa đến UTDD lan tỏa, trong đó bao gồm hai vị trí trên nhiễm sắc thể
1q22 [78]. Sau đó, Saeki và cộng sự [9] dựng lên bản đồ tính nhạy cảm để khám
phá những vị trí liên quan đến UTDD ở nhiễm sắc thể 1q22 và báo cáo rằng 2 SNP
rs2070803 và rs4072037 liên quan có ý nghĩa đến tính nhạy cảm tới UTDD lan tỏa
tại Nhật Bản và các kết quả đã được xác nhận ở Nhật Bản và nghiên cứu Hàn Quốc.
SNP rs4072037 nằm trong exon 2 của gen MUC1 và kiểm soát vị trí nối tại ranh
giới giữa exon 1 và 2 [9] [79]. SNP này ảnh hưởng đến vùng gen khởi động
promotor và phá vỡ các chức năng sinh lý của MUC1 [9], [80]. Các rs4072037 alen
G tương quan với VNTR lớn và alen A với VNTR nhỏ [79]. Tuy nhiên, các VNTR
không phải là hậu quả trực tiếp của tính đa hình với tính nhạy cảm GC vì vùng TR
không được dịch trong các tế bào biểu mô dạ dày bình thường hoặc ác tính [9].
Điều này cho thấy VNTR là một vùng gắn đa hình cho các biến thể di truyền, chẳng
hạn như rs4072037, liên quan đến nguy cơ ung thư dạ dày. SNP rs2070803 G/A có
vị trí giữa gen MUC1 và TRIM46 và các chức năng của nó chưa được hiểu rõ.
Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy mối liên quan giữa UTDD với SNP tại
các vị trí rs2070803 và rs4072037 (Bảng 1.2).

20
Bảng 1.4: Mối liên quan giữa ung thư dạ dày và SNP MUC1

SNPs
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs207080
3 (G/A)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)
rs407203
7 (A/G)

Năm

2009
2010
2010
2010
2011
2011
2011
2012
2013
2013
2014

OR (95%CI)
và kiểu gen
1.81
AA to AG + GG
2.20 (1.41–3.44)
AA to GG
0.72 (0.62–0.85)
G to A, allelic
0.75 (0.65–0.87)
G to A, allelic
1.74 (1.26–2.39)
A to G, allelic
1.62 (1.32–1.99)
A to G, allelic
0.73
G to A, allelic
0.46 (0.32–0.67)
AA + AG to GG

0.5 (0.3–0.9)
AG to AA
0.4 (0.2–0.9)
AG to AA
0.78 (0.67–0.91)
AG to AA

p

0.031
<0.01
5.74 × 10-5
9.45 × 10-5
7.82 × 10-4
4.04 × 10-6
1.0 × 10-4
<0.001
*
*
0.031

Dân tộc
Trung
Quốc
Caucasia
n
Trung
Quốc
Trung
Quốc

Hàn
Quốc
Nhật bản
Trung
Quốc
Trung
Quốc
Caucasia
n
Caucasia
n
Hàn
Quốc

Loại

Tha

ung

m

thư

khảo

UTDD

[72]

UTDD

[73]

Trừ
tâm vị
Tâm vị
UTDD
lan tỏa
UTDD
lan tỏa
Trừ
tâm vị

[77]
[77]
[9]
[9]
[81]

UTDD

[10]

Tâm vị

[75]

Trừ
tâm vị

UTDD

[75]
[82]

1.5. Kỹ thuật PCR-RFLP
1.5.1. Phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) do nhà khoa học Kary Mullis phát
minh vào năm 1983 đã tạo ra một cuộc cách mạng trong lĩnh vực Y-Sinh học, nó
giúp các nhà khoa học đi từ những quy trình cơ bản nhất để thực hiện các nghiên
cứu chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực, trong đó có Y học. PCR là kỹ thuật khuếch
đại một đoạn DNA ở môi trường ngoài cơ thể mà không cần sử dụng các sinh vật


21
sống như E.coli hay nấm men. Nguyên lý của kỹ thuật PCR cũng tuân thủ những
nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể như: đoạn DNA khuôn cần
tháo xoắn, cần có các cặp mồi, nguyên liệu và môi trường thích hợp, cần enzym
DNA polymerase và các nucleotid gắn vào sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ
sung. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác biệt là dùng nhiệt độ để tháo xoắn thay
cho enzym helicase, enzym DNA polymerase là enzym chịu nhiệt và có hệ thống
điều chỉnh nhiệt độ cho từng giai đoạn của phản ứng [83], [84], [85].
Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm 3 giai đoạn [83], [84]:
- Giai đoạn 1- biến tính: chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính
bởi nhiệt độ cao, thường là 94-950C, tách thành hai chuỗi đơn.
- Giai đoạn 2- gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống về nhiệt độ gắn mồi (40700C) cho phép các đoạn mồi gắn với các sợi DNA khuôn.
- Giai đoạn 3- kéo dài: nhiệt độ được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu để enzym
xúc tác cho quá trình tổng hợp sợi DNA (thường là 720C).
Như vậy từ một sợi DNA xoắn kép ban đầu sau n chu kỳ của phản ứng PCR

ta thu được 2n bản copy có chiều dài được quyết định bởi vị trí bám của mồi.
Điều này có nghĩa là nếu hiệu suất của phản ứng đạt 100% thu chỉ cần khoảng
20 chu kỳ, số DNA thu được là khoảng 1 triệu bản copy để sử dụng cho các thí
nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, để đạt được lượng DNA cần thiết cho việc phân
tích các đặc tính của gen các nhà khoa học thường tiến hành phản ứng trong
khoảng từ 25-40 chu kỳ tùy theo nồng độ khởi điểm của DNA khuôn. Nhờ kỹ
thuật PCR, chúng ta thu được 1 lượng rất lớn DNA theo mục đích của từng thí
nghiệm. Song điều đó cũng có nghĩa là, trong quá trình tiến hành PCR, việc nhiễm
1 lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng,
chính vì vậy cần có những đối chứng thích hợp trong quá trình thao tác để thu được
kết quả chính xác.


22

Hình 1.8. Các giai đoạn trong phản ứng PCR
(Nguồn: )
1.5.2. Enzym giới hạn
Enzym giới hạn được Werner Aber tìm ra lần đầu ở các chủng E.coli khi nó
đang hạn chế sự nhân lên của DNA lạ khi chúng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn.
Đây là một enzym endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những
enzym này phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mà không gây tổn hại
đến các base làm cho phân tử DNA dài bị cắt ra thành từng đoạn ngắn hơn .
Enzym giới hạn có trình tự nhận biết là đoạn DNA gồm 4-8 cặp nucleotid có
trình tự đối xứng (giống nhau khi đọc theo chiều 5’-3’) hoặc bất đối xứng, còn vị
trí cắt có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự này. Dựa vào vị trí cắt enzym giới hạn
được chia thành 3 loại :
Loại I: khi enzym nhận biết trình tự, nó sẽ di chuyển đến vị trí trên
phân tử DNA cách đó 1000-5000 nucleotid để cắt.
Loại II: enzym cắt DNA ngay tại vị trí nhận biết.

Loại III: enzym cắt DNA tại vị trí cách vị trí nhận biết khoảng vài chục
nucleotid.
Một số enzym tạo ra các vết cắt ở cùng 1 vị trí trên mạch đối diện tạo ra các
đoạn DNA “đầu bằng”, còn hầu hết các enzym giới hạn đều tạo ra các vết cắt hơi
chéo nhau (hình chữ chi) tạo ra các đoạn DNA “đầu dính”.


23

Hình 1.9. Các kiểu cắt của enzym giới hạn
1.5.3. Kỹ thuật PCR-RFLP
Nguyên lý của kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc
một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này
bằng enzym giới hạn thích hợp ta được các đoạn DNA có chiều dài khác nhau.
Sự khác nhau này có thể nhận biết bằng cách điện di sản phẩm trên gel. Sau khi
phân tích kết quả ta có thể tìm được tính đa hình của đoạn DNA ban đầu.
Như vậy, quy trình của kỹ thuật PCR-RFLP sẽ bao gồm các bước:
- Tách chiết DNA từ tế bào có nhân.
-

Dùng phản ứng PCR để khuếch đại 1 đoạn gen cần nghiên cứu có
kích thước phù hợp.

- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu được.
- Cắt sản phẩm PCR thu được bằng enzym giới hạn thích hợp.
- Điện di sản phẩm thu được và đọc kết quả.
1.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid
A,T,G,C trên phân tử DNA.
Hiện nay phương pháp Sanger được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới.

Phương pháp này sử dụng nguyên liệu để tổng hợp sợi DNA đích gồm cả
deoxyribonucleotide (dNTP) và dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP). Cấu
trúc của ddNTP tương tự như dNTP nhưng không có gốc -OH ở đầu 3’ nên phản
ứng tổng hợp DNA sẽ bị dừng lại ngay tại vị trí mà ddNTP được gắn ngẫu nhiên
vào thay thế cho dNTP. Do vậy sản phẩm sẽ gồm nhiều đoạn gen có kích thước
hơn kém nhau 1 nucleotid. Điện di sản phẩm, dựa vào vị trí của các băng sáng ta
đọc được trình tự của gen.
Ngày nay, các nhà khoa học thường dùng các ddNTP có gắn huỳnh quang và
kết quả sẽ được đọc trên máy giải trình tự tự động.


24

Hình 1.10: Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự gen
(Nguồn: daviddarling.info)


25
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
- Nhóm chứng (n=130): gồm những người khỏe mạnh bình thường được
tuyển chọn qua các đợt khám sức khỏe tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện
108, nội soi dạ dày không loét, không có dấu hiệu tổn thương tiền ung thư, tình
nguyện tham gia nghiên cứu.
- Nhóm nghiên cứu (n=130): gồm những bệnh nhân được chẩn đoán xác
định bị mắc bệnh ung thư dạ dày dựa trên những đặc điểm lâm sàng và cận lâm
sàng điển hình, đặc biệt là kết quả giải phẫu bệnh (GPB).
2.1.2. Cỡ mẫu thuận tiện

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: Bệnh - Chứng
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm kiểm chuẩn, Trường Đại học Y Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2016 đến tháng 12/2017.
2.2.2. Kỹ thuật thu thập thông tin
Thông tin được thu thập theo bộ cấu trúc được thiết kế sẵn.
2.2.3. Nội dung các biến số nghiên cứu
- Thông tin cơ bản cá nhân: Tuổi, giới,…
- Tiền sử: Hút thuốc lá, uống rượu gồm các thông tin có/không, tần suất, mức
độ,…
- Thông tin về khác: nhiễm Helicobacter Pylori (HP), phân loại u, kích thước
u, vị trí, giai đoạn,…