Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcumalonga L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
............... ***...............

BÙI ANH VĂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ
NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)
VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
............... ***...............

BÙI ANH VĂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ
NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)
VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã
nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình.
Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS Lê Mai Hương người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực
hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này.
Tôi xin đươc bày tỏ lòng biết ơn đến đề tài “Nghiên cứu metagenome của
vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: cây thuốc có củ (cây
nghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng”
MS: ĐTĐLCN.14/4 thuộc chương trình Hợp tác Nghiên cứu Việt Nam – Hà
Lan, do PGS.TS Lê Mai Hương chủ nhiệm đã cho tôi cơ hội được thực hiện
nghiên cứu của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôi
kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên
cứu luận văn, là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Đình Luyện, Ths. Hoàng Kim Chi
và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các
Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,
những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi
yên tâm học tập hoàn thành khóa học này.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, Anh, Chị và gia đình dồi dào
sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn
i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
hoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp
đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình
bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc./.
Tác giả luận văn

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3
1.1. Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.) ........................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 3
1.1.2. Thành phần hóa học .............................................................................. 4
1.2. Đại cương khu hệ nấm vùng rễ ................................................................... 5
1.2.1. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae) ............................................ 5
1.2.2. Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae) ............................................. 6

1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) ............................ 7
1.2.4. Một số loại nấm rễ khác........................................................................ 8
1.2.5. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ................................................... 8
1.2.6. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ.......................... 10
1.3. Vai trò khu hệ nấm vùng rễ ...................................................................... 11
1.4. Nấm vùng rễ trên cây thuốc ...................................................................... 15
1.5. Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ.................................... 15
1.5.1. Ảnh hưởng của các yếu tố lý học ..................................................... 15
1.5.2. Sự tương quan giữa các nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ.17
1.6. Một số nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ ............................................... 17
1.6.1. Trên thế giới........................................................................................ 17
1.6.2. Việt Nam ............................................................................................. 21
1.7.

Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu các khu hệ vi sinh vật...... 23

1.7.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics.............................................. 23
1.7.2. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất...24
CHƯƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................... 26
iii


2.1. NGUYÊN LIỆU ...........................................................................................26
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 26
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................. 26
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .................................................................................26
2.1.5. Môi trường ............................................................................................. 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ..................................................................... 27
2.2.2. Phân lập bào tử AM ............................................................................ 28

2.2.3. Phân lập chủng nấm vùng rễ ............................................................... 28
2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM ......... 29
2.2.5. Hoạt tính sinh enzyme ngoại bào........................................................... 29
2.2.6. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................29
2.2.7. Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 30
2.2.8. Phương pháp Tách dòng gen thông qua vector pBT ............................. 31
2.2.9. Đọc và phân tích trình tự ....................................................................... 32
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................... 34
3.1. Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh .................................................... 34
3.2. Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến khu hệ nấm AM vùng rễ
Curcuma longa L. ............................................................................................ 35
3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM ...................................... 38
3.4. Phân lập các chủng nấm vùng rễ khác ................................................... 42
3.4.1. Phân lập mẫu rễ ................................................................................ 42
3.4.2. Phân lập mẫu đất vùng rễ ................................................................. 43
3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ........................................................... 45
CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 49
4.1. Kết Luận.................................................................................................... 49
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 50
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 56

iv


DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
STT

Từ viết tắt

Viết đầy đủ

1

AM

Endomycorrhizae

2

EM

Ectomycorrhizae

3

AEM

Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn

4

SEM

Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48].............................................. 3
Hình 1. 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47] ................................................................... 6
Hình 1. 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46]................................................................ 7
Hình 3. 1: Bào tử AM phân lập từ các mẫu đất N1t và N11t ............................. 35
Hình 3. 2: Khả năng sinh enzyme ngoại bào ...................................................... 47

vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2. 1: Trình tự mồi sử dụng cho định danh các chủng nấm ........................ 30
Bảng 2. 2: Trình tự mồi cho định danh các chủng nấm AM............................... 31
Bảng 3. 1: Số lượng bào tử AM tổng số trong 100g đất phân lập ...................... 34
Bảng 3. 2: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở
khoảng thời gian khác nhau. ............................................................................... 35
Bảng 3. 3: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở điều
kiện nitơ khác nhau. ............................................................................................ 40
Bảng 3. 4: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ rễ cây nghệ ............................ 44
Bảng 3. 5: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ cây nghệ ............. 46
Bảng 3. 6: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập

vii

47


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3. 1: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất ...................... 37
Biểu đồ 3. 2: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất vùng rễ ở điều
kiện bón nitơ khác nhau ...................................................................................... 41
Biểu đồ 3. 3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập ...47

viii


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

MỞ ĐẦU
Khu hệ nấm vùng rễ là quần hợp nấm - thực vật đóng vai trò quan trọng
trong quá trình phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái. Hơn 90%
các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vào
mối quan hệ này để tồn tại. Chúng phát triển bằng cách phát triển hệ sợi ra vùng
đất bao quanh rễ và lan dần ra xung quanh, nhờ đó làm tăng khả năng hấp thu
dinh dưỡng, nước của hệ rễ và đồng thời làm thay đổi cấu trúc đất theo chiều
hướng có lợi. Với tầm quan trọng và ý nghĩa thiết thực hình thức cộng sinh này
đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực
tiển sản xuất nông - lâm nghiệp ở nhiều nước trên toàn thế giới.
Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ
nghệ vàng chứa tinh dầu, đặc biệt curcumin – hoạt chất quý trong y dược. Nghệ
không chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm
thuốc, có nhiều loại nghệ nhưng nhưng nghệ vàng được sử dụng phổ biến trong
công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Nghệ vàng có vị đắng cay, mùi thơm
hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Nghệ vàng dùng
để chữa các bệnh: viêm loét dạ dày, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt
Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thư, tiểu đường, viêm gan B, C, kháng nấm,

chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [9]. Hoạt chất Curcumin
trong củ Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần chính của
Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa học là (1E,6E)-1,7-bis(4hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5dione. Curcumin có dạng bột
màu vàng được mệnh danh như một loại thần dược có khả năng phòng chống và
chữa được rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm,
chống oxy hóa, chống ung thư - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu
ở khối u, giúp tăng cường miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm, kháng virus. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhưng
khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ thì vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu. Vì vậy
1


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

đây là một hướng tiếp cận mới trong nghiên cứu toàn diện về cây nghệ trong
lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề
tài “Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcuma
longa L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng”, trong nghiên cứu này, chúng
tôi đã sử dụng kỹ thuật metagenomics để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu
tố dinh dưỡng tới khu hệ nấm vùng rễ, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ đa dạng khu hệ nấm rễ AM và đánh giá
một số chỉ tiêu sinh hóa.
Nội dung nghiên cứu:
 Khảo sát khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng: Phân lập và phân loại một
số chủng nấm vùng rễ nội cộng sinh và ngoại cộng sinh.
 Đánh giá ảnh hưởng hàm lượng nitơ, thời gian thu mẫu lên sự đa dạng
khu hệ nấm vùng rễ dụng kỹ thuật phân tích dữ liệu metagenomics.

2


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.)
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây Nghệ vàng còn có tên “Uất kim”, Khương hoàng. Tên khoa học là
Curcumin longa L, họ gừng (Zingiberaceae), thuộc loại cây cỏ dại cao 0,6 – 1m
thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi cắt ngang có màu vàng sẫm [9]. Cây
nghệ vàng được trồng phổ biến trong nước, tuy nhiên tập trung nhiều nhất ở
vùng Hưng Yên, Thanh Hóa, Bình Dương. Trên thế giới có nhiều ở Ấn Độ,
Indonesia, Campuchia, Lào, Trung Quốc và một số nhiệt đới khác.

Hình 1. 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48].
Nghệ vàng thuộc chi Curcuma, họ gừng. Chi này có 15 loài, trong đó ở
Việt Nam tìm thấy 14 loài. Theo các nghiên cứu gần đây, còn có nhiều loài khác
trong chi này có hoạt chất Curcumin như C.aromatica (nghệ trắng), C.zedoaria
( nghệ đen), lượng Curcumin cao nhất (cỡ 0,3%) phổ biến nhất ở Việt Nam cho
nên rất thuận lợi cho việc dùng làm nguyên liệu sản xuất Curcumin [9].

