Nghiên cứu về liên cầu nhóm b ở các phụ nữ viêm âm đạo tại bệnh viện phụ sản trung ương năm 2016

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm âm đạo là một trong những bệnh phụ khoa thường gặp nhất ở phụ
nữ. Theo một số nghiên cứu của các tác giả trong nước, tỉ lệ viêm âm đạo ở
phụ nữ khoảng 20% và các thai phụ khoảng 50%. Viêm âm đạo nếu không
được điều trị đúng, kịp thời có thể gây viêm CTC, TC, viêm dính vịi trứng và
hậu quả là bệnh nhân có thể bị vơ sinh, chửa ngồi tử cung [1],[2],[3].
Liên cầu nhóm B cư trú ở đường tiêu hóa và niệu dục của người phụ
nữ, thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng trong hầu hết các trường
hợp. Ở phụ nữ có thai, liên cầu nhóm B có thể gây nhiễm trùng tiết niệu,
nhiễm khuẩn ối, viêm niêm mạc tử cung. Sự lây truyền dọc từ mẹ sang con có
thể xảy ra vào thời kỳ chuyển dạ hoặc vỡ ối. Sự lây nhiễm này là yếu tố nguy
cơ quan trọng gây nhiễm trùng sơ sinh trầm trọng với tỷ lệ tử vong tới 50%.
Một số nghiên cứu cho thấy con của những sản phụ bị nhiễm liên cầu nhóm B
có nguy cơ nhiễm khuẩn huyết sơ sinh cao gấp 25 lần so với con của những
sản phụ bình thường. Tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B đường sinh dục ở phụ nữ
khơng có thai và các thai phụ khơng có sự khác biệt [4],[5].
Liên cầu nhóm B được chia thành 10 type huyết thanh, trong đó các
type Ia, Ib, II, III, V chiếm tới 95%. Type III là type hay gây viêm màng não ở
trẻ sơ sinh và nhiễm khuẩn sơ sinh muộn nhất [6].
Năm 1996, Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh của Hoa Kỳ (CDC) và Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO) đã ban hành Khuyến cáo về Chiến lược điều trị dự
phịng nhiễm liên cầu nhóm B ở các thai phụ. Kết quả cho thấy có sự giảm
đáng kể của tần suất bệnh và tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng sơ sinh [7].
Do việc lạm dụng kháng sinh dự phịng, liên cầu nhóm B đã có hiện
tượng kháng lại một số thuốc kháng sinh như erythromycin, clindamycin...


2
Năm 2005, tỷ lệ kháng thuốc của liên cầu nhóm B với hai loại kháng sinh

này là 16,5%, tỷ lệ này đã tăng lên tới 69,9% trong năm 2008 [8],[9],[10].
Chẩn đốn viêm âm đạo do liên cầu nhóm B có ý nghĩa rất quan trọng
trong việc điều trị cho bệnh nhân và ngăn ngừa các nhiễm khuẩn sơ sinh trầm
trọng [11].
Ở Việt Nam, những khuyến cáo của WHO và CDC về vấn đề này chưa
được thực hiện đúng mức. Bệnh viện Phụ sản Trung ương là tuyến cao nhất
nhận khám và điều trị nhiều bệnh nhân nữ bị các bệnh liên quan đến nhiễm
trùng cơ quan sinh dục trong đó có viêm âm đạo. Hiện tại chưa có nghiên cứu
nào xác định tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B dịch âm đạo cũng như đánh giá
mức độ nhạy cảm với kháng sinh và xác định các type huyết thanh bằng PCR.
Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu về liên cầu nhóm B ở
các phụ nữ viêm âm đạo tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2016”
nhằm các mục tiêu:
1.

Xác định tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B ở các phụ nữ viêm âm
đạo tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2016.

2.

Xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng liên
cầu nhóm B phân lập được.

3.

Xác định các type huyết thanh của các chủng liên cầu nhóm B
bằng kỹ thuật PCR.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sinh lý học âm hộ, âm đạo, cổ tử cung
1.1.1. Dịch âm đạo
- Dịch âm đạo (thường gọi là khí hư) bao gồm các tế bào âm đạo bong
ra, chất tiết từ tuyến Bartholin, tuyến Skene, dịch nhầy ở cổ tử cung, dịch tiết
ra từ buồng tử cung và dịch thấm từ thành âm đạo.
- Bình thường, dịch âm đạo trong, hơi quánh, thay đổi theo chu kỳ kinh
nguyệt, vào thời kỳ phóng nỗn dịch âm đạo nhiều và loãng là dịch sinh lý.
1.1.2. Sinh hóa học
Dịch âm đạo chứa các phân tử carbonhydrat, glucose, protein, acid amin,
acid béo, các ion K+, Na+, Cl-. Bình thường hàm lượng acid lactic là 0,658 ±
0,118 mg/g dịch tiết âm đạo.
1.1.3. Độ pH âm đạo
Bình thường mơi trường âm đạo nghiêng về acid (pH từ 3,8 đến 4,6). Độ
pH âm đạo là do glycogen tích lũy trong tế bào biểu mơ chuyển thành acid
lactic khi có trực khuẩn Doderlin. Nồng độ Glycogen dự trữ trong tế bào chịu
ảnh hưởng của estrogen.
1.1.4. Hệ vi sinh bình thường trong âm đạo
Dịch âm đạo thường chứa 108 đến 1012 vi khuẩn/ml, gồm trực khuẩn
Doderlin chiếm khoảng 50-88%. Ở phụ nữ bình thường, hệ vi sinh vật có
trong âm đạo ở trong trạng thái cân bằng động. Mất sự cân bằng này có thể
dẫn tới tình trạng viêm nhiễm âm đạo.
Các tác nhân vi khuẩn cơ hội trong đó có liên cầu nhóm B sẽ gây bệnh
khi chúng hiện diện với số lượng cao và hoặc khi có đường vào.


