Kỹ thuật pha thuốc nhuộm giemsa và nhuộm tiêu bản máu tìm ký sinh trùng sốt rét

Kỹ thuật pha thuốc nhuộm giemsa và nhuộm tiêu bản máu tìm ký sinh trùng
sốt rét
1. CHUẨN BỊ PHƯƠNG TIỆN.
1.1. Dụng cụ:
- Ống đong các loại 10ml, 20ml.
- Pipet nhỏ giọt.
- Đũa thuỷ tinh.
- Giá nhuộm, giá cắm, các dụng cụ nhuộm.
- Đồng hồ.
1.2. Hoá chất:
- Thuốc nhuộm giemsa mẹ.
- Dung dịch đệm hoặc nước cất.
- Giấy thử pH,máy đo pH.
- Các dung dịch điều chỉnh pH : NaH2PO4 2%, KH2PO4 2%.
- Cồn tuyệt đối.
Cách pha dung dịch đệm (phosphat buffer solution):
- KH2PO4: 0,7g
- NaH2PO4: 1,0g
Cân 2 loại muối trên, mỗi loại vào 1 cốc chứa 150ml nước cất, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều
cho tan hết. Đổ 2 loại vào ống đong rồi cho thêm nước cất cho đủ 1000ml. Khuấy đều, kiểm
tra và điều chỉnh pH 7,2.
Cách pha dung dịch giemsa nhuộm:
Nhuộm thường quy: dung dịch giemsa 3- 4%: Pha 9,7 ml dung dịch đệm với 0,3ml giemsa
mẹ, khi nhuộm để 30- 45 phút.
Nhuộm nhanh: dung dịch giemsa 10%: Pha 9ml dung dịch đệm với 1ml giemsa mẹ. Khi
nhuộm để 15- 20 phút.
2. QUY TRÌNH KỸ THUẬT
- Cố định tiêu bản giọt đàn bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30o, tay phải cầm pipet
nhỏ 3- 4 giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản máu. Dùng pipet gạt ngang cho cồn
tràn phủ khắp diện tích máu, vừa gạt vừa nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của
tiêu bản máu. Cắm tiêu bản lên giá cho khô.

- Đối với tiêu bản giọt đặc quá dày hoặc bị bẩn, mốc thì phải dung giải bằng cách nhỏ nước
cất hoặc dung dịch giemsa 1% kín giọt máu, quan sát tới khi màu hồng của máu trôi đi, để
lại trên tiêu bản 1 giọt máu màu vàng nhạt là được.
- Pha dung dịch giemsa, tính đúng lượng giemsa cho vừa đủ để nhuộm.
- Xếp tiêu bản lên giá, nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm phủ kín diện tích máu, để thời gian
đúng với quy định.
- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, không đổ thuốc nhuộm trước, không để nước xối trực
tiếp vào giọt máu, để tiêu bản khô tự nhiên( muốn khô nhanh có thể dùng quạt không dùng
nhiệt độ).
- Soi kính hiển vi vật kính 100x, trả lời kết quả về ký sinh trùng sốt rét và nhận xét tiêu bản
nhuộm.


3. LƯU Ý KHI RỬA TIÊU BẢN:
- Không nên đổ thuốc nhuộm trước khi nhỏ nước rửa, như vậy thuốc nhuộm có thể bám lại
lên bề mặt lam máu.
- Tránh rửa tiêu bản giọt đặc dưới vòi nước chảy vì có thể làm bong giọt máu
4. NHẬN XÉT TIÊU BẢN NHUỘM TỐT:
Một tiêu bản nhuộm tốt khi xem dưới kính hiển vi thấy như sau:
- Tiêu bản sạch, không cặn, không bụi, không bị trôi.
- Hồng cầu bắt màu xanh tím hoặc xanh da trời, hoặc có màu hồng nhạt. Nếu có hồng cầu bị
nhiễm KST sốt rét, thấy hững hạt sắc tố và hạt đặc hiệu.
- Bạch cầu đơn nhân có màu xanh tím
- Tế bào chất của bạch cầu lympho có màu xanh lơ nhạt.
- Bạch cầu đa nhân trung tính có những hạt to nhỏ không đều màu xanh lơ tới đỏ.
KST sốt rét có hình thể rõ ràng: nhân bắt màu đỏ sẫm hoặc đỏ tía, nguyên sinh chất màu
xanh lơ, hạt sắc tố màu tím sẫm hoặc nâu đen ánh vàng.
5. BẢO QUẢN TIÊU BẢN:
Tiêu bản muốn lưu lại lâu dài cần bảo quản tôt. Khi soi xong phải lau sạch dầu trên tiêu bản
bằng cách úp tiêu bản lên giấy thấm để loại bớt dầu, sau đó nhỏ 1-2giọt xylen lên phía trên

giọt máu rồi dùng vải mềm mỏng sạh lau nhẹ cho sạch. Tiêu bản để chỗ không có ánh sáng,
tốt nhất là để trong hộp gỗ.

Giemsa nhuộm
Nguyên tắc và kết quả Reiter nhuộm nhuộm cơ bản giống nhau. Tuy nhiên, pháp luật về hạt
nhân và ký sinh trùng màu cấu trúc tốt hơn cho thấy rõ ràng hơn, trong khi các hạt tế bào chất và
trung tính được tô màu kém. Đưa vào tài khoản theo chiều dài của hai, có thể nhuộm phức tạp.
Cụ thể là để pha loãng dung dịch Giemsa thay vì đệm, theo Reiter nhuộm 10min thuốc nhuộm.,
Hoặc đầu tiên với Reiter nhuộm màu, và sau đó pha loãng Giemsa màu.
Giemsa nhuộm
Giemsa (Giemsa) nhuộm
Giemsa nhuộm bởi các thành phần eosin xanh. Nguyên tắc và kết quả Reiter nhuộm nhuộm cơ
bản giống nhau. Bạch cầu ái toan protein kiềm hạt, kết hợp với axit thuốc nhuộm eosin, nhuộm
màu hồng, được gọi là bạch cầu ái toan vật chất, protein hạt nhân và tế bào chất tế bào lympho
có tính axit và cơ bản thuốc nhuộm màu xanh methylen hoặc kết hợp xanh của thuốc nhuộm
màu tím và màu xanh là chất basophilic; hạt trung hòa là nhà nước đẳng điện và eosin và vẻ đẹp


có thể được kết hợp với màu xanh, nhuộm màu hoa cà, được gọi là các chất trung tính.

PH có một số ảnh hưởng đến các tế bào đã được nhuộm màu. Các tế bào của các thành phần
khác nhau không phải là protein, bởi vì điện lưỡng tính dựa trên protein, tính phí với các giải
pháp của VN có thể được, trong môi trường có tính axit trong việc tăng phí, dễ dàng để kết hợp
và eosin, màu đỏ, môi trường trong một phần ba năm tăng điện tích âm, dễ dàng để kết hợp vẻ
đẹp màu xanh hoặc xanh, nhuộm màu xanh. Vì vậy, nhuộm là rất nhạy cảm với nồng độ ion
hydro, nhuộm mảnh phong nha phải làm sạch, không ô nhiễm axit. Xu công thức đặc biệt chất
lỏng phải sử dụng methanol cao chất lượng, pha loãng với một số bộ đệm nhuộm, nước rửa phải
ở gần trung tính, hoặc có thể dẫn đến một loạt các tế bào phản ứng nhuộm màu bất thường, để
xác định khó khăn, thậm chí gây ra lỗi.
Chung điều hành kỹ thuật chuẩn bị xét nghiệm máu, nhuộm tế bào, kính hiển vi, chẩn đoán bệnh