3


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1.2. Thành phần hóa học
Bằng các nghiên cứu khoa học đã thực hiện từ năm 1988 đến nay thành
phần hóa học của củ nghệ vàng đã được xác định là gồm các thành phần chính
như curcumin, tinh dầu, tinh bột, v.v. Sau đây là các thành phần cụ thể:


Chất màu curcumin 0,3% - 1%, tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan trong

nước, tan trong cồn, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục.
- Các chất màu vàng gọi chung là curcumin. Vào đầu thế kỉ XIX người ta
đã chiết được curcumin tinh thể không tan trong nước, tan trong cồn, ete, dầu
béo. Nhưng năm 1953 Srinivasan đã chứng minh bằng sắc kí cột silic rằng đó là
hỗn hợp:
- Curcumin chính thức (còn gọi là curcumin I) chiếm 60% đây là một
dixeton đối xứng không no có thể coi như là diferuloyl-metan (axit ferulic là
axit hydroxy-4-metoxy-3-xinamic).
- Curcumin II hay demetoxy-curcumin chiếm 24% và curcumin III hay bisdemetoxy-curcumin chiếm 14% trong đó 1 hay 2 hydroxyxinamic thay cho axit
ferulic. Nếu dùng sắc kí trên giấy sẽ thấy các chất curcumin khác nữa nhưng với
lượng rất nhỏ.
- Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết từ bột củ
nghệ sau khi đã cất lấy hết tinh dầu bằng benzen, sau đó thu hồi dung môi trong
áp lực giảm và kết tinh bằng cồn etylic cho tới khi có độ chảy không thay đổi và
một vết trên sắc kí lớp mỏng đã thu được 0,76 – 1,1% curcumin I tinh khiết, độ
chảy 182 -183°C. Nếu chọn củ nghệ thu vào tháng 1, tháng 2 có thể đạt tới
1,5% curcumin.


Tinh dầu 1 – 5% có màu vàng nhạt, thơm. Trong tinh dầu gồm có 25%

cacbua tecpenic, chủ yếu là zingiberen và 65% xeton sespuitecpenic, các chất
tumeron, curcumen C15H24 một cacbon không no.


Ngoài ra còn tinh bột, canxi oxalat, chất béo. Củ nghệ chứa 8 – 10%

nước, 6 – 8% chất vô cơ, 40 – 50% tinh bột nhựa.
4


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.2. Đại cương khu hệ nấm vùng rễ
Trong tự nhiên, giữa các sinh vật đều có mối quan hệ với nhau, ảnh hưởng
lẫn nhau tạo thành quần xã sinh vật. Trong đó, quan hệ cộng sinh là cả hai cùng
sống chung và cùng tồn tại. Khi mối quan hệ đó phát triển đến mức độ cao thì
hình thành một loại cộng sinh. Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm
trong đất với rễ của thực vật bậc cao, đây là mối quan hệ cộng sinh không thể
tách rời, ảnh hưởng đến nhau: Nấm không có rễ thì không thể tồn tại, cây không
có nấm thì sinh trưởng phát triển kém và chết. Sự cộng sinh giữa khu hệ nấm và
rễ cây mang lại lợi ích cho cả hai bên. Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên
được Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức – đưa ra vào năm 1885 để chỉ
mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [35]. Thuật ngữ này
bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ).
Người ta thường chia khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ thành 3 loại:
nẫm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh.

Ngoài ra, còn có một số loại khác.
1.2.1. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae)
Nấm rễ nội cộng sinh là nấm với thể sợi nấm xuyên qua các tế bào rễ,
thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo
lớp vỏ bao ngoài rễ. Đặc trưng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của
rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig. Dựa vào
kết cấu sợi nấm có vách ngăn và vòi hút, người ta chia nấm nội cộng sinh thành
2 loại:
- Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM)
- Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải
phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và
chùm (Arbuscular).

5


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

So với nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh rất ít loài. Năm 1989, chỉ
mới phát hiện 133 loài nấm rễ nội cộng sinh [39]. Con đường xâm nhập của
nấm rễ nội cộng sinh:
Giai đoạn 1: Thiết lập điểm tiếp xúc và phát triển dọc theo bề mặt của rễ.
Giai đoạn 2: Một hoặc nhiều sợi nấm hình thành chỗ phồng thâm nhập vào
tế bào biểu bì hoặc tế bào vỏ để vào rễ.

Hình 1. 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47]
1.2.2. Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae)
Nấm rễ ngoại cộng sinh là nấm có sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưa

hóa gỗ, không xuyên qua các tế bào mô rễ mà chỉ kéo dài giữa các tế bào. Đây
là một loại nấm hình thành mạng lưới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô
sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút.
Nấm rễ ngoại cộng sinh thường có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận
thấy bằng mắt thường). Đặc trưng cơ bản của chúng là:
 Trên bề mặt rễ dinh dưỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi
nấm đan chéo nhau.
 Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lưới do thể sợi nấm sinh
trưởng mà thành.
6


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

 Do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn, to, giòn và có màu sắc khác nhau,
tán rễ và biểu bì không có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợi nấm kéo
dài ra.
Guo Xiuzhen và cộng sự đã phát hiện 140 loài, danh sách các loài, chi, họ,
nấm ngoại cộng sinh thường hình thành thể quả trên mặt đất như nấm gan bò
(Boletus), nấm bao ngỗng (Amatina), nấm tán đỏ (Russula), nấm da
(Thelephora), nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu
(Poisolithus)…[11]. Con đường xâm nhập của nấm rễ ngoại cộng sinh:
Giai đoạn 1: Sợi nấm tiếp xúc, nhận biết và bám chặt các tế bào biểu bì rế
ở gần đỉnh rễ của rễ non tích cực phát triển.
Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này sự xâm nhập các sợi nấm hình thành lớp
phủ dày đặc trên bề mặt rễ.

Hình 1. 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46]

1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza)
Nấm rễ nội ngoại cộng sinh mang đặc trưng của 2 loại nội cộng sinh và
ngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý. Chúng thường có ở các rễ cây
thông (Pinaceae), cây Cáng lò (Betula alnoides), Đỗ quyên quả mọng (Arbutus)
và các cây thuộc họ Lan thủy tinh (Monotropaceae) [5].

7


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.2.4. Một số loại nấm rễ khác.
 Nấm rễ giả (Pseudo mycorrhiza): nấm rễ giả thường xuất hiện ở cây lá
kim, đặc biệt là các cây con vàng yếu, hoặc vườn ươm thiếu ánh sáng, có lúc
trên cây có phân bón nhiều. Loại này không có lưới Hartig và màng nấm nhưng
trong tế bào rễ vẫn có sợi nấm nội sinh. Có tác giả cho rằng sự hình thành sợi
nấm giả là do rễ nấm ngoại cộng sinh thoái hóa dần rồi do nấm gây bệnh xâm
nhiễm mà hình thành. Những nấm gây bệnh này không ảnh hưởng lớn đến cây.
 Nấm rễ ngoại vi (Peritrophic mycorrhiza): là nấm chỉ phủ một lớp lưới
sợi thưa ở bề mặt ngoài của rễ nhưng không xâm nhiễm vào rễ cây hoặc xâm
nhiễm ở mức nhẹ. Jan-Eriknylund cho rằng đó là giai đoạn đầu của lưới Hartig.
Theo Piche (1982) từ khi có lưới thưa đến khi có lưới Hartig chỉ mất 5-14 ngày.
Hiện tượng này không ảnh hưởng gì đến cây [16, 23].
1.2.5. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ
 Nấm rễ nội cộng sinh:
Cũng như nấm ngoại sinh, sự xâm nhiễm của nấm rễ nội cộng sinh đến từ
bào tử. Bào tử trong đất, trong điều kiện thích hợp nẩy mầm, sinh trưởng, mọc
ra ống mầm, rồi hình thành sợi nấm vách dày có đường kính 20–30 µm, còn sợi

nấm sau khi tiếp xúc hình thành sợi nấm vách mỏng, đường kính chỉ 2–7 µm,
chất kích thích sinh trưởng nấm rễ do bộ rễ tiết ra làm cho những sợi này hướng
về rễ cây, tiếp xúc nhanh với rễ cây. Sau khi tiếp xúc chúng hình thành vòi bám
tạo thành điểm xâm nhiễm và thành “dùi sợi nấm” chọc thủng vỏ rễ. Điểm xâm
nhập thường cách đuôi rễ 0,5 –1 cm, rồi liên tục hình thành nấm rễ nội cộng
sinh mới. Nói chung điểm xâm nhiễm nấm rễ nội cộng sinh là vỏ rễ cây hoặc
qua lông hút mà nhiễm vào.
Khả năng xâm nhập của nấm rễ nội cộng sinh phụ thuộc rất lớn vào mức
độ già, non của lông hút và loài cây chủ. Rễ cỏ 3 lá (Trifolim repens) thường
phải sau 3 tuần, bạch đàn và cam quýt thường phải sau 1 tháng mới bắt đầu xâm
8


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

nhiễm. Về tỷ lệ xâm nhiễm người ta thường lấy ngô làm đối chứng, sau 2 tuần
tỷ lệ xâm nhiễm là 23 – 27%.
Cơ chế sợi nấm xuyên qua vách tế bào tầng bỏ rễ đến nay vẫn chưa rõ. Có
tác giả cho rằng sợi nấm hình thành dùi, có tác giả lại cho rằng sợi nấm sản sinh
enzyme. Nói chung, sợi nấm không xuyên qua tế bào phân sinh, cũng không
qua rễ cây có nốt sần cây họ Đậu [27].
Thể sợi nấm sau khi xâm nhập vào rễ có thể sinh trưởng nhanh len lỏi giữa
các tế bào rồi mới vào trong tế bào, cũng có thể phát triển giữa các tế bào,
nhưng không hình thành lưới Hartig như nấm ngoại sinh.
Sợi nấm sau khi vào trong tế bào liền bao quanh lấy nguyên sinh chất,
phân nhánh hình thành vòi hút, nhưng màng tế bào vẫn bao lấy nhánh sợi nấm
và nguyên sinh chất. Cuộc sống sợi nấm trong tế bào rất ngắn chỉ mấy ngày đến
mười mấy ngày là bị phân giải, nhưng tế bào nhiễm nấm vẫn sống và bị nhánh

sợi nấm khác tạo ra sợi nhánh mới. Cho nên, trong tế bào ta phát hiện cả sợi
nhánh, cả xác sợi nấm.
Có trường hợp sợi nấm xâm nhập vào tầng vỏ ngoài không phân nhánh.
Chúng chỉ phân nhánh ở tầng giữa và tầng trong của vỏ cây. Nhánh sợi nấm
trong tế bào rất nhỏ chỉ 0,5 – 1,0µm. Chỗ phân nhánh là nơi trao đổi chất dinh
dưỡng giữa nấm và rễ. Bởi vì ở gốc nhánh sợi nấm người ta phát hiện nhiều hạt
đường và giọt dầu, và trong dịch bào phát hiện có muối photphorat và một số
hợp chất hòa tan. Nhánh phân ra bị phân giải lại cung cấp cho rễ cây sử dụng
[5].
 Nấm rễ ngoại cộng sinh:
Theo quan điểm bệnh lý học, quá trình hình thành nấm cộng sinh cũng như
quá trình xâm nhiễm, chia ra các giai đoạn: tiếp xúc, xâm nhập, ủ bệnh hay phát
triển và xuất hiện. Trong đất hình thành nhiều bào tử nấm, sợi nấm, xâm nhiễm
vào bộ rễ, làm cho rễ cây ngừng sinh trưởng, phình lên và hình thành bao nấm,
9


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

sau đó sợi nấm phân nhánh thành bao. Sợi nấm xâm nhiễm vào tầng vỏ của rễ
dinh dưỡng, giữa tế bào hình thành mạng lưới gọi là lưới Hartig [5].
Trong một số trường hợp chúng không theo trình tự như trên mà hình
thành ngay lưới Hartig rồi hình thành bào sợi nấm, hoặc có lúc không hình
thành cả 2 loại này. Phần lớn nấm rễ chỉ cộng sinh với rễ dinh dưỡng. Từ hạt
nảy mầm ra lá thật, cây con sinh trưởng nhờ dinh dưỡng được cung cấp từ hạt,
còn sau đó cây cần dinh dưỡng trong đất. Giai đoạn này nếu bộ rễ tiếp xúc với
nấm rễ, thì sự hình thành rễ - nấm rất nhanh và rất có lợi. Cho nên những năm
gần đây, nhiều người dùng phương pháp cấy nấm vào cùng lúc cây con mới nảy