4
Để tự bảo vệ, ngoài sự bền vững của biểu mơ vẩy, cịn có một số cơ chế khác:

+ pH âm đạo toan < 4,5 là môi trường không thuận lợi cho vi khuẩn gây
bệnh phát triển. Để có được môi trường âm đạo toan cần phải nhờ đến sự có
mặt bình thường của trực khuẩn Doderlin có sẵn trong âm đạo. Các vi khuẩn
này chuyển glycogen có trong tế bào biểu mô âm đạo thành acid lactic.
+ Niêm mạc âm đạo có dịch thấm từ mạng tĩnh mạch, bạch mạch, dịch
này có enzym kháng khuẩn.
+ Chất nhầy cổ tử cung cũng có các enzym kháng vi khuẩn như lysozym,
peroxidase, lactoferin.
Dịch sinh lý âm đạo không bao giờ gây ra các triệu chứng cơ năng như
kích thích, ngứa hay đau khi giao hợp, khơng có mùi, khơng chứa bạch cầu đa
nhân và khơng cần điều trị [12],[13].
1.2. Liên cầu nhóm B.
1.2.1. Sự cư trú của liên cầu nhóm B trong cơ thể người
Liên cầu nhóm B có thể được tìm thấy từ nhiều vị trí trên cơ thể người.
Đường tiêu hóa là nơi thường trú của tác nhân này và có vai trị như một kho
dự trữ để vi khuẩn phát tán đến các vị trí khác. Đường niệu dục là vị trí các
liên cầu nhóm B hay gây nhiễm trùng. Liên cầu nhóm B có mặt trong âm đạo
bắt đầu từ tuổi vị thành niên, sự cư trú này có thể là tạm thời hoặc mãn tính
hoặc có tính chất từng giai đoạn.
Tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B ở âm đạo phụ nữ có thể khác nhau tùy theo
chủng tộc, vị trí địa lý, độ tuổi, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo
của thai phụ và ở phụ nữ khơng có thai là như nhau [9]. Khoảng 10% đến
20% thai phụ có liên cầu nhóm B trong âm đạo - trực tràng (10% từ xét
nghiệm bệnh phẩm âm đạo, 27% từ xét nghiệm bệnh phẩm trực tràng) [14],
[15],[16].


5
Liên cầu nhóm B có thể khơng gây ra triệu chứng trên cá thể mang mầm
bệnh (người lành mang vi khuẩn). Đối với các thai phụ liên cầu nhóm B có

khả năng gây bệnh lý nguy hiểm như sảy thai tự nhiên, thai chết lưu, đẻ non,
nhiễm trùng ối, nhiễm trùng hậu sản... [17],[18],[19].
1.2.2. Đặc điểm sinh vật hóa học.
Liên cầu được Billroth mô tả lần đầu tiên vào năm 1874 từ mủ của các
tổn thương viêm quầng và các vết thương bị nhiễm trùng. Năm 1880, Pasteur
phân lập được liên cầu ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết. Sau đó Ogston
(1881), Rosenbach (1884) đã nghiên cứu kỹ về tổ chức bệnh lý.
Năm 1919, Brown đã xếp loại liên cầu theo những hình thái tan máu
khác nhau khi chúng phát triển trên mơi trường thạch máu:
Tan máu (β): Vịng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hồn tồn.
Hình thái tan máu này gặp chủ yếu ở liên cầu nhóm A, ngồi ra cịn có thể gặp
ở nhóm B, C, G, F.
Tan máu (α): Tan máu khơng hồn tồn, xung quanh khuẩn lạc có vịng
tan máu màu xanh, thường gặp liên cầu viridans.
Tan máu (γ ): Xung quanh khuẩn lạc khơng nhìn thấy vịng tan máu.
Hồng cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt, thường gặp đối với liên cầu
nhóm D (S. faecalis).
Năm 1930, Lancefield dựa vào kháng nguyên C (Carbohydrat) của vách
tế bào vi khuẩn để xếp liên cầu thành các nhóm A, B, C,... R.
1.2.2.1. Đặc điểm sinh học
- Hình thể và tính chất bắt màu.
Liên cầu nhóm B là những cầu khuẩn bắt màu Gram dương, xếp thành
chuỗi dài ngắn khác nhau, không di động, đôi khi có vỏ, đường kính 0,6 -1 um.


6

Hình 1.1. Hình ảnh liên cầu nhóm B [23]
- Tính chất ni cấy
Liên cầu nhóm B là những vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện. Mơi trường ni

cấy cần nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường,... Liên cầu nhóm B
phát triển thuận lợi trong khí trường có oxy hoặc có một phần CO2.
Nhiệt độ thích hợp là 370 C. Trên mơi trường lỏng, liên cầu nhóm B phát
triển hình thành các chuỗi đến khi đủ lớn thì tạo thành những hạt nhỏ hoặc
những hạt như bông rồi lắng xuống đáy ống. Vì vậy sau 24 giờ ni cấy, mơi
trường phía trên trong suốt, đáy ống có nhiều hạt lắng cặn.


