BÀI GIẢNG THÍ NGHIỆM VỆ SINH THỰC PHẨM

.

Pha dung dịch chất chỉ thị : Hòa tan 8g bromthymol blue vào hỗn hợp 250 ml ethanol
90% và 250 ml nước cất
Tiệt trùng môi trường ở 121 oC trong thời gian 15 phút
8. Môi trường DRBC _ Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol
Thành phần

Số lượng

Đơn vị

Glucose
Peptone
K2HPO4
MgSO4
Rose bengal (5%w/v)
Dichloran (0,2% w/v trong ethanol)
Chloramphenicol*
Agar
Nước cất
pH cuối (25oC)

10
5
1
0,5
0,5
1
0,1
15

1000
7,0 ± 0,2

g
g
g
g
ml
ml
g
g
ml

* Chloramphenicol để nguội đến 50 oC mới bổ sung vào
Tiệt trùng môi trường ở 121 oC trong thời gian 15 phút
Chú ý :
-

Môi trường có chứa dichloran và rose bengal nên ức chế sự kéo dài khuẩn ty
nấm mốc mọc nhanh , vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm.

-

Rose bengal là chất dễ bị phân hủy trong ánh sáng, nên cần giữ môi trường
trong tối.

Trang { PAGE }


.

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút
5. Môi trường thạch nấm men – nấm sợi (Yeast Mould Agar)
Thành phần
Bột chiết nấm men
Bột chiết malt
Peptone
Dextrose
Agar
Nước cất
pH cuối (25oC)

Số lượng

Đơn vị

3
3
5
10
20
1000
6,2 ± 0,2

g
g
g
g
ml
ml

* Đường có thể là glucose, saccharose hoặc lactose

Tiệt trùng môi trường ở 121 oC trong thời gian 15 phút
6. Môi trường MRS (Man, Rogosa, Sharpe)
Thành phần

Số lượng

Đơn vị

Peptone
Bột Lab-Lemco
Bột chiết nấm men
Glucose
Sorbitan mono-oleate
K2HPO4
Sodium acetate 3H20
Triammonium citrate
MgSO4.7H20
MgSO4.4H20
Agar
Nước cất
pH cuối (25oC)

10
8
4
20
1

2
5
2
0,2
0,05
10
1000
6,2 ± 0,2

g
g
g
g
ml
g
g
g
g
g
g
ml

Tiệt trùng môi trường ở 121 oC trong thời gian 15 phút
7. Môi trường lên men
Thành phần
Đường*
Peptone
Bột chiết nấm men
Dd chất chỉ thị
Nước cất

pH cuối (25oC)

Số lượng

Đơn vị

5
10
5
2
1000
7,0 ± 0,2

g
g
g
ml
ml

* Đường có thể là glucose, saccharose hoặc lactose

Trang { PAGE }


.

PHỤ LỤC
1. Môi trường Cao thịt – Pepton
Thành phần
Cao thịt

Pepton
NaCl
Agar
Nước cất
pH cuối

Số lượng

Đơn vị

5
10
5
15
1000
7,0 ± 0,2

g
g
g
g
ml

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút
2. Môi trường Czapek – Dox
Thành phần
NaNO3

K2HPO4
MgSO4

KCl
FeSO4
Saccharose
Agar
Nước cất
pH cuối (25oC)

Số lượng

Đơn vị

2,0
1,0
0,5
0,5
0,1
30
15
1000
7,3 ± 0,2

g
g
g
g
g
g
g
ml

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút
3. Môi trường PDA _Potato Dextrose Agar
Thành phần
Khoai tây*
Dextrose
Agar
Nước cất
pH cuối (25oC)

Số lượng

Đơn vị

200
20
20
1000
5,6 ± 0,2

g
g
g
ml

* Dịch chiết từ 200 g khoai tây có thể thay thế bằng 4 g bột chiết khoai tây

Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút
4. Dung dịch pha loãng SPW _ Salt Pepton Water
Thành phần
NaCl

Pepton
Nước cất

Số lượng

Đơn vị

85
10
1000

g
g
ml

Trang { PAGE }


.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm, nước và
mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2005
2. Lê Văn Việt Mẫn - Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB
Đại học Quốc gia Tp. HCM, 2006
3. Nguyễn Thành Đạt – Mai Thị Hằng, Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, 2000
4. Giáo trình thực tập Vi sinh năm IV, Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học tự
nhiên Tp. HCM, năm học 2000 – 2001
5. Adams M.R., Moss M.O. Food Microbiology 3rd ed. – Chapter 10 Method for the
microbiological examination of foods, RSC, 2008

Trang { PAGE }


.

6.5.

Yêu cầu viết báo cáo

-

Nêu cơ chế lên men ethanol

-

Quy trình các bước tiến hành lên men sữa chua

-

Giải thích các thông số trong từng quá trình.

6.6.

Tiêu chí đánh giá
Bảng 6.2. Tiêu chí đánh giá bài 6

STT

Tiêu chí đánh giá

1

Ý thức tổ chức, kỷ luật

1

2

An toàn, vệ sinh

1

3

Thời gian

1

4

Chuẩn bị

1

5

Thao tác :

6

7

-

Pha chế môi trường lên men đúng

1,0

-

Kiểm tra các thông số biến đổi trong quá
trình lên men (VD : pH)

1,0

Kết quả:
- Xác định hàm lượng acid lactic tạo ra trong
quá trình lên men hoặc gián tiếp quá sự giảm
giá trị pH.
- Thảo luận kết quả

1,0

1,0

Báo cáo
- Hình thức trình bày báo cáo
- Nội dung bài báo cáo đầy đủ yêu cầu đề ra
TỔNG

6.7.

