Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn streptomyces g246, g261, g248 thu thập tại vùng biển miền trung việt nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (13.59 MB, 262 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
CAO ĐỨC DANH
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ
CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261,
G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI – 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------------------CAO ĐỨC DANH
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ
CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261,
G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 9 44 01 14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.
PGS. TS. Habil Phạm Văn Cƣờng
2.
TS. Trần Đăng Thạch
Hà Nội - 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Habil. Phạm Văn Cường và TS. Trần Đăng Thạch.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả. Toàn bộ các thông tin trích dẫn trong luận án được chỉ rõ
nguồn gốc xuất xứ.
Nghiên cứu sinh
Cao Đức Danh
LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam. Kinh phí thực hiện từ đề tài thuộc đề tài
VAST.TĐ.DLB.04/16-18 và VAST. ĐA47.12/16-19 . Trong quá trình nghiên cứu, tác
giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như
đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy hướng dẫn khoa học
PGS.TS. Habil. Phạm Văn Cường, TS. Trần Đăng Thạch đã chỉ ra hướng nghiên cứu,
tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án.
Tôi xin cảm ơn PGS. TS. Đoàn Thị Mai Hương và các anh chị trong phòng Tổng
hợp hữu cơ, TS. Lê Thị Hồng Minh và các nhà khoa học phòng Công nghệ sinh học –
Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp
đỡ, thảo luận và đưa ra những chỉ dẫn cho luận án của tôi.
Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Hương Khê, Ban Giám đốc Sở
GD&ĐT Hà Tĩnh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học của mình.
Tôi xin cảm ơn GS.TS. Đỗ Công Thung và các cán bộ kiêm thợ lặn Viện Tài
nguyên và Môi trường biển đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt chuyến thu
mẫu ngoài biển.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cơ sở đào tạo Viện Hóa sinh biển và Học
viện Khoa học và công nghệ, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, các cán
bộ phụ trách các nghiên cứu sinh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên
tôi những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày
tháng năm 2019
Tác giả
Cao Đức Danh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... i
DANH MỤC CÁC HÌNH....................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT............................................... vii
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................... 3
1.1. Sự phân bố và tính đa dạng của vi sinh vật biển.............................................. 3
1.2. Xạ khuẩn và sự hình thành các hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn......................4
1.2.1. Xạ khuẩn (Actinobacteria)......................................................................... 4
1.2.2. Sự hình thành các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học ở xạ khuẩn....7
1.3. Các họ xạ khuẩn biển thƣờng gặp................................................................... 8
1.3.1. Họ Streptomycetaceae................................................................................ 8
1.3.2. Họ Micromonosporaceae........................................................................... 8
1.3.3. Các họ khác của xạ khuẩn biển................................................................. 9
1.4. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển........................9
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.......................................................... 9
1.4.1.1. Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh................................................. 9
1.4.1.2. Các hợp chất có hoạt tính kháng lao................................................ 15
1.4.1.3. Các hợp chất có hoạt tính chống ung thư và gây độc tế bào............18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc......................................................... 26
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................32
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu........................................................................ 32
2.1.1. Vật liệu.................................................................................................... 32
2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 32
2.1.3. Thiết bị.................................................................................................... 33
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 33
2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu................................................................... 33
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn biển [74-76].....................................34
2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch các chủng bằng que cấy vòng [74, 77]............35
2.2.4. Phƣơng pháp giữ giống xạ khuẩn sau phân lập [74, 77, 78]...............35
2.2.5. Phƣơng pháp hoạt hoá và nuôi cấy [74, 77, 78]................................... 35
2.2.6. Phƣơng pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy để sàng lọc hoạt tính sinh
học
.............................................................................................................
2.2.7. Phƣơng pháp định danh xạ khuẩn .......................................
2.2.7.1. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn ..............................
2.2.7.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn bằng kỹ thuật sinh học ph
2.2.8. Phƣơng pháp sinh khối lƣợng lớn [83]...................................
2.2.9. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất thứ cấp. ........................
2.2.10. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân
2.2.11. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ....
2.2.13. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng lao [86]. .........................
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................................
3.1.
Kết quả thu mẫu ................................................................................
3.2.
Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn .............................................
3.3.
Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc. ...............
3.4.
Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 .........
3.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu ...............................
3.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom ....................................................................
3.4.3. Giải trình tự gen ........................................................................................
3.5.
Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng xạ khuẩn G246, G261, G2
3.6.
Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ ch
khuẩn Streptomyces sp. G246 ..................................................................................
3.6.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết ...........................................................................
3.6.2. Phân lập các chất từ các cặn chiết ...........................................................
3.6.3. Thông số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng
Streptomyces sp. G246 ..............................................................................................
3.6.3.1.
trihydroxylflavanone ......................................................................................
3.6.3.2.
tetrahydroxylchalcone ....................................................................................
3.6.3.3. Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly) ..................................................
3.6.3.4. Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr) ...........................................
3.6.3.5. Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr) ..........................................
3.6.3.6. Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala).................................................. 53
3.6.3.7. Hợp chất G246-7: norharman......................................................... 53
3.6.3.8. Hợp chất G246-8: tryptophan......................................................... 54
3.6.3.9. Hợp chất G246-9: indol-3-carboxylic acid...................................... 54
3.6.3.10. Hợp chất G246-10: phenyl alanin................................................ 54
3.7. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G261.............................................................................. 54
3.7.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết......................................................................... 54
3.7.2. Phân lập các chất từ cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261........55
3.7.3 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. G261...................................................................................... 57
3.7.3.1. Hợp chất G261-1: norharman......................................................... 57
3.7.3.2. Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol.................................................. 57
3.7.3.3. Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid.................................. 57
3.7.3.5. Hợp chất G261-5: 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid.....................57
3.7.3.6. Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide......................................58
3.7.3.7. Hợp chất G261-7: phenyl alanine................................................... 58
3.7.3.8. Hợp chất G261-8: cyclo-(pro-gly)................................................... 58
3.7.3.9. Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala).................................................. 58
3.7.3.10. Hợp chất G261-10: cyclo-(Leu-Pro)............................................. 58
3.7.3.11. Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr)............................................... 58
3.7.3.12. Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe).........................59
3.8. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G248.............................................................................. 59
3.8.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết......................................................................... 59
3.8.2. Phân lập các chất từ các cặn chiết......................................................... 60
3.8.3. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ
chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248.......................................................... 62
3.8.3.1. Hợp chất G248-1: cyclo-(Pro – Leu)............................................... 62
3.8.3.2. Hợp chất G248-2: cyclo-(Pro-Phe)................................................. 63
3.8.3.3. Hợp chất G248-3: norharman......................................................... 63
3.8.3.4. Hợp chất G248-4: cyclo (Pro-Tyr).................................................. 63
3.8.3.5. Hợp chất G248-5: cyclo-(Pro-Gly).................................................. 63
3.8.3.6. Hợp chất G248-6: cyclo-(Pro-Trp).................................................. 64
3.8.3.7. Hợp chất G248-7: adenine.............................................................. 64
3.8.3.8. Hợp chất G248-8: 2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid.........................64
3.8.3.9. Hợp
chất
G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′-
dihydroxylflavanone..................................................................................... 64
3.8.3.10.
Hợp
chất
G248-10:
(2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7-
dihydroxylflavanone..................................................................................... 64
3.8.3.11.
Hợp
chất
G248-11:
(2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-
tetrahydroxylflavanone................................................................................. 64
3.8.3.12. Hợp
chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-
tetrahydroxylchalcone.................................................................................. 65
3.8.3.13. Hợp chất G248-13:
(2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-
trihydroxylflavanone..................................................................................... 65
3.9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc...............65
3.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSVKĐ của các hợp chất........................65
3.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của các hợp chất phân lập đƣợc.......65
3.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc . 65
CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ............................................................. 68
4.1. Kết quả thu mẫu............................................................................................. 68
4.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn.......................................................... 68
4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc.............................68
4.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248........................ 69
4.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu...............................69
4.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom.................................................................... 69
4.4.3. Giải trình tự gen xác định tên các chủng xạ khuẩn................................ 70
4.5. Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248.......70
4.6. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G246.............................................................................. 70
4.6.1.
Hợp
5,2′,4′-
chất
G246-1:
(2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-
trihydroxylflavanone (hợp chất mới)................................................................ 70
4.6.2.
Hợp
2,4,2′,6′-
chất
G246-2:
(2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-
tetrahydroxylchalcone (hợp chất mới)............................................................. 77
4.6.3. Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly)......................................................... 83
4.6.4. Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr).................................................. 84
4.6.5. Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr).................................................. 85
4.6.6. Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala)......................................................... 86
4.6.7. Hợp chất G246-7: norharman................................................................ 87
4.6.8. Hợp chất G246-8: tryptophan................................................................. 88
4.6.9. Hợp chất G246-9: indole-3-carboxylic acid........................................... 88
4.6.10. Hợp chất G246-10: phenyl alanin........................................................ 89
4.6.11. Tổng hợp các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp. G246
90
4.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G261.............................................................................. 91
4.7.1. Hợp chất G261-1: norharman................................................................ 91
4.7.2. Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol.......................................................... 91
4.7.3. Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid.......................................... 92
4.7.4. Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid
92
4.7.5. Hợp chất G261-5: acid 3-hydroxy-4-methoxybenzoic............................95
4.7.6. Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide............................................. 96
4.7.7. Hợp chất G261-7: phenylalanin............................................................. 96
4.7.8. Hợp chất G261-8: cyclo-(Pro-Gly)......................................................... 97
4.7.9. Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala)......................................................... 97
4.7.10. Hợp chất G261-10: cyclo-(Pro-Leu)..................................................... 98
4.7.11. Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr)...................................................... 99
4.7.12. Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe)...............................100
4.7.13. Hợp chất G261-13: cyclo-(Leu-Tyr)................................................... 101
4.7.14. Tổng hợp các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp.
G261
102
4.8. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces sp. G248............................................................................ 103
4.8.1. Hợp chất G248-1: cyclo-(Pro-Leu)....................................................... 103
4.8.2. Hợp chất G248-2: cyclo-(Pro-Phe)....................................................... 103
4.8.3. Hợp chất G248-3: norharman.............................................................. 104
4.8.4. Hợp chất G248-4: cyclo-(Pro-Tyr)........................................................ 105
4.8.5. Hợp chất G248-5: cyclo-(Pro-Gly)........................................................ 105
4.8.6. Hợp chất G248-6: cyclo-(Pro-Trp)....................................................... 106
4.8.7. Hợp chất G248-7: adenine.................................................................... 107
4.8.9.
5,2′-
Hợp
chất
G248-9:
(2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-
dihydroxylflavanone........................................................................................ 108
4.8.10. Hợp chất G248-10: 6-prenyl-4′-methoxy-5,7-dihydroxylflavanone...115
4.8.11.
5,7,2′,4′-
Hợp
chất
G248-11:
(2S,2″S)-6-lavandulyl-
tetrahydroxylflavanone................................................................................... 116
4.8.12. Hợp
2,4,4′,6′-
chất
G248-12:
(2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-
tetrahydroxylchalcone..................................................................................... 119
4.8.13.
Hợp
chất
G248-13:(2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-
trihydroxylflavanone....................................................................................... 125
4.8.14. Tổng hợp các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp.
G248
126
4.9. Biện luận kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc
từ các chủng xạ khuẩn........................................................................................ 127
4.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSV kiểm định của một số hợp chất.....127
4.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của một số hợp chất.........................128
4.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc
.....
128
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 129
* KẾT LUẬN....................................................................................................... 129
* KIẾN NGHỊ...................................................................................................... 130
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.......................................... 131
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 132
i
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của các nhóm vi khuẩn............................................ 6
Bảng 3. 1. Giá trị MIC của cặn chiết EtOAc của các chủng được thử hoạt tính kháng
vi sinh vật kiểm định............................................................................................... 44
Bảng 3. 2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng lao của các chủng nghiên cứu............45
Bảng 3. 3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào KB của cặn chiết EtOAc của dịch
nuôi cấy các chủng xạ khuẩn phân lập được........................................................... 45
Bảng 3. 4. Điều kiện nuôi cấy lượng lớn của 3 chủng nghiên cứu..........................49
Bảng 3. 5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được đối với
VSVKĐ................................................................................................................... 66
Bảng 3. 6. Kết quả thử hoạt tính kháng lao một số chất phân lập được...................67
Bảng 3. 7. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 14 hợp chất tách chiết từ các
chủng nghiên cứu G246, G261 và G248 đối với 4 dòng tế bào thử nghiệm...........67
Bảng 4. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-1 và hợp chất tham khảo............71
Bảng 4. 2. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-2 và chất so sánh G246-1...........78
Bảng 4. 3. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-3 và hợp chất tham khảo............84
Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-4 và hợp chất tham khảo.............85
Bảng 4. 5. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-5 và hợp chất tham khảo............86
Bảng 4. 6. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-6................................................. 87
Bảng 4. 7. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-7 và hợp chất tham khảo............88
Bảng 4. 8. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-9 và hợp chất tham khảo............89
Bảng 4. 9. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-10 và hợp chất tham khảo..........90
Bảng 4. 10. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-7 và hợp chất tham khảo..........96
Bảng 4. 11. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-8 và hợp chất tham khảo...........97
Bảng 4. 12. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-9 và hợp chất tham khảo..........98
Bảng 4. 13. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-10 và hợp chất tham khảo........99
ii
Bảng 4. 14. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-12 và hợp chất tham khảo......100
Bảng 4. 15. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-13 và hợp chất tham khảo......101
Bảng 4. 16. Số liệu phổ NMR của hợp chất G248-2 và hợp chất tham khảo........104
Bảng 4. 17. Số liệu phổ NMR của hợp chất G248-6 và hợp chất tham khảo........106
Bảng 4. 18. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-9 và hợp chất tham khảo.......109
Bảng 4. 19. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-10 và hợp chất tham khảo.....116
Bảng 4. 20. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-11 và chất tham khảo.............119
Bảng 4. 21. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-12 và hợp chất tham khảo.....120
Bảng 4. 22. Số liệu phổ NMR của hợp chất G248-13 và hợp chất tham khảo......126
iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Gram dương và Gram âm...................6
Hình 1. 2. Cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn lao.................................................... 16
Hình 4. 1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của
hợp chất G246-1 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo...................................... 70
Hình 4. 2. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất G246- 1.................................................. 73
1
Hình 4. 3. Phổ H NMR hợp chất G246-1: (500.13 MHz, CD3OD).......................73
Hình 4. 4. Phổ
13
C NMR của hợp chất G246-1: 125.76 MHz, CD3OD..................74
Hình 4. 5. Phổ DEPT của hợp chất G246-1: 125.76 MHz, CD3OD........................74
1
1
Hình 4. 6. Phổ H- H COSY của hợp chất G246-1: 500.13 MHz, CD3OD............75
Hình 4. 7. Phổ HSQC của hợp chất G246-1............................................................ 75
Hình 4. 8. Phổ HMBC của G246-1......................................................................... 76
Hình 4. 9. Phổ NOESY của G246-1: 500.13 MHz, CD3OD................................... 76
Hình 4. 10. Phổ CD và ECD cho 2 đồng phần 2S,2″S- và 2S,2″R- của G246-1......77
Hình 4. 11. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của
hợp chất G246-2 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo G246-1......................... 77
Hình 4. 12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất G246-2................................................. 79
1
Hình 4. 13. Phổ H NMR của hợp chất G246-2: 500.13 MHz, CDCl3...................80
Hình 4. 14. Phổ
13
C NMR của hợp chất G246-2: 125.76 MHz, CDCl3..................80
1 -1
Hình 4. 15. Phổ H H COSY của hợp chất G246-2: 500.13 MHz, CDCl3.............81
Hình 4. 16. Phổ HSQC của hợp chất G246-2.......................................................... 81
Hình 4. 17. Phổ HMBC của hợp chất G246-2......................................................... 82
Hình 4. 18. Phổ NOESY của hợp chất G246-2 (500.13 MHz, CDCl3)...................82
Hình 4. 19. Phổ CD và phổ CD tính toán 2 đồng phần 2″S- và 2″R- của G246-2...83
Hình 4. 20. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-3................................................. 83
Hình 4. 21. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-4................................................. 84
iv
Hình 4. 22. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-5................................................. 85
Hình 4. 23. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-6................................................. 86
Hình 4. 24. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của
hợp chất G246-7..................................................................................................... 87
Hình 4. 25. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-8................................................. 88
Hình 4. 26. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-9................................................. 89
Hình 4. 27. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-10............................................... 89
Hình 4. 28. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-1 đến G246-10...........................90
Hình 4. 29. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-1................................................. 91
Hình 4. 30. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-2................................................. 91
Hình 4. 31. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-3................................................. 92
Hình 4. 32. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của G261-4..........92
Hình 4. 33. Phổ HR-MS chất G261-4..................................................................... 93
1
Hình 4. 34. Phổ H-NMR (500 MHz; CD3OD) của chất G261-4...........................93
Hình 4. 35. Phổ
13
C-NMR (500 MHz; CD3OD) của chất G261-4..........................94
Hình 4. 36. Phổ HSQC của chất G261-4................................................................. 94
Hình 4. 37. Phổ HMBC của chất G261-4................................................................ 95
Hình 4. 38. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-5................................................. 95
Hình 4. 39. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-6................................................. 96
Hình 4. 40. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-7................................................. 97
Hình 4. 41. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-8................................................. 97
Hình 4. 42. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-9................................................. 97
Hình 4. 43. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-10............................................... 98
Hình 4. 44. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-11............................................... 99
Hình 4. 45. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-12............................................. 100
Hình 4. 46. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-13............................................. 101
v
Hình 4. 47. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-1 đến G261-13.........................102
Hình 4. 48. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-1............................................... 103
Hình 4. 49. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-2............................................... 103
Hình 4. 50. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-3............................................... 104
Hình 4. 51. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-4............................................... 105
Hình 4. 52. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-5............................................... 105
Hình 4. 53. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-6............................................... 106
Hình 4. 54. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-7............................................... 107
Hình 4. 55. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-8............................................... 107
Hình 4. 56. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của
hợp chất G248-9 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo....................................108
Hình 4. 57. Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất G248-9....................................... 110
Hình 4. 58. Phổ IR của hợp chất G248-9.............................................................. 111
1
Hình 4. 59. Phổ H-NMR (500 MHz; CD3OD) của hợp chất G248-9................. 111
Hình 4. 60. Phổ
13
C NMR của hợp chất G248-9: 125.76 MHz, CD3OD..............112
Hình 4. 61. Phổ DEPT của hợp chất G248-9: 125.76 MHz, CD3OD....................112
1
1
Hình 4. 62. Phổ H- H COSY của hợp chất G248-9: 500.13 MHz, CD3OD........113
Hình 4. 63. Phổ HMBC của G248-9..................................................................... 113
Hình 4. 64. Phổ HSQC của hợp chất G248-9........................................................ 114
1
Hình 4. 65. Phổ ROESY của hợp chất G248-9 ( H: 500.13 MHz)........................114
Hình 4. 66. Phổ CD và phổ ECD của 2 đồng phân 2S,2″S- và 2S,2″R- G248-9....115
Hình 4. 67. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-10............................................. 115
Hình 4. 68. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của
hợp chất G248-11 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo..................................116
Hình 4. 69. Phổ CD và ECD cho 2 đồng phân 2S,2″S- và 2S,2″R- G248-11.........118
vi
Hình 4. 70. Cấu trúc hóa học, các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp
chất G248-12 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo......................................... 119
Hình 4. 71. Phổ HR- ESI-MS của hợp chất G248-12........................................... 121
1
Hình 4. 72. Phổ H-NMR (500 MHz; CD3OD) của hợp chất G248-12...............122
Hình 4. 73. Phổ
13
C NMR của hợp chất G248-12: 125.76 MHz, CD3OD............122
Hình 4. 74. Phổ DEPT của hợp chất G248-12: 125.76 MHz, CD3OD..................123
1
1
Hình 4. 75. Phổ H- H COSY của hợp chất G248-12: 500.13 MHz, CD3OD......123
Hình 4. 76. Phổ HMBC của G248-12................................................................... 124
Hình 4. 77. HSQC của hợp chất G248-12............................................................. 124
Hình 4. 78. Phổ CD và ECD của 2 đồng phân 2″S- G248-12 và 2″R-G248-12.....125
Hình 4. 79. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-13............................................. 125
Hình 4. 80. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-1 đến G248-13.........................127
vii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
TLC
CC
RP
ESI-MS
HRESI-MS
1
H-NMR
13
C-NMR
DEPT
COSY
HSQC
HMBC
NOESY:
IC50
OD
TMS
ppm
RNA
SEM
UIC
UV
DMSO:
DNA
MRSA
MIC
GG+
Ký hiệu
KS
HTKS
VK
VSV
VSVKĐ
XK
δH, δC
CTPT
CKS
1
MỞ ĐẦU
Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học
lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật trên trái
đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường biển đã được biết đến
như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, như một kho dược liệu
khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt
dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc
điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá.
Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế
giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số đó có rất nhiều các hợp chất thứ
cấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú. Đồng thời nhiều hợp chất trong
số này đã đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Việt Nam nằm
trong khu vực Thái Bình Dương (có chủ quyền biển với diện tích khoảng 1.000.000
2
km ) có hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên
biển. Chính phủ Việt Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài
nguyên thiên nhiên và nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển. Tuy nhiên nghiên
cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt
đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của
nước ta là rất lớn.
Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của con người và động
vật. Khoảng nửa sau thế kỷ 19, người ta đã phát hiện vi sinh vật chính là nguyên nhân
gây ra các bệnh truyền nhiễm. Do đó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi sinh vật gây
bệnh đã được phát triển thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, Alexander Fleming
phát hiện ra Penicillin – hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh và được Abraham,
Chain, Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào năm 1941. Thuốc
kháng sinh Penicillin trở nên nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều người trong chiến tranh
thế giới II. Kể từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí
hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ,
với nhu cầu ngày càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn. Hiện nay, đã có thêm
nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm
phần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển. Nhưng càng ngày càng nhiều các vi sinh vật
2
gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Do vậy, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu,
tìm kiếm, phát hiện các loại kháng sinh mới, các hoạt chất có tính kháng lao, chống
ung thư. Vì vậy chúng tôi thực hiện luận án này với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập
và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba
chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền
Trung - Việt Nam”.
Mục tiêu nghiên cứu:
Phát hiện các hợp chất có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào từ nguồn vi
sinh vật đáy biển miền Trung của Việt Nam, cụ thể là:
- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp từ dịch
nuôi cấy của 3 chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam.
- Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của
các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng
các hợp chất này.
Nhiệm vụ nghiên cứu:
- Tổng quan tài liệu các nghiên cứu trước đây về các hợp chất thứ cấp cũng như
hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật biển.
- Tìm các quy trình xử lý dịch nuôi cấy để tạo dịch chiết. Tinh chế các cặn dịch
chiết này trên sắc ký cột để thu được các phân đoạn.
- Tinh chế các chất có trong các phân đoạn để thu được các hợp chất sạch.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập được.
- Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các chất phân lập được.
- Thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với một số dòng tế bào ung thư như
KB, MCF-7, Hep-G2, Lu-1 của các hợp chất sạch phân lập được.
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Sự phân bố và tính đa dạng của vi sinh vật biển
Biển là môi trường sống rất đặc biệt, vì ở đó nghèo chất dinh dưỡng và độ mặn
cao. Biển là một hệ sinh thái tự nhiên lớn nhất địa cầu vì hơn 70% bề mặt trái đất được
bao phủ bởi nước. Vi sinh vật biển có khả năng thích nghi với các điều kiện môi
trường biển luôn bị thay đổi, điều này mở ra các triển vọng phát triển các hợp chất hữu
cơ thứ cấp đặc biệt. Số lượng vi sinh vật biển không cao như trên cạn. Vi sinh vật biển
có thể phân lập được từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối tượng sinh vật biển mà vi
sinh vật có thể liên kết. Hiểu được qui luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ tạo điều
kiện thuận lợi để thu thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho việc phân lập định
9
hướng các nhóm vi sinh vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1-4]. Có 10 đơn
6
vị phân loại vi khuẩn trên quả đất trong đó 10 taxa là từ đại dương. Sự phân bố của vi
5
sinh vật biển là 10 TB/ml và dự báo các đại dương chứa 3,6.10
29
TB vi sinh vật, với
phần lớn sinh khối là từ vi khuẩn, cổ khuẩn, xạ khuẩn và nấm đơn bào. Vi khuẩn
thường chiếm ưu thế trong nước biển là Pseudomonas sp., Vibrio sp., Achromobacter
sp., Flavobacterium sp., và Micrococcus sp. Quần thể vi sinh vật biển có thể chia theo
điều kiện sống của chúng. Các sinh vật biển như hải miên, san khô mềm, thân mềm,
rong, da gai và một số vật liệu biển khác như trầm tích được biết là vật chủ của cộng
đồng vi sinh vật lớn và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh
dưỡng và sự đặc hữu của từng loài. Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật
bằng các phương pháp như điện di (DGGE), giải trình tự gen 16S rRNA, người ta
nhận thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên, san hô mềm và một số vật liệu
biển khác có tới hơn 25 phyla, trong đó có Proteobacteria,
Nitrospira,
Cyanobacteria,
Bacteriodetes,
Actinobacteria,
Chloroflexi,
Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia, ngoài các thành
viên của cổ khuẩn. Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên là nấm, xạ khuẩn
và microalgae. Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống virus được
phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola. Những nghiên cứu
về hải miên chỉ ra các loại vi sinh vật liên kết hải miên trong đó có các thành viên
Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Cyanobacteria và Archaea
[5].
Nhóm vi khuẩn hiếu khí là các vi khuẩn dị dưỡng, có khả năng phát triển trên
4
nguồn cơ chất sẵn có như hiđrocacbon, lipit, protein ở điều kiện có oxy hay ít oxy.
Nhóm vi khuẩn chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ: bao gồm vi khuẩn nitrit hóa, nitrat
hóa và vi khuẩn khử nitrat. Trong đó nhóm vi khuẩn nitrit hóa sẽ oxy hóa amonium
thành nitrit để nhóm vi khuẩn nitrat hóa oxy hóa tiếp thành nitrat. Còn nhóm vi khuẩn
khử nitrat sẽ khử nitrat thành nitơ phân tử, khép kín một chu trình chuyển hóa các hợp
chất chứa nitơ.. Nhóm vi sinh vật sử dụng hydrocacbon và tạo chất hoạt hóa bề mặt là
các vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt và sử dụng các hyđrocacbon của
dầu mỏ làm cơ chất cho sự phát triển. Số lượng của vi khuẩn sử dụng hydrocacbon là
chỉ thị cho sự ô nhiễm dầu.
Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai trò quan trọng
đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản. Những vi sinh vật này có
thể tìm thấy ở bất kỳ ngõ ngách nào ở đại dương từ trên bề mặt đến dưới thềm đáy
biển, trên các cơ thể sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu. Khoảng 1% số tế
bào vi khuẩn quan sát được ở các mẫu sinh vật lấy từ biển là có thể phát triển trong
các môi trường nuôi cấy nhân tạo. Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một
trong số các nguồn tài nguyên quan trọng sản sinh các chất hữu cơ với cấu trúc hóa
học đa dạng và có hoạt tính sinh học thú vị [1-4]. Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã
được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhờ các tính chất đặc
hiệu của chúng [6]. Hầu hết các hợp chất thứ cấp đã biết từ vi khuẩn được tạo ra bởi
xạ khuẩn (actinobacteria) và khuẩn lam (cyanobacteria).
1.2.
Xạ khuẩn và sự hình thành các hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn
1.2.1. Xạ khuẩn (Actinobacteria)
Xạ khuẩn là ngành đặc biệt thuộc vi khuẩn Gram dương, có sự phát triển theo
cấu trúc khoang, sợi (filamentous growth) và đôi lúc giống như nấm. Trước đây, xạ
khuẩn thường được phân loại là nấm sợi (filamentous fungi) và thỉnh thoảng được gọi
là ″vi khuẩn bậc cao″. Chúng có đặc điểm hoá sinh học đặc biệt, tạo ra lượng lớn các
loại hợp chất tự nhiên, rất nhiều trong số đó có hoạt tính sinh học mạnh như kháng
sinh hoặc các hoạt tính dược học khác. Về khía cạnh các hợp chất tự nhiên, các chi
quan trọng nhất trong xạ khuẩn là Streptomyces và Actinomyces. Xạ khuẩn biển có
trong trầm tích biển và trong rất nhiều các sinh vật biển khác (endophytes). Gần đây,
các nhà khoa học đã phát hiện một số chi xạ khuẩn biển mới với các hợp chất đặc
5
trưng và quan trọng [7, 8]. Đặc biệt, các chi này đều có khả năng thích nghi với môi
trường có độ mặn khác nhau.
Các nghiên cứu hiện nay hầu hết đều sử dụng hệ thống phân loại xạ khuẩn của
tác giả Bergey [9, 10]. Hệ thống phân loại này chủ yếu dựa trên các phân tích dải trình
tự nucleotide một gene của RNA thay vì các dữ liệu về kiểu hình như truyền thống. Kể
từ khi xuất hiện phương pháp so sánh dải trình tự rRNA [2], đã có những tranh luận
kéo dài về hiệu quả của marker đơn phân tử (đơn gene), trong việc giải mã và xác định
loài mới. Mặc dù các phân tích dựa trên việc so sánh nhiều gene đã được sử dụng từ
lâu, tuy nhiên trong phân loại học, phương pháp này hiện chưa thể áp dụng do chưa có
một cơ sở dữ liệu đầy đủ đối với các chuỗi đa phân tử (đa gene). Ngay cả trong kỷ
nguyên của di truyền học hiện nay, chỉ có rất ít dữ liệu cho các chuỗi không phải là
rRNA, trong khi hiện có hơn 400.000 cấu trúc rRNA cơ bản thuộc các cơ sở dữ liệu
chung hoặc chuyên ngành. Bên cạnh đó, dữ liệu của các dự án lập bản đồ gene đã giúp
xác định một tập hợp nhỏ các gene là đại diện cho kiểu gene của sinh vật tiền nhân.
Hơn nữa, kết quả của các nghiên cứu sử dụng phương pháp so sánh trình tự đơn gene
ở trên thế giới cơ bản đều phù hợp với những hiểu biết về tiến hoá của sinh vật tiền
nhân. Mặc dù hình dạng chi tiết cây tiến hoá được xây dựng từ các marker khác nhau
có khác nhau, chúng vẫn có các nhóm/ bậc phân loại chính tương đồng hoặc ít nhất là
không đối lập phương pháp phân loại của Bergey dựa trên các cơ sở dữ liệu của về các
cấu trúc đơn gene của rRNA là một phương pháp có độ tin cậy cao [11].
Xạ khuẩn là một trong những ngành lớn của giới vi khuẩn, được phân loại dựa
trên đặc điểm phân nhánh của gene 16S rRNA và những dấu hiệu phân loại đặc trưng
của gen 16S rRNA. Dựa trên các kết quả nghiên cứu về gen 23S rRNA và sự sắp xếp
của các gen, xạ khuẩn khác các ngành vi khuẩn khác do chúng có một số protein đặc
hữu như: cytochrome-c, oxidase subunit 1, CTP synthase and glutamyl-tRNA
synthase. Theo Bergey, đến năm 2012, xạ khuẩn bao gồm 5 lớp, 19 bộ, 50 họ và 221
chi [9, 10].
Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương hoặc vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí với phản ứng
nhuộm mầu thay đổi (Gram-stain-variable), với cấu trúc thành tế bào cứng, cố định có
chứa muramic acid. Hầu hết xạ khuẩn là chemo-organotrophs (nguồn năng lượng có
được từ quá trình oxi hoá các liên kết hoá học trong các hợp chất hữu cơ) phát triển
trong môi trường pH trung tính, tuy nhiên, có một số xạ khuẩn sống trong môi trường