7
Trên môi trường đặc, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ,
trịn, lồi, bóng, khơ, màu hơi xám.
Liên cầu nhóm B phát triển trên mơi trường thạch máu có thể gặp dạng
tan máu β.
- Tính chất hóa sinh học.
Liên cầu nhóm B khơng có men catalase, chúng có khả năng phát triển
trong mơi trường có ethyl- hydrocuprein.
+ Thử nghiệm Catalase (-)

Hình 1.2. Thử nghiệm Catalase (-) [23]
+ Thử nghiệm Hippurat (+)


8
Hình 1.3. Thử nghiệm Hippurat (+) [23]
- Cấu trúc kháng nguyên
Liên cầu nhóm B có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Sau đây là những
kháng nguyên quan trọng liên quan nhiều đến độc lực, cơ chế gây bệnh.
+ Kháng nguyên C đặc hiệu nhóm
Đây là kháng nguyên nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Dựa vào carbohydrat
C, Lancefield xếp liên cầu thành các nhóm từ A đến R.

+ Kháng nguyên M đặc hiệu type
Kháng nguyên M cũng nằm ở vách tế bào vi khuẩn.
Protein M nằm rải đều trên bề mặt của tế bào, gắn ở rìa của tế bào nên dễ
dàng kết hợp với kháng thể kháng protein M.
Protein M có khả năng chống lại thực bào vì vậy nó có liên quan trực
tiếp tới độc lực của liên cầu nhóm B. Kháng nguyên M bị thủy phân bởi men
trypsin hoặc pepsin.
+ Những kháng nguyên khác
Kháng nguyên T: Là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá hủy bởi
nhiệt độ ở pH acid.
Kháng nguyên P: Bản chất là nucleoprotein. Kháng nguyên này có phản
ứng chéo với nucleoprotein của tụ cầu.
Kháng nguyên R: Bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn.
Chúng có phản ứng chéo giữa các type huyết thanh hoặc giữa các nhóm.
Kháng nguyên R đề kháng với trypsin.
Dựa vào các kháng nguyên cacbonhydrat và polysaccharid, liên cầu
nhóm B được chia thành 10 type huyết thanh, trong đó các type Ia, Ib, II, III,


9
V chiếm tới 95%. Type III là type hay gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh và
nhiễm khuẩn sơ sinh muộn nhất.
- Các enzym và độc tố
+ Streptokinase: năm 1939 Tillett và Garner đã mô tả streptokinase gồm
2 phân tử nhỏ A và B.
Streptokinase là kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành
kháng thể antistreptokinase. Streptokinase có khả năng làm tan tơ huyết,
hoạt hóa xung quanh vùng tổn thương vì thế tạo điều kiện cho vi khuẩn lan
tràn nhanh.
+ Streptodornase; (Deoxyribonuclease) hoặc DNase: Tillett đã mô tả

enzym streptodornase có 4 loại A, B, C, D và 4 loại này là những kháng
nguyên khác nhau, có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể đặc
hiệu. Streptodornase có khả năng thủy phân ADN, do đó làm lỏng mủ, nhưng
nó chỉ có tác dụng khi có mặt của ion Mg.
+ Hyaluronidase: Thủy phân acid hyaluronic của tổ chức, tạo điều kiện
cho vi khuẩn lan tràn sâu rộng vào các mơ. Enzym này là một kháng ngun
có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể.
+ Proteinase: Có khả năng thủy phân protein và có khả năng kích thích
cơ thể hình thành kháng thể.
+ Dung huyết tố: Liên cầu tan máu β có khả năng hình thành hai loại
dung huyết tố:
Streptolysin O: Dễ bị mất hoạt tính bởi oxy, vì thế trên mơi trường ni
cấy, chúng gây tan máu ở phía sâu trong thạch. Độc tố này mang tất cả các
tính chất của một ngoại độc tố: đặc biệt có tính kháng ngun mạnh, vì thế có
khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể (antistreptolysin O).


10
Streptolysin S: Có vai trị tan máu ở bề mặt của môi trường nuôi cấy.
Độc tố này không bị mất hoạt tính bởi oxy, tính kháng ngun kém, vì vậy
khơng kích thích cơ thể hình thành kháng thể.
+ CAMP factor bản chất là một protein ngoại bào có ở liên cầu nhóm B.
1.2.2.2. Miễn dịch
Trong các loại kháng thể tạo thành, chỉ có kháng thể kháng protein M có
khả năng chống lại quá trình nhiễm trùng. Kháng thể này mang tính chất đặc
hiệu typ.
Kháng thể kháng streptolysin và kháng thể kháng streptokinase khơng có
khả năng bảo vệ cơ thể [20],[21],[22].
1.3. Các kỹ thuật xác định liên cầu nhóm B trong phịng xét nghiệm
1.3.1. Các kỹ thuật thơng thường xác định liên cầu nhóm B