mầm ra lá thật và có thể đạt được mục đích rễ - nấm hóa cây mầm.
1.2.6. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ
Do sự chọn lọc và tính thích nghi khác nhau, phạm vi tồn tại cây chủ khác
nhau. Một số loài nấm hình thành trên nhiều loài cây. Một số loài chỉ cộng sinh
trên một vài loài cây. Chengming (1995) chia những loài sống trên 5 loại cây
gồm 10 loài thuộc Amanita, Cantharenlus; những loài sống trên 2 – 3 loại cây
như Boletus, Ramaria; chỉ sống trên 1 loại cây có Suillus, Russula.
Có loài như Pisolithus tinctorius sống trên 72 loài cây, nấm mục rỗng mọc
đất (Cenococcum geophyllum) mọc trên 75 loài cây hạt trần.
Cùng một loài nấm nhưng chủng khác nhau cũng có tính chuyên hóa khác
nhau. Nấm Lactarius deliciosus có 3 kiểu chuyên hóa khác nhau (thông, vân
sam, lãnh sam). Có loài phạm vi cây chủ rất hẹp là nấm bụng màu trắng
(Hymenogaster albellus) chỉ có ở cây Bạch đàn.
Ngoài việc chọn loài cây thích hợp, các loài cây khác nhau có lúc cũng
chọn nấm thích hợp. Một số loài cây có thể dùng nhiều loài nấm khác nhau để
hình thành rễ nấm, thậm chí trên rễ của một loài cây có rất nhiều loài nấm cộng
sinh. Có nhiều loài cây như Thông 5 lá, Dương, Bạch đàn không có tính chuyên

10


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

hóa cao đối với nấm rễ. Bạch đàn Úc tự nhiên đã thu thập được 400 loài nấm
cộng sinh trên 81 chi Bạch đàn [3, 32].
Ngược lại, có nhiều loài nấm rễ có tính chuyên hóa rất mạnh, như nấm
ngoại cộng sinh trên họ cây Long não. Nếu như nấm cổ ngựa hạt đậu cấy lên
cây con giâm hom sẽ không hình thành rễ - nấm [3].

Nhiều nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan,
Srilanca đều mở rộng nghiên cứu về nấm rễ cộng sinh với họ cây long não –
loài cây tượng trưng cho rừng mưa nhiệt đới. Chủ yếu là nấm mỡ sáp (Laccaria
laccuta) và nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu. Thái
Lan có 68 loài. Calimantan có 60 loài, Philippin có 14 loài… [18]
Những loài cây khác nhau, các giai đoạn phát triển khác nhau, loài nấm
cộng sinh cũng không hoàn toàn như nhau, nói chung những cây rừng non
lượng rễ - nấm rất ít, rừng già trưởng thành số loài chiếm nhiều nhất, nhưng
rừng quá già lại rất ít. Tổ thành quần thể nấm rễ thường thay đổi nấm Boletus và
Amanita thay thế dần nấm cổ ngựa vỏ cứng và chiếm dần ưu thế [18]. Không
những thế chúng biểu hiện sự giao thoa nhau. Ví dụ trên cây Bạch đàn và cây
Dương, lúc cây còn non sự xuất hiện nấm rễ nội cộng sinh là chính, nhưng đến
tuổi lớn nấm ngoại sinh lại chiếm ưu thế, cuối cùng là nấm ngoại cộng sinh thay
thế. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do đặc tính sinh lý của cây ở các
giai đoạn khác nhau [3,7].
1.3. Vai trò khu hệ nấm vùng rễ
Nấm vùng rễ (đặc biệt nhóm nấm AM – arbuscular) là thể sống cộng sinh
bắt buộc, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của thực vật ở cạn, chúng có
vai trò thực tiễn trong nền kinh tế, khoa học và các chu trình vật chất, năng
lượng trong tự nhiên. Những hoạt động của nấm cũng như của thực vật có vai
trò hỗ trợ cho nhau. Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật dưới dạng đường
hexoses và các vitamin. Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang nấm được thực
11


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào. Tại các sợi nấm nội bào diễn ra

quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose, lipid…
cho hoạt động của nấm. Gần 20% cacbon do thực vật tổng hợp được chuyển
sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được nấm biến đổi và
dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng thêm nguồn hữu
cơ trong đất.


Tăng khả năng hấp thụ phốt pho và dinh dưỡng của cây chủ.
Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụ

các chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụ
dinh dưỡng lân (P) (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được
cung cấp nhờ nấm) [37]. Sợi nấm có thể lan rộng đến 8 cm quanh rễ và hấp thụ
chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh
dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần. Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm cao
gấp 6 lần so với qua các lông rễ [8].
Trong đất luôn có lượng phốt pho nhất định, những gốc phốt phát khó hoạt
động, do kết hợp với Fe, Na, Al cố định trong đất mà thành các photpho không tan,
cây không thể hấp thu chúng. Số photpho đó có đến 1/2 - 1/3 thậm chí đến 95 – 99%,
chỉ có một lượng rất ít photpho hòa tan được cây sử dụng. Lông hút của rễ chỉ hút một
ít photpho hòa tan quanh rễ và xuất hiện hiện tượng thiếu photpho giả [8].
Nấm rễ nội sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme Phosphatase chuyển
photpho không tan thành photpho hòa tan, cung cấp cho cây trồng. Hoạt tính
của enzyme tăng gấp mấy lần so với cây không có nấm rễ. Ngoài ra, nấm rễ có
thể sản sinh muối oxalat kết hợp với Fe, Al, muối P không tan trong đất, từ đó
mà làm tăng khả năng hút P của rễ cây [8].
 Hình thành chất kích thích sinh trưởng.
Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm có vai trò kích thích sinh trưởng
thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như auxins,
12

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

cytokinins, axit gibberellic và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ chống
lại các mầm bệnh từ trong đất [33, 37].
 Nâng cao sức chống chịu và thích nghi với môi trường của cây trồng
Nấm rễ tham gia vào nhiều hoạt động có lợi cho cây trồng giúp cây sinh
trường và phát triển tốt. Mạng lưới rộng lớn của rợi nấm rất quan trọng trong
việc hấp thụ và lưu giũ nước. Trong điều kiện hạn hán, nấm rễ thực vật chịu hạn
hán tốt hơn thực vật không có nấm rễ [45].
Sự cộng sinh của nấm rễ nội cộng sinh có thể làm tăng cường sinh trưởng
của cây con lên đến 400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điệu kiện khô
hạn và nghèo dinh dưỡng [14]. Ngoài ra, nấm rễ nội cộng sinh còn làm tăng khả
năng hấp thụ nước của rễ cây và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh [14].
Thực tế ở những loài gỗ lớn có nấm rễ nội cộng sinh cho thấy cây vẫn tồn
tại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây không có
cộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu. Kết quả nghiên cứu cũng
cho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh đạt ngang
với cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng bằng
một nửa. Những loài sống phụ thuộc vào nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu là ở
những nơi đất chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinh
dưỡng tồn tại nhiều ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờ
đến sự lan rộng của hệ sợi nấm [12].
 Cải thiện môi trường xung quanh
Nhiều nghiên cứu thăm dò điện tử chứng minh xung quanh rễ những cây
thông xuất hiện tầng kết dính rộng gấp nhiều lần so với cây thông không có nấm
rễ cộng sinh, tầng đó tạo ra khu trao đổi ion, bộ rễ tăng khả năng hấp thụ và vận

chuyển cây chủ, có lợi cho sinh trưởng phát triển của cây trồng.
Nấm rễ nội cộng sinh tạo ra các hợp chất hữu cơ Humic và “keo”
(polysaccharides ngoại bào) ràng buộc đất lại với nhau và cải thiện kết cấu đất. Kết
13


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

cấu đất ảnh hưởng hưởng tích cực đến sự tăng trưởng bằng cách thúc đẩy thông
khí, nước chuyển động vào đất, tăng trưởng gốc, phân phối dinh dưỡng [14].
Nấm rễ nội cộng sinh không chiếm tỷ lệ cao trong đất nhưng có vai trò
quan trọng trong việc điều chỉnh đặc tính sinh học của đất nhờ sự phân bổ rộng
khắp của hệ sợ nấm trong lớp đất tầng mặt. Nấm rễ nội cộng sinh có khả năng
hấp thụ trực tiếp các chất carbon do cây cố định và cấu thành đầu vào chính của
carbon và năng lượng trong đất, chúng phân phối lượng carbon này khắp cả khu
vực đất quanh rễ cây cho vi sinh vât sử dụng [43]. Lượng cacbon đáng kể được
vận chuyển bằng hệ sợi nấm từ cây này sang cây khác đã được xác định. Điều
này giúp giảm sự cạnh tranh giữa các loài khác nhau và góp phần vào tính ổn
định và đa dạng của hệ sinh thái.
Ngoài ra, trong đất có chứa ion Fe3+ ở dạng khó hòa tan. Nấm rễ nội công
sinh đã tiết ra một hợp chất đặc biệt có khả năng hấp thụ mạnh ion Fe3+ và biến
đổi thành dạng dễ tan giúp cây dễ dàng sử dụng [35].
AM tham gia vào biến đổi mối quan hệ đất - cây - nước, tăng cường sự
thích nghi của thực vật với các điều kiện bất lợi (khô hạn, nhiễm kim loại). Ở
những nơi có hàm lượng kim loại nặng cao, AM có vai trò khử độc môi trường
giúp cây sinh trưởng tốt. Bắt đầu từ cải thiện hấp thụ nước và các chất dinh
dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây sẽ dẫn tới tăng hiệu suất quang
hợp, sự vận chuyển chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất của cây. Cây sinh

trưởng nhanh, giảm bớt việc sử dụng phân bón hóa học (đôi khi lên tới một nửa
lượng dự kiến) dẫn tới tăng thu nhập cho nông dân. Kết quả thử nghiệm phân
bón sinh học mycorrhiza trên cây Asparagus đã chứng minh được điều đó, khi
những nông dân sử dụng lượng phân bón hóa học cùng với phân bón sinh học
mycorrhiza thì năng suất cây trồng được cải thiện hơn 50% và thu nhập của
nông dân tăng 61% so với khi sử dụng chỉ mỗi phân bón hóa [33, 37].
 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng

14


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Năm 1942 Davis phát hiện nấm rễ ngoại cộng sinh có thể làm giảm bớt
bệnh hại rễ. Các năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộng
sinh có thể giảm bệnh thối cổ rễ của thông xuống 25%, chúng không chỉ phòng
trừ bệnh mà còn xúc tiến sinh trưởng cây con, các bệnh tuyến trùng, bệnh mốc
sương, bệnh bướu rễ đều giảm đi rõ rệt [33].
1.4. Nấm vùng rễ trên cây thuốc
Tất cả các cây thuốc ở nhiều nước trên thế giới đều chứa những khu hệ
nấm rễ. Những khu hệ nấm rễ này có thể tổng hợp các chất giống như thuốc từ
cây chủ, hoặc tổng hợp nên một sản phẩm chứa một hay nhiều hợp chất có cấu
trúc hóa học gần giống như thế, tức là tương tự như thuốc từ cây thuốc mà nó
nội sinh. Ví dụ như trường hợp của các subglutinol do Fusarium subglutinans
tạo thành; nấm nội sinh vùng rễ này được phân lập từ một cây thuốc nổi tiếng
của Trung Quốc có đặc tính ức chế miễn dịch và khá tương đồng về mặt cấu
trúc với những hoạt chất đã biết của cây này [24].
1.5.

Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ
Theo Bạch Phương Lan (2004), khu hệ nấm vùng rễ có thể bị ảnh hưởng

bởi các yếu tố sau:
1.5.1. Ảnh hưởng của các yếu tố lý học
- Nhiệt độ:
Để phát triển mỗi một sinh vật phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất
định. Ngoài khoảng nhiệt độ đó, vi sinh vật sẽ bị hạn chế sự phát triển. Nhiệt độ
thường gây cho khu hệ nấm những chiều hướng sau: Đối với nhiệt độ thấp
thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển
hoá các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các hệ enzym, dẫn đến thay đổi khả
năng trao đổi chất của chúng, vì thế các thành phần trong khu hệ nấm vùng rễ
mất khả năng phát triển và sinh sản, nhiều trường hợp dẫn chết. Khả năng gây
chết từ từ chứ không xảy ra đột ngột như ở nhiệt độ cao. Đối với nhiệt độ cao
15