Điểm

0,5
1,5
10

Câu hỏi thảo luận

1. Mục tiêu của việc đo hàm lượng chất khô trong dịch sữa nguyên liệu?
2. Tại sao phải ủ dịch lên men ở 40 – 43 oC?
3. Nếu thay đổi nhiệt độ lên men thì chất lượng sản phẩm có thay đổi không và thông
số nào sẽ thay đổi theo?
4. Ngoài định tính acid lactic sinh ra trong quá trình lên men sữa chua bằng pH kế,
người ta có thể sử dụng phương pháp nào để chứng minh acid lactic sinh ra một
cách chính xác ?

Trang { PAGE }


.

6.3.

Các bước tiến hành

Quy trình công nghệ lên men sữa chua:
Sữa tươi

Làm ấm
Phụ gia

Phối chế

Sữa bột

Cấy men

Men giống

Rót hộp

Hũ nhựa

Ủ
Bảo quản
Sản phẩm
Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu và các phụ liệu.
Bước 2. Xác định hàm lượng chất khô của sữa bằng Brix kế.
Bước 3. Tính toán hàm lượng các chất phụ gia và sữa bột cần phối chế (điều chỉnh độ
Brix > 16% và thêm các phụ gia khác ...)
Bước 3. Duy trì nhiệt độ canh trường ở 40 – 45 oC.
Bước 4. Cấy men vào canh trường theo tỷ lệ 10% men giống.
Bước 5. Sau khi khuấy đều men vào sữa, xác định pH điểm đầu và rót dịch sữa vào hũ
nhựa
Bước 5. Ủ ở 40o C trong 5 – 6 giờ.
Bước 6. Sau 6 giờ lên men, xác định pH điểm cuối và bảo quản sữa chua trong tủ lạnh ở
2 – 4 oC
6.4.

Kết quả

-

Đánh giá các thông số kiểm soát quá trình lên men (pH, nhiệt độ (oC)…)

-

Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men

Trang { PAGE }


.

các sản phẩm phụ diacetin, ester và các acid hữu cơ bay hơi nên sữa chua bổ dưỡng và có
hương vị thơm ngon.
Có thể sản xuất bằng phương pháp lên men tự nhiện (nhờ hệ VSV nhiễm tự nhiên) và
phương pháp cấy giống thuần khiết.
6.2.

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Bảng 6.1. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 6

A. HÓA CHẤT:
STT
TÊN HÓA CHẤT

QUY CÁCH

GHI CHÚ

SL/ĐVT

1

Bông thấm nước

2

Cồn

3

Sữa đặc /sữa tươi

1 hộp

2 tổ

4

Sữa chua

1 hộp

1 tổ

5

Gelatin

1,0 kg
95 0+ 700

Lưu từ đầu

2 + 3 lít

Tinh khiết

60 g

QUY CÁCH

SL/ĐVT

100ml
250ml

8cm x 15cm

2 cái
1 cái
1 cái
1 cái
10 cái
5 cái
1 cái

150 g

QUY CÁCH

SL/ĐVT

10-30%

1 cái
1 cái
1 cái
10 cái
2 cái
2 cái

1 lớp

B. DỤNG CỤ :
STT

1
2
3
4
5
6
7
8

TÊN DỤNG CỤ

Cốc thủy tinh
Cốc thủy tinh
Đũa thủy tinh
Nồi vừa
Cốc thủy tinh
Nhiệt kế
Đồ khui sữa hộp
Túi nylon nhỏ

1000ml
0 0-1000C

GHI CHÚ

1 tổ
1 tổ
1 tổ
1 tổ
1 lớp
1 lớp
1 lớp
SV chuẩn bị

C. THIẾT BỊ :
STT

1
2
3

4
5
6

TÊN THIẾT BỊ

Nồi hấp tiệt trùng
Tủ ấm
Tủ lạnh
Bếp điện
pH kế
Brix kế

Trang { PAGE }

GHI CHÚ

1 lớp
1 lớp
1 lớp
1 lớp
1 lớp
1 lớp


.

BÀI 6.

LÊN MEN LACTIC

Mục tiêu:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
-

Thực hiện quá trình lên men lactic

-

Nhận biết dấu hiệu lên men lactic

6.1. Cơ sở lý thuyết
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường với sự tích lũy acid lactic trong môi
trường. Con người đã biết ứng dụng hiện tượng này từ lâu để chế biến các loại thức ăn
chua (sữa chua, muối dưa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc hay sản xuất acid lactic
phục vụ cho ngành công nghiệp thuộc da, dệt nhuộm, công nghiệp thực phẩm…
Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù các loại vi khuẩn
này không đồng nhất với nhau về mặt hình thái (hình que ngắn, dài, hình cầu), song về
mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất. Tất cả đều là những vi khuẩn Gram dương,
không tạo bào tử và hầu hết không di động. Thu nhận năng lượng từ việc phân giải
hydrate carbon và tiết ra acid lactic.
6.1.1. Cơ chế lên men lactic
Khi thủy phân đường trong điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang
pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+
NADH

C6H12O6

NAD+

CH3COCOOH

CH3 - CHOH - COOH + Q

Căn cứ vào sản phẩm sinh ra, quá trình lên men lactic được chia làm 2 kiểu:
Lên men lactic đồng hình
Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đường tạo thành sản phẩm chủ yếu là acid
lactic (95%).
VSV lên men lactic đồng hình:
-

Giống Streptococcus: S. cremoris, S. lactis, S. thermophillus…

-

Giống Lactobacillus: L. bulgaricus, L. acidophillus, L. platarum…

Lên men lactic dị hình
Khi lên men các vi khuẩn chỉ tạo ra 60% acid lactic phần còn lại là acid acetic, rượu
ethanol, glycerin và một số sản phẩm khác.
VSV lên men lactic dị hình: Lactobacillus brasicar fermentatae, Leuconostoc
mesenteroides, Escherichia coli…
6.1.2. Lên men sữa chua
Sữa chua là loại sản phẩm lên men từ sữa tươi. Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao và có
hương vị thơm ngon nên được nhiều người ưa thích. Ở nhiều quốc gia, sữa chua là món
ăn hàng ngày của nhân dân. Vì sữa chua có hàm lượng acid lactic cao nên protein sữa
không tiếp tục bị phân giải nữa, mà bị đông tụ. Bên cạnh đó, quá trình lên men còn tạo ra
Trang { PAGE }

.