1.3.1.1. Kỹ thuật nhuộm soi
Nhuộm Gram để sơ bộ đánh giá mức độ viêm, hình thể, cách sắp xếp, số
lượng vi khuẩn. Tiêu bản được làm từ bệnh phẩm/mẫu hoặc từ khuẩn lạc.
Trên tiêu bản nhuộm Gram: Vi khuẩn có hình cầu hoặc hình bầu dục,
đường kính 0,6 -1µm, bắt màu Gram Dương, xếp thành chuỗi, phân chia
trong mặt phẳng thẳng góc với trục của chuỗi.
Trong bệnh phẩm liên cầu thường đứng thành chuỗi ngắn một hoặc hai
đôi với nhau, trong môi trường nuôi cấy đặc biệt là trong canh thanh chuỗi sẽ
dài hơn [23].
1.3.1.2. Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Tùy loại bệnh phẩm lựa chọn mơi trường thích hợp. Các mơi trường để
ni cấy liên cầu nhóm B là thạch máu, BHI, thioglycolate... ủ 37 0C ở khí
trường bình thường hoặc có 5-10% CO2.


11
Tất cả các loại bệnh phẩm cần phải cấy ngay vào mơi trường ni cấy
thích hợp, chậm nhất khơng q 3 giờ. Trong trường hợp cần vận chuyển đi xa,
mẫu bệnh phẩm phải được bảo quản trong môi trường vận chuyển thích hợp.
Với bệnh phẩm máu và dịch não tủy, thường chỉ có một loại vi khuẩn
nên cấy vào mơi trường BHI hoặc các chai cấy máu có bán sẵn trên thị
trường, các hạt reagent sẽ hấp phụ kháng sinh tạo điều kiện cho vi khuẩn phát
triển. Vi khuẩn phát triển thay đổi nồng độ CO 2 trong chai cấy máu và máy sẽ
báo dương tính. Cấy chuyển sang mơi trường thạch máu, ủ 370C / 24 giờ.
Với các bệnh phẩm có thể nhiễm nhiều loại vi khuẩn nên cấy tăng sinh
vào môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và giàu chất dinh dưỡng
(môi trường selective LIM, môi trường selective Todd-Hewitt). Các kháng
sinh trong môi trường cấy (gentamycin và axit nalidixic, hoặc colistin và axit
nalidixic) giúp loại trừ những loại vi sinh vật không phải là liên cầu nhóm B.
Chất dinh dưỡng trong mơi trường cấy giúp liên cầu nhóm B sinh sản mạnh,

từ đó tăng khả năng phát hiện hơn so với cách cấy trực tiếp bệnh phẩm vào
môi trường thạch máu. Sau khi ủ môi trường tăng sinh ở 37 0C/ 24 giờ cấy
chuyển sang môi trường thạch máu, ủ 370C / 24 giờ.
Trên môi trường canh thang liên cầu phát triển thành các chuỗi lắng
xuống đáy ống tạo lắng cặn. Các chuỗi liên cầu nhuộm soi từ mơi trường canh
thang ln có xu hướng dài hơn so với trên thạch đĩa.
Trên thạch máu liên cầu nhóm B tạo các khuẩn lạc nhỏ đường kính
0,5mm, trịn, lồi, bóng, màu hơi xám. Phần lớn các chủng liên cầu nhóm B
gây tan máu hồn tồn trên thạch máu, có một số chủng gây tan máu khơng
hồn tồn, vịng tan huyết thường nhỏ hơn so với liên cầu nhóm A. Khuẩn lạc
nhỏ, màu xanh nhạt trên môi trường Uriselect.
Liên cầu nhóm B khơng sinh nha bào và khơng di động.


12
Khi ni cấy trong mơi trường kỵ khí liên cầu có kích thước nhỏ hơn so
với khi ni cấy trên mơi trường hiếu khí, đơi khi có các vi khuẩn chỉ bằng
một nửa so với bình thường.
- Thử nghiệm Catalase: liên cầu và tụ cầu có hình thể và kích thước tương
tự nhau. Catalase là enzym chỉ có ở tất cả các tụ cầu mà khơng có ở liên cầu.
Đây là đặc điểm quan trọng để chẩn đoán phân biệt tụ cầu và liên cầu.
Liên cầu nhóm B catalase âm tính.
- Thử nghiệm CAMP dương tính.
- Có thể định danh bằng các thanh định danh có bán sẵn trên thị trường
hoặc máy định danh và đều dựa trên các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn.
+ Định danh bằng Máy định danh Vitex II
Định danh trên máy định danh vi khuẩn là một trong các kỹ thuật định
danh tốt nhất hiện nay đang được áp dụng tại nhiều phịng xét nghiệm. Tuy
nhiên, kỹ thuật này cần phải có máy định danh và khơng phải tất cả các phịng
xét nghiệm đều được trang bị thiết bị này.

Sử dụng các khuẩn lạc thuần cấy qua đêm để định danh. Dùng que cấy lấy
3-5 khuẩn lạc thuần cho vào ống nước muối NaCl 4,5% tạo độ đục 5-6,3 McF.
Sử dụng thanh GP để định danh. Kết quả sẽ được máy báo sau khoảng 6 giờ.
Kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi khuẩn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn
đoán xác định liên cầu nhóm B. Tuy nhiên kỹ thuật này cho kết quả khá lâu
sau 48 đến 72 giờ.
Theo các khuyến cáo của CDC, WHO cấy bệnh phẩm từ âm đạo- trực tràng
là phương pháp tốt nhất để tầm soát liên cầu nhóm B ở các thai phụ. Các nghiên
cứu cho thấy lấy bệnh phẩm từ cả hai vị trí này cho kết quả phát hiện liên cầu
nhóm B cao hơn so với trường hợp chỉ lấy mẫu ở âm đạo hoặc trực tràng.
El Aila và cộng sự đã phân lập vi khuẩn từ hai vị trí lấy bệnh phẩm riêng
biệt (âm đạo và trực tràng) cho thấy: trong số 36 kết quả nuôi cấy dịch âm đạo-


13
trực tràng dương tính có 19 trường hợp dương tính ở cả hai vị trí, 9 trường hợp
cấy dịch âm đạo dương tính và 8 trường hợp cấy dương tính với mẫu bệnh phẩm
lấy từ trực tràng [24].
Theo một nghiên cứu của Daniels J và cộng sự năm 2009, khi cấy dịch âm
đạo-trực tràng làm tăng khả năng phát hiện liên cầu nhóm B lên tới 50% so với
khi cấy dịch âm đạo. Có thể sử dụng 1 hoặc 2 que tăm bơng cho 2 vị trí lấy
bệnh phẩm [25].
Các nghiên cứu đã được tiến hành để xác định độ nhạy và thời gian mọc
của liên cầu nhóm B trong từng môi trường khác nhau như thạch máu; môi
trường giàu dinh dưỡng; môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và
giàu chất dinh dưỡng (môi trường selective LIM, môi trường selective ToddHewitt). Chất dinh dưỡng trong môi trường giúp liên cầu nhóm B sinh sản
mạnh, từ đó tăng khả năng phát hiện của phương pháp cấy lên 50% so với
cách cấy trực tiếp bệnh phẩm vào môi trường thạch máu. Do đó, đã có khuyến
cáo sử dụng loại mơi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và giàu chất
dinh dưỡng cho mục đích tầm sốt liên cầu nhóm B [26].

Theo Votava M và cộng sự khi cấy dịch âm đạo - trực tràng trên thạch
máu cừu sau khi đã tăng sinh qua đêm bằng Todd- Hewitt, tỷ lệ phân lập được
liên cầu nhóm B lên tới 27,9% [27],[28].
1.3.1.3. Kỹ thuật ngưng kết
Gồm các thử nghiệm kết tụ (latex agglutination test - LAT)
- Nguyên lý:
Phần lớn các chủng liên cầu tan huyết β có các kháng nguyên (KN) đặc
hiệu nhóm được xác định bằng các kháng thể (KT) đặc hiệu nhóm. Các KN
này chính là các polysacharid có mặt ở thành tế bào vi khuẩn. Các hạt latex có
gắn KT đặc hiệu nhóm sẽ kết hợp với các KN tương ứng tạo thành các hạt
ngưng kết có thể nhìn thấy bằng mắt thường.


14
Có nhiều loại kit thương mại dựa trên nguyên lý phản ứng ngưng kết
như: Pastorex Strep Plus, Slidex Strep- Kit, Masta Strep... có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao [29].

Hình 1.4. Hình ảnh ngưng kết [23]
1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng nhiều trong
chẩn đoán và nghiên cứu liên cầu nhóm B. Các kỹ thuật này cho các kết
quả có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, kết quả xác định sẽ nhanh hơn.
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Mục đích và nguyên lý kỹ thuật PCR
Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển “phản
ứng chuỗi trùng hợp’’ gọi là Polymerase Chain Reaction.
- Mục đích phương pháp: phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong
ống nghiệm.
- Nguyên lý của phản ứng PCR: dựa trên sự sao chép theo cơ chế bán

bảo tồn của DNA trong tế bào. Một đoạn của phân tử DNA chuỗi kép được


15
tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng
hợp sợi DNA mới. Kỹ thuật PCR được thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu,
mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôn
theo chiều 5’ đến 3’ dưới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase. Mạch
DNA mới được hình thành với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên
sợi DNA khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng đoạn DNA cần tổng hợp sẽ
tăng gấp đơi.
Để thực hiện được phương pháp cần có: phân tử DNA ban đầu, hai đoạn
DNA mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầu
của phân tử DNA ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi. 4 loại Nu (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP), Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao;
enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus.
Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: ủ DNA ban đầu ở nhiệt độ cao: 92 - 950C để tách
DNA thành sợi đơn.
- Giai đoạn lai ghép: DNA mồi được lai ghép với sợi đơn của DNA ban
đầu. Thực hiện ở nhiệt độ: 50 - 520C.
- Giai đoạn tổng hợp DNA: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các
Nu vào sau DNA mồi dựa DNA ban đầu làm khuôn. Thực hiện ở nhiệt độ :
70 - 720C. Sau mỗi chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu tổng hợp nên hai
phân tử DNA, đến chu kỳ sau hai phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp nên
4 phân tử DNA.
Qua các giai đoạn như đã nêu ở trên, và cứ như vậy thực hiện tiếp các
chu kỳ sau. Sau n chu kỳ từ một phân tử DNA ban đầu sẽ có 2 n phân tử được
tạo thành.

16
Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhậy, từ một lượng DNA rất
ít ban đầu, với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau khi áp dụng phương pháp
PCR sẽ có một lượng lớn DNA đủ dùng cho những chẩn đoán, nghiên cứu.
Phương pháp PCR trong nhiều trường hợp đã thay thế cho phương pháp
Southern blotting vì phương pháp này thực hiện nhanh, cần lượng DNA ít.
1.3.2.2. Một số kỹ thuật PCR đặc biệt
Từ kỹ thuật PCR ban đầu, ngày nay người ta đã đề xuất nhiều cải biến để
nâng cao tính năng và hiệu quả của PCR.
Kỹ thuật realtime PCR
- Nguyên lý: Là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR có khả năng vừa phát
hiện vừa định lượng sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng (realtime
nghĩa là đúng thời điểm).
Đây là kỹ thuật gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng
phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA
được tạo thành.
Để định lượng vi khuẩn, tiến hành nhân đoạn đặc hiệu của vi khuẩn bằng
kỹ thuật PCR, đo tín hiệu phát huỳnh quang của các đoạn DNA được nhân
lên, xác định chu kỳ mà nồng độ DNA mới được tổng hợp vượt qua ngưỡng
(tương đương với thời gian thực mà nồng độ vi khuẩn vượt qua ngưỡng), nếu
chỉ ít chu kỳ nhân lên mà nồng độ DNA đã vượt qua ngưỡng thì chứng tỏ
nồng độ ban đầu lớn, và ngược lại, nếu phải qua nhiều chu kỳ nhân lên nồng
độ DNA mới vượt qua ngưỡng thì chứng tỏ nồng độ ban đầu ít. Để tính nồng
độ vi khuẩn người ta có các mẫu có nồng độ DNA đặc hiệu đã biết trước, so
sánh thời điểm qua ngưỡng của mẫu cần xác định với mẫu chứng có thể tính
ra nồng độ trong bệnh phẩm.


17

- Ưu điểm:
+ Kiểm soát được lượng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định được
lượng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại. Ở kỹ thuật
PCR thơng thường, gel agarose có nhiều hạn chế như độ phân giải thấp do
vậy định lượng thường không chính xác.
+ Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản
phẩm khuếch đại.
+ Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1-2 giờ trong khi PCR truyền thống
phải mất từ 3-5 giờ.
+ Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm.

Kỹ thuật PCR lồng (PCR nested)
- Nguyên lý: Là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi. Đoạn DNA được tổng hợp
bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho PCR lần thứ 2. Điều này
đã làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Nó chỉ nhân lên đoạn đặc hiệu
của DNA lần 1, đồng thời nó sẽ không nhân lên với những sản phẩm không
đặc hiệu của lần 1.
- Ưu điểm: Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy lên nhiều lần so với của phản
ứng PCR thông thường. Mặc dù sản phẩm PCR lần 1 không rõ song các
khn đích sẽ được khuếch đại lên nhiều lần nhờ PCR lồng tiếp theo. Còn các
sản phẩm phụ trong sản phẩm PCR lần 1 sẽ ít có khả năng gắn với mồi (của
PCR lồng lần 2) do vậy sẽ khơng được khuếch đại. Dùng cặp mồi đặc hiệu có
thể xác định được gene đặc trưng cho lồi, thậm chí một chủng vi sinh vật nào
đó. Đây là lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định type vi sinh vật trong
nghiên cứu dịch tễ học.


18
- Nhược điểm: Sản phẩm PCR lần 1 không đặc hiệu song lại đủ lớn và
có thể làm khn cho PCR lồng tiếp theo. Hiện tượng này dẫn đến các sản

phẩm gen không đặc hiệu cũng sẽ được khuếch đại và làm sai lệch kết quả.
Kỹ thuật Multiplex PCR
Multiplex PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử nhằm khuếch đại nhiều
trình tự DNA chỉ trong một phản ứng PCR. Trong q trình phân tích PCR đa
mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả
các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Như một phương
pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút
ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả.
Các kỹ thuật trên có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và cho kết quả nhanh sẽ
giúp cho cơng tác điều trị chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, do chi phí của thử
nghiệm và các trang thiết bị rất tốn kém nên thử nghiệm này có thể sẽ là một
phương pháp tầm soát trong tương lai [30],[31].
1.4. Các nghiên cứu về nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo
1.4.1. Các nghiên cứu về nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo ở Việt Nam
Liên cầu nhóm B chủ yếu cư trú ở âm đạo và trực tràng thường không
gây triệu chứng lâm sàng cho người mang mần bệnh, chúng có khả năng gây
bệnh khi có mặt với số lượng cao và hoặc khi có đường vào. Tỷ lệ gặp ở
người trưởng thành cao hơn ở trẻ em. Tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B ở phụ nữ
có thể khác nhau tùy theo chủng tộc, vị trí địa lý, độ tuổi. Tuy nhiên, tỷ lệ
nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo của thai phụ và ở phụ nữ khơng có thai là như
nhau. Đặc biệt tỷ lệ này còn thay đổi tùy thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm, mơi
trường nuôi cấy, kỹ thuật xác định...[15],[16],[17].
Vi khuẩn này gây ra các tác hại lớn trên thai kỳ như: viêm màng ối, rỉ ối,
nhiễm trùng ối, đẻ non, thai chết lưu, nhiễm khuẩn huyết sơ sinh, viêm màng
não ở trẻ sơ sinh, nhiễm trùng hậu sản...[4],[18].


19
Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm liên cầu
nhóm B ở âm đạo. Các nghiên cứu này khảo sát tình hình nhiễm khuẩn đường

sinh dục dưới, qua đó đánh giá tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B bằng phương
pháp ni cấy và định danh vi khuẩn thông thường [32],[33],[34].
Nguyễn Thị Ngọc Khanh và cộng sự (2001) đã nuôi cấy bệnh phẩm từ
âm đạo của 602 thai phụ sống tại Hà Nội đến khám thai tại Viện BVBMTSS
từ 1998-2000. Kết quả có 4,5% đối tượng nghiên cứu nhiễm liên cầu nhóm B
âm đạo [35],[36].
Nghiên cứu của Nguyễn Khoa Nam (2006) thực hiện trên 200 thai phụ
cho thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B là 17% [15].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Vĩnh Thành và Ngô Thị Kim Phụng
thực hiện tại Bệnh viện Từ Dũ năm 2007 với phương pháp cấy bệnh phẩm từ
âm đạo- trực tràng tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B là 18,1% [14].
Bùi Thị Thu Hương (2010) tiến hành cấy dịch âm đạo- trực tràng của các
thai phụ sinh non tại Bệnh viện Từ Dũ tỷ lệ dương tính với liên cầu nhóm B là
17,5% [18].
Theo Trần Quang Hiệp (2011) tại Bệnh viện Bạch Mai tỷ lệ cấy dịch âm
đạo phân lập được liên cầu nhóm B là 6,5% [37].
1.4.2. Các nghiên cứu về nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo trên thế giới
Đánh giá được mức độ nguy hiểm của liên cầu nhóm B có thể gây ra cho
thai phụ và sơ sinh, trên thế giới, từ những năm đầu thập niên 80 của thế kỷ
trước đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những mối liên
quan, những yếu tố nguy cơ cũng như kháng sinh thích hợp để điều trị cho các
thai phụ và sơ sinh nhiễm liên cầu nhóm B [38],[39].


20
El Aila và cộng sự trong nghiên cứu thực hiện vào năm 2009 đã cho thấy
tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B tại Bỉ là 24%. Shore EM (2008) nghiên cứu trên
2878 thai phụ đã chỉ ra tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B là 22% [24],[39].
Lambiase A và cộng sự (2005-2008) nhận thấy liên cầu nhóm B đã có
hiện tượng kháng lại một số thuốc kháng sinh như erythromycin và

clindamycin. Năm 2005 tỷ lệ kháng thuốc của liên cầu nhóm B với hai loại
kháng sinh này là 16,5%, tỷ lệ này đã tăng lên tới 69,9% trong năm 2008. Tỷ
lệ kháng tetracycline tương đối cao mặc dù các nghiên cứu hàng năm trước đó
chưa có thơng báo. Các chủng liên cầu nhóm B vẫn nhạy cảm tốt với
penicilline (100%) và ampicillin [9].
Theo nghiên cứu của Shore EM (2008) 100% các chủng liên cầu nhóm B
phân lập được nhạy cảm với penicillin. Tỷ lệ kháng đơn thuần với
erythromycin 22%, clindamycin 19%, tỷ lệ kháng với cả 2 kháng sinh này là
18% [39].
Trong số các type huyết thanh được biết đến, type III hay gặp nhất và là
type có tỷ lệ kháng fluoroquinolones cao nhất, tỷ lệ đa kháng kháng sinh cao.
Type V có tỷ lệ kháng erythromycin cao hơn các type khác [40].
- Liên cầu nhóm B hiện diện ở âm đạo vào bất kỳ thời điểm nào của thai
kỳ, nhưng sự lây nhiễm truyền dọc từ mẹ sang con chỉ xảy ra khi chuyển dạ
bắt đầu khởi phát và màng ối bị vỡ. Cơ chế của sự lây nhiễm là do thai nhi
hoặc trẻ sơ sinh hít, nuốt phải dịch ối hoặc dịch âm đạo nhiễm liên cầu nhóm
B hoặc bị xâm nhiễm qua những vết thương sang chấn trong đẻ. Tỷ lệ trẻ sơ
sinh bị phát hiện nhiễm liên cầu nhóm B từ những người mẹ có mang liên cầu
nhóm B là 50%, chỉ có 1-2% trong số này có biểu hiện lâm sàng. Khoảng
80% trường hợp nhiễm trùng sơ sinh sớm có triệu chứng trong 3 ngày đầu sau
sinh. Liên cầu nhóm B có thể gây viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm


21
phổi sơ sinh. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, con của những sản phụ bị
nhiễm liên cầu nhóm B có nguy cơ nhiễm khuẩn huyết sơ sinh cao gấp 25 lần
so với con của những sản phụ bình thường [5].


22

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các phụ nữ đến khám tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương có đủ
tiêu chuẩn sẽ được chọn vào mẫu nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn
Những phụ nữ đến khám tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương trong thời gian
nghiên cứu có các tiêu chuẩn sau:
- Được bác sỹ khám lâm sàng, chẩn đoán viêm âm đạo và được chỉ định
cấy dịch âm đạo.
- Không sử dụng thuốc kháng sinh, đặt thuốc âm đạo trong vòng 48 giờ
trước khi đến khám.
- Đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ
- Các trường hợp có sử dụng kháng sinh và đặt thuốc âm đạo trong vòng 48 giờ.
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Vi sinh Bệnh viện Phụ sản Trung
ương và Khoa xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
2.1.5. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2016 đến khi đủ số mẫu nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Đây là nghiên cứu mô tả, cắt ngang.