máu; nhuộm xấu.
Nguyên tắc và kết quả nhuộm với Reiter nhuộm cơ bản giống nhau. Nhưng điều này pháp luật
hạt nhân và ký sinh trùng màu cấu trúc tốt hơn cho ít rõ ràng hơn, và các hạt trung hòa là tế bào
chất màu và người nghèo. Đưa vào tài khoản theo chiều dài của hai, có thể nhuộm phức tạp. Giải
pháp Giemsa được thay thế bằng bộ đệm pha loãng, thuốc nhuộm nhuộm bởi Reiter 10 phút.
Đầu tiên với Reiter nhuộm hoặc nhuộm, và sau đó pha loãng Giemsa màu. [1]
Reiter nhuộm
Reiter (Wright) nhuộm, thuốc nhuộm axit; eosin; thuốc nhuộm cơ bản; xanh methylene, hấp phụ,
PH của các tế bào là màu; methanol, Jim (Giemsa) nhuộm được sử dụng trong chất làm mềm
mùa xuân có chứa nhựa thông Axit béo và giàu vitamin, có thể được sử dụng để tăng tốc độ lưu
thông máu da, kích thích sự bài tiết tế bào trên khuôn mặt, cải thiện môi trường sinh lý da, giảm
thiệt hại khí hậu cho da.
(1) Reiter thuốc nhuộm bằng thuốc nhuộm axit và thuốc nhuộm cơ bản eosin xanh methylene
thành phần thuốc nhuộm của composite. Methylen thuốc nhuộm màu xanh như tetramethyl
thionine có trên o-quinone quinone và loại hai cấu trúc. Thường clorua, methylene chloride màu
xanh, tức là. Dễ dàng bị oxy hóa thành một màu xanh, hai, ba methyl thionine thuốc nhuộm thứ
khác. Màu xanh methylen thương mại đã được oxy hóa một phần để Azure. Yihong thường muối


natri. Cụ thể là eosin và Iraq trộn để tạo ra một dung dịch keo lyophobic eosin xanh methylene
mưa trung lập, tức là Reiter thuốc nhuộm.
(2) các tế bào nhuộm màu cả hấp phụ vật lý, mà còn là mối quan hệ hóa học của các thành phần
tế bào khác nhau khác nhau hóa học, các mối quan hệ của thuốc nhuộm khác nhau là không
giống nhau. Như vậy, giải pháp thuốc nhuộm sau khi nhuộm máu trên bảng cùng, bạn có thể
thấy một loạt các màu sắc, chẳng hạn như hemoglobin, hạt protein cơ bản bạch cầu ái toan, và
các axit thuốc nhuộm eosin kết quả, thuốc nhuộm màu hồng, được gọi là bạch cầu ái toan chất,
protein hạt nhân và tế bào chất tế bào lympho có tính axit và thuốc nhuộm methylene kết hợp cơ
bản màu xanh hoặc xanh của thuốc nhuộm màu tím và màu xanh, được gọi là chất basophilic;
hạt trung hòa là trạng thái đẳng điện và eosin màu xanh vẻ đẹp có thể kết hợp, nhuộm màu hoa
cà, được gọi là các chất trung tính.

