Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc ranitidine của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

HOÀNG THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI
PHÓNG THUỐC RANITIDINE CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN
MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA
GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học
ThS. NGÔ THỊ HẢI YẾN

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Ngô Thị Hải Yến và
các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ để em hoàn thiện được khóa luận này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong bốn
năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là
hành trang giúp em vững bước trong tương lai.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh
nhất. Nhưng do lần đầu em được làm quen với công tác nghiên cứu khoa học,
cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi
những thiếu sót mà bản thân chưa thấy được. Em rất mong được sự đóng góp

của quý thầy cô và các bạn để khóa luận của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Hoàng Thi Trang


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của em trong suốt thời gian
qua, những kết quả và số liệu trong khóa luận được em thực hiện tại “Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2”.
Những số liệu đạt được không hề sao chép hay trùng lặp với bất kỳ tài liệu
nào và cũng chưa từng được công bố trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Hoàng Thị Trang


BẢNG VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng anh

Tên tiếng Việt

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

BC

Bacterial cellulose

Cellulose vi khuẩn

OD

Optical Density

Mật độ quang phổ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2
4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 3
5. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 3
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .........................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (BC)............................................................ 4
1.2. Giới thiệu về thuốc ranitidine.................................................................... 6
1.3. Nước dừa già..............................................................................................9
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước. .............................................. 9
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 11
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 11
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 11

2.2.1. Phương pháp dựng đường chuẩn ......................................................... 11
2.2.2. Chuẩn bị màng BC ............................................................................... 13
2.2.3. Chuẩn bị môi trường đệm (Phosphat buffered saline)-PBS 1X ........... 14
2.2.4. Chế tạo màng BC ................................................................................. 14
2.2.5. Xác định lượng Ranitidine nạp vào màng BC ..................................... 15
2.2.6. Khảo sát lượng thuốc giải phóng của màng BC ở các độ dày màng
0,3cm và 1cm, trong các môi trường pH khác nhau ...................................... 16
2.2.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc
Ranitidine........................................................................................................ 17
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ............................................... 17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 18


3.1. Nghiên cứu về độ dày màng ................................................................... 18
3.2.Thu được màng BC thô ............................................................................ 19
3.3. Thu màng BC tinh khiết .......................................................................... 20
3.4. Thu màng BC nạp Ranitidine.................................................................. 20
3.5. Giải phóng thuốc từ màng BC...................................................... ...........22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 29
1. Kết luận ...................................................................................................... 29
2. Kiến nghị ....................................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................30


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ứng dụng màng BC ..........................................................................5
Bảng 2.1. Bảng nồng độ Ranitidine ở giá trị đo OD = 312............................ 12
Bảng 2.2. Môi trường lên men tạo màng BC.................................................. 13
Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tươi.............................................................. 19
Bảng 3.2. Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc....................... 23

Bảng 3.3. Hệ số tương quan bình phương (R2), tốc độ giải phóng (K) và trị số
số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau của hai độ dày
màng BC ........................................................................................................ 27


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của Ranitidine..................................... 12
Hình 2.2. Sơ đồ lên men tạo màng BC ...........................................................13
Hình 3.1. Màng BC khi lên men..................................................................... 18
Hình 3.2.a. Màng dừa thô 1cm....................................................................... 19
Hình 3.2.b. Màng dừa thô 0,5cm.................................................................... 19
Hình 3.3.a. Màng dừa tinh khiết 1cm............................................................. 20
Hình 3.3.b. Màng dừa tinh khiết 0,5cm.......................................................... 20
Hình 3.4.a. Màng dừa nạp thuốc 1cm ............................................................ 21
Hình 3.4.b. Màng dừa nạp thuốc 1cm ............................................................ 21
Hình 3.5.a. Mật độ quang phổ lượng thuốc giải phóng ở pH = 2 của màng
0,5cm .............................................................................................................. 23
Hình 3.5.b. Mật độ quang phổ lượng thuốc giải phóng ở pH = 2 của màng
1cm .............................................................................................................. 24
Hình 3.5.c. Mật độ quang phổ lượng thuốc giải phóng ở pH = 4,5 của màng
0,5cm .............................................................................................................. 24
Hình 3.5.d. Mật độ quang phổ lượng thuốc giải phóng ở pH = 4,5 của màng
1cm ............................................................................................................... 25
Hình 3.5.e. Mật độ quang phổ lượng thuốc giải phóng ở pH = 6,8 của màng
0,5cm .............................................................................................................. 25
Hình 3.5.f. Mật độ quang phổ lượng thuốc giải phóng ở pH = 6,8 của màng
1cm ................................................................................................................. 26