5.4.

Yêu cầu viết báo cáo

-

Nêu nguyên tắc các phương pháp định lượng trực tiếp và gián tiếp VSV

-

Trình bày cơ chế lên men ethanol.

-

Nêu các bước tiến hành quá trình lên men ethanol.

-

Phân tích các yếu tố làm ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol

5.5.

Tiêu chí đánh giá
Bảng 5.4. Tiêu chí đánh giá bài 5
STT

Tiêu chí đánh giá

1

Ý thức tổ chức, kỷ luật

1

2

An toàn, vệ sinh

1

3

Thời gian

1

4

Chuẩn bị

1

5

Thao tác :

6

-

Kỹ thuật đếm khuẩn lạc chính xác trên máy
đếm khuẩn lạc.

0,5

-

Hoạt hóa và định lượng trực tiếp tế bào nấm
men trên kính hiển vi

1,0

-

Nấu cơm nếp không khê, cháy.

0,5

Kết quả:
-

7

Sản phẩm cơm rượu lên men không bị hư
Giải thích và biện luận các hiện tượng lên
men ethanol

Báo cáo

- Hình thức trình bày báo cáo
- Nội dung bài báo cáo đầy đủ yêu cầu đề ra
TỔNG

5.6.

Điểm

1,0
1,0

0,5
1,5
10

Câu hỏi thảo luận

1. Nêu nhược điểm và ưu điểm của phương pháp đếm VSV bằng buồng đếm hồng
cầu.
2. Trong công nghiệp lên men, người ta thường sử dụng phương pháp định lượng
VSV nào nhất, tại sao?
3. Hãy phân tích sự khác biệt của phương pháp định lượng VSV trực tiếp và gián
tiếp?
4. Trong kỹ thuật lên men cơm rượu, tại sao ta phải để 1/4 - 1/3 thể tích trống trong
vật chứa cơ chất lên men?
5. Ngoài phương pháp cảm quan, người ta còn dùng phương pháp hóa học để định
tính ethanol được sinh ra trong quá trình lên men cơm rượu. Nêu phương pháp đó.
Trang { PAGE }

.

Bước 5. Để cơm nếp đã gieo men vào trong vật chứa từ 2/3 – 3/4 thể tích (tuỳ theo hình
thù của vật chứa) và bịt lại bằng màng bao PVC (màng mỏng dùng để bao đĩa
thức ăn).
Bước 6. Ủ ở 30 oC, 3 - 4 ngày sẽ cho sản phẩm cơm rượu.

Trang { PAGE }


.

10-1 số đếm nhỏ hơn 25 thì kết quả ghi: < 2,5 x 10 -2 CFU/g.
Hình 5.6. Số lượng và dạng khuẩn lạc trên Petri sau nuôi cấy
5.3.1.2.

Phương pháp đếm trực tiếp – Phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng
cầu
Bước 1. Nghiền viên nấm men và cân 1 g bột nấm men
Bước 2. Cho 1 g bột nấm men vào 49 ml nước cất (37 oC), lắc đều và đưa vào tủ ấm (37
o
C) để hoạt hóa 20-30 phút.
Bước 3. Dịch bột nấm men được lấy ra từ tủ ấm được pha loãng gấp 4, 8, 16, 32 lần.
Bước 4. Chọn độ pha loãng sao cho trên một buồng đếm có 5 – 10 tế bào/1 ô lớn.
Bước 5. Chọn 5 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm và đếm 5 ô này.
Bước 6. Trong một ô lớn, đếm tế bào nấm men quy định theo đường dzích dzắc từ trái
sang phải của dải các ô nhỏ và nếu tế bào nấm men nằm ở trên cạnh bên phải và
cạnh đáy của ô vuông nhỏ thì thuộc về ô đó.
Bước 7. Lấy số trung bình cộng của số tế bào nấm men trong một ô lớn (A) rồi tính theo
công thức trên ta được số lượng tế bào nấm men có trong 1 g bột nấm men.

Hình 5.7. Cách cho dịch vi sinh vật vào buồng đếm
Lưu ý : Mẫu cần đếm là bột nấm men dễ có sai số do chất mang là tinh bột dễ nhầm lẫn với tế
bào nấm men

5.3.2. Lên men cơm rượu
Bước1. Vo gạo nếp trắng hay nếp lứt (đã ngâm được 30 – 60 phút), thêm nước và đưa lên
bếp nấu.
Bước 2. Khi cơm sôi, vặn bếp điện nhỏ lại và lót lên bếp 1 miếng amiante để âm cho tới
khi cơm chín.
Bước 3. Xới cơm ra một cái thau nhựa sạch, để nguội nơi lặng gió.
Bước 4. Khi cơm nếp nguội đến 35 – 40 oC (ấm ấm), ta rắc bột nấm men vào với tỷ lệ 35
– 40 tỷ tế bào/1kg cơm nếp và đảo đều bằng bao tay nylon hay đũa tre. Lưu ý:
không nên đảo quá nhiều làm nhão cơm thì lên men sẽ không đạt.
Trang { PAGE }


.

