Báo cáo thực hành phân tích dụng cụ

BÀI 1: XÁC ĐỊNH SẮT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRẮC QUANG, KỸ
THUẬT ĐƯỜNG CHUẨN TRỰC TIẾP
1.1. CÂU HỎI CHUẨN BỊ
1. Trình bày nguyên tắc xác định của Fe2+. Kỹ thuật trong bài là gì?
Phức giữa 1,10-phenantrolin với sắt (II) có tên gọi là “feroin” có màu đỏ cam được
hình thành trong khoảng pH từ 2-9, hấp thụ ở λ = 510nm. Phức bền, có cường độ màu
không thay đổi nhiều tháng, khoảng tuân theo định luật Beer là 0,13-5ppm. Do trong
nước sắt tồn tại ở cả 2 dạng Fe 2+ và Fe3+. Vì vậy muốn xác định tổng hàm lượng sắt
trong nước cần chuyển toàn bộ Fe 3+ thành Fe2+ bằng tác nhân khử như hydroxylamine,
hydroquynon hay hydrazine. Sau đó, tạo phức với thuốc thử 1,10-phenantrolin ở pH từ
2,9 đến 3,5: một ion Fe2+ sẽ kết hợp với 3 phân tử thuốc thử để hình thành phức có
màu đỏ cam. Đo mật độ quang của dung dịch phức ở bước sóng 510nm để xác định
hàm lượng sắt.
Kỹ thuật được sử dụng trong bài là kỹ thuật đường chuẩn.
2. Trình bày vai trò của từng hoá chất trong bài thực hành này, có