Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

======

ĐẶNG THI YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

======

ĐẶNG THI YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

TS. NGUYỄN PHÚC HƯNG

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu tại Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, em đa
nhận được sư hương dẫn và giúp đơ tận tình của thầy cô, anh chi và các bạn.
Đầu tiên, với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành
cảm ơn TS. Nguyễn Phúc Hưng, người thầy đa hương dẫn, quan tâm, giúp đơ em
trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước dừa già”
Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tơi các thầy cô giáo trong khoa Sinh KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đa tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đơ em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Mặc dù đa co nhiều cô gắng đê hoàn thành khóa luận một cách tốt
nhất nhưng do bươc đầu đi vào thực tế sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến
thức của em còn hạn chế. Do vậy không tránh khỏi những thiếu xót trong quá
trình thực hiện, em rất mong nhận được sư góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh
viên đê đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin cảm ơn sư giúp đơ của các thầy cô, cảm ơn gia
đình cùng toàn thê các bạn, đa luôn ở bên động viên, giúp đơ và khích lê em
hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đặng Thi Yến

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài này là của chính tôi thực hiên dươi sư hướng
dẫn của TS. Nguyễn Phúc Hưng. Những sô liệu kết quả nghiên cứu trong khóa
luận này là trung thực và không trùng lặp hay sao chép với một đề tài nào khác.
Những trích dẫn, kết quả nghiên cứu co trong khoa luận lấy từ các công bô chính
thức và co ghi chu rõ ràng.
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đặng Thi Yến


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 2
3. Nhiêm vu nghiên cứu ......................................................................................... 2
4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn............................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU.......................................................... 4
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ................................ 4
1.1.1. Đặc điêm phân loại của Acetobacter xylinum............................................. 4
1.1.1.1. Vi trí phân loại........................................................................................... 4
1.1.1.2. Đặc điêm vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................................. 4
1.1.1.3. Nhu cầu dinh dương của vi khuẩn A. xylinum .......................................... 4
1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum ............. 5
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK ........................................................................... 5
1.1.2.2. Đặc tính của màng CVK ........................................................................... 5
1.1.2.3. Sinh tổng hợp CVK................................................................................... 6

1.1.2.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................... 6
1.1.3. Giới thiệu tổng quan về thuốc Omeprazole ................................................. 7
1.2. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nươc ............... 8
1.2.1. Trên thế giới ................................................................................................. 8
1.2.2. Ở Viêt Nam................................................................................................... 8
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................10
2.1. Vật liêu và trang thiết bi nghiên cứu .............................................................10
2.1.1 Chủng vi sinh ..............................................................................................10


2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................10
Các vật liệu sư dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1: ...................10
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ....................................................................................10
Các thiết bi sư dung trong nghiên cứu như bảng 2.2: ..........................................10
2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 11
2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................12
2.3.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men .......................12
2.3.2. Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường nươc dừa già ........................12
2.3.3.Phương pháp xư lý màng CVK trước khi nạp Omeprazole........................13
2.3.4. Đánh giá đô tinh khiết của vật liêu CVK ...................................................14
2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn ...............................................................15
2.3.6.Phương pháp xác đinh lượng thuốc hấp thu vào màng CVK .....................16
2.3.7.Chuẩn bi môi trường đêm ...........................................................................17
2.3.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK nạp thuốc.18
2.3.9. Phương pháp đánh giá động học giải phong của Omeprazole…………...20
2.3.10. Phương pháp xư lí sô liêu thống kê……………………………………..21
2.4. Địa điêm tiến hành nghiên cứu .....................................................................21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................22
3.1. Màng Cellulose vi khuẩn nuôi cấy từ môi trường nươc dừa già ..................22
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường................................................................23

3.4. Kết quả quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của Omeprazole26
3.5. Màng sau khi được nạp thuốc Omeprazole...................................................30
3.6. Lượng thuốc giải phong từ màng CVK vào các môi trường pH ..................33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................40


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Vật liệu sư dụng trong nghiên cứu ......................................10
Bảng 2.2. Các thiết bi sư dụng trong nghiên cứu................................. 11
Bảng 2.3: Thành phần môi trường tạo màng CVK..............................12
Bảng 3.1. Bảng nồng đô Omeprazole giá tri OD 276nm (pH = 2)......27
Bảng 3.2. Bảng nồng đô Omeprazole giá tri OD 275nm (pH = 4,5)...28
Bảng 3.3. Bảng nồng đô Omeprazole giá tri OD 275nm (pH = 6,8)...29
Bảng 3.4. Giá tri trung bình của 3 lần đo được của màng dừa ............31
hấp thu thuốc Omeprazole ...................................................................31
Bảng 3.5: Khối lượng thuôc omeprazole hấp thu vào màng CVK
......32 tại thời điêm 2h
....................................................................................32
Bảng 3.6. Mật đô quang khi tiến hành giải phóng thuốc trong các môi
trường pH khác nhau tại các thời điêm khác nhau (n = 3)...................33
Bảng 3.7. Tỉ lê phần trăm giải phóng thuốc omeprazole của các màng
ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau
..............................................................................................................36
Bảng 3.8: Hê sô tương quan R2, tốc đô giải phong thuốc (k) và tri sô sô
mũ giải phóng (n) đối vơi các môi trường pH khác nhau....................38


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đô tinh chế màng CVK .................................................................13

Hình 2.2. Chuẩn bi môi trường đêm ở pH 2; 4,5; 6,8 .......................................18
Hình 2.3. Chuẩn bi điều kiên cho giải phóng máy khuấy từ 50 vòng/phút và ở
nhiệt đô 37°C........................................................................................................19
Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nươc dừa già...............23
Hình 3.2. Thu màng CVK thô ở các khoảng thời gian khác nhau.....................24
Hình 3.4. Màng đa được tinh chế và kiêm tra đô tinh sạch ...............................26
Hình 3.5. Biểu đô biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 2 ..................27
Hình 3.6. Biểu đô biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 4,5 ...............28
Hình 3.7. Biểu đô biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 6,8 ...............30
Hình 3.8. Mật đô quang phổ của màng CVK - Omeprazole trong các đô dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau ................................................................35
Hình 3.9. Đô thi biêu diễn tỉ lê giải phóng thuốc từ màng CVK.......................37


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một sô loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum [2, 4]. Màng sinh học (CVK) co cấu trúc
và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tư glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucozit). Nhưng cellulose vi khuẩn cũng khác với
cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tư như ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng co những đặc tính vượt trội với
đô dẻo dai, bền chắc, co khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và đô tinh khiết
cao [2,5]. Trên thế giơi màng Cellulose vi khuẩn đa được ứng dụng nhiều trong
các lĩnh vực công nghê như dùng làm màng phân tách cho quá trình xư lí nươc,
chất mang đặc biêt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi
đô nhơt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh
học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [7]. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng
CVK đa được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều tri bỏng
[3, 4], loét da, làm mạch máu nhân tạo điều tri các bệnh tim mạch, làm mặt nạ

dương da cho con người. Ở Viêt Nam, viêc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK
còn ở mức đô khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mơi chỉ dừng lại bước đầu
nghiên cứu.
Omeprazole được dùng đê điều tri các rối loạn về dạ dày và thực quản
(như trào ngược axit, viêm loét). Thuốc hoạt động bằng cách làm giảm lượng
axit do dạ dày tiết ra. Thuốc giúp làm giảm các triệu chứng như ợ nóng, kho nuốt
và ho dai dẳng. Thuốc giúp chữa lành tổn thương dạ dày và thực quản do axit,
giúp ngăn ngừa các vết loét, và co thê giúp ngăn ngừa ung thư thực quản.
Omeprazole thuộc nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPI).

1


Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thu
thuốc co kiêm soát, tăng khả dụng sinh học của thuốc Omeprazole trong điều tri
bệnh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Ngiên cứu kha năng giải phóng thuốc
omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men tư môi trường nước dừa
già”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Thiết kế hê thống màng CVK được lên men từ môi trường nước dừa già.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK lên
men từ môi trường nươc dừa già.
- Sư dụng màng đê bảo vê thuốc Omeprazole tránh tác nhân gây ảnh hưởng
tơi thuốc trong quá trình sư dụng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xư lí màng CVK lên men từ môi trường nươc dừa già.
- Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp thuốc Omeprazole.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng Omeprazole từ hê thống CVK đa được
nạp thuốc ở môi trường pH khác nhau, định hướng sư dụng.
4. Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiêm.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK, định hương viêc khắc
phục nhược điêm của thuốc.
+ Viêc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế của
thuốc Omeprazole sẽ mở ra một hương nghiên cứu mơi không chỉ dừng lại