Bước 2. Dùng viết lông phân mặt đáy Petri thành 4 phần bằng nhau hay dùng máy đếm
khuẩn lạc (nếu có).
Bước 3. Mỗi một khuẩn lạc đếm được đánh dấu một chấm mực bằng bút đếm khuẩn lạc
Bước 4. Khi có tổng số số khuẩn lạc ở các đĩa Petri thì áp dụng công thức (*) suy ra số
lượng VSV có trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích thực phẩm.
Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trên 1 g mẫu được tính như sau:
{EMBED Equation.3} (*)

Trong đó:

A là số tế bào vi khuẩn /1g mẫu

N là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
n i là số lượng đĩa cấy tại một độ pha loãng
V là thể tích dịch cấy vào Petri
fi là độ pha loãng tương ứng

Ví dụ: Phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1 gram thịt heo sống đã qua bảo
quản 3 ngày ở 10 oC. Kết quả:
10-3
224
235

Độ pha loãng (fi)
Đĩa số 1 (n1)
Đĩa số 2 (n2)

10-4
20
26

Áp dụng công thức, ta có kết quả:
{EMBED Equation.3}

Hình 5.5. Đếm khuẩn lạc TS VKHK (Môi trường cao thịt-pepton)
Các kết quả của tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ
số thập phân.
Trường hợp khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là một khuẩn lạc.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở nồng độ
10-4 số đếm > 250 thì kết quả ghi: > 2,5 x 10-6 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ

Trang { PAGE }
Petri có > 250 khuẩn lạc

Petri có 25 – 250 khuẩn lạc

Petri < 25 khuẩn lạc

Petri có khuẩn lạc mọc loang


.

4
5
6
7
8
9

Đường Saccharose
Cồn
Gạo nếp lức
viên nấm men
Màng bao PVC (wrap PVC)
Túi nilon PP/PE

Bao thức ăn
Loại 1 kg

60 g

1+2 lít
1 kg
10 viên
1 cuộn
100 g

SV chuẩn bị, 1 lớp

QUY CÁCH

SL/ĐVT

GHI CHÚ

Þ =18mm
Þ =100mm
250 ml
1ml
10ml

1 ml

80 cái
80 cái
22 cái
30 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái

2 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
2 tờ
1 cái
2 hộp
2 cái
1 đôi
10 cái
1 bộ
1 cái
5 cái
1 + 5 cái

QUY CÁCH

SL/ĐVT

95 0+ 700

SV chuẩn bị, 2 tổ
SV chuẩn bị, 1 tổ

B. DỤNG CỤ :
STT

1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24

TÊN DỤNG CỤ

Ống nghiệm
Hộp petri
Bình tam giác
Ống hút

Ống hút
Quả bóp cao su
Bình tia
Đèn cồn
Cốc thủy tinh
Cốc thủy tinh
Cốc thủy tinh
Giá để ống nghiệm
Giá để ống hút
Đũa thủy tinh
Giấy lau kính
Buồng đếm hồng cầu
Lame + lamelle
Cân đồng hồ
Đũa tre
Chậu
Cối và chày
Nồi
Ống hút nhỏ giọt
Pipetman + Đầu típ

500ml
100ml
250ml
1000ml

2kg
Dài
vừa
vừa

Đồ lưu nhận từ buổi 1
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1lớp
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1 lớp
1tổ
1tổ
Lưu buổi 5, trả buổi cuối
1 tổ
1tổ
1lớp
1tổ

C. THIẾT BỊ :
STT

1
2
3
4

5
6
7
8

TÊN THIẾT BỊ

Nồi hấp tiệt trùng
Tủ ấm
Tủ lạnh
Cân điện tử
Bếp điện
Cân đồng hồ
Kính hiển vi
Máy đếm khuẩn lạc

1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
2 cái

GHI CHÚ

1lớp
1lớp
1lớp

1lớp

1 tổ
1 tổ
1 tổ
1lớp

5.3. Các bước tiến hành
5.3.1. Định lượng VSV
5.3.1.1.

Phương pháp đếm gián tiếp – Phương pháp đếm khuẩn lạc

Bước 1. Sinh viên lấy kết quả từ các đĩa Petri đã cấy trải (kết quả bài 4), chọn đếm đĩa
Petri có số lượng 25 – 250 khuẩn lạc.

Trang { PAGE }


.

Quá trình lên men ethanol nhờ nấm men là cơ sở của việc sản xuất các loại rượu, bia, cồn
và glycerin. Quá trình này còn được ứng dụng trong sản xuất bánh mì (làm nở bột mì) và
một số loại nước giải khát.
5.1.3.1.

Cơ chế quá trình lên men ethanol

Tinh bột { EMBED Equation.3 } Dextran { EMBED Equation.3 }

Glucose

EMP

Pyruvate
Acetaldehyde
pH 4 - 5

Ethanol

Khi phân huỷ đường trong điều kiện kỵ khí, VSV chuyển hydro từ NADH đến
acetaldehyde tạo thành rượu ethanol để tái tạo NAD+. Sản phẩm tạo thành là ethanol và
CO2 Phương trình phản ứng :
NADH

C6H12O6

CH3COCOOH

NAD+

CH3CHO

C2H5OH + CO2 + 113,4 Kj

Các VSV tham gia trong quá trình lên men rượu ngoài giống Saccharomyces (S.
cerevisiae, S. ellipsoideus), Schizosaccharomyces còn có nấm mốc Mucor (M. rouxii) hay
vi khuẩn Sarcina (S. ventriculi)...
5.1.3.2.

