Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

PHẠM THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
DICLOFENAC CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG
NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

PHẠM THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
DICLOFENAC CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG
NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS. Phạm Thị Kim Dung

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu với đề tài:
, thầy cô và các bạn tại Trung tâm Hỗ trợ
nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều. Qua đây, em muốn được gửi lời
cảm ơn chân thành tới:
ThS. Phạm Thị Kim Dung – Người đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn
cho em để thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này.
Các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn
Sinh lý người và động vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã luôn giúp đỡ
và tạo điều kiện cho em trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và gia đình đã quan tâm,
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2018
Sinh viên

Phạm Thị Thu Trang


LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.

2. Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác.
3. Kết quả trong đề tài thu được do tự bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn
đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Thu Trang


MỤC LỤC`

MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
5.

ngh a hoa học và ý ngh a thực tiễn.......................................................... 3

6. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE VI KHUẨN (CVK)............................. 5
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum ............................................... 5
1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum ....................................................................... 5
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum............................ 6
1.1.4. Tính chất độc đáo của màng CVK .......................................................... 7
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK................................................................................. 8
1.1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................ 8
1.1.7. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum ..................................... 9

1.2. TỔNG QUAN VỀ THUỐC DICLOFENAC .......................................... 12
1.2.1. Công thức .............................................................................................. 12
1.2.2. Dược động học ...................................................................................... 12
1.2.3. Phân bố - chuyển hoá ............................................................................ 12
1.2.4. Thải trừ.................................................................................................. 12
1.2.5. Tác dụng................................................................................................ 13
1.2.6. Rủi ro và tác dụng phụ .......................................................................... 13
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 15


2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.2.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 15
2.2.2. Chuẩn bị màng CVK............................................................................. 15
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng........................................................ 17
2.2.4. Phương pháp dựng đường chuẩn .......................................................... 18
2.2.5. Chế tạo màng CVK nạp Diclofenac...................................................... 22
2.2.6. Chuẩn bị môi trường đệm PBS ............................................................. 23
2.2.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK đã nạp thuốc
Diclofenac ....................................................................................................... 23
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả................................................ 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................... 25
3.1. Kết quả tạo màng CVK từ môi trường nước vo gạo ................................ 25
3.2. Tinh chế màng CVK ................................................................................ 26
3.3. Màng CVK nạp thuốc Diclofenac............................................................ 27
3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng ra hỏi màng CVK. ......... 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 36

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo ..................................... 9
Bảng 2.2. Môi trường lên men tạo màng CVK............................................... 16
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 276nm............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 278nm............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 281nm............. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Kết quả thu màng CVK tươi........................................................... 25
Bảng 3.2. Mật độ quang hi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm hác
nhau trong các môi trường pH hác nhau đối với màng chưa ép...Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.3. Mật độ quang hi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm hác
nhau trong các môi trường pH hác nhau đối với màng ép 50% .......... 29
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH
hác nhau trong các hoảng thời gian hác nhau (%) (n =3)................ 32
Bảng 3.5. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% ở các môi trường pH
hác nhau trong các hoảng thời gian hác nhau (%) (n=3)................. 32


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm.
Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm.
Hình 2.5. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm.
Hình 3.1. Màng CVK khi lên men
Hình 3.2. Màng CVK thu được
Hình 3.3. Mẫu được rút ra để đo quang phổ lúc 6 giờ và 8 giờ
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng

0,5cm và 1cm hông ép trong các môi trường pH khác nhau (n = 3)
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm ép 50% trong các môi trường pH khác nhau (n = 3)


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quá trình tạo màng CVK
Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
Sơ đồ 3.1. Chu trình tinh chế màng CVK


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong thời gian gần đây, theo nghiên cứu người ta đã chú ý đặc biệt về
việc sử dụng nguyên vật liệu sinh học trong các loại sản phẩm chăm sóc sức
khỏe nhờ khả năng tái tạo, phân hủy sinh học và tương thích sinh học của
chúng. Một trong số đó có khả năng đáp ứng được những ưu điểm trên và
đang dần phổ biến tới đó là cellulose. Vật liệu này vượt trội hơn so với các
polyme tự nhiên và tổng hợp khác [12]. Do đó, màng cellulose vi huẩn
(CVK) là đối tượng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài về
nhiều nghiên cứu ứng dụng khoa học và công nghệ khác nhau. Đây là một
loại nguyên liệu mới, được áp dụng rất nhiều trong các l nh vực khác nhau.
Nổi bật là trong l nh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm thuốc
chống viêm và giảm đau, thí dụ như hi bị phong thấp, bị thâm tím, căng bắp
thịt, đau thắt lưng cấp và thoái hoá khớp. Nó còn được dùng để điều trị đau
bụng kinh. Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng màng CVK trong đòi
sống vẫn còn khá là mới mẻ.
Màng Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một số loài
vi khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Ngoài những đặc tính và cấu
trúc giống nhau giữa màng CVK và cellulose của thực vật thì giữa chúng vẫn