ở viêc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn co thê ứng dụng trên
nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển
hơn. Bên cạnh đo ta cũng co thê tìm ra được những ưu nhược điêm của
màng CVK đê từ đo co những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính của
màng CVK, hạn chế các yếu điêm của màng đê ứng dụng màng trên nhiều
lĩnh vực khác nhau.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum.
+ Từ màng CVK đa được tạo ra được dùng đê nghiên cứu khả năng giải
phóng thuốc nhằm khắc phục được những tác dụng phu không mong
muốn trong việc điều tri rối loạn dạ dày và thực quản bằng thuốc
Omeprazole.
+ Từ kết quả nghiên cứu được co thê áp dụng vào thực tiễn.


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
1.1.1.1. Vị trí phân loại

A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, ho
Pseudomonadaceae.
Là loại hiếu khí bắt buộc, co chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:
+ Lơp: Schizomycetes
+ Bộ: Pseudomonadales
+ Bô phụ: Pseudomonadieae
+ Họ: Pseudomonadaceae
1.1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum
A. xylinum co dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thươc ngang khoảng
0,6 - 0,8µm, dài khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di
động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi. Nhưng khi tế bào già hay do điều
kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng co thê bi biến đổi: tế bào dài hơn, phình to
ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lơn dần, đường kính hạt từ 2 – 5mm, tròn, nhày, rìa mép
trơn, co màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, co màu cafe
sữa rồi khô dần.
1.1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A.
xylinum


A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt đô tối ưu cho vi khuẩn phát triển
từ 25 – 300C, ở 370C tế bào sẽ bi suy thoái hoàn toàn và nhiệt đô thích hợp nhất
là 250C. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ưu đê sản xuất
cellulose là 5,5.
A. xylinum sư dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau. Tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường co thê thay đổi, nhưng đường hay được sư dụng và cho
hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất
thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.

Khi nuôi cấy, đê tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung
acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sư dụng đường đê chuyên hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48h lớp
màng dày, trong và đạt đến đô dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1,4 glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đa cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của
CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng khác
nhau về cấu trúc đại thê [7].
Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ co bản chất là
hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bo hợp
thành day, mỗi day dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm.
1.1.2.2. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dương lỏng
thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm


tương tư như giấy da với đô dày 0,01 – 0,5nm. Sản phẩm này co những tính chất
rất đặc biêt như: đô tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, đô kết tinh và đô bền cơ
học cao, co thê bi phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không
độc và không gây di ứng, co khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản
khuẩn. Vơi các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều trong các ngành
công nghiêp khác nhau trong đo co y học.
1.1.2.3. Sinh tổng hợp CVK
Quá trình lên men:
-

Pha sinh trưởng

-

Pha tích tu sản phẩm

-

Quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum

1.1.2.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dương cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tô
tăng trưởng và các yếu tô vi lượng.
Nhu cầu sư dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên co rất nhiều nghiên cứu và đề nghi sư dụng
các sản phẩm thư cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nươc dừa
già, nươc mía...đê làm nguyên liêu trong nuôi cấy A. xylinum. Trong đo nươc dừa
già được xem là môi trường điên hình trong nuôi cấy A. xylinum.
Nươc dừa già là môi trường thích hợp đê nuôi cấy vi khuẩn do trong nươc
dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng trưởng như 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,...Vì vậy, A. xylinum rất
thích hợp phát triển trong môi trường này.
Nươc dừa sau khi thu hoạch được sư dụng không quá 3 ngày, tránh đê lâu


làm cho đường và các chất dinh dương khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém.
1.1.3. Giới thiệu tổng quan về thuốc Omeprazole
Nhóm dược lí: Thuốc đường tiêu hóa
Tên biêt dược: Abacid, Bicasan, Drivo
Dạng bào chế: viên nang; viên nén bao phim; viên nén; bột pha dung dịch
tiêm

Thành phần: Omeprazole
Công thức hóa học:

Công thức phân tử: C17H19N3O3S [1]
Tên khoa học: 5-methoxy-2-[4 methoxy-3,5 dimethyl-2 pyridinyl methyl
sulfinyl] -1H-benzimidazole [1]
Trọng lượng phân tử: 345,4
Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng. Rất kho tan trong nươc, tan trong
dicloromethan, hơi tan trong ethanol 96% và methanol, tan trong dung dịch kiềm
loãng [1].
Dược lực: Omeprazole là chất ức chế đặc hiệu tác dụng bằng cách khóa hê
thống enzyme của Hydrogen-potassium Adenosine Triphosphatase, cũng gọi là
bơm proton H+ K+ ATPase của tế bào thành dạ dày.
Dược động học: Omeprazole bi hủy trong môi trường acid, nên thuốc ở
dươi dạng viên bao không tan ở dạ dày chỉ hấp thu ở tá tràng, ruột non [16].


Thuốc bắt đầu tác dụng 1 giờ sau uống, đạt đỉnh cao nồng đô huyết tương sau 2
giờ, và sư hấp thu hoàn toàn sau 3 giờ đến 6 giờ.
Omeprazole bi sinh biến đổi ở gan. Các chất chuyên hóa không hoạt tính
trong huyết tương là sulfon, sulfua, hydroxyl omeprazole. 80% các chất chuyên
hóa bài tiết trong nước tiểu, 20% bài thải theo phân.
Thuốc Omeprazole chỉ định: loét tá tràng tiến triên, loét dạ dày tiến triển,
viêm thực quản do hồi lưu dạ dày - thực quản, hội chứng Zollinger - Ellison [1,
12].
Liều tiêu chuẩn: 20mg/ ngày
Tác dụng phụ: thuốc dung nạp tốt. Các triệu chứng như buồn nôn, nhức
đầu, đầy hơi và táo bón rất hiếm. Thỉnh thoảng co ban da nhưng biểu hiện này
thường nhẹ và chóng hết.
1.2. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1. Trên thế giới
Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đa được ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghê khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xư lí nươc, chất mang đặc biêt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm
chất biến đổi đô nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biêt trong lĩnh vực y
học, màng CVK đa được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình
điều tri bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu tri các bệnh tim mạch; làm
mặt nạ dưỡng da cho con người.
1.2.2. Ở Việt Nam


Ở Viêt Nam, viêc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức đô khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mơi chỉ dừng lại bươc đầu nghiên cứu. Các kết
quả ứng dụng của màng CVK hầu như mơi chỉ dừng lại ở điều kiên thí nghiêm.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyên chọn được chủng A. xylinum BHN co khả
năng tạo màng CVK và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng CVK từ
chủng A. xylinum BHN co khả năng ứng dụng cho tri bỏng cho thỏ là cơ sở đê
tạo ra màng tri bỏng cho người [2, 3].
Mong muốn khắc phục được những tác dụng phu của thuốc Omeprazole
trong chữa bệnh viêm loét dạ dày, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết
kiêm được chi phí. Màng CVK co thê tư sản xuất trong nước từ những nguồn
nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, co những đặc tính phù hợp trong viêc
nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole.


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và trang thiết bi nghiên cứu
2.1.1 Chủng vi sinh

Vi khuẩn tạo Cellulose từ dịch trà xanh lên men [5, 9, 11] được nuôi cấy tại
Phòng sạch Vi sinh - Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Các vật liệu sư dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1:
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

1

Omeprazole

Mỹ

2

Nươc dừa già

3

D- Glucose

Trung Quốc

4

Axit acetic

Viêt nam

5

Amoni sulfat

Trung Quốc

6

Disodium phosphate

Trung Quốc

7

Axit citric

Trung Quốc

8

Peptone

European Union

9

Natri hidroxit

Viêt Nam

10

Nươc cất 2 lần

Viên NCKH và UD trường
Đại học Sư phạm HN 2

11

Ethanol

Nhà máy hóa chất Đức Giang

12

Kali dihidrophotphat

Trung Quốc

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bi sư dung trong nghiên cứu như bảng 2.2:


Bảng 2.2. Các thiết bi sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bi

Nước sản xuất

Địa điểm nghiên cứu

Nồi hấp khư trùng HV- Nhật Bản

Viên NCKH&ƯD Trường

110/HIRAIAMA

ĐHSP Hà Nội 2

Máy đo quang phổ UV- Shimadru - Nhật Bản

Viên NCKH&ƯD Trường

Vis 2450

ĐHSP Hà Nội 2

Cân phân tích, cân kĩ Sartorius - Thụy Sỹ

Viên NCKH&ƯD Trường

thuật

ĐHSP Hà Nội 2

Buồng cấy vô trùng

Haraeus

Viên NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Tủ sấy, tủ ấm

Binder - Đức

Viên NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Khuấy

từ

gia

nhiệt IKA - Đức

Viên NCKH&ƯD Trường

CC162

ĐHSP Hà Nội 2

Máy lắc tròn tốc đô chậm Orbital

Viên NCKH&ƯD Trường

Shakergallenkump

– ĐHSP Hà Nội 2

Anh
Tủ lạnh Daewoo, tủ
lạnh sâu

Viên

NCKH&ƯD

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Bình tam giác co chia vạch, ống nghiêm, cốc đong thủy tinh co chia vạch,
bình thủy tinh, lo penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ, thước, gạc vô trùng, giấy lọc, giấy
bạc và các dụng cu hóa sinh thông dụng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum.


- Xư lí màng CVK thô đê thu được CVK tinh chế.
- Cho màng CVK nạp thuốc Omeprazole.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole từ hê thống đa làm,
từ đo chọn ra hê thống màng cho khả năng giải phóng thuốc chậm nhất.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter tư dịch trà xanh lên men
Đun sôi 1000ml nươc, bổ sung 20g trà xanh đê trong thời gian 10 - 15
phút. Sau đo lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đường khuấy
đều, đê nguội. Sau 7 – 10 ngày ở nhiệt đô 30oC thu được dịch trà đường lên men

(chứa vi khuẩn Acetobacter: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum,... )
[5, 9, 11] và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.
2.3.2. Phương pháp tạo màng CVK tư môi trường nước dưa già
A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường cải biến từ môi trường chuẩn
Hestrin - Schramm và được trình bày ở bảng 2.3 dươi đây:
Bảng 2.3: Thành phần môi trường tạo màng CVK
Glucose 20g

Nươc dừa già 1000ml

KH2PO4 0,3g

Acid axetic 2%

(NH4)2SO4 0,5g

10% dịch giống A. xylinum

Pepton 10g
Hấp trong nồi khư trùng ở 113°C, 15 phút. Sau đo môi trường được khư
trùng bằng tia UV trong 30 phút đê nguội môi trường rồi bổ sung thêm 10% dịch
giống và 2% acid acetic. Cuối cùng, ủ tĩnh trong khoảng 6 - 14 ngày ở 26°C 
thu màng.


2.3.3.Phương pháp xử lý màng CVK trước khi nạp Omeprazole
Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 14 ngày ở 26°C, màng CVK được nhúng vào nước
cất, và sau đo các màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy
trình được thê hiện ở sơ đô hình 2.1 dưới đây:

Tách màng CVK thô
Ép loại nươc
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép
Hấp trong nồi hấp
113℃, 1 giờ
Ngâm trong nươc
48h, kiêm tra tạp chất
CVK tinh chế
Hình 2.1: Sơ đồ tinh chế màng CVK
-Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
- Trong màng chứa một lượng lơn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong
NaOH 3% đê phá vơ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tô của vi
khuẩn [4].
- Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước cất 2 lần
rồi ép màng, sau đo ngâm với HCl 3% khoảng 48h đê trung hòa hết NaOH.


- Ngâm nươc: Màng sau khi ngâm vơi HCl rửa sạch bằng nươc cất 2
lần rồi ép màng. Ngâm nươc cất 2 lần đê trung hòa hết acid trong khoảng
48h ta thu được Cellulose vi khuẩn tinh chế [4].
2.3.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK
Nhằm đảm bảo cho vật liệu CVK sau khi xư lý đa loại được các tạp chất
co thê gây độc hại. Sư dụng đường glucose và protein của vi khuẩn là chất
đê khảo sát.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong CVK tinh chế
Nguyên tắc: + Dùng thuốc thư Fehling mơi pha đê phát hiện sư hiện
diện của đường D - glucose, nếu co sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ [3].
Tiến hành:

+ Dịch thư của vật liệu CVK các loại sau khi đa xư lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng là nươc cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiêm chứa mẫu thư mỗi ống nghiêm 1ml thuốc thư
Fehling rồi ngâm trong cốc nươc nóng.
+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiêm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu CVK tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo kết tủa
của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: + CVK tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nươc cất, lắc kỹ
với máy rung siêu âm trong 10 phút.
+ Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% đê phát hiện sư hiện diện của
protein trong dịch chiết màng.
+ Mẫu chứng âm là nươc cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1%
(pepton đa sư dụng đê nuôi cấy vi khuẩn).


+ Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục. So sánh với mẫu chứng âm
không chứa protein [3].
Vật liệu CVK tinh chế dùng đê tạo màng nạp thuốc phải đạt được những
tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, co khả năng áp sát vào da, co tính
che phủ tốt.
+ Đô ẩm thích hợp, co khả năng hút nước và dịch mô.
2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn
Nguyên lí: Sư dụng máy đo quang phổ tư ngoại UV - 2450 đo mật đô quang
phổ (OD) của Omeprazole ở các nồng đô khác nhau vơi bươc sóng 275nm.
Máy quang phổ bao gồm hê thống quang học co khả năng cung cấp ánh
sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Và co hai cuvet đo dùng cho dung dịch
thư và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về đô dài
quang trình của cốc đo là ±0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác

thận trọng [1].
Thực hiên:
+ Chuẩn bi dung dịch mẫu trắng: NaOH 0,1N.
+ Chuẩn bi dung dịch mẫu chuẩn chứa thuốc Omeprazole ở các nồng đô
(mg/ml) khác nhau: 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% mg/ml trong dung môi
NaOH 0,1N.
+ Đê kết quả đo co đô chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần
và đo quang phổ 3 lần, lấy giá tri trung bình đê xây dựng đường chuẩn.
Phương trình biểu diễn mối quan hê giữa nồng đô và đô hấp thu co dạng:
y = ax + b với R2 là hê sô tương quan
Trong đó:

y: đô hấp thu của dung dịch tại λmax


x: nồng đô của dung dịch
Giá tri mật đô quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng đô khác nhau.
Làm tương tư trên khảo sát phổ Omeprazole và xây dựng khoảng tuyến tính
định lượng (đường chuẩn) của Omeprazole trong môi trường pH = 2,0; 4,5 và
6,8.
2.3.6. Phương pháp xác định lương thuốc hấp thụ vào màng CVK
Sư dụng màng CVK được tạo ra từ nươc dừa già co kích thươc 0,5cm
và đô dày 1cm, đem hấp thu theo các thông sô thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa .
Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 xác định lượng Omeprazole trong
CVK đa nạp thuốc.
Lấy giá tri OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được
nồng đô Omeprazole (C%) trong dung dịch, từ đo tính được khối lượng
Omeprazole co trong dung dịch theo công thức sô 1:
C% (w/v) = x 100% (1)
Trong đó: C% là nồng đô phần trăm khối lượng - thê tích chỉ sô

mg chất tan co trong 100ml dung dịch.
mct: khối lượng chất tan (mg).
Vdd: thê tích của dung dịch (ml).
Sau khi tính được lượng thuốc Omeprazole co trong dung dịch ta tính
được khối lượng thuốc Omeprazole được hấp thu vào màng CVK theo công thức
2:
mht = m1 - m2 (2)
Trong đó: mht là khối lượng thuốc Omeprazole được hấp thu vào
màng CVK (mg).
m1 là khối lượng thuốc Omeprazole ban đầu (mg).


m2 là khối lượng thuốc Omeprazole trong dung dịch sau
khi hấp thu (mg).
Hiêu suất nạp thuốc vào màng CVK được tính theo công thức 3:
EE (%) = mht/m1 x 100% (3)
Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng.
2.3.7. Chuẩn bị môi trường đệm
Pha 3 dung dịch đệm co pH là 2; 4,5; 6,8 theo cách pha chế một sô dung
dịch chuẩn đô theo Dược điên Viêt Nam [1].
+ Dung dịch đêm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nươc, thêm
119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nươc vừa đủ 1000ml, đo pH và
hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH).
+ Dung dịch đêm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong
1000ml nươc, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH).
+ Dung dịch đêm pH = 6,8: Hoà tan 28,80g dinatri hydrophosphat và
11,45g kali dihydrophosphat trong nươc vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH
nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).