Quy trình lên men cơm rượu
Nếp trắng

Nếp lức
(Ngâm 30 – 60 phút)
Vo gạo

Vo gạo
Nấu

Để nguội (35 – 40 oC)
Phối trộn

Nghiền mịn

Men ngọt

Ủ (30 oC, 3 – 4 ngày)
Sản phẩm cơm rượu
5.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị
Bảng 5.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị bài 5
A. HÓA CHẤT:
STT

1
2
3

TÊN HÓA CHẤT

QUY CÁCH

Nước cất
Bông không thấm nước
Bông thấm nước

SL/ĐVT

6 lít
1,0 kg
0,5 kg
Trang { PAGE }

GHI CHÚ

Lưu từ đầu


.

Phương pháp đếm khuẩn lạc được thực hiện bằng kỹ thuật hộp đổ hay hộp trải với các
thiết bị hỗ trợ (máy đếm khuẩn lạc, bút đếm khuẩn lạc) để đọc kết quả. Trong phương
pháp này cần thực hiện nhiều độ pha loãng theo bậc 10 với mật độ tế bào thích hợp để có
được số lượng tế bào riêng rẽ trên môi trường thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số
khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào trên 1 đĩa quá lớn, các khuẩn lạc sẽ mọc chồng chéo
lên nhau không thể đếm được. Nếu mật độ tế bào trên 1 đĩa quá nhỏ, sẽ không có giá trị
thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu trên 1 đĩa được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín
(FDA, AOAC) là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
5.1.2.1.

Phương pháp đo độ đục

Mật độ VSV có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua độ cản quang (độ đục)
của tế bào. Tế bào VSV cản các chùm sáng (λ, 550 – 610 nm) chiếu qua và màn chắn ánh
sáng phía sau sẽ nhận được ánh sáng ít hơn so với các chùm sáng chiếu đến. Tỷ lệ ánh
sáng nhận trên ánh sáng chiếu đi cho ta được giá trị mật độ quang (OD_Optical density)
tuyến tính với mật độ tế bào VSV có trong mẫu.
Dựng đường tương quan tuyến tính theo ví dụ sau: Lấy dịch huyền phù tế bào pha loãng
ở các cấp độ khác nhau để có được các giá trị theo bảng sau:
Bảng 5.2. Các giá trị tương quan giữa mật độ quang và số lượng tế bào vi sinh vật
Độ pha loãng (lần)
OD610nm
Mật độ tế bào đếm trực tiếp
(Triệu tế bào/ml)

Nước cất
0

5
0,16

4
0,28

3
0,44

2
0,61

1
0,71

0

5

10

15

20

25

Mật độ tế bào của đường tuyến tính có thể được đếm trực tiếp bằng buồng đếm hay kính
hiển vi huỳnh quang.

Hình 5.4. Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và số lượng tế bào VSV

Đường tuyến tính được thể hiện bằng hàm số y = ax + b (x là giá trị OD của mẫu cần xác
định, y là kết quả mật độ tế bào có trong mẫu)
5.1.3. Lên men ethanol
Rượu ethanol là một loại sản phẩm lên men đường phổ biến của nhiều nhóm VSV. Song
tác nhân lên men chủ yếu là nấm men, đặc biệt là loài Saccharomyces cerevisiae. Nhiều
loài vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí tùy tiện cũng có khả năng tạo thành rượu như là một sản
phẩm chủ yếu hay một sản phẩm phụ của quá trình lên men hexose và pentose.

Trang { PAGE }

.

Loại lưới
đếm (Grid
type)
Thoma

0,1

Kích thước
ô vuông
nhỏ (mm)
0,05

Semen

0,01

0,10

Neubauer cải
tiến

0,1

0,05

Bürker

0,1

0,05

Chiều
cao (h)

Buồng đếm (Chamber)

Lưới đếm
(Grid)

{ INCLUDEPICTURE
{ INCLUDEPICTURE
"lution.
"bas.c unibas.ch/ebert/lab/img
h/ebert/lab/img/thoma.jpg" \*
/thoma.gif" \*
MERGEFORMATINET }
MERGEFORMATINE
T}
{ INCLUDEPICTURE
{ INCLUDEPICTURE
"lution.
"bas.c unibas.ch/ebert/lab/img
h/ebert/lab/img/semen.jpg" \*
/semen.gif" \*
MERGEFORMATINET }
MERGEFORMATINE
T}

{ INCLUDEPICTURE
{ INCLUDEPICTURE
"lution.
"bas.c unibas.ch/ebert/lab/img
h/ebert/lab/img/neubauer2.gif"
/neubauer.gif" \*
\* MERGEFORMATINET }
MERGEFORMATINE
T}
{ INCLUDEPICTURE
{ INCLUDEPICTURE
"lution.
"bas.c unibas.ch/ebert/lab/img
h/ebert/lab/img/semen.jpg" \*
/buerker.gif" \*
MERGEFORMATINET }
MERGEFORMATINE
T}

Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Để quan sát và đếm trực tiếp trên kính hiển vi huỳnh quang, người ta phải nhuộm VSV
bằng các chất phát huỳnh quang như: acridin cam (AODC), 4,6-dianidino-2-phenyl indol
(DAPI), flourescent isothiocyanate (FITC). Số đếm nhận được từ phương pháp này luôn
cho kết quả cao khoảng gấp đôi so với phương pháp đếm gián tiếp bằng khuẩn lạc. Sự
khác biệt này phản ánh sự chọn lọc của môi trường, điều kiện nuôi cấy VSV, một phần tế
bào bị chết hay bị tổn thương không thể mọc thành khuẩn lạc được. Số lượng VSV đếm
trực tiếp bằng kính hiển vi tương đương với số lượng tế bào thực tế có trong mẫu.