23
2.2.2. Cỡ mẫu

Được tính theo cơng thức:

n = Z(12 −α/2)

p (1 − p )
d2

n: cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu
Z: trị số giới hạn của độ tin cậy
2
Với độ tin cậy 95%, Z(1−α/2) = 1,96

Chọn d = 0,05.
p: tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B dịch âm đạo.
Dự kiến p= 15%
Cỡ mẫu n = 196.
Số đối tượng đủ tiêu chuẩn được nghiên cứu là 385 người.
Chúng tôi lấy n= 385
2.2.3. Nội dung nghiên cứu, các biến số nghiên cứu
1. Tuổi bệnh nhân: Tuổi bệnh nhân được phân thành các nhóm:
- Dưới 20 tuổi
- 20 đến 24 tuổi
- 25 đến 29 tuổi
- 30 đến 34 tuổi
- 35 đến 39 tuổi
- 40 đến 44 tuổi
- ≥ 45 tuổi
2. Nơi ở của bệnh nhân: được chia thành các nhóm
- Nội thành Hà Nội
- Ngoại thành Hà Nội.

- Các tỉnh khác
3. Nghề nghiệp: được chia thành các nhóm
- Cán bộ viên chức
- Cơng nhân
- Nông dân
- Nội trợ
- Khác


24
4. Trình độ học vấn: được chia thành các nhóm
- Đại học và sau đại học
- Trung cấp, cao đẳng
- Trung học phổ thông
- Trung học cơ sở và tiểu học
2.3. Vật liệu
2.3.1. Thiết bị
+ Máy móc
- Tủ ấm 370C (Jouan của Pháp).
- Kính hiển vi (Olympus của Nhật).
- Máy định danh vi khuẩn Vitex II (Biomerieux của Pháp).
- Máy PCR (C1000 Thermal Cycler hãng Biorad của Mỹ).
- Máy vortex (BR-2000 Vortexer hãng Biorad của Mỹ).
- Máy ủ nhiệt (Techne-Dr Blook).
- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR system 9700 AB (Applied
Biosystem, Mỹ).
- Máy ly tâm (hãng Eppendorf của Đức).
- Máy ly tâm lạnh (Tomy-Seiko MX-301 của Nhật).
- Bộ điện di ngang (Horizond 58 hãng Gibco-BRL của Mỹ).
- Máy soi và chụp gel (Geldoc hãng Biorad Mỹ).

+ Dụng cụ nuôi cấy phân lập vi khuẩn
- Tăm bông cứng vô trùng đựng trong ống nghiệm vơ trùng.
- Lam kính sạch, ống nghiệm vô trùng, giá để mẫu.
- Que cấy, đèn cồn
+ Dụng cụ cho PCR
- Các loại pippet (10µl, 200µl, 1000µl)
- Các loại đầu côn vô trùng tương ứng
- Ống eppendorf vơ trùng 1,5 ml
- Tube chạy PCR loại ≥ 50µl


25
2.3.2. Hóa chất
2.3.2.1. Vật liệu hóa chất dùng cho ni cấy định danh liên cầu nhóm B và
làm kháng sinh đồ
- Bộ thuốc nhuộm Gram.
- Các môi trường nuôi cấy và làm kháng sinh đồ theo thường qui: thạch
máu, thạch Mueller Hinton, Todd-Hewitt.
- Các khoanh giấy kháng sinh của hãng MAST DIAGNOSTICS:
penicillin 10 units, ampicillin 10µg, cefotaxim 30µg, erythromycin 15µg,
clindamycin 2µg, vancomycin 30µg, levofloxacin 5µg.
- Bộ sinh phẩm định danh liên cầu.
- Thanh định danh GP 67 .
- Chủng vi khuẩn S. aureus ATCC 25923.
- Dung dịch H2O2 và các vật liệu cần thiết khác.
2.3.2.2. Vật liệu hóa chất dùng cho tách chiết DNA và định type liên cầu
nhóm B
+ Vật liệu dùng cho tách chiết DNA
- Kít tách chiết DNA: (QIAamp DNA Mini Kit hãng QIAGEN - Đức).
- Ethanol 100% (Merk - Đức)

+ Vật liệu PCR dùng cho xác định các type huyết thanh của các
chủng liên cầu nhóm B
- PCR Master mix của hãng QIAGEN.
- Dung dịch đệm TAE - Tris Acetate EDTA (Invitrogen - Mỹ).
- Cồn 96-100 % (Meck - Đức).
- PCR purification Kit (Norgen - Canada).
- Agarose dùng trong điện di phát hiện ADN (Invitrogen - Mỹ).
- GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000 x dùng để nhuộm ADN
(Biotium - Canada).
- Dung dịch đệm TE - Tris EDTA (Invitrogen - Mỹ).
- PBS - Phosphate Buffer Saline (First Base - Singapore).
- Nước cất vô trùng (Invitrogen - Mỹ).