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là BC) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng sinh học (BC) có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với
nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực
vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai,
bền chắc [1]. Màng BC được coi là 1 nguồn polymer mới, là giải pháp trên
con đường tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới hiện nay.
Trên thế giới, màng BC đã được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực
công nghệ khác nhau: dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình
xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,
làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm,
thiết kế hệ thống giải phóng thuốc giúp thuốc giải phóng kéo dài với tốc độ
chậm và nhiều ứng dụng khác [7, 8]. Trong lĩnh vực y học, màng BC đã được
ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da,
làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho
con người [3, 11].
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn. Nhu cầu về các loại màng để đắp vết thương hở, mặt nạ dưỡng da,
vật liệu dẫn truyền thuốc… đều phải nhập ngoại với giá thành cao. Trong khi
đó, màng BC hoàn toàn có thể sản xuất trong nước bằng phương pháp lên men
tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylium trong môi trường lỏng.
Ranitidine là một chất đối kháng thụ thể histamin H2 có tính chọn lọc
cao và là một thuốc ức chế tiết acid dịch vị mạnh. Do đó, ranitidine ức chế cả
sự tiết dịch vị của tế bào nền và tiết acid do histamin, pentagastrin và các chất

1

gây tiết khác. Trên cơ sở khối lượng, ranitidine mạnh hơn cimetidine trong
khoảng từ 4 đến 9 lần nhưng tác dụng phụ không mong muốn lại ít hơn.
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những tác
dụng phụ không mong muốn như: nhức đầu, nổi ban, chóng mặt, táo bón, tiêu
chảy và buồn nôn. Các phản ứng này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc.
Với mục đích tạo ra màng BC dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A.
xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, khắc phục
tính ít tan trong nước và khả dụng sinh học của BC trong việc điều trị bệnh.
Đó là lý do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
ranitidine của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa
già”.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế chế tạo hệ thống màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi
trường nước dừa già được nạp thuốc ranitidine và nghiên cứu khả năng giải
phóng thuốc từ hệ thống này.
Chế tạo hệ thống BC đã nạp thuốc ranitidine có khả năng kéo dài thời
gian giải phóng thuốc, điều này có thể giúp cải thiện sự hấp thụ thuốc vào cơ
thể, nâng cao được hiệu quả tốt trong chữa trị viêm loét dạ dày ở người.
3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng giải phóng thuốc ranitidine của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già.
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật
khoa Sinh - KTNN_Trường ĐHSP Hà Nội 2, Viện Nghiên cứu Khoa học
và Ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội 2.


4. Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế, tạo màng BC, nạp Ranitidine vào màng.
- Thử nghiệm tác dụng của màng BC nạp Ranitidine trong quá trình giải
phóng thuốc. Đánh giá sự hấp thụ và giải phóng thuốc của màng BC.
5. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ môi trường nước dừa già, thuốc
Ranitidine dạng tinh khiết 95%.
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC.
- Mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng giải phóng của màng
BC trên nhiều loại thuốc khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời
gian giải phóng của các loại thuốc đó.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng màng BC làm hệ thống vận chuyển thuốc nhằm định hướng
tạo ra hệ thống nạp và giải phóng thuốc đạt hiệu quả cao có thể cải thiện
những hạn chế của thuốc trong điều trị bệnh.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (BC)
Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần
chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của
vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn (BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ
yếu tạo màng bảo vệ [4].
1.1.1. Tính chất độc đáo của BC
- Độ tinh khiết cao.
- Độ bền dai cơ học lớn.
- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm.
- Màng cellulose được định hướng trong quá trình tổng hợp.
- Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp.

- Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen
liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose [4].
1.1.2. Màng BC lên men từ môi trường nước dừa già.
Màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già là một
nguồn nguyên liệu mới có đặc tính riêng biệt so với màng cellulose được lên
men từ những môi trường khác [4].
1.1.3. Ứng dụng của màng BC
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5 nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, không độc và không gây dị
ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn. Với các tính


chất này, BC được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau
[4].
Bảng 1.1. Ứng dụng màng BC
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm
- Tráng miệng ( thạch dừa)
- Ăn kiêng ( kem, salad)

Thực phẩm

- Thịt nhân tạo
- Vỏ bao xúc xích
- Nước uống siro không có cholesterol

- Trà Kobucha hay Manchurian
- Lớp màng trị bỏng

Y dược

- Tác nhân vận chuyển thuốc
- Da nhân tạo
- Chất làm co mạch

Mỹ phẩm

- Móng nhân tạo
- Đánh mỏng dày và mỏng hơn
- Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Môi trường

- Hấp thu chất độc
- Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ
Trang phục
Thể thao

- Thu hồi dầu
- Sản xuất sợi nhân tạo
- Y phục quân đội
- Lều lắp ráp
- Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

- Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ
- Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

- Làm màng lọc


1.2. Giới thiệu về thuốc ranitidine
- Ranitidine là một chất đối kháng thụ thể histamin có tính chọn lọc cao.
Có tính chất dạng bột kết tinh trắng hoặc vàng nhạt, tan hoàn toàn trong
nước, hơi tan trong ethanol khan, rất khó tan trong methylen clorid. Chế
phẩm có tính đa hình [5].
- Tên chung quốc tế: Ranitidine.
- Thành phần: Ranitidine hydrochloride
- Loại thuốc: Ức chế tiết acid dịch vị mạnh. Do đó, ranitidine ức chế
cả sự tiết dịch vị của tế bào nền và tiết acid do histamin, pentagastrin và các
chất gây tiết khác [5].
1.2.1. Tác dụng
Ranitidine được sử dụng để điều trị loét dạ dày và ruột đồng thời ngăn
ngừa bệnh tái phát sau khi điều trị. Loại thuốc này cũng được sử dụng để điều
trị và ngăn chặn các vấn đề ở dạ dày và cổ họng (thực quản) gây ra bởi dư
lượng axit trong dạ dày (ví dụ như hội chứng Zollinger-Ellison, viêm thực
quản ăn mòn) hoặc trào ngược axit dạ dày vào thực quản (bệnh trào ngược dạ
dày - GERD). Ranitidine được biết đến như là thuốc chẹn histamine, hoạt
động bằng cách giảm lượng axit trong dạ dày của bạn. Điều này giúp chữa
lành và ngăn ngừa lở loét và cải thiện các triệu chứng như ợ nóng, đau dạ dày
[5].

Sự ức chế tiết acid dạ dày đã quan sát được qua việc dùng ranitidine
theo đường tĩnh mạch, cho vào tá tràng và theo đường uống. Tác động về ức
chế này phụ thuộc vào liều lượng với đáp ứng tối đa đạt được với liều uống
150mg. Sự tiết pepsin cũng bị ức chế tuy nhiên sự tiết của niêm dịch dạ dày
không bị ảnh hưởng. Ranitidine không làm thay đổi sự tiết bicarbonate hay
men tụy đáp ứng với secrectin và pancreozymin [5].


Ranitidine được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ tối đa
trong huyết tương đạt được trong vòng 2 đến 3 giờ. Nồng độ trong huyết
tương không bị ảnh hưởng đáng kể khi có thức ăn ở dạ dày tại thời điểm uống
hay khi có sự hiện diện của các thuốc kháng acid. Khả dụng sinh học của
ranitidine dùng theo đường uống vào khoảng 50%. Sự gắn kết protein với
ranitidine ở người vào trong khoảng 10 đến 19%. Thời gian bán hủy đào thải
vào khoảng 3 giờ. Đường đào thải chủ yếu là nước tiểu (tỷ lệ đào thải trong
nước tiểu của ranitidine dạng tự do và chuyển hóa trong 24 giờ sau khi uống
một liều 100mg là vào khoảng 33%). Có một mối tương quan tuyến tính giữa
liều lượng (lên tới 150mg) và tác dụng ức chế tiết acid dạ dày. Nồng độ
ranitidine trong huyết tương là 93,6ng/ml (trong khoảng 48 -125) có tác động
ức chế sự tiết acid dạ dày được kích thích vào khoảng 50%. IC50 của
ranitidine ở vào khoảng 100ng/ml. Khi uống 150mg ranitidine, nồng độ huyết
tương vượt quá IC50 (100ng/ml) kéo dài hơn 8 giờ và sau 12 giờ, nồng độ
huyết tương vẫn còn đủ cao để cho tác dụng ức chế sự tiết acid dạ dày. Ở bệnh
nhân loét tá tràng, uống 150mg ranitidine mỗi 12 giờ làm giảm đáng kể hoạt
tính ion hydrogen trung bình trong 24 giờ đến 69% và lượng acid dạ dày tiết
ra vào ban đêm đến 90%. Nồng độ hữu hiệu trong máu của ranitidine duy trì
qua 24 giờ với một liều đơn duy nhất 300mg hay 150mg hai lần mỗi ngày.
Mặc khác, tính theo độ acid trong 24 giờ và lượng acid tiết ra vào ban đêm,
150mg ranitidine dùng hai lần mỗi ngày ưu việt hơn 200mg cimetidine ba lần
mỗi ngày và 400mg vào buổi tối (với p < 0,001 và 0,05 tương ứng) [5].

Ở người tình nguyện sử dụng ranitidine, không có báo cáo về tác dụng
ngoại ý đáng kể trên đường tiêu hóa hay hệ thần kinh trung ương; hơn nữa,
nhịp tim, huyết áp, điện tâm đồ và điện não đồ không bị ảnh hưởng nhiều khi
dùng ranitidine. Ở người tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân, ranitidine
không ảnh hưởng nồng độ trong huyết tương của các nội tiết tố sau : cortisol,


testosterone, oestrogen, GH, FSH, LH, TSH, aldosterone hay gastrin - mặc dù
cũng như cimetidine, ranitidine làm giảm lượng vasopressin tiết ra. Điều trị
với liều 150mg ranitidine hai lần mỗi ngày đến 6 tuần không làm ảnh hưởng
trục hạ đồi - tuyến yên - tinh hoàn, buồng trứng hay thượng thận. Với liều
tiêm tĩnh mạch 50mg ranitidine không có tác dụng trên nồng độ prolactin. Chỉ
với liều tiêm tĩnh mạch 300mg mới thấy có sự tăng tiết prolactin, tương tự
như tác dụng sinh ra do liều 200mg cimetidine tiêm tĩnh mạch [5].
1.2.2. Tác dụng phụ
Nhức đầu, nổi ban, chóng mặt, táo bón, tiêu chảy và buồn nôn đã được
báo cáo xuất hiện ở một số rất ít bệnh nhân được điều trị với thuốc nhưng
cũng xảy ra ở những người dùng giả dược. Một vài bệnh nhân sau khi bị tác
dụng phụ lại dùng thử trở lại ranitidine đã bị tái phát nổi ban da, nhức đầu hay
chóng mặt.
Đã có báo cáo về một vài trường hợp gia tăng transaminase huyết thanh
và g-glutamine transpeptidase nhưng đã trở về tình trạng bình thường trong cả
hai trường hợp tiếp tục trị liệu hay ngưng thưốc. Trong nghiên cứu có đối
chứng giả dược bao gồm gần 2500 bệnh nhân, không có khác biệt giữa tỷ lệ
gia tăng SGOT và SGPT ở nhóm bệnh nhân được điều trị với ranitidine và
nhóm bệnh nhân dùng giả dược. Các trường hợp viêm gan hiếm khi xảy ra
cũng đã được báo cáo, nhưng căn bệnh này cũng thoáng qua và không xác
định được mối liên hệ nhân quả với sự sử dụng thuốc [5].
Phản ứng dạng phản vệ (phản vệ, nổi mề đay, phù mạch thần kinh, co
thắt phế quản) hiếm khi xuất hiện khi dùng ranitidine theo đường uống và

đường tiêm. Đôi khi các phản ứng này cũng xuất hiện sau một liều đơn duy
nhất.


Giảm số lượng bạch cầu và tiểu cầu đã xuất hiện trên một vài bệnh
nhân. Các xét nghiệm huyết học và trên thận không cho thấy bất thường nào
liên quan với thuốc.
Không có ảnh hưởng lâm sàng đáng kể nào về chức năng nội tiết hay
tuyến sinh dục được báo cáo.
1.3. Nước dừa già
Để tạo điều kiện tốt cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn và quá trình
lên men tạo màng tôi sử dụng nước dừa già làm nguyên liệu chính cho quá
trình lên men. Trong nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích
thích tố tăng trưởng như 1, 3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol,
sorbitol, các vitamin, acid amin và các nguyên tố vi lượng… Vì vậy A.
xylinum rất thích hợp phát triển trong môi trường này.
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.4.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989), dùng
màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và
Farad, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi
truyền quang,làm môi trường cơ chất trong sinh học,thực phẩm [2]. Các tác
giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004), Wan và
Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng đắp lên các vết thương hở,vết
bỏng đã thu được kết quả tốt [2].
1.4.2. Tại Việt Nam
- Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng được quan tâm. Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh và cs [2]

đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng BC từ A. xylium đạt hiệu quả cao.


Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong
ứng dụng màng BC điều trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất
tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng BC có cho thêm
hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm
mà các loại màng khác trên thế giới không có.
- Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [4] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacterxylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng BC tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai,độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.
Hiện nay việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là
một hướng đi mới.


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Ranitidine.
- Dung môi là HCl 0,1M.
- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi
khuẩn A. xylinum (Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP
Hà Nội 2) lên men trong môi trường nước dừa già.
- Máy đo quang phổ UV-2450 (Shimadzu-Nhật Bản), Cân phân tích
(Sartorius-Đức), Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA, Buồng cấy vô
trùng (Haraeus), Tủ sấy, Tủ ấm (Binder-Đức), Khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức),
và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC:

• Glucose,
• Pepton,
• Diamoni phosphate,
• Ammonium sulfate,
• Acid acetic,
• Nước dừa già,
• Dịch giống A. xylinum.
Các hóa chất nêu trên đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp dựng đường chuẩn
Mẫu dung dịch chuẩn: Chuẩn bị 150mg/900ml dung dịch thuốc
Ranitidine, trong đó gồm: 150mg Ranitidine, 900ml dung dịch HCl 0,1M


Tiếp tục pha loãng dung dịch thuốc đã pha ở các nồng độ khác tương đương ở
các nồng độ 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%. Dùng hệ thống quang phổ tử
ngoại khả biến (máy UV-Vis) để đo cường độ của vạch phổ hấp thụ của
Ranitidine ở bước sóng 312 nm trong các dung dịch mẫu chuẩn. Kết quả được
thể hiện ở bảng 2.1. Bảng nồng độ Ranitidine ở giá trị đo OD = 312 và hình
2.1. Phương trình đường chuẩn của Rantidine
Bảng 2.1. Bảng nồng độ Ranitidine ở giá trị đo OD = 312
Trung

Nồng độ

Lần 1

Lần 2

Lần 3

10

0,049

0,048

0,047

0,048

20

0,13

0,132

0,131

0,131

40

0,199

0,198

0,195

0,197

60

0,286

0,284

0,286

0,285

80

0,395

0,396

0,394

0,395

100

0,475

0,473

0,472

0,474

Độ
hấp
thụ
quang
phổ

0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

bình

y = 0.086x - 0.045
R² = 0.995

Linear
(OD312nm)
OD312nm

0

10

220

40

460

80

6100

8

Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)

Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của Ranitidine


2.2.2. Chuẩn bị màng BC
- Chuẩn bị màng BC từ A. xylinum ở môi trường nuôi cấy được thể hiện
ở bảng 2.2. Môi trường lên men tạo màng BC
Bảng 2.2. Môi trường lên men tạo màng BC
Nước dừa già

1000ml

Glucose

20g

Diammonium hydrogen phosphate

0,3g

Ammonium sulfate

0,5g

Pepton

10g

Axit axetic

2%

- Từ các thành phần môi trường lên men tạo màng BC ở bảng 2.2, quá
trình tạo màng BC được thể hiện ở sơ đồ hình 2.2
Hóa chất
Cân đủ hóa chất cho vào tam giác 1000ml
Nước dừa
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, hòa tan hóa
chất
Đổ môi trường đã pha vào
bình tam giác 1000ml
Cho vào hấp ở 121°C
Đổ giống
Thêm 2% acid axetic
Lên men

Hình 2.2. Sơ đồ lên men tạo màng BC


- Sau khi ủ tĩnh cho 6 - 14 ngày ở 26°C đạt mức tiêu chuẩn độ dày
0,5cm và 1cm ta lấy màng và dùng khuôn dập nhỏ. sau khi dập đủ số lượng ta
mang đi tinh sạch màng bằng cách: cân 12g NaOH cho vào trong 1000ml
nước cất, sau đó bỏ các màng đã dập sẵn vào trong dung dịch, tiếp theo mang
đi hấp ở nhiệt độ khoảng 121°C trong 2h, sau đó là cho màng đi xả dưới vòi
nước chảy khoảng 1 - 2 ngày và kiểm tra độ tinh sạch của màng. Cuối cùng
thu được màng BC tinh khiết.
2.2.3. Chuẩn bị môi trường đệm
Môi trường đệm dùng để giải phóng thuốc:
- Dung dich đệm pH = 2: Hòa tan 6,57g KCl trong nước, thêm 119ml
dung dịch HCl 0,1M và thêm nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH
nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH)
- Dung dịch đệm pH 4,5: Hòa tan 6.8g kali dihiro phosphat trong 1000ml
nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần ( dùng HCl hoặc NaOH)
- Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 28,8g dinatrihydrophosphat và
11,45g kalihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH
nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH)
2.2.4. Chế tạo màng BC
Mục đích: Chế tạo màng BC nạp và giải phóng thuốc Ranitidine có khả
năng điều trị tốt. Thu màng BC ở các độ dày mỏng khác nhau và sử dụng
màng để ta có thể so sánh được sự khác biệt ở từng độ dày đó.
Nguyên tắc: Vi khuẩn A. xylinum khi cho vào môi trường sẽ sử dụng
chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp nên cellulose. Màng cellulose


dày lên dần và ngưng lại tại một thời điểm nhất định, khi môi trường hết chất
dinh dưỡng. Độ dày của màng sẽ tùy thuộc vào lượng môi trường và thời gian

nuôi cấy.
Cách tiến hành: Môi trường được pha với hoá chất như ở trên mang đi
hấp khử trùng rồi cho vào các bình nuôi cấy với độ dày môi trường khác nhau
như sau:
+ Lô 1: Độ dày môi trường là 0,5cm
+ Lô 2: Độ dày môi trường là 1cm
Theo dõi sự tạo thành màng ở các lô sau các khoảng thời gian, thu được
màng ở những độ dày khác nhau.
Màng BC ướt được ép để loại bỏ khoảng 50% nước bằng cách. Cho
màng BC ngâm trong dung dịch HCl 0,1M chứa Ranitidine trong 2 giờ và đặt
trong bóng tối, cho phép các giải pháp hấp thụ đầy đủ.
2.2.5. Xác định lượng Ranitidine nạp vào màng BC
Lượng thuốc Ranitidine hấp thụ vào màng BC được tiến hành thử
nghiệm trên 2 mẫu.
+ Mẫu 1: Dùng màng BC có độ dày 1cm.
+ Mẫu 2: Dùng màng BC có độ dày 0,5cm.
Cho 1 mẫu màng đã loại bớt nước vào bình tam giác có chứa sẵn dung
dịch Ranitidine. Sau 30 phút, 1giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định
lượng thuốc được hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi, lặp lại thí
nghiệm 3 lần lấy giá trị trung bình để tính toán.
Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được
nồng độ Raniidine (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng
Ranitidine có trong dung dịch.
Để tính được lượng thuốc hấp thụ qua màng, áp dụng công thức (1):
m(ht) = m(trước) - m(sau) (1)


Trong đó:
m(ht): Lượng thuốc hấp thụ vào màng,
m(trước): Lượng chất tan ban đầu,

m(sau): Lượng chất tan còn lại trong dung môi
Tỉ lệ thuốc hấp thụ vào màng BC được tính theo công thức (2):
EE=

Qd−

Qt

Trong đó:

x 100% (2)

Qt

EE: Hiệu quả hấp thụ,
Qt: Lượng chất tan trên lý thuyết thêm vào,
Qd: Lượng chất tan còn lại trong dung môi.
2.2.6. Khảo sát lượng thuốc giải phóng của màng BC ở các độ dày màng
0,5cm và 1cm, trong các môi trường pH khác nhau
- Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ:
37 ± 0,5°C.
- Môi trường khảo sát: tiến hành ở các môi trường pH: 2; 4,5; 6,8.
- Tiến hành khảo sát trên 2 lô:
+ Lô 1: Độ dày màng là 0,5cm: Tiến hành cho màng BC nạp Ranitidine
với độ dày màng là 0,5cm vào các môi trường có độ pH lần lượt là pH=2;
pH=4,5; pH=6,8.
+ Lô 2: Khảo sát ở độ dày màng là 1cm: Tiến hành cho màng BC nạp
Ranitidine với độ dày màng là 1cm vào các môi trường có độ pH lần lượt là
pH=2; pH=4,5; pH=6,8.
Sau khi cho màng BC nạp Ranitidine vào các môi trường pH khác nhau

(mỗi bình chứa 900ml), ta tiến hành rút 5ml mẫu ở các khoảng thời gian 0,5h;
1h; 2h; 4h; 6h; 8h; 12h; 24h. Đồng thời cho vào 5ml các dung dịch đệm pH
tương ứng vào các mẫu đã rút ra.


Sau đó tiến hành đo mật độ quang của các mẫu thu được, lấy mẫu và
tiến hành xác định lượng thuốc giải phóng. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy giá trị
trung bình.
2.2.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc
Lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống hấp thụ được tiến hành:
Việc giải phóng % ranitidine từ màng BC được tính theo công thức (3):
R% =
 ×

Trong đó:

=��
∑
Ct ×V1 +
−1 = 1

2

× 100%



R %: Tỉ lệ giải phóng thuốc,
Ct: Nồng độ của Ranitidine trong dung dịch ở thời điểm t,
V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau,

n: Số lượng mẫu lấy ra từ dịch giải phóng,
V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào.
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch
chuẩn. Số trung bình cộng được dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp
lại thí nghiệm. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p <
0,05. Kết quả được xử lý bởi phần mềm DDSolver, và Data analysic.