5.1.2. Phương pháp định lượng gián tiếp
5.1.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số
lượng tế bào VSV còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân
chia và tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy, phương pháp này còn có
tên là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay đếm đĩa (plate count). Phương
pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc VSV tuỳ thuộc vào môi trường và
điều kiện nuôi cấy.
Trang { PAGE }


.

Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa
phiến kính và được bào quanh bởi hai đường rãnh hai bên. Đĩa đếm có hình tròn, thấp
hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm vì thế khi phủ lên 1 lá kính thì độ sâu của đĩa
đếm đồng đều nhau. Buồng đếm Neubauer cải tiến có 16 hoặc 25 ô lớn hình vuông, mỗi
ô lớn gồm 16 ô nhỏ hình vuông .

Hình 5.3. Buồng đếm Neubauer cải tiến
Chiều cao buồng đếm (h):

h = 0,1 mm

Cạnh 1 ô vuông nhỏ:

50 µm = 0,05 mm = 1/20 mm

Diện tích của 1 ô vuông nhỏ:

(1/20) mm x (1/20) mm = (1/400) mm 2

Diện tích 1 ô vuông lớn (S):

(1/400) mm 2 x 16 = (1/25) mm 2

Thể tích 1 ô vuông lớn (V):

(1/25) mm 2 x 0,1 mm = (1/250) mm3

Khi thực hiện quan sát VSV cần pha loãng mẫu sao cho mỗi ô lớn trong buồng đếm
khoảng từ 5 – 10 tế bào VSV. Sau đó nhỏ 1 giọt mẫu lên buồng đếm và đậy lại bằng lá
kính, quan sát ở vật kính 10X để tìm đúng lưới đếm rồi chuyển sang vật kính 40X. Chọn
5 ô lớn, gồm 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa. Các ô được chọn phải có số lượng mang tính đại
diện cho cả buồng đếm. Kết quả được bao nhiêu lấy số trung bình cộng của 5 ô đó (A).
Số tế bào có trong 1 ml mẫu ban đầu được tính theo công thức:
{ EMBED Equation.3 } (Tế bào/ml)
Trong đó:

A. - số tế bào trung bình trong 1 ô vuông lớn.
1000 - hệ số chuyển đổi từ mm3 sang ml
(1 ml = 1 cm 3 = 103 mm3)
F – hệ số pha loãng của mẫu trước khi đếm
V – Thể tích của 1 ô vuông lớn

Bảng 5.1. Các loại buồng đếm
Trang { PAGE }


.

Hình 5.2. Cấu tạo buồng đếm Neubauer cải tiến

Trang { PAGE }


.

BÀI 5.

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
LÊN MEN ETHANOL

Mục tiêu:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
-

Định lượng vi sinh vật bằng một số phương pháp phân tích gián tiếp và trực tiếp

-

Thực hiện quá trình lên men ethanol

-

Nhận biết các dấu hiệu lên men ethanol

5.1. Cơ sở lý thuyết
5.1.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật
Sự hiện diện của VSV có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau, như:
-

Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu bằng kính hiển vi quang học

hoặc bằng kính hiển vi huỳnh quang.

-

Đếm gián tiếp bằng số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định hoặc đo độ đục
(mật độ quang) của tế bào…

Sau đây là một số phương pháp thường dùng để định lượng VSV:
5.1.1.1. Phương pháp định lượng trực tiếp
Vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như: nấm men, tảo… có thể được định lượng bằng
cách đếm trực tiếp bằng buống đếm trên kính hiển vi. Phương pháp này có ưu điểm là có
thể xác định được ngay lượng tế bào trong mẫu, nhưng lại có nhược điểm là không xác
định được tế bào còn sống hay đã chết, dễ lầm tế bào VSV với các hạt vật thể khác có
trong môi trường và dịch huyền phù VSV phải có mật độ tế bào phải lớn.
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Hình 5.1. Buồng đếm hồng cầu

Trang { PAGE }


.

4.4.

Yêu cầu viết báo cáo

-

Nêu nguyên tắc của kỹ thuật lấy mẫu dạng rắn, lỏng, và bán rắn

-

Trình bày các quy trình các bước từ lấy mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng và cấy
mẫu.

-

Phân biệt sự khác nhau của kỹ thuật hộp đổ và hộp trải.

4.5.

Tiêu chí đánh giá
Bảng 4.3. Tiêu chí đánh giá bài 4

STT

Tiêu chí đánh giá

1

Ý thức tổ chức, kỷ luật

1

2

An toàn, vệ sinh

1

3

Thời gian

1

4

Chuẩn bị

1

5

Thao tác :

6

-

Pha chế môi trường đúng

-

Lấy mẫu đúng kỹ thuật

-

Pha loãng đúng kỹ thuật, chuẩn xác.

-

Cấy mẫu đúng kỹ thuật

Kết quả:
- Đếm khuẩn lạc các đĩa cấy
-

7

Tính kết quả đúng

0,5
0,5
0,5
0,5

1,0
1,0

Báo cáo
- Hình thức trình bày báo cáo
- Nội dung bài báo cáo đầy đủ yêu cầu đề ra
TỔNG

4.6.

Điểm

0,5
1,5
10

Câu hỏi ôn tập

1. Hãy nêu các nguyên nhân làm sai lệch kết quả thường gặp khi phân tích VSV ?
2. Trong kỹ thuật phân tích tổng số VKHK, tại sao môi trường thạch được đổ ở 45 oC.
3. Trong chỉ tiêu phân tích tổng số NM-NM, tại sao ta không sử dụng kỹ thuật hộp đổ
mà lại sử dụng kỹ thuật hộp trải ?
4. Khi sử dụng môi trường Czapek-Dox thay thế môi trường DRBC trong phân tích
tổng số NM-NM có ảnh hưởng đến kết quả phân tích không ? Giải thích ?

Trang { PAGE }


.

Bước 3. Đặt đĩa Petri trên mặt phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa Petri theo hai chiều ngược
nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần để dịch VSV dàn đều ở mặt đáy của đĩa Petri và trộn
đều trong môi trường cấy.
Bước 4. Đậy đĩa Petri, để đông tự nhiên.
Bước 5. Gói giấy và ủ ở nhiệt độ thích hợp.

Hình 4.5. Phương pháp phân tích vi sinh bằng kĩ thuật hộp đổ

Trang { PAGE }


.

Bước 5

Dùng pipetteman với đầu tip vô trùng (hay pipette 1ml vô trùng) hút 1ml dịch
mẫu vào ống nghiệm (theo hình) để được các độ pha loãng tiếp theo.

Bước 6

Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng
tay ta được các độ pha loãng.

4.3.2. Kỹ thuật hộp trải
Sử dụng các đĩa Petri chứa môi trường Cao thịt-pepton và Czapek-Dox đã hấp khử trùng.
Các Petri chứa môi trường Cao thịt –pepton dùng để phân lập vi khuẩn. Các Petri chứa
môi trường Czapek-Dox dùng để phân lập nấm men hay nấm mốc.
Các bước thực hiện:
Bước 1. Dùng micropipette và đầu tip vô trùng hút 0,1 ml dịch VSV lên bề mặt môi
trường thạch đĩa trong không gian vô trùng.
Bước 2. Nhúng đầu que trang trong cốc thuỷ tinh chứa cồn 70 o, đốt trên ngọn lửa đèn cồn
để khử trùng. Để đầu que trải nguội trong không gian vô trùng (gần ngọn lửa đèn
cồn).
Bước 3. Mở đĩa Petri, dùng que trang gạt đều giọt VSV trên bề mặt thạch. Dùng que
trang gạt xoay đều trên bề mặt thạch. Trong khi gạt, xoay đĩa Petri tới lui 3 – 4
lần, mỗi lần ½ chu vi cho dịch VSV được trải đều khắp trên bề mặt môi trường.
Bước 4. Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
theo từng đối tượng VSV mục tiêu.

Hình 4.4. Mô hình kỹ thuật hộp trải
4.3.3. Kỹ thuật hộp đổ
- Pha chế môi trường cao thịt-pepton như ở bài 2.

- Chuẩn bị Petri, gói giấy không thấm nước.
- Chuẩn bị ống nghiệm thạch, gói giấy không thấm nước.
 Hấp khử trùng
Sau khi hấp khử trùng, thực hiện các bước sau:
Bước 1. Dùng micropipette và đầu típ vô trùng hoặc pipette đã vô trùng chuyển 1 ml dịch
VSV lên đĩa Petri vô trùng chưa có môi trường.
Bước 2. Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trường nóng chảy ở 45 oC vào đĩa Petri đã cấy giống
VSV.

Trang { PAGE }


.

9
10

Cồn
Nước mía

11

Giấy nhôm

95 0+ 700

1+2 lít
100 ml

1 lớp, SV chuẩn bị

1 cuộn

B. DỤNG CỤ :
STT

1
2
3
4
5
8
7
10
13
15
16
17
18
19
20
21
22

TÊN DỤNG CỤ

Ống nghiệm
Hộp petri
Bình tam giác
Ống hút

Ống hút
Đầu típ
Micropipette
Quả bóp cao su
Que trải
Đèn cồn
Cốc thủy tinh
Cốc thủy tinh
Cốc thủy tinh
Giá để ống nghiệm
Giá để ống hút
Đũa thủy tinh
Bình tia

QUY CÁCH

SL/ĐVT

GHI CHÚ

Þ =18mm
Þ =100mm
250 ml
1ml
10ml
1000 µl
1000µl

80 cái
80 cái

22 cái
30 cái
2 cái
80 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
3 cái
2 cái
2 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái

Đồ lưu nhận từ buổi 1

100ml
250ml
1000ml

Đã lưu từ buổi 3
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1tổ
1lớp

1tổ
1tổ
1tổ
1tổ

C. THIẾT BỊ :
STT

2
3
4
5
6
7
9
10
11

4.3.

TÊN THIẾT BỊ

QUY CÁCH

Nồi hấp tiệt trùng
Tủ sấy
Tủ cấy
Tủ ấm
Tủ lạnh
Bể điều nhiệt Memmert

Cân điện tử
Bếp điện
Máy đếm khuẩn lạc

Có giá đỡ

GHI CHÚ

SL/ĐVT

1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
1 cái
2 cái
10 cái
1 cái

1lớp
1lớp
1lớp
1lớp
1lớp
1lớp
1lớp
1lớp
1lớp

Các bước tiến hành

4.3.1. Kỹ thuật pha loãng mẫu
Mẫu thực phẩm có thể là dạng rắn hoặc dạng lỏng
Bước 1

Cân 10,0 g (hoặc 25,0 g) hoặc hút 10,0 ml (hoặc 25,0 ml) mẫu vào bình tam
giác đã có 90 ml (hay 225 ml) SPW.

Bước 2

Nếu là mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) hay xay mẫu
trong cối vô trùng tối đa 2,5 phút.

Bước 3

Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được mẫu có độ pha loãng
10-1
{ EMBED ACD.ChemSketch.20 }
Hình 4.3. Kỹ thuật pha loãng
Trang { PAGE }


.

thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó chúng ta có thể gián tiếp xác định được mật độ
tế bào hay bào tử gọi chung là CFU (Coloning Form Unit) có trong thực phẩm cũng như
phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật.
4.1.4. Kỹ thuật hộp trải (spread plate)
Là kỹ thuật pha loãng theo bậc 10 dịch chứa VSV thành các mức pha loãng khác nhau và

chuyển 0,1 ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi trường thạch. Sau thời gian ủ,
mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.

Hình 4.1. Kỹ thuật hộp trải
Chú ý: Người ta cũng thường dùng kỹ thuật này để nuôi cấy, phân lập hay phân tích
tổng số nấm men-nấm mốc…
4.1.5. Kỹ thuật hộp đổ (pour plate)
Là kỹ thuật pha loãng giống VSV như kỹ thuật hộp trải, nhưng kỹ thuật này chuyển 1ml
dịch pha loãng lên hộp Petri vô trùng, sau đó đổ môi trường nóng chảy ở 45 oC (trong bể
ổn nhiệt) lên đĩa và xoay vòng theo hai chiều ngược nhau vài lần để cho các tế bào phân
tán vào môi trường. Sau thời gian ủ, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc mọc
dưới và trên môi trường thạch.
{ INCLUDEPICTURE " \* MERGEFORMATINET }

Hình 4.2. Kỹ thuật hộp đổ
Chú ý: Kỹ thuật hộp đổ thường được áp dụng trên đối tượng vi khuẩn, ví dụ như phân
tích chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí
4.2.

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Bảng 4.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất bài 4

A. HÓA CHẤT:
STT
TÊN HÓA CHẤT

1
2
3
4

5
6
7
8

QUY CÁCH

DRBC
Cao thịt
Pepton
Agar
NaCl
Nước cất
Bông không thấm nước
Bông thấm nước

SL/ĐVT

1500 ml
10 g
40 g
60 g
200 g
6 lít
1,0 kg
0,5 kg
Trang { PAGE }

GHI CHÚ

Lưu từ đầu


.

-

Tiến hành kiểm nghiệm. Trường hợp có nhiều mẫu hàng chưa kiểm nghiệm ngay một
lúc thì phải đảm bảo điều kiện bảo quản sao cho vi sinh vật trong thực phẩm không bị
thay đổi cho đến khi kiểm nghiệm.

-

Trong trường hợp mẫu có khối lượng lớn hoặc thể tích lớn, ta cần tiến hành lấy mẫu
trong điều kiện an toàn vi sinh vật để tránh cho vi sinh vật từ môi trường xung quanh
nhiễm thêm vào mẫu vừa lấy.

4.1.1.4.

Lấy mẫu thực phẩm dạng lỏng

Các loại thực phẩm dạng lỏng, như nước chấm, nước mắm, nước tương, dầu ăn… thường
được chứa đựng trong các thùng to hay bồn thì dùng ống cao su sạch, khô đem cắm vào
những vị trí trên, dưới, giữa, bên cạnh để hút . Sau đó trộn đều các mẫu đó, rồi mới lấy
lượng mẫu chính xác để phân tích.
Đối với các loại thực phẩm lỏng đóng gói, chai, hộp… mẫu lấy sẽ giữ nguyên bao bì. Sau
đó khuấy hoặc lắc đều cho kỹ trước khi hút.
4.1.1.5.

Lấy mẫu thực phẩm dạng rắn

Thực phẩm là một khối rắn to, đồng nhất, lấy mẫu ở các góc, ở trong giữa. Sau đó, mẫu
được đem nghiền, trộn đều, rồi mới đem cân và cho vào túi dập mẫu.
Thực phẩm dạng bột đem trộn đều, cân và cho vào túi dập mẫu.
Đối với các nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm ở dạng rắn, như gạo, cà phê, hạt tiêu,
trà, … có thể dung cây xăm hay dụng cụ chuyên dụng khác để lấy mẫu trên, dưới, giữa,
cạnh các bao. Rồi được chia mẫu trung bình trong các máy chia mẫu.
Trường hợp thực phẩm đặc lẫn lỏng không đồng nhất
Xay nát mẫu thực phẩm đặc lẫn lỏng thành một khối đồng nhất. Sau đó cân một lượng
xác định theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích. Thường mẫu được định lượng là 10 hoặc 25
gram.
4.1.2. Ghi kết quả kiểm nghiệm
Kết quả kiểm nghiệm được ghi trong một phiếu kiểm nghiệm bao gồm:
-

Tên và địa chỉ cơ quan kiểm nghiệm.

-

Số thứ tự mẫu hay mã số mẫu ghi trong sổ kiểm nghiệm.

-

Tên mẫu thực phẩm thử và tên nhà sản xuất.

-

Tên cơ quan lấy mẫu và gửi mẫu.

-

Ngày giờ tiếp nhận mẫu tại PTN.

-

Trạng thái bao bì.

-

Yêu cầu kiểm nghiệm.

-

Kết quả phân tích

Chú ý: Kết quả kiểm nghiệm cần ghi theo yêu cầu kiểm nghiệm. Phiếu kiểm nghiệm do người phụ trách
ký và có chữ ký duyệt của thủ trưởng.

4.1.3. Kỹ thuật pha loãng
Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng theo bậc
10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha loãng dịch pha loãng sẽ có
mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi sinh vật
Trang { PAGE }