(3) tác động PH trên nhuộm tế bào. Thành phần khác nhau của tế bào không protein, các giải
pháp điện lưỡng tính dựa trên protein với phụ trách PH có thể, trong môi trường axit của sự gia
tăng tiếp theo trong phí, dễ dàng kết hợp với eosin, màu đỏ, môi trường ba trong sự thiên vị tiêu
cực tăng phí, dễ dàng kết hợp với xanh methylene hoặc xanh, nhuộm màu xanh. Vì vậy, các tế
bào đã được nhuộm màu rất nhạy cảm với nồng độ ion hydro, nhuộm mảnh khá phải sạch,
không ô nhiễm axit. Xu công thức đặc biệt với giải pháp methanol có chất lượng cao phải được
pha loãng nhuộm đệm phải được sử dụng, rửa sạch nước tự nhiên gần như trung tính, hoặc có
thể dẫn đến một loạt các tế bào bất thường nhuộm phản ứng, kết quả xác định khó khăn, hoặc
thậm chí gây ra một lỗi. Thuốc nhuộm kiềm tươi chuẩn bị phải được lưu trữ ở nhiệt độ phòng
hoặc 37 ℃ thời gian nhất định, cho đến khi thuốc nhuộm trưởng thành, chủ yếu là màu xanh
dần dần chuyển thành xanh B trước khi sử dụng, còn thời gian lưu trữ, nhuộm hiệu quả hơn.
Máy kế toán Gilliland khác sử dụng tỷ lệ hấp thụ thuốc nhuộm đặc biệt như thông số kỹ thuật
chất lượng Xu.
rA đo như sau: Hãy Reiter nhuộm 15-25μl (xác định nồng độ thuốc nhuộm), thêm methanol
10ml pha loãng với methanol hợp rỗng ống gấp, bước sóng 650nm và 25nm tương ứng màu. Ra
= a650/a525 Bởi vì các nhà lãnh đạo Hoa Kỳ đội cho đỉnh hấp thụ màu xanh của 650nm, Yihong
hấp thụ đỉnh bước sóng 525nm;. Đỉnh B xanh mà còn cho độ hấp thụ 650nm A là khoảng một
nửa màu xanh methylen. Vì vậy, mới nhuộm rA với gần 2, với quá trình oxy hóa dần dần của
xanh methylene xanh B, RA cũng giảm tương ứng. RA giảm đến 1,3 ± 0,1 khi đã sẵn sàng để sử
dụng. Reiter thuốc nhuộm trong quá trình lưu trữ, phải được niêm phong và để ngăn chặn sự bốc
hơi và quá trình oxy hóa của methanol acid formic. Một số người đã lập luận trong công thức


bằng cách thêm glycerin 30ml, để ngăn chặn sự bốc hơi của methanol, có thể được nhuộm đồng
liên quan rõ ràng. Methanol phải được tinh khiết, như methanol, acetone nội dung quá lớn, thuốc
nhuộm axit, màu bạch cầu kém. [1]
Máu bôi nhọ
Chuẩn bị xét nghiệm máu và nhuộm màu của kính hiển vi lam máu là phương pháp cơ bản của
tế bào máu, ứng dụng lâm sàng là rất rộng, đặc biệt là cho việc chẩn đoán các bệnh về máu khác
nhau có giá trị lớn, ứng dụng phân tích tế bào máu mở rộng , xét nghiệm máu có thể được quan

sát như một kết quả của một phương pháp đơn giản để đánh giá bộ máy. Hơn 10 cao năng Trạm
quan sát lĩnh vực xét nghiệm lam máu ước tính sơ bộ số lượng tế bào bạch cầu và tiểu cầu trong
một số các tế bào này theo thứ tự như một kết quả của các tài liệu tham khảo kiểm soát chất
lượng công cụ phân tích. Nhưng tồn đọng chuẩn bị bôi nhọ người nghèo và nhuộm, các tế bào
thường làm cho nó khó khăn để xác định, và thậm chí dẫn đến kết luận sai. Ví dụ, các tế bào
máu chồng chéo lên nhau bộ phim thu nhỏ là quá dày, phim máu quá mỏng là tập trung hơn vào
sự phân bố không đồng đều tế bào bạch cầu cạnh; vết phản ứng có tính axit hoặc kiềm có thể
gây nhuộm tế bào bất thường. Do đó, độ dày chuẩn bị phù hợp, phân phối, bôi nhọ các bài kiểm
tra tốt máu huyết màu là một cải cách quan trọng của công nghệ.
Các cấu trúc bên trong của các tế bào đã được quan sát cho tóc, xác định các tế bào khác nhau và
những thay đổi bất thường trong máu dòng màu bôi nhọ phải nhạo báng. Nhiều phương pháp
nhuộm lam máu chủ yếu là Roche nhuộm tiến hóa đến. Reiter chung nhuộm. [1]