tồn tại một số điểm hác nhau như: cellulose vi khuẩn không chứa các hợp
chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến cho nên giúp
chúng có một số đặc tính vượt trội về độ dẻo dai, bền chắc, khả năng hút nước
cao và độ tinh khiết cao.
Diclofenac, dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh, được
điều trị khi bị phong thấp, căng bắp thịt, bị thâm tím, đau thắt lưng cấp hay
thoái hoá khớp. Ngoài ra, nó còn được dùng để điều trị đau bụng kinh ở nữ
giới.
1


Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do
đó làm giảm đáng

ể sự tạo thành chất trung gian của quá trình viêm

(prostaglandin, prostacyclin, thromboxane). Diclofenac điều hòa con đường
lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Tuy nhiên, nhược điểm của Diclofenac là
có thể gây ra bệnh tim đe dọa tính mạng hoặc các vấn đề lưu thông như đột
quỵ hoặc các cơn đau tim, đặc biệt là khi sử dụng nó lâu dài. Không sử dụng
Diclofenac ngay trước khi hoặc sau khi phẫu thuật tim (bắc cầu động mạch
vành hoặc CABG).
Nước vo gạo là loại chất khá phổ biến và gần gũi trong cuộc sống hằng
ngày. Ngoài ra nước vo gạo còn có giá thành rất rẻ và dễ tìm kiếm. Do vậy ta
nên sử dụng nước vo gạo để làm môi trường lên men những vi khuẩn cần
thiết cho quá trình nghiên cứu.
Với mục đích nghiên cứu thiết kế hệ thống gồm CVK nạp thuốc và khả
năng giải phóng thuốc giúp Diclofenac không bị phá huỷ trong môi trường
acid, làm cho thuốc được giải phóng một cách éo dài, đồng thời làm giảm

bớt các tác dụng phụ của thuốc trong điều trị bệnh, tôi đã chọn và nghiên cứu
đề tài:
u kh
cellulose vi khu n lên men t

i phóng thu c Diclofenac c a màng
c vo g

.

2. Mục đích nghiên cứu
- Chế tạo được màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước
vo gạo.
- Thiết kế được hệ thống gồm cellulose vi khuẩn nạp thuốc và khả năng
giải phóng thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn được lên men từ
môi trường nước vo gạo với độ dày màng khác nhau trong các môi trường pH
khác nhau mô phỏng đường tiêu hóa.
- Nâng cao tối ưu hoá quá trình giải phóng và kéo dài thuốc.


3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xử lí màng CVK.
- Thiết kế, chế tạo màng CVK để giải phóng thuốc Diclofenac.
- Khảo sát khả năng giải phóng thuốc của màng CVK ở các độ dày
màng khác nhau trong môi trường pH khác nhau.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.

- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5.
5.1.

ngh a khoa học và ý ngh a th c ti n
ngh a khoa học:
+ Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có những hiểu biết về

tiềm năng giải phóng của màng CVK.
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
5.2.

ngh a th c ti n:
+

Thiết kế được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter

xylinum lên men từ môi trường nước vo gạo.
+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm hệ thống giải phóng
thuốc có thể đưa vào điều trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng, duy trì nồng
độ thuốc trong máu trong một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho người
bệnh, giảm các tác dụng phụ không mong muốn, nâng cao được khả năng sử
dụng thuốc.
+ Xây dựng được hệ thống vận tải thuốc diclofenac để khắc phục
những hạn chế không mong muốn của thuốc.


+ Từ các kết quả nghiên cứu ta có thể áp dụng vào trong thực tiễn.
6. Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị màng CVK;

- Phương pháp dựng đường chuẩn;
- Chuẩn bị bộ đệm;
- Chế tạo màng CVK nạp Diclofenac;
- Xác định lượng Diclofenac nạp vào màng CVK;
- Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng của màng CVK;
- Phương pháp xử lý thống kê.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cellulose vi khuẩn(CVK)
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn gốc từ Philippin, A. xylinum
thuộc nhóm khuẩn Axetic. Theo phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.
xylium thuộc lớp Schizomycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonaceae
[5].
1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum
* Đặc điểm hình thái:
A. xylinum là trực huẩn dạng hình que, thẳng hay hơi cong, ích thước
ngang hoảng 0,6-0,8 µm, dài hoảng 2-3 µm, vi huẩn hông sinh bào tử,
hiếu hí bắt buộc, sắp xếp riêng rẽ đôi hi xếp thành chuỗi, có hả năng tạo
váng hemicellulose há dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H 2SO4. Tùy
điều iện nuôi cấy mà các vi huẩn này có thể sinh ra các tế bào có hình thái
hác biệt dạng éo dài hoặc phình to ra.[6]
A. xylinum thường sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi
là “thủy hoài sâm” [9].
A. xylinum sinh trưởng ở điều iện pH <5, nhiệt độ hoảng 28-32°C và
có thể tích lũy 4-5% acid acetic, nhưng

hi nồng độ acid vượt quá mức cho

phép, chúng sẽ quay lại ức chế hoạt động của vi huẩn.
* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum:
A. xylinum là loài vi huẩn hiếu hí. Nhiệt độ tối ưu cho vi huẩn phát
0

0

triển từ 28 – 32 C. Ở nhiệt độ 37 C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn.


A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường hác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và
cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.
Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi huẩn lạ, người ta thường bổ
sung acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi huẩn sử dụng đường để chuyển
hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 –
48h lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Màng CVK được cấu tạo từ nhiều chuỗi polimer β-1,4-glucopyranose
không phân nhánh. Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc hóa học cơ
bản của CVK há tương đồng với cellulose của thực vật nhưng chúng lại khác
nhau về cấu trúc đại thể [10, 17].
- Theo AJ. Brown (1886), CVK có cấu tạo gồm nhiều sợi siêu nhỏ kết
hợp với nhau, bản chất những sợi này là hemicellulose, có đường kính 1,5nm.
Những sợi này kết hợp với nhau thành từng bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi
dãy có chiều dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm.
- Đặc tính cấu trúc của CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy:
+ Trong nuôi cấy t nh (S - BC: Static-Bacterial Cellulose): Màng CVK

thu được có đặc điểm dày, dẻo dai, màu trắng trong hơi ngả màu vàng. Do khi
nuôi cấy t nh thì A. xylinum sẽ tạo ra cellulose nhiều hơn tạo thành màng dày
trên bề mặt của môi trường.
+ Trong nuôi cấy động (A - BC: Agitated-Bacterial Cellulose): Màng
CVK thu được có đặc điểm hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và hông được tự
do dao động trong môi trường nuôi cấy. Do khi nuôi cấy động thì một số ít


cellulose hình thành theo dạng hyền phù phân tán trong đó chuỗi β-1,4-glucan
được xếp một cách ngẫu nhiên.
+ Lượng CVK thu được ở hai phương pháp nuôi cấy động và nuôi cấy t
nh là khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy t nh lớn
hơn so với khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động [5, 15].
1.1.4. Tính chất độc đáo của màng CVK
Màng CVK có một số tính chất độc đáo như: độ tinh khiết cao, độ bền
dai cơ học lớn, khả năng thấm hút nước cao,...
- Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [18].
- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lượng nhẹ, độ bền đáng ể [7, 18].
- Khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm: đó là khả năng giữ nước tốt,
lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng
200 lần trọng lượng của nó (Patel & Suresh 2008; Wippermann et al. 2009)
[19].
Do vậy, màng CVK đã được ứng dụng trong nhiều l nh vực công nghệ
khác nhau như: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công
nghệ pin,... nổi bật nhất là trong l nh vực y học [7,12]. Trong y học, màng
CVK thu được từ quá trình nuôi cấy t nh được nghiên cứu và ứng dụng làm
da nhân tạo. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu

và ứng dụng màng CVK được tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng thực nghiệm
trên đối tượng là thỏ. Những kết quả ứng dụng trên đã chứng minh rằng màng
CVK có khả năng giúp vết thương mau lành và ngăn hông nhiễm trùng [4].
Ngoài ra, CVK còn được ứng dụng để sản xuất màng băng vết thương, sử
dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [2].


1.1.5. Sinh tổng hợp CVK
- Quá trình lên men: + Pha sinh trưởng
+ Pha tích tụ sản phẩm
- Quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum
Cellulose được tổng hợp từ một số nhóm vi

huẩn và đặc biệt là A.

xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng cacbon, phụ thuộc vào
trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu
trình Krebs, ết hợp với quá trình tạo glucose. Ngày nay, quá trình tổng hợp
cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bước và thường trải qua 2 giai đoạn chính là
giai đoạn polymer hóa và giai đoạn ết tinh.
Có 2 iểu nuôi cấy: lên men t nh và lên men động (có huấy đảo).
1.1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường được tổng hợp từ các
nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho,
các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
A. xylinum có nhu cầu sử dụng đường rất lớn vì vậy có rất nhiều
nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công
nghiệp hác để làm nguyên liệu nuôi cấy A. xylinum như: rỉ đường, chất thải
nhà máy sản xuất phomat, nước dừa già, nước mía, ...
Trong đó nước vo gạo được coi là môi trường nuôi cấy A. xylinum rất

lý tưởng.
Trong nước vo gạo có rất nhiều thành phần dinh dưỡng và vitamin như
cacbonhydrat, sắt, vitamin B, vitamin C,... Do vậy, môi trường nước vo gạo
rất thích hợp cho sự phát triển của A. xylinum, thành phần dinh dưỡng của
nước vo gạo được thể hiện ở bảng 1.1:


Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo
Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Kháng chất

Fe ( 7% - 8%) , Zn ( 12% -13%)

Axitamin

leucine , valine , lysine

1.1.7. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum
Phương pháp sản xuất CVK: lên men t nh và lên men động [5].
1.1.7.1. Lên men t nh
Để lên men A. xylinum thì môi trường dinh dưỡng được đặt vào các
khay có bề mặt rộng thoáng. Khi lên men để tạo độ thông thoáng với môi
trường bên ngoài mà không xảy ra trường hợp nhiễm khuẩn, các khay cần
được đậy giấy báo có độ xốp. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 28 30ᴼC. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt của môi
trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa
không khí với môi trường lỏng. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên
màng cellulose bên trên. Sau 7-10 ngày có thể thu được màng CVK [5, 15].
1.1.7.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy
lắc.
Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi
cấy được chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong máy lắc ổn


nhiệt ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút. CVK được tạo ra từ môi trường lắc có
dạng hạt hình sao, hạt nhỏ và các sợi dài, chúng có đặc điểm là phân tán rất
tốt trong môi trường. Lượng O2 hòa tan trong môi trường tác động lớn đến sự
sinh trưởng và khả năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá
trình lên men đạt hiệu quả cao, người ta thường xuyên sử dụng các reactor có
sục hí để lên men [5, 15].
1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của màng CVK
1.1.8.1.Trên thế giới
Trên thế giới màng CVK đã được ứng dụng rất nhiều trong các l nh vực
công nghệ hác nhau. Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên
cứu ứng dụng CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo, trong

đó có 9 nghiên cứu với màng CVK tinh hiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến
đổi màng CVK và 7 với các vật liệu Nanocomposite. Như vậy, trong l nh vực
này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu.
Tác giả Brown (1989), Jonas và Farad (1998) sử dụng màng như một
chất để biến đổi độ nhớt, tạo ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm, sản xuất giấy chất lượng
cao [3].
Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng hô CVK thu
được sau hi ngâm trong benzal onium chloride (một tác nhân háng huẩn;
Merc KGaA, Darmstadt, Đức) có hả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị
2

diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 g/cm , và tác dụng của thuốc éo
dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S.aureus và B.subtilis [11].
Luan J. et al. (2012), đã nghiên cứu màng CVK nạp sulfadiazine bạc,
một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm huẩn
do bỏng.


1.1.8.2.Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK bắt đầu từ
những năm 2000. Những nghiên cứu trong nước bước đầu đã thành công
trong tuyển chọn chủng có đặc tính quý, sản xuất thử nghiệm màng CVK và
thử nghiệm ứng dụng trong sản xuất bao bì, gạc và mặt nạ.
Ngày nay, ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi
khuẩn A. xylinum ngày càng được quan tâm. Năm 2012, Đinh Thị Kim
Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh [3] đã công bố công trình
nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial
cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, ết quả cho thấy màng CVK được
tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có các sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền cơ

học lớn, độ thấu
màng trị bỏng.

hí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng trong làm


1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac
1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
Tên IUPAC hệ thống: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
Phân tử lượng: 296,148 g/mol
Công thức cấu tạo: Được mô tả ở hình 1.1

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac
1.2.2. Dược động học
Diclofenac hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hoá sau khi uống, hấp thụ
sẽ tốt hơn nếu uống hi đói. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương là
1,5mg/l xuất hiện hai giờ sau khi uống, nồng độ thuốc trong bao hoạt dịch đạt
mức cao nhất sau khi uống khoảng 4 đến 6 giờ. Tác dụng của thuốc xuất hiện
vào khoảng 30 – 60 phút sau hi đặt thuốc vào trực tràng, 20 – 30 phút sau
khi tiêm bắp, 60 – 120 phút sau khi uống [17].
1.2.3. Phân bố - chuyển hoá
Diclofenac gắn nhiều protein huyết tương, chủ yếu là albumin (99%).
Khoảng 50% liều thuốc uống được chuyển hoá qua gan lần đầu, sinh khả
dụng của thuốc trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% so với liều tiêm t nh mạch
[17].
1.2.4. Thải trừ


Thời gian bán thải của thuốc trong huyết tương vào khoảng 1 - 2 giờ.

Thời gian bán thải trong bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng
được thải trừ qua thận dưới dạng chất chuyển hoá còn một phần hoạt tính và
1% dưới dạng thuốc nguyên vẹn, phần còn lại thải trừ qua mật và phân.
1.2.5. Tác dụng
Diclofenac dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid [14]. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh.
Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm
giảm đáng

ể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là

những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con
đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu.
1.2.6. Rủi ro và tác dụng phụ
Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, Diclofenac gây
hại đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin
(chất có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tưới
máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin
nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư
đặc biệt ở những người bị bệnh thận hoặc suy tim mãn tính. Với những người
bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp
và suy tim cấp [15] .
Không dùng thuốc chứa Diclofenac trong thời ì mang thai, đặc biệt là
3 tháng cuối thai kì.
* Các triệu chứng thường gặp:
- Toàn thân: Nhức đầu, bồn chồn, ù tai.
- Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng,
chán ăn, hó tiêu.
- Gan: Tăng các transaminase.

* Ít gặp:
- Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở người bệnh hen),
choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay.
- Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển,
nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ ( hi đặt thuốc vào trực
tràng).
- Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu,
dễ bị kích thích.
- Da: Mày đay.
- Hô hấp: Co thắt phế quản.
- Mắt: Nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt, nhìn đôi.
* Hiếm gặp:
- Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc.
- Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn.
- Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng
bạch cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu.
- Gan: Rối loạn co bóp túi mật, chức năng gan bất thường, nhiễm độc
gan (vàng da, viêm gan).
- Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội
chứng thận hư.


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Diclofenac được mua ở Trung Quốc.
- Dung môi: metanol được mua tại Việt Nam.
- NaOH, HCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 và một số hóa chất khác.
- Nguyên liệu tạo màng CVK: đường glucose, nước vo gạo, acid acetic,
axit citric, disodium phosphate, HCl, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích.

- Màng CVK (99% hàm lượng nước) sản xuất từ vi khuẩn A. xylinum
lên men trong môi trường nước vo gạo.
- Máy đo quang phổ UV-2450 (Shimadzu-Nhật Bản); cân phân tích
(Sartorius-Thụy Sỹ); nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; buồng cấy vô
trùng (Haraeus); tủ sấy, tủ ấm (Binder-Đức); khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức),
và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.
- Ống nghiệm, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có
nút xoáy, bình tam giác, gạc vô trùng, hộp nhựa, lọ penicilin, bình hút ẩm,
giấy lọc, giấy bạc, bình định mức loại 100ml, 500ml, 1000ml, pipet chính xác
1ml, 5ml, 10ml, thước ẹp panme,... và nhiều dụng cụ hóa sinh hác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Cho màng CVK nạp Diclofenac vào giải phóng thuốc ở
các điều kiện pH khác nhau rồi tính tốc độ giải phóng thuốc ở mỗi pH đó.
- Thí nghiệm 2: Trong cùng một pH cho màng CVK có độ dày khác
nhau đã nạp Diclfenac giải phóng thuốc rồi tính tốc độ giải phóng thuốc.
2.2.2. Chuẩn bị màng CVK
- Chuẩn bị màng CVK từ A. xylinum ở môi trường nuôi cấy được thể
hiện ở bảng 2.2 [13]:


Bảng 2.2. Môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần

Khối lượng

Nước vo gạo

1000ml

Glucoze

20g

KH2PO4

2g

(NH4)2SO4

3g

Pepton

10g

Axit axetic

2%

- Từ các thành phần trong môi trường lên men tạo ra màng CVK ở
bảng 2.2, quá trình tạo màng CVK được thể hiện ở sơ đồ 2.1:
Hóa chất

Nước gạo
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, hòa tan
hóa chất
Đổ môi trường vào các bình tam giác
Cho vào hấp ở 121°C, khoảng thời gian
là 20 phút

Đổ giống (10%)
Thêm 2% acid axetic
Lên men
Sơ đồ 2.1. Quá trình tạo màng CVK