Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

=====
=

NGUYỄN THỊ SINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên
ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS. NGUYỄN PHÚC HƯNG

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
thầy TS. Nguyễn Phúc Hưng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người đã
hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận vừa qua.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy, cô giáo của Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình làm thực nghiệm tại
trường.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo đã giảng dạy em

trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên ghế giảng đường
đại học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh
nhất. Nhưng do lần đầu em được làm quen với công việc nghiên cứu khoa
học, cũng như sự hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh
khỏi những thiếu sót mà bản thân em chưa thấy. Em rất mong được sự đóng
góp của quý thầy cô và các bạn để đề tài khóa luận tốt nghiệp đại học của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Sinh


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
Omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo
gạo” do chính em thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Phúc Hưng,
Trường Đại Học Sư phạm Hà Nội. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong
khóa luận là trung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kì công trình
nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Sinh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

.......................................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề
tài.......................................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu
................................................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên
cứu............................................................................................... 3
4. Nhiệm vụ nghiên
cứu................................................................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
....................................................................................... 3
NỘI
DUNG....................................................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU......................................................................................... 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên
cứu........................................................ 5
1.1.1. Giới thiệu về chủng Acetobacter xylinum
............................................................................ 5
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
................................................................................................. 5
1.1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng
CVK.............................................................. 5
1.1.2. Giới thiệu về vật liệu
CVK.................................................................................................... 6
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK
.................................................................................................... 6
1.1.2.2. Tính chất độc đáo của màng
CVK..................................................................................... 7
1.1.2.3. Ứng dụng của màng

CVK.................................................................................................. 8
1.1.3. Thuốc
Omeprazole................................................................................................................. 8
1.1.3.1. Cấu trúc
............................................................................................................................... 8
1.1.3.2. Tính chất của Omeprazole
................................................................................................. 9
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước..........................................................
11
1.2.1. Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn ................................................................
11


1.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc Omeprazole ......................................................................
12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................
14
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................
14
2.1.1. Chủng vi sinh .......................................................................................................................
14
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................................................
14
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ..............................................................................................................
14
2.2. Nội dung nghiên cứu...............................................................................................................
15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................................
15
2.3.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo..................................

15
2.3.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc...................................................
17
2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ..............................................................................
17


2.3.4. Phương pháp xây dựng đường chuẩn .................................................................................
18
2.3.5. Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline)-PBS 1X ...............................
19
2.3.6. Xác định lượng Omeprazole nạp vào màng CVK .............................................................
20
2.3.7. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết
kế............................................................................................................................................. 21
2.3.8. Nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ CVK nạp thuốc với các loại màng CVK có
kích
thước khác nhau và điều kiện môi trường khác nhau ..................................................................
21
2.3.9. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc .................................
22
2.3.10. Xử lý thống kê....................................................................................................................
23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................................
24
3.1. Tạo màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo ...........................................................
24
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường ........................................................................................
25

3.3. Kết quả quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của Omeprazole ......................
26
3.4. Thu màng CVK nạp Omeprazole ..........................................................................................
29
3.5. Giải phóng thuốc từ màng CVK ............................................................................................
30
3.6. Phân tích động dược học giải phóng của Omeprazole .........................................................
34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................................
37
1.1. Kết luận....................................................................................................................................
37
1.2. Kiến nghị .................................................................................................................................
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................................
38


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo .........................................6
Bảng 1.2. Một số thông số dược động học của Omeprazole ..............................10
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu.....................................................14
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...............................................15
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy A. xylium ..........................................................16
Bảng 2.4. Môi trường đệm PBS.........................................................................20
Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch thuốc ở pH = 2 (n = 3)...............................26
Bảng 3.2. Giá trị OD của dung dịch thuốc ở pH = 4,5 (n = 3)............................27
Bảng 3.3. Giá trị OD của dung dịch thuốc ở pH = 6,8 (n = 3)............................28
Bảng 3.4. Khối lượng Omeprazole nạp vào màng CVK tại thời điểm 2 giờ ......30
Bảng 3.5. Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n=3)..................31

Bảng 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole từ màng CVK trong các độ dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3)...................................................33
Bảng 3.7. Hệ số tương quan (R 2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau................................................34


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK .......................................................6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Omeprazole......................................................8
Hình 3.1. Màng CVK nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ..........................24
sau 6 ngày nuôi cấy ...........................................................................................24
Hình 3.2. Thu màng CVK thô loại 6 x 3,5 ở các khoảng thời gian khác
nhau ..................................................................................................................25
Hình 3.3. Thu màng CVK thô loại 5 x 2 các khoảng thời gian khác nhau..........26
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH = 4,5.............28
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH = 6,8...........29
Hình 3.7. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
CVK có độ dày 0,5cm và 1cm trong môi trường pH khác nhau (n=3)...............32
Hình 3.8. Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc của màng CVK .....................................34


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (CVK) được tạo thành từ Acetobacter xylinum có cấu
trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý
đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi
nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban
đầu,... Vì vậy, CVK được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: công
nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, thực phẩm, y học,... đáng chú ý nhất
trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc. CVK đã được sử dụng

như trong một vài hệ thống để phân phối thuốc. Amin và cộng sự [9] đã báo
cáo việc sử dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử
dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng CVK giúp cho thuốc được
giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Gần đây
hơn, Huang và cộng sự [11] nghiên cứu việc sử dụng màng CVK cho việc
kiểm soát in vitro của Omeprazole. Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm
soát sự giải phóng thuốc qua màng CVK còn được thử nghiệm mô phỏng
trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu được cho thấy rằng thuốc đã được giải
phóng với một tốc độ chậm.
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ
khiêm tốn. Nhu cầu về các loại màng để đắp vết thương hở, mặt nạ dưỡng da,
vật liệu dẫn truyền thuốc… trong nước và đều phải nhập ngoại với giá thành
cao. Trong khi đó, màng CVK hoàn toàn có thể sản xuất trong nước bằng
phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường
lỏng.
Omeprazole là chất ức chế đặc hiệu tác dụng bằng cách khóa hệ thống
enzym của Hydrogen-potassium Adenosine triphosphatase, cũng gọi là bơm
proton H+ K+ ATPase của tế bào thành dạ dày. Omeprazole bị hủy ở
môi
1


trường acid, nên thuốc được trình bày dưới dạng viên bao không tan ở dạ
dày, chỉ hấp thụ ở tá tràng, ruột non. Omeprazole bị sinh biến đổi ở gan. Các
chất chuyển hóa không hoạt tính trong huyết tương là sulfon, sulfua và
hydroxy Omeprazole. 80% các chất chuyển hóa (hydroxy-ome-prazole và
acid carboxylic tương ứng) bài thải trong nước tiểu. Phần còn lại 20% bài thải
theo phân. Tác dụng phụ của thuốc là: dung nạp tốt; buồn nôn, nhức đầu,
đầy hơi và táo bón rất hiếm; thỉnh thoảng có ban da, nhưng biểu hiện này
thường nhẹ và chóng hết; khó thở; sưng mặt, môi, lưỡi hoặc họng.

Tuy nhiên, Omeprazole làm chậm sự bài thải của diazepam, phenytoin
và warfarin (là những chất bị chuyển hóa do oxy hóa ở gan). Do đó, phải
giám sát bệnh nhân dùng các thuốc này cùng lúc với Omeprazole và giảm liều
lượng, nhất là với phenytoin.
Môi trường nước vo gạo có nguồn gốc từ thực vật, dễ kiếm, rẻ tiền và có
rất nhiều vi chất dinh dưỡng, vitamin thuộc nhóm B như vitamin B1, B5,…
vitamin E và một số thành phần có lợi khác thích hợp cho vi khuẩn
Acetobacter xylinum phát triển.
Với mục đích chế tạo màng sinh học CVK để khảo sát sự giải phóng
thuốc Omeprazole qua màng nhằm giúp thuốc được giải phóng một cách kéo
dài, chúng tôi đã chọn đề tài: “ Khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và tạo hệ thống CVK đã hấp thụ thuốc
được lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc Omeprezole từ hệ thống
trên nhằm tìm ra hệ thống có khả năng giải phóng thuốc kéo dài, có thể giúp
tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể để thuốc phát huy được hiệu quả tốt nhất
trong việc chữa trị bệnh, từ đó có thể làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc.


3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc
Omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro (nghiên cứu ngoài cơ thể).
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật, Khoa
Sinh học Trường ĐHSP Hà Nội, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tạo được màng CVK từ chủng A. xylinum lên men từ môi trường nước

vo gạo. Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp thuốc Omeprazole.
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole qua màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo đã được nạp thuốc ở
môi trường pH khác nhau.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có những hiểu biết về tiềm
năng giải phóng của màng CVK. Mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả
năng giải phóng của màng CVK trên nhiều loại thuốc khác nhau nhằm tăng
sinh khả dụng và kéo dài thời gian giải phóng của các loại thuốc đó.
Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng
VCK để từ đó có những hướng nghiên cứu để làm tăng các đặc tính của màng
để áp dụng loại màng này vào nhiều lĩnh vực khác nhau trong đời sống thực
tiễn.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum
lên men từ môi trường nước vo gạo.


Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm hệ thống giải phóng thuốc
có thể đưa vào điều trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng thuốc, duy trì nồng
độ thuốc trong máu trong một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho
người bệnh, giảm tác dụng phụ của thuốc không mong muốn.


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Giới thiệu về chủng Acetobacter xylinum

1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
- Màng CVK được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như: Acetobacter,
Achromobacter, Agrobecterium, Pseudomonas,…
- A. cetobacter xylinum là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất.
Giống vi khuẩn A. xylinum sử dụng được lấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh,
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6-0,8µm, dài khoảng 2-3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già
hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài
hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
1.1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng CVK
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp Omeprazole nên có rất nhiều nghiên cứu và đề
nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ
đường, nước dừa già, nước mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum.
Trong đó, nước vo gạo được xem là môi trường thích hợp trong nuôi cấy
A. xylinum.


Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước
vo gạo có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các vitamin như cacbonhydrat,
sắt, vitamin C, vitamin B, vitamin E,... Vì vậy A. xylinum rất thích hợp
để phát triển trong môi trường nước vo gạo, thành phần dinh dưỡng của
nước gạo được thể hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo

Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7% - 8%), Zn (12% - 13%)

Axitamin

Leucine, Valine, Lysine

1.1.2. Giới thiệu về vật liệu CVK
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A.
xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp
bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng CVK.
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
CVK là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng
Acetobacter xylinum. CVK cấu tạo bởi những chuỗi polyme β-1,4-


glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC),
tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [10]. Theo AJ. Brown (1886),
CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính
1,5nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó
hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm.
1.1.2.2. Tính chất độc đáo của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5nm. Sản phẩm này có các
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả năng
thấm hút nước cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme,...
Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể.
Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể,
lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 - 700
lần trọng lượng nước của nó.
Màng CVK có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc, không gây dị ứng và có khả năng chịu nhiệt tốt (khoảng
100oC không gây ảnh hưởng lớn tới màng CVK, nhưng khi nhiệt độ thấp có
thể làm tăng tính mềm dẻo của nó), đặc biệt CVK có khả năng cản khuẩn.
Với đặc tính này CVK đã được ứng dụng làm màng lọc vô khuẩn.

Màng CVK được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có


thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi
trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá
trình tổng hợp.
1.1.2.3. Ứng dụng của màng
CVK
CVK được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như:
thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,... đặc
biệt trong lĩnh vực y học [6,14]. Trong y học, màng CVK thu được từ quá
trình nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo. Ở Brazil,
màng CVK ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da
nhân tạo dùng đắp vết thương [2]. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí
Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị
bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng CVK giúp vết
thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng [4]. Ngoài ra,
sản phẩm CVK còn được ứng dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu
thuật, ghép mô, cơ quan [2].
Ngoài ra, CVK còn được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như:
Trong công nghiệp giấy màu CVK được dùng để sản xuất giấy điện tử chất
lượng cao, trong công nghiệp môi trường đã sử dụng CVK làm màng phân
tách để xử lí nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và
Fonah, 1998), làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học
sử dụng để cố định Protein [4].
1.1.3. Thuốc Omeprazole
1.1.3.1. Cấu trúc

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Omeprazole

Tên khoa học: 5 - methoxy-2-[[(4 - methoxy - 3,5 - dimethyl – 2 pyridinyl) methyl] sulfinyl] 1H - benzimidazole.
1.1.3.2. Tính chất của Omeprazole
Lý tính: Omeprazole dưới dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà. Nóng
chảy ở khoảng 1550C kèm theo sự phân huỷ, khó tan trong nước, khó tan
trong aceton và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol
[8].
Hoá tính: Omeprazole vừa có tính acid, vừa có tính base, hấp thụ mạnh
bức xạ tử ngoại. Các tính chất này được ứng dụng trong định tính, định
lượng và trong bào chế Omeprazole. Độ ổn định của Omeprazole phụ thuộc
vào pH. Trong môi trường acid, Omeprazole nhanh chóng bị phân huỷ, trong
môi trường kiềm Omeprazole khá bền vững [8].
Dược lý và cơ chế tác dụng [1]: Omeprazole là một dẫn xuất của
benzimidazole không có hoạt tính ức chế enzym ở môi trường trung
tính, nhưng ở pH ≤ 5 Omeprazole được proton hoá thành 2 dạng acid
sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm
sulfohydryl của enzym H+ - K+ - ATPase ở tế bào thành nên ức chế bài tiết
acid trên 48 giờ. Do vậy Omeprazole được dùng điều trị trong các trường
hợp : trào ngược dạ dày thực quản, loét dạ dày tá tràng, hội chứng ZollingerEllison.
Dược động học [1]: Omeprazole là một chất ức chế bài tiết dịch vị dạ dày
do ức chế proton ở các tế bào thành dạ dày. Omeprazole được hấp thụ hoàn
toàn ở ruột non sau khi uống từ 3 – 6 giờ. Sinh khả dụng tuyệt đối sau khi
liều uống đầu tiên là khoảng 35%, tăng lên 60% khi dùng chế độ đa liều.
Omeprazole có nửa đời thải trừ ngắn (khoảng 40 phút - 1 giờ), nhưng tác
dụng ức chế bài tiết acid lại phụ thuộc vào thời gian bơm proton bị ức chế, do
đó thời gian thuốc có tác dụng dài hơn nhiều (48 đến 72 giờ) [4]. Omeprazole
được chuyển hóa gần như hoàn toàn ở gan qua hệ cytochrom P450, trong đó

isoenzym chịu trách nhiệm chính trong chuyển hóa Omeprazole là CYP
2C19 và sự bão hòa enzym này phụ thuộc liều. Ngoài ra, thuốc có ái lực thấp
với isoenzym CYP 3A4, isoenzym này chỉ có vai trò chuyển hóa Omeprazole
khi dùng liều rất cao. Các chất chuyển hóa của Omeprazole đều không có
hoạt tính sinh học và được đào thải chủ yếu qua nước tiểu (khoảng 80%),
phần còn lại được đào thải qua phân [20]. Dược động học của thuốc thay đổi
không có ý nghĩa ở người già hay người có chức năng thận suy giảm. Với
những người suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ
thanh thải giảm, nhưng không có biểu hiện tích lũy thuốc trong cơ thể. Một
số thông số dược động học chính của Omeprazole được trình bày trong bảng
1.2.
Bảng 1.2. Một số thông số dược động học của Omeprazole
Thông số DĐH

Giá trị

AUC (µg.h/mL)

0,2 - 1,2

Cmax (µg/ml)

0,08 – 8

Tmax (h)

1–3

T1/2 (h)

0,6 – 1

Cl (L.h/kg)

0,45

Vd (L.kg)

0,31 – 0,34

Sinh khả dụng (%)
Đơn liều

35

Đa liều

60

Tỷ lệ liên kết với protein huyết

95

tương (%)
Chỉ định: Trào ngược dạ dày – thực quản, Loét dạ dày – tá tràng, hội
chứng Zollinger – Ellison.
Chống chỉ định: Mẫn cảm với thuốc.


Phản ứng bất lợi: Một số phản ứng thường gặp có thể xảy ra khi điều trị

với Omeprazole như rối loạn tiêu hóa, buồn nôn và nôn, đau bụng, trướng
bụng. Hiếm gặp hơn là các phản ứng gây mất ngủ, chóng mặt, mày đay, ra
mồ hôi...
Liều dùng và cách dùng: Liều thường dùng cho người lớn là 20 – 40
mg/lần/ngày, thời gian điều trị từ 4 – 8 tuần.
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn
*Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989),
dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để
làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực
phẩm [4]. Các tác giả Hamlyn và cộng sự (1997), Cienchanska (2004),
Legeza và cộng sự (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cộng sự (2006) sử
dụng màng đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt [4].
*Ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng được quan tâm. Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh và cộng
sự [4] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt
hiệu quả cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử
nghiệm in vivo trong ứng dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng
CVK gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả
cho thấy màng CVK có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia
tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không
có.


Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như

Quỳnh [7] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng ”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có
sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển
vọng ứng dụng làm màng trị bỏng.
Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc
tính và cấu trúc màng. Về thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo
màng sinh học dùng trong trị bỏng, và được ứng dụng trong sản xuất thạch
dừa. Hiện nay việc nghiên cứu CVK làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là
một hướng đi mới.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc Omeprazole
*Trên thế giới
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá
hiệu quả và tính an toàn của Omeprazole trong điều trị loét dạ dày tá tràng
cho thấy Omeprazole là thuốc có hiệu lực giảm tiết acid mạnh, cho hiệu quả
giảm triệu chứng nhanh, tỉ lệ lành loét cao.
Ngoài ra đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng diệt HP
của các phác độ khác nhau có chứa Omeprazole. Kết quả nghiên cứu cho
thấy hiệu quả diệt HP phụ thuộc nhiều vào tính kháng thuốc của vi khuẩn,
do đó cần lưu ý đánh giá tính kháng thuốc trước khi lựa chọn phác đồ sử
dụng cho bệnh nhân [20].
Năm 1973 khi các nghiên cứu về cimetidine được thông báo, các nhà
khoa học thụy điển đã nảy ra ý định gắn vòng Benzylimidazol vào chất này
với hy vọng tạo ra một hợp chất mới có tác dụng kháng acid mạnh hơn.
Timoprazole ra đời năm 1975 có tác dụng ức chế bài tiết acid khá mạnh và đã
xác định được tác dụng này là do sự bất hoạt enzym H+, K+/ATPase.
Tiếp


theo đó hàng loạt các thay đổi về công thức hóa học để đến năm 1979

Omeprazole đã dược tổng hợp và được giới thiệu rộng rãi tại hội nghị tiêu
hóa toàn thế giới ở Rome 1988 để rồi sau đó được sử dụng rất phổ biến trên
lâm sàng.
Tháng 8/2003 được sự hỗ trợ kỹ thuật của WHO, Viện Kiểm nghiệm đã
thực hiện nghiên cứu “Mô hình mẫu đánh giá tương đương sinh học các dạng
bào chế trên người tình nguyện” nhằm chuẩn hóa kỹ thuật trong đánh giá
tương đương sinh học in vivo ở Việt Nam. Tiếp theo đó, một số đề tài cấp bộ
đã thực hiện như đánh giá tương đương sinh học viên nang cephalexin,
diclofenac, một số viên tác dụng kéo dài như theophylin, nifecdipin.
Gần đây, một số doanh nghiệp dược trong nước đã quan tâm, yêu cầu
đánh giá tương đương sinh học cho các sản phẩm sản xuất trong nước.
Công ty Dược VTVT Phú Yên, công ty TNHH dược phẩm Sài gòn (SPM),
Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang, Imexpharn, Domesco, Công ty TNHH
Hasan.
*Ở Việt Nam
Ở việt Nam, phần lớn Omeprazole được sử dụng là một loại thuốc chữa
trị bệnh trào ngược dạ dày thực quản và bệnh thực quản ăn mòn.
Tại một số đơn vị nghiên cứu như Viện kiểm nghiệm, trường đại học
Dược Hà Nội, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh... đã bắt đầu
triển khai nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm
Omeprazole [8].
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, Bộ Y tế đã cấp phép cho khoảng 42
chế phẩm của Omeprazole lưu hành ở VN. Hiện nay, 37 sản phẩm có số đăng
kí còn hạn, trong đó có 25 sản phẩm nước ngoài và 12 sản phẩm trong nước.
Các sản phẩm này có giá trị chênh lệch nhau khá nhiều.


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Chủng vi sinh
Vi khuẩn tạo cellulose từ dịch trà xanh lên men [1, 2] được nuôi cấy tại
Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

1

Omeprazole

Mỹ

2

D- Glucose

Trung Quốc

3

Axit acetic

Việt nam

4

Amoni sulfat

Trung Quốc

5

Disodium phosphate

Trung Quốc

6

Axit citric

Trung Quốc

7

Peptone

European Union

8

Natri hidroxit

Việt Nam

9

Nước cất 2 lần

Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP
Hà Nội 2

10

Ethanol

Nhà máy hóa chất Đức Giang

11

Kali dihidrophotphat

Trung Quốc

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
* Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.2.


Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị

Nước sản xuất

Địa điểm nghiên cứu

Nồi hấp khử trùng HV-

Nhật Bản

Viện NCKH&ƯD Trường

110/HIRAIAMA
Máy đo quang phổ UV-

ĐHSP Hà Nội 2
Shimadru - Nhật Bản Viện NCKH&ƯD Trường

Vis 2450
Cân phân tích

ĐHSP Hà Nội 2
Sartorius - Thụy Sỹ

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Buồng cấy vô trùng

Haraeus

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Tủ sấy, tủ ấm

Binder - Đức

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Khuấy từ gia nhiệt

IKA - Đức

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

* Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh,
đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, bình tam giác, lọ
penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định
mức, pipet, thước kẹp panme,... và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo ra màng CVK được lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Cho thuốc được hấp thu vào màng CVK.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc Omeprazole từ hệ thống
được tạo ra từ bước trên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo


A. xylium được nuôi cấy trong môi trường chuẩn Hestrin - Schramm
bằng cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo được trình bày như trong

bảng 2.3.
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy A. xylium
Thành phần

Khối lượng

Nước vo gạo

1000 ml

Glucose

20 g

KH2PO4

2g

(NH 4)2SO4

3g

Pepton

4g

Acid acetic

5 ml

10% dịch giống A.xylium
Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: Môi
trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các bình lên men có
bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các bình được đậy bằng vải xô
có độ xốp giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên
ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho
quá trình lên men là 28- 30oC.
Nguyên liệu nước vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó thêm
các chất dinh dưỡng cần thiết tạo màng. Hấp tiệt trùng ở 113oC, trong 15
phút. Để nguội rồi bổ sung dịch giống đã hoạt hóa vào theo tỷ lệ 1/10 và acid
acetic (5 ml), lắc 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào hộp nhựa đã được
hấp tiệt trùng. Nuôi cấy tĩnh tong 7 ngày, thu được sản phẩm màng CVK thô.


2.3.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và
các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid acetic. Vì vậy, trước khi
hấp thu thuốc cần phải xử lý màng.
Mục đích: Loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tạo thành màng dày ở mặt
môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong
NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử
trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng
nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng
trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng CVK cần đạt là
trung tính, ta thu được CVK tinh khiết.
2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK

Mục đích: Nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại được các
tạp chất có thể gây độc hại. Chất được khảo sát là đường glucose và protein
của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: + Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện
diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng.