NGHIÊN cứu xác ĐỊNH tỷ lệ NHIỄM, căn NGUYÊN VI SINH, yếu tố NGUY cơ NHIỄM KHUẨN HUYẾT LIÊN QUAN đến ĐƯỜNG TRUYỀN TRUNG tâm và HIỆU QUẢ CAN THIỆP tại BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG, năm 2018 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG
-----------------*-----------------

PHẠM THỊ HÀ TRANG

NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG
NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TẠI NINH BÌNH, PHÚ YÊN
VÀ CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP ĐỂ CHẨN ĐOÁN
NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TẠI CỘNG ĐỒNG
(2018-2021)
CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC
MÃ SỐ: 9720117

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH CHI TIẾT

HÀ NỘI – 2019


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................4
1.1. Đại cương về sán lá gan nhỏ 4
1.1.1 Hình thể

4

1.1.2 Chu kỳ phát triển

5

1.1.3 Phương thức lây truyền bệnh ở người. 6
1.1.4 Bệnh học

6

1.1.5 Triệu chứng 7
1.1.6 Chẩn đoán

7

1.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới và Việt Nam

8

1.3. Đặc điểm và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình và Phú Yên
10
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ12
1.5. Tổng quan về kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt và ứng dụng phát triển
bộ kit phân tử chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa

15

1.6. Kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán sán lá gan nhỏ 24
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............27
2.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

27

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Thời gian

28

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
2.3. Thiết kế nghiên cứu
2.3.1. Mục tiêu 1

28

2.3.2. Mục tiêu 2.

30

2.3.3. Mục tiêu 3

37

28

28

2.4. Thu thập số liệu, xử lý số liệu 39
2.5. Sai số và khống chế sai số.

41

28

27


2.6. Đạo đức trong nghiên cứu.

41

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ.................................................................42
3.1. Mô tả thực trạng nhiễm, thành phần loài sán lá gan nhỏ trên người tại
một số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình và Phú Yên 42
3.1.1. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan nhỏ ở người dân 42
3.1.2. Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm SLGN trên người dân tại
Ninh Bình và Phú Yên
48
3.2. Chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis
sinensis và Opisthorchis viverrini trên người.
50
3.2.1. Kết quả lựa chọn phương pháp tách ADN từ mẫu phân, từ con sán
trưởng thành 50
3.2.2. Kết quả thiết kế, lựa chọn mồi LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. s
sinensis và O. viverrini trên người.
50
3.2.3. Kết quả chế tạo chứng dương bằng công nghệ ADN tái tổ hơp
51
3.2.4. Kết quả tối ưu các thành phần của bộ kít
51
3.2.5. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của bộ kít LAMP
51

3.2.6. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ổn định của bộ kít
tại phòng thí nghiệm
51
3.3. Đánh giá khả năng ứng dụng bộ kit LAMP để phát hiện tỉ lệ nhiễm sán
lá gan nhỏ trên người tại tỉnh Ninh Bình và Phú Yên. 51
3.3.1. Kết quả xét nghiệm phân xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ bằng
Kato-Katz
52
3.3.2. Kết quả xét nghiệm phân xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ
bằng bộ kít LAMP 52
3.3.3. Kết quả xét nghiệm phân xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ
bằng PCR. 52
3.3.4. Kết quả so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, mức độ tương đồng giữa các
kỹ thuật xét nghiệm 52
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN...............................................................53
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..................................................................................53
KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU........................................................................54


TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI, TÍNH KHẢ THI CỦA ĐỀ TÀI...........56
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ELISA

Enzyme-Linked
immunosorbent Assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch
liên kết với enzyme

FECT

Formalin-Ether
concentration technique

Phương pháp ly tâm lắng cặn
Formalin-Ether

IFA

Indirect Fluorescent
antibody

Phản ứng kháng thể huỳnh
quang gián tiếp

IHA

Indirect hemagglutination Phản ứng kháng nguyên gián
test
tiếp

LAMP

Loop-Mediated
Isothermal
Amplification
Nucleic acid sequencebased amplification

Khuếch đại đẳng nhiệt
mạch vòng

Polemerase Chain
Reaction

Phản ứng chuỗi Polimerase

NASBA

PCR
SLGN
WHO

Kỹ thuật khuếch đại dựa trên
trình tự ADN

Sán lá gan nhỏ
World Health
Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ................................................6
Hình 1.2: Các vị trí thiết kế các mồi LAMP...................................................17
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng tạo vật liệu khởi đầu..............................................19
Hình 1.4. Tái bản và kéo dài chuỗi ADN........................................................20
Hình 1.5. Các bước tiến hành kỹ thuật LAMP................................................21
Hình 3.1. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ chung của hai tỉnh...............................43


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm nhân khẩu học của đối tượng tham gia
nghiên cứu...............................................................42
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ tại
điểm nghiên cứu.......................................................43
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi..........43
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới.....................44
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nghề nghiệp.......44
Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn.45
Bảng 3.7. Kiến thức của đối tượng nghiên cứu về bệnh sán lá
gan nhỏ....................................................................45
Bảng 3.8. Kiến thức của đối tượng nghiên cứu về phòng bệnh
SLGN........................................................................46
Bảng 3.9. Tiền sử ăn gỏi cá....................................................48
Bảng 3.10.Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm SLGN và tiền sử ăn gỏi
cá.............................................................................48
Bảng 3.11.Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm SLGN và tình trạng ăn
gỏi cá trong 3 tháng gần đây..................................49
Bảng 3.12.Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm và kiến thức về bệnh
SLGN........................................................................49

Bảng 3.13.Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm và kiến thức về phòng
bệnh SLGN...............................................................50


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sán lá gan nhỏ là loài sán lá gây bệnh trên người với tỷ lệ nhiễm cao tại
nhiều quốc gia vùng Đông Nam Châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Triều
Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Campuchia [1], [2]. Người nhiễm sán lá gan nhỏ
thường không có các triệu chứng cấp tính rõ ràng, nhưng khi bị nhiễm mãn tính
thường có một số biểu hiện lâm sàng như đau bụng, đau thượng vị, mệt mỏi, vàng
da, nôn, sốt nhẹ và tiêu chảy [1]. Tuy vậy, ảnh hưởng nghiêm trọng nhất khi
nhiễm sán lá gan nhỏ là nguy cơ gây ung thư gan cao, theo thống kê sán lá gan
nhỏ được xếp vào nhóm các tác nhân sinh học số 1 gây ung thư gan ở người [3].
Có hai loài sán lá gan nhỏ thường gặp là Clonorchis sinensis,
Opisthorchis viverrini. Trong đó, loài sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố chủ
yếu ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam. Sán lá gan nhỏ O. viverrini được
tìm thấy chủ yếu ở Campuchia, Lào, Thái Lan và Việt Nam [4].
Tại Việt Nam đã phát hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và
O. viverrini với hai vùng dịch tễ rõ rệt. Loài C. sinensis lưu hành cao ở vùng
đồng bằng Bắc bộ. Theo thống kê của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng– Côn
trùng Trung ương từ năm 1976 đến 2004, đã xác định bệnh sán lá gan nhỏ C.
sinensis lưu hành ở ít nhất 15 tỉnh với tỷ lệ nhiễm trung bình 19%, một số nơi
có tỷ lệ nhiễm cao tới 37% như Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%.
Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O. viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía
Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, Bình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%,
Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4%. Đến nay, đã ghi nhận
bệnh sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 32 tỉnh trong cả nước, tỷ lệ nhiễm sán
lá gan nhỏ có khác nhau ở mỗi điểm nghiên cứu [4, 5].
Bệnh sán lá gan nhỏ được chẩn đoán dựa vào một số yếu tố như dịch tễ,

lâm sàng, các xét nghiệm cận lâm sàng. Hiện nay, xét nghiệm tìm trứng hoặc
sán lá gan nhỏ trưởng thành trong phân hoặc dịch tá tràng được xem là tiêu
chuẩn chẩn đoán “vàng” trong chẩn đoán xác định bệnh sán lá gan nhỏ [2].


2
Phương pháp Kato-Katz được WHO (1994) khuyến cáo sử dụng là kỹ thuật
có thể phát hiện được trứng giun, sán lá gan nhỏ, sán lá ruột, sán dây, sán lá
gan lớn trong phân, áp dụng được trên thực địa tại những vùng dịch tễ có tỷ lệ
nhiễm giun ≥ 20%, các loài sán ≥ 10%. Tuy nhiên, do lượng trứng trong phân
thấp nên các phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng giun sán có độ nhạy
không cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm
của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với
trứng của sán lá ruột nhỏ [2]. Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn
theo Esteban và cộng sự (1997) [6] hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến
là phương pháp có độ chính xác cao, ngoài trứng giun sán còn có thể phát hiện
được đơn bào thể kén, dễ dàng kiểm tra lại các mẫu nghi ngờ do mẫu phân có
thể được bảo quản trong formalin 10%. Tuy vậy, do lượng trứng trong phân ít
nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng xét nghiệm tại thực địa[2]. [7],
Các xét nghiệm miễn dịch phản ứng kháng nguyên gián tiếp (Indirect
hemagglutination test: IHA), phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp
(Indirect Fluorescent antibody (IFA), phản ứng ELISA (enzyme-Linked
immunosorbent assay) có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào từng loại
test và còn nhiều tranh luận do có hiện tượng dương tính kéo dài và lai chéo
giữa các loài, khó triển khai tại thực địa [2], [8], [9].
Chẩn đoán bằng sinh học phân tử sử dụng các gen đích ITS1, ITS2 và
ADN ty thể với các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ
O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [10], [11], [12].
Tuy vậy chưa được áp dụng rộng rãi do giá thành cao và khâu kỹ thuật phức
tạp, không triển khai được tại thực địa [13].

Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống và
Real time PCR trong chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa, các nghiên
cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN
đẳng nhiệt với những ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu tương đương kỹ thuật


3
PCR nhưng loại bỏ được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét
nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm được rút ngắn xuống còn 30 60 phút, đặc biệt các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt có khả năng phát triển
thành các bộ kit phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa [4], [14].
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop-Mediated Isothermal
Amplification) được nghiên cứu và phát triển từ năm 1998 [15]. Đây là một
phương pháp nhân bản gen mới, có thể tổng hợp một đoạn ADN lớn mà
không cần chu trình biến nhiệt. Đặc điểm của phương pháp này là sử dụng 4
mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt để nhận ra 6 vùng riêng biệt trên gen
đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất (650C). Thành phần phản
ứng gồm có ADN khuôn, mồi, enzyme Bst DNA polymerase. Những ưu điểm
vượt trội của công nghệ này so với các kỹ thuật đang sử dụng hiện nay như:
độ nhạy, độ đặc hiệu cao tương đương với các phương pháp PCR; tiết kiệm
kinh phí, thời gian; đơn giản, dễ thực hiện; dễ triển khai tại thực địa,...
Nhằm đánh giá thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên cộng đồng dân cư
tại vùng dịch tễ sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình và Phú Yên và chế tạo bộ kit
phân tử có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng
chẩn đoán bệnh sán lá gan nhỏ, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu thực
trạng nhiễm sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo bộ sinh phẩm
LAMP để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ tại cộng đồng (2018-2021) với 3
mục tiêu sau:
1. Mô tả thực trạng nhiễm, thành phần loài sán lá gan nhỏ trên người
tại một số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020).
2. Chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm sán lá gan

nhỏ Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini trên người.
3. Đánh giá khả năng ứng dụng bộ kit LAMP để phát hiện nhiễm sán lá
gan nhỏ trên người tại điểm nghiên cứu.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


4

1.1.

Đại cương về sán lá gan nhỏ

Sán lá gan nhỏ (SLGN) là một trong những loài sán lá chính gây bệnh
trên người. Trên thế giới đã tìm thấy có 3 loài sán lá gan nhỏ là Clonorchis
sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis felineus. Ở Việt Nam, đến nay
chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài sán lá gan lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis,
Opisthorchis viverrini.
1.1.1 Hình thể
Sán trưởng thành.
Sán lá gan nhỏ C. sinensis có hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt. Sán dài
10-12mm, rộng 2-4mm, có hai mồm hút, mồm hút phía trước thông với
đường tiêu hoá có đường kính 600 µm, mồm hút phía sau (mồm hút bụng) có
đường kính 500µm. Ống tiêu hoá chạy dọc 2 bên thân và là ống tắc, không
nối thông với nhau. Sán không có hậu môn vì dinh dưỡng của sán chủ yếu là
thẩm thấu các chất dinh dưỡng qua bề mặt sán. Do vậy trên thân sán có nhiều
tuyến dinh dưỡng.
Trên thân sán có cả bộ phận sinh dục đực và cái. Tinh hoàn chia nhánh,
chiếm gần hết phía sau thân. Buồng trứng ở khoảng giữa thân, tử cung chạy
ngoằn ngoèo, trong chứa nhiều trứng.

Trứng
Trứng sán lá gan rất nhỏ, kích thước 16-17µm x 26-30µm, hình bầu
dục, một cực có nắp giống hình chóp mũ, một cực phình to hơn giống chiếc lọ
phình đáy và có gai nhỏ. Trứng mầu vàng sẫm. Vỏ mỏng, nhẵn, có đường
viền kép. Bên trong là khối nhân có thể có hình ảnh ấu trùng.

1.1.2 Chu kỳ phát triển
Sán lá gan nhỏ ký sinh ở các ống mật nhỏ trong gan. Nếu nhiều, sán có
thể phá huỷ nhu mô gan và ký sinh ở tổ chức gan. Sán dinh dưỡng bằng cách
thẩm thấu các chất dinh dưỡng từ dịch mật.


5
Sán lá gan đẻ trứng tại các ống mật. Trứng theo mật xuống ruột và theo
phân ra ngoài. Trứng cần có môi trường nước để phát triển thành ấu trùng
lông. Ấu trùng lông bơi tự do trong nước tìm tới ký sinh ở một số loài ốc để
phát triển thành vĩ ấu trùng (ấu trùng đuôi) sau khi vào ốc từ 21-30 ngày. Sán
lá gan nhỏ có vật chủ chính là người, ngoài ra các loài động vật khác như chó,
mèo, lợn, chuột, chồn cũng là vật chủ của sán lá gan nhỏ. Để gây nhiễm được
cho người hay vật chủ khác, sán lá gan nhỏ phải ở giai đoạn ấu trùng có khả
năng gây nhiễm (giai đoạn ấu trùng lông). Khi ăn phải thức ăn có chứa ấu
trùng sán lá gan nhỏ ở giai đoạn có khả năng gây nhiễm, ấu trùng này theo
thức ăn từ thực quản đi xuống dạ dày rồi tá tràng, tại đây các ấu trùng đó sẽ
tìm cách chui lên đường mật và đến khu trú tại các nhánh đường dẫn mật
trong gan. Các ấu trùng sẽ mất khoảng vài tháng để trở thành sán lá gan nhỏ
trưởng thành và sán lá gan nhỏ trưởng thành có thể tồn tại trong gan tới 20 25 năm. Trong quá trình đó trứng của sán lá gan nhỏ tạo ra sẽ lại theo đường
dẫn mật đi xuống ruột và theo phân thải ra ngoài môi trường - nguồn nước.
Trong môi trường nước, trứng sán lá gan nhỏ được vật chủ trung gian thứ
nhất là ốc ăn, trong cơ thể của ốc, trứng của sán lá gan nhỏ sẽ phát triển
qua ba giai đoạn. Khi đã ở dạng trùng lông, chúng sẽ được đào thải ra

ngoài và bơi lội trong môi trường nước, khi gặp một số loài cá nước ngọt
giữ vai trò vật chủ trung gian thứ hai, ấu trùng này sẽ xuyên qua da cá để
kết thành nang trong thịt cá và trở thành dạng ấu trùng nang có khả năng
gây nhiễm cho người [16].


6

Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ
1.1.3 Phương thức lây truyền bệnh ở người.
Do người dân tại nhiều địa phương có tập quán, thói quen ăn gỏi cá
sống, bị nhiễm bệnh khi ăn phải cá có ấu trùng SLGN. Trong đó:
Miền Bắc nước ta, cá được rửa sạch, đánh vẩy, lọc thịt, thịt cá được
thấm khô, thái nhỏ rồi trộn cùng với nước chát củ búp ổi. Sau đó thịt cá được
trộn thính cùng gia vị và ăn kèm cùng nhiều loại lá thơm.
Miền Nam (Phú Yên) có tập quán ăn gỏi cá là “gỏi sinh cầm”, nghĩa là
ăn cả con cá còn đang sống, đang bơi trong chậu dùng vó vớt từng con, nhắm
rượu với đủ loại lá thơm, tập quán này cũng có từ lâu đời trong nhân dân địa
phương. Do vậy tỷ lệ nhiễm O. viverrini khá phổ biến [16].
Một số trường hợp trong vùng dịch tễ sán lá gan nhỏ, tuy không ăn gỏi
cá nhưng cũng bị nhiễm bệnh do ăn cá rán chưa chín (phần thịt còn sống).
1.1.4 Bệnh học
Sán lá gan gây những tổn thương nghiêm trọng ở gan. Sán gây kích
thích thường xuyên đối với gan, đồng thời chiếm thức ăn và gây độc. Vị trí ký


7
sinh và kích thước của sán dễ gây hiện tượng tắc. Do sán thường bám chặt
vào ống mật, dùng mồm để hút thức ăn nên lâu dần gan sẽ bị xơ hóa lan toả ở
khoảng cửa, tổ chức gan bị tăng sinh và có thể dẫn tới hiện tượng xơ hoá gan,

cổ chướng, thoái hoá mỡ ở gan. Độc tố do sán tiết ra có thể gây nên các tình
trạng dị ứng, đôi khi có thể gây thiếu máu, tăng bạch cầu ái toan.
Về thương tổn bệnh học, gan bị to rõ rệt. Trọng lượng của gan có thể
tới 4kg. Ở mặt gan có những điểm phình giãn, những chỗ phình giãn thường
có màu trắng nhạt và tương ứng với sự giãn nở của ống mật. Nếu cắt các điểm
phình giãn thấy chảy ra dịch màu xanh xám.
1.1.5 Triệu chứng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh sán lá gan nhỏ phụ thuộc vào cường độ
nhiễm và phản ứng của vật chủ. Trong trường hợp nhiễm ít không có triệu
chứng gì đặc biệt. Trường hợp nhiễm sán lá gan với số lượng trên 100 con thì
bệnh biểu hiện qua 2 giai đoạn sau: Giai đoạn khởi phát người bệnh thường
bắt đầu với các biểu hiện của rối loạn dạ dày ruột như chán ăn, ăn không tiêu,
đau âm ỉ vùng gan, tiêu chảy hoặc táo bón thất thường. Kèm theo có thể thấy
toàn thân phát ban, nổi mẩn. Giai đoạn toàn phát người bệnh đau vùng gan
nhiều hơn, kèm theo thiếu máu, vàng da và cổ trướng có thể xuất hiện ở giai
đoạn muộn. Nếu có bội nhiễm do vi khuẩn, bệnh nhân có thể sốt thành từng
cơn hoặc sốt kéo dài.
1.1.6 Chẩn đoán
* Lâm sàng: Không đặc hiệu vì dễ nhầm với các bệnh gan mật khác.
* Xét nghiệm: Xét nghiệm phân tìm trứng bằng kỹ thuật trực tiếp hoặc tập trứng.
- Xét nghiệm phân tìm trứng sán là biện pháp đơn giản nhưng có tính
chất khẳng định việc mắc bệnh. Trường hợp nhiễm ít cần phải xét nghiệm
dịch tá tràng.


8
- Trong trường hợp không tìm thấy trứng sán, các xét nghiệm miễn dịch
cùng với hình ảnh siêu âm có giá trị chẩn đoán. Các xét nghiệm đánh giá chức
năng gan có giá trị trong việc đánh giá thương tổn và tiên lượng bệnh.
* Siêu âm: Siêu âm vùng gan có thể phát hiện được sán lá gan và các

thương tổn do sán lá gan.
1.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới và Việt Nam
Hai loài sán lá gan nhỏ chính thường gặp gây bệnh ở người là
Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini. Các vùng dịch tễ của sán lá gan
nhỏ là khu vực Đông Nam Á (Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan), khu
vực Đông Á (Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài loan, Nhật Bản) và một phần Đông
Bắc của Nga. Trong đó, loài sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố chủ yếu ở
Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam. Sán lá gan nhỏ O. viverrini được tìm
thấy chủ yếu ở Campuchia, Lào, Thái Lan và Việt Nam [4]. Clonorchis
sinensis được Mc. Conell tìm ra đầu tiên năm 1875 trên tử thi người Trung
Quốc ở Calcutta Ấn Độ và được Cobbold đặt tên là Distoma sinense. Dựa vào
hình thái học, Loose (1907) và Kobayashi (1912) thống nhất đặt tên là
Clonorchis sinensis.
Bệnh phân bố phía Đông từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc (trừ Tây
Nam), Đài Loan và miền Bắc của Việt Nam. Năm 1947, Stoll thông báo có 19
triệu người bị nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis. Tại Nhật: từ năm1886-1898,
tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 30-67% dọc sông Ton, hồ Kasumigaura, đồng bằng
Nobi, Aichi và Gifu, vùng hồ Biwa, sông Onga và sông Chigugo. Năm 1963
có nơi tỷ lệ nhiễm là 40-50%. Tại Triều Tiên: Trường hợp C. sinensis đầu tiên
được công bố năm 1915 (Matsumoto). Seo và cộng sự (1958) công bố tỷ lệ
nhiễm 11,7%, năm 1969 tỉ lệ nhiễm 4,7% bằng xét nghiệm phân Kato. Tỷ lệ
nhiễm 11,1-21,1% bằng test trong da (Wathon và Chyn, 1959; Rim và cộng
sự, 1973). Bằng test trong da với kháng nguyên C. sinensis xét nghiệm ở học
sinh tiểu học sống dọc sông lớn như sông Han, sông Nakdong, sông Kuno,


9
sông Yeongsan và sông Mangyong và trên 4676 giáo viên có tỷ lệ dương tính
11,1%. Tại sông Nakdong gần Pusan miền Đông Hàn Quốc tỷ lệ nhiễm tới
82,9%, ở làng Kimhae Gun có cường độ nhiễm 10.698 trứng/gam phân trong

số 284 trường hợp (Rim, 1973). Gần đây Seo và cộng sự (1981) xét nghiệm
phân 13.373 người, tỷ lệ nhiễm trung bình là 21,5% trong đó cao nhất ở sông
Nakdong (40,2%) và thấp nhất ở sông Mangyong (8%) ước tính có 830.000890.000 người trong số 4 triệu người trong vùng lưu hành bệnh.
Tại Trung Quốc: C. sinensis phân bố ở hầu hết các vùng ở Trung Quốc,
trừ vùng Tây - Nam. Miền Nam Trung Quốc, đặc biệt ở tỉnh Kwangtung tỷ lệ
nhiễm trên 40%, có làng nhiễm 100% (Komiya, 1966). Bệnh phân bố ở ít nhất
21 tỉnh của Trung Quốc với tỷ lệ nhiễm từ 0,08-57%, nhiều vùng nhiễm trên
5% (Xu Long Qi, 2004).
Tại Đài Loan: Trường hợp đầu tiên C. sinensis được phát hiện năm
1915 (Choi) và được nghiên cứu chi tiết bởi Chow (1960), Kim và Kuntz
(1964), Cross (1969). Có 3 vùng lưu hành bệnh như Meinung, Kaohsing, Hsien
ở miền Nam, hồ Sun-Moon và Miao-Li ở miền Trung. Bằng xét nghiệm phân
tại Meinung cho thấy 10-52% nhiễm C. sinensis (Chow 1960, Hsieh 1989,
Huang 1957, Kuntz 1961), tại vùng gần hồ Sun-Moon tỷ lệ nhiễm 39-51%
(Clarke 1971) và tại Miao-Li tỷ lệ nhiễm 57% (Ong và Lu, 1979).
Hiện nay, ước lượng số người nhiễm bệnh trên toàn cầu với C. sinensis
là khoảng 35 triệu và gần một nửa trong số bệnh nhân này (khoảng 15 triệu) ở
Trung Quốc [17].
Sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini lần đầu tiên được Lieper mô tả
(1911), lấy từ tử thi của hai tù nhân ở một nhà tù Chiengmai, phía Bắc Thái
Lan vào năm 1911. Bedier và Chesneau (1929) đã phát hiện thấy O. viverrini
nhiễm ở những người dân tại Takhet (23%). Sau này Sadun (1955) đã nghiên
cứu về hình thái và dịch tễ học của loài sán lá gan này ở Đông Bắc Thái Lan


10
và đã đi đến kết luận là những trường hợp bị nhiễm sán ở Thái Lan là do O.
viverrini, và đã cũng được Wykoff và cộng sự, (1965) xác nhận lại.
Hiện nay, sán lá gan nhỏ O. viverrini đã được xác định có phân bố ở
các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam, Campuchia,

Trung Quốc. Ước tính có khoảng 10 triệu người nhiễm trong đó có gần 8 triệu
người nhiễm tại Thái Lan, gần 2 triệu người nhiễm tại Lào. Đặc biệt ở Thái
Lan điều tra 60 làng trong 7 tỉnh Đông Bắc có tỉ lệ nhiễm 8-68%
(Sithithaworn và cộng sự, 1994), ở Lào có tới 1,7 triệu người nhiễm, có nơi tỉ
lệ nhiễm tới 54,4-100% [18].
- Ở Việt Nam: Từ năm 1908 Mouzel, 1909 Mathis và Leger đã tìm thấy
C. sinensis. Năm 1924 Railiet phát hiện được O.felineus ở Hà Nội. Năm 1965
Đặng Văn Ngữ và Đỗ Dương Thái bắt gặp một trường hợp O. felineus phối
hợp với C. sinensis.
Tại Việt Nam đã phát hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và
O. viverrini với hai vùng dịch tễ khác nhau rõ rệt. Loài C. sinensis lưu hành
cao ở vùng đồng bằng Bắc bộ. Theo thống kê của Viện Sốt rét –Ký sinh
trùng–Côn trùng Trung ương từ năm 1976 đến 2004, đã xác định bệnh sán lá
gan nhỏ C. sinensis lưu hành ít nhất ở 15 tỉnh với tỷ lệ nhiễm trung bình 19%,
một số nơi có tỷ lệ nhiễm cao tới 37 % như Nam Định, Hoà Bình , Ninh Bình
20-30%. Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O. viverrini lưu hành chủ yếu ở các
tỉnh phía Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, Bình Định 11,9%, Đăk
Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4%... Đến nay, đã
ghi nhận bệnh sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 32 tỉnh trong cả nước, tỷ lệ
nhiễm sán lá gan nhỏ có khác nhau ở mỗi điểm nghiên cứu [19].
1.3. Đặc điểm và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình và Phú Yên
Kết quả nghiên cứu đề tài“Tình hình nhiễm sán lá gan và biến động của
tỷ lệ nhiễm tại một số điểm điều tra có can thiệp một phần bằng điều trị đặc
hiệu” giai đoạn 1991-1995 do Nguyễn Văn Đề làm chủ nhiệm đề tài cho


11
thấy: Tại các điểm nghiên cứu ở miền Bắc Việt Nam (Kim Sơn - Ninh Bình)
nhân dân có tập quán ăn gỏi cá mè Hypophtalmichthic molitrix. Loài sán
nhiễm là C. sinensis, tỷ lệ nhiễm trên người là 18,5-29,6 %, tỷ lệ nhiễm trên

chó là 4/14, trên mèo là 8/19. Tỷ lệ nhiễm trên cá mè là 26,8 - 56,4 %. Tại
điểm miền Nam (An Mỹ - Phú Yên) nhân dân có tập quán ăn sỏi cá diếc
Carassins carassius. Loài sán nhiễm là O. viverrini. Tỷ lệ nhiễm trên người là
36,9%, trên mèo là 6/10. Tỉ lệ nhiễm trên ốc M. tuberculatus là 8 %.Tỉ lệ
nhiễm trên cá diếc là 40-49 tuổi. Tại các điểm nghiên cứu tỷ lệ nhiễm sán lá
gan tăng dần theo nhóm tuổi và tỷ lệ cao nhất ở nhóm 40-49 tuổi.
Nguyễn Văn Đề (2003) đã xét nghiệm phân trên 30.000 người, phát
hiện bệnh sán lá gan nhỏ ở 15 tỉnh miền Bắc và miền Trung. Tỉ lệ nhiễm trên
người biến động từ 0,2% (Thái Bình) đến 36,9% (Phú Yên). Chó nhà nhiễm
28,6%, mèo nhà nhiễm 64,2%. Nguyễn Văn Chương (2004) xét nghiệm 2249
mẫu phân người ở tỉnh Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi và Quảng Nam cho
thấy tỉ lệ nhiễm sán lá gan ở cả 4 địa điểm là 13,16%. Người nhiễm chủ yếu là
do tập quán ăn gỏi cá sống.
Kết quả nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh sán
lá gan nhỏ tại huyện Yên Khánh, Kim Sơn tỉnh Ninh Bình năm 2016 và đề
xuất biện pháp phòng chống.” của Học viện Quân Y do TS. Lê Trần Anh làm
chủ nhiệm đề tài cho thấy:
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai huyện Kim Sơn, Yên
Khánh là 19,5%; chưa có sự khác biệt tỷ lệ nhiễm giữa hai huyện. Tỷ lệ
nhiễm ở nam giới (26,6%) cao hơn ở nữ (8,3%) (p< 0,001; OR = 3,994).
Cường độ nhiễm sán trung bình ở nam cao hơn ở nữ.
Người ăn gỏi cá có nguy cơ nhiễm sán cao gấp 5,8 lần không ăn gỏi cá
(p<0,001). Cường độ nhiễm sán trung bình là 564,10; đa số (87,2%) đối
tượng nhiễm nhẹ, không có đối tượng nào nhiễm mức độ nặng.


12
Tình hình nhiễm ấu trùng sán trên cá mè (Hypophthalmichthys
molitrix), cá mòi (Konosirus punctatus) thu được tại địa điểm nghiên cứu:
71,4% cá mè nhiễm nang ấu trùng sán, cá mòi không nhiễm nang ấu trùng sán.

Chưa phát hiện được ấu trùng sán Clonorchis sinensis trên cá tại địa điểm nghiên
cứu. 71,4% cá mè nhiễm nang ấu trùng sán lá ruột Haplorchis pumilio, mật độ
trung bình 8,75 ấu trùng/cá, 0,0299 ấu trùng/gam cá. 2,6% cá mè nhiễm
Haplorchis taichui, mật độ 0,0390 ấu trùng/cá; 0,00001 ấu trùng/gam cá.
Tỷ lệ, cường độ nhiễm chưa có sự khác biệt giữa cá thu được tại ba xã
nghiên cứu.
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ
Chẩn đoán bệnh sán lá gan nhỏ dựa vào một số yếu tố như dịch tễ, lâm
sàng, xét nghiệm cận lâm sàng (Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong
phân hoặc dịch tá tràng, các xét nghiệm miễn dịch, sinh học phân tử).
Yếu tố dịch tễ: Đã từng ăn gỏi cá, ăn cá chưa nấu chín hoặc sống ở
trong vùng có tập quán ăn gỏi cá.
Dấu hiệu lâm sàng: Có một số biểu hiện của các triệu chứng lâm sàng
như: đau tức vùng gan, ậm ạch khó tiêu, kém ăn, thường có rối loạn tiêu hóa
(phân nát hoặc bạc màu, phân không thành khuôn….), đôi khi có xạm da,
vàng da. Bệnh nhân có thể có dấu hiệu gan to hay xơ gan tùy mức độ và thời
gian mắc bệnh.
Xét nghiệm tìm trứng, hoặc sán lá gan nhỏ trưởng thành trong phân
hoặc dịch tá tràng được xem là tiêu chuẩn “vàng” trong chẩn đoán xác định
bệnh sán lá gan nhỏ. Có nhiều phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán lá
gan nhỏ khác nhau như xét nghiệm trực tiếp bằng nước muối sinh lý hoặc
Lugol, xét nghiệm phân theo phương pháp Kato (định tính) và Kato-Katz
(định lượng); Phương pháp ly tâm lắng cặn Formalin-Ether (FECT-.
Formalin-Ether concentration technique).


13
Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và
cộng sự (1997) hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến là phương pháp
tập trung trứng giun sán và bào nang đơn bào dựa trên nguyên lý ly tâm lắng

cặn có độ chính xác cao, ngoài trứng giun sán có thể phát hiện được đơn bào
thể kén, dễ dàng kiểm tra lại các mẫu nghi ngờ do phân có thể được bảo quản
trong Formalin 10%. Đến nay có nhiều cải tiến kỹ thuật này để có thể đánh
giá cả định tính và định lượng được số trứng giun sán trong một gram phân.
Tuy vậy, do lượng trứng trong phân ít nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng
trong xét nghiệm tại thực địa.
Phương pháp Kato (1954), Kato-Katz (1972) được WHO (1994)
khuyến cáo sử dụng để xét nghiệm phân phát hiện trứng giun sán tại những
vùng dịch tễ có tỷ lệ nhiễm giun ≥ 20%, các loài sán ≥ 10%. Đây là kỹ thuật
có thể phát hiện được trứng giun, sán lá gan nhỏ, sán lá ruột, sán dây, sán lá
gan lớn trong phân, áp dụng được tại thực địa. Tuy nhiên, do lượng trứng
trong phân thấp nên các phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng giun sán có
độ nhạy không cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh
nghiệm của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ
và với trứng của sán lá ruột nhỏ. Một nghiên cứu khám nghiệm tử thi tìm sán
trưởng thành và sử dụng các phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán O.
viverrini cho thấy ngưỡng xét nghiệm phân có thể xác định được trên các mẫu
có tỷ lệ nhiễm trên 20 sán trưởng thành hoặc 1000 trứng/ 01 gram phân do
vậy ước tính ít nhất 20% số người nhiễm sán không được phát hiện [20].
Các xét nghiệm miễn dịch: Thử test trong da (intradernal test), phản
ứng cố định bổ thể (complement Fixation test), miễn dịch điện di
(immuroelectrophoresis), phản ứng kháng nguyên gián tiếp (Indirect
hemagglutination test: IHA), phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp
(Indirect Fluorescent antibody (IFA)), phản ứng ELISA (enzyme-Linked
immunosorbent assay). Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao, độ


14
đặc hiệu tùy thuộc vào từng loại test và còn nhiều tranh luận, có hiện tượng
dương tính kéo dài và lai chéo giữa các loài, khó triển khai tại thực địa. Một

loạt xét nghiệm huyết thanh học được sử dụng như: Thử test trong da
(intradernal test) với kháng nguyên C. sinensis (Min 1984, Rim 1973). Độ
nhạy 83,1%, độ đặc hiệu 77,8%, có 14% dương tính giả ở nhiễm nhẹ, 3%
dương tính giả nhiễm trung bình và 2% dương tính giả ở nhiễm nặng. Phản
ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent antibody (IFA)
test) (Cho và Soh 1974, 1976) có 15% chéo với Paragonimus, đạt tỷ lệ dương
tính với nhiễm nhẹ là 28,1%, nhiễm trung bình là 68,9%, nhiễm nặng là 77,884,6%. Phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent assay) được
Ruitenberg và cộng sự giới thiệu năm 1975 dựa trên cơ sở của Voller và cộng
sự năm 1974 trong nghiên cứu sốt rét. Sau đó nhiều tác giả đã nghiên cứu áp
dụng ELISA trong chẩn đoán sán lá gan (Lee và cộng sự, 1981, Yang và cộng
sự, 1983). Độ nhạy của phản ứng ELISA đạt 86,4-93% và độ đặc hiệu đạt
95,7-98,6%. Kết quả ELISA cũng dương tính kéo dài sau khi điều trị, thường
1-3 tháng, có trường hợp đến 1-2 năm, song về hiệu giá kháng thể giảm dần
đến âm tính (ngoại trừ bệnh nhân tái nhiễm).
Chẩn đoán bằng sinh học phân tử: Nhiều nghiên cứu sử dụng các gen
đích ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1), ITS2 và ADN ty thể phát triển các
kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C.
sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Wongratanacheewin và cộng sự
(2002) [21] sử dụng kỹ thuật PCR để xác định O. viverrini trên các mẫu phân
người cho độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 98% với các mẫu phân có mật
độ nhiễm trứng sán > 1000 trứng/1gam phân, tuy vậy độ nhạy giảm còn 68%
với các mẫu có mật độ nhiễm trứng sán < 200 trứng/1 gam phân. Kỹ thuật
PCR đã phát hiện được thêm 29% các mẫu dương tính với sán lá gan nhỏ từ
số các mẫu âm tính bằng kỹ thuật soi kính hiển vi. Sử dụng kỹ thuật real time
PCR để chẩn đoán định lượng nhiễm C. sinensis đã được nhiều tác giả nghiên


15
cứu phát triển [22], [23]. Các kỹ thuật phân tử này đã được ứng dụng trong
kiểm nghiệm an toàn thực phẩm phát hiện giai đoạn ấu trùng sán lá gan nhỏ

trong cá thành phẩm. Tuy vậy chưa được áp dụng rộng rãi do giá thành cao và
khâu kỹ thuật phức tạp mà chủ yếu được ứng dụng trong đánh giá hiệu lực
của thuốc điều trị, giám sát tái nhiễm hay phát hiện các vùng dịch tễ mới của
sán lá gan nhỏ tại khu vực Đông Nam Á [24], [25].
1.5.

Tổng quan về kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt và ứng dụng

phát triển bộ kit phân tử chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực
địa
Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống và
Real time PCR trong chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa, các nghiên
cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN
đẳng nhiệt với những ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương kỹ
thuật PCR nhưng loại bỏ được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét
nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm được rút ngắn xuống còn 30 60 phút, đặc biệt các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt có khả năng phát triển
thành các bộ kit phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa.
Đến nay có khoảng hơn 10 phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt khác
nhau được phát triển như: Kỹ thuật khuếch đại dựa trên trình tự ADN
(NASBA-Nucleic acid sequence-based amplification) (Mugagas và cộng sự,
2009), kỹ thuật TMA (Transcription Mediated Amplification), kỹ thuật RCA
(Rolling Circle Amplification) (Lizardi và cộng sự, 1998) [95], kỹ thuật
LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification (Notomi và cộng sự, 2000);
kỹ thuật RPA (Recombinase Polymerase Amplificaion)…Trong đó, kỹ thuật
khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian (LAMP - Loop Isothermal
Median Ampification) là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng nhiều
nhất, dựa trên nguyên lý của kỹ thuật LAMP nhiều bộ kít chẩn đoán mầm
bệnh được phát triển, thương mại hóa trên thị trường. Đây là kỹ thuật khuếch

16
đại ADN tương tự như PCR, nhưng quá trình thực hiện khuếch đại ADN được
hoàn thành trong một bước duy nhất và ở một nhiệt độ ổn định. Kết quả của
phản ứng được phát hiện dựa vào độ đục của sản phẩm tạo thành hoặc sử
dụng các chất nhuộm màu huỳnh quang mà không cần phải điện di. Kỹ thuật
LAMP về lý thuyết có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương hoặc thậm chí cao
hơn so với kỹ thuật PCR, máy móc, thiết bị cần thiết để tiến hành kỹ thuật thì
đơn giản (gồm máy ly tâm để tách chiết ADN và máy ủ nhiệt để thực hiện
phản ứng LAMP), không cần trang bị các máy móc phân tích đắt tiền như
máy PCR, hệ thống điện di ADN. Do đó, LAMP có thể thực hiện trong phòng
xét nghiệm tuyến cơ sở (bệnh viện huyện, trạm y tế xã…) và rất phù hợp cho
việc phát hiện tác nhân gây bệnh tại thực địa.
 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng LAMP (Loop-Mediated
Isothermal Amplification)
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP được nghiên cứu và phát triển
bởi công ty Eiken Chemical Co. Ltd năm 1998 [26]. Đây một phương pháp
nhân bản gen mới, có thể tổng hợp một đoạn ADN lớn mà không cần chu
trình biến nhiệt. Đặc điểm phương pháp là sử dụng 4 mồi khác nhau được
thiết kế đặc biệt để nhận ra 6 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn
ra ở một nhiệt độ duy nhất. Quá trình tái bản và phát hiện gen đích chỉ diễn ra
trong một bước duy nhất. Thành phần phản ứng gồm có ADN khuôn, mồi,
enzyme Bst DNA polymerase, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 65 0C. Phương
pháp này có hiệu quả khuếch đại cao khoảng 109 - 1010 bản sao trong thời gian
từ 15 - 60 phút.
LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có
điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao
gồm các mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được
vào 6 chuỗi đích của khuôn, thì sản phẩm DNA-vòng mới được tạo ra.
Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm

17
ADN-vòng sẽ không được tạo ra. Đặc biệt sản phẩm của phản ứng có thể
quan sát bằng mắt thường do sự kết tủa của muối pyrophotphate (Mg2P2O7)
dưới dạng vẩn đục màu trắng hoặc phát quang khi nhuộm bằng các thuốc
nhuộm (SYBR green). Do vậy, LAMP thường được sử dụng để tạo các bộ kít
chẩn đoán nhanh. Tổng giá thành có thể được giảm vì LAMP không đòi hỏi
hoá chất đặc biệt và thiết bị phức tạp [4].


Các thành phần cơ bản của phản ứng LAMP:

- Mồi: Thiết kế 4 loại mồi (mô tả như bên dưới) dựa theo 6 đoạn riêng
biệt trên đoạn gene quan tâm: đoạn F3c, F2c và F1c ở đầu 3' và đoạn
B1, B2 và B3 ở đầu 5'.

Hình 1.2: Các vị trí thiết kế các mồi LAMP
FIP : Forward Inner Primer (FIP) bao gồm đoạn F2 (ở đầu 3') bổ sung
cho đoạn F2c, và đoạn giống như đoạn F1c ở đầu 5'.
F3 : Forward Outer Primer bao gồm đoạn F3 bổ sung cho đoạn F3c.
BIP : Backward Inner Primer (BIP) bao gồm đoạn B2 (ở đầu 3’) bổ sung
cho đoạn B2c và đoạn giống như B1c ở đầu 5’.
B3 : Backward Outer Primer bao gồm đoạn B3 bổ sung cho đoạn B3c.
- Enzym: sử dụng phổ biến trong phản ứng LAMP là enzym Bst
polymerase được phân lập từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus có


18
khả năng xúc tác tổng hợp ADN và tự tách chuỗi cao, hoạt động tối ưu
ở 660 C.

- dNTPs và buffers: tương tự như kỹ thuật PCR.
- ADN khuôn: ADN khuôn sử dụng cho kỹ thuật LAMP không đòi hỏi
mức độ tinh sạch cao, có thể sử dụng các phương pháp tách ADN đơn
giản, để rút ngắn thời gian chuẩn bị.
- Thuốc nhuộm biểu hiện kết quả: SYBR green là một thuốc nhuộm
cyanine bất đối xứng được sử dụng như là một chất nhuộm acid nucleic
trong sinh học phân tử. Nó được dùng trong kỹ thuật real-time PCR và
cũng để hiện ADN trong điện di thay cho Ethidium bromide. SYBR
green liên kết với ADN hình thành phức hợp ADN-nhuộm hấp thụ ánh
sáng màu xanh (λmax = 488 nm) và phát ra ánh sáng màu xanh lá cây
(λmax = 522 nm). SYBR green ưu tiên gắn với ADN sợi đôi, nhưng sẽ
vẫn liên kết với ADN sợi đơn nhưng với hiệu suất thấp hơn. Nguyên
tắc nhuộm của SYBR Green là khi chèn vào sợi đôi ADN sẽ phát
huỳnh quang, số lượng ADN càng nhiều thì lượng huỳnh quang phát ra
càng cao. Ngoài ra có thể sử dụng một số loại thuốc nhuộm khác như
Hydroxyl Naphthol Blue (HNB) hoặc Calcein.
 Cơ chế phản ứng LAMP gồm ba bước chính: tạo vật liệu khởi đầu, tái
bản và kéo dài chuỗi, cuối cùng là lặp lại chu kỳ (Notomi và CS, 2002).
Bước 1- Tạo vật liệu khởi đầu:
Một trong những mồi LAMP sẽ bám vào trình tự ADN đích (Hình
2A), sau đó dưới tác dụng của enzyme Bst polymerase có hoạt tính
tách sợi và kéo dài sợi mới theo chiều 3’-5’. Ví dụ: Mồi FIP bám vào vị trí
F2c sau đó kéo dài mạch (Hình 2B). Tiếp theo mồi F3 sẽ bám vào vị trí F3c
trên 2 mạch mới để kéo dài mạch (hình 2D). Ở bước này sẽ tách mạch và tổng
hợp bởi mồi F1c ra (hình 2F), sau đó ở đầu 5’ của mạch này, do trình tự
F1c bổ sung với với F1 nên sẽ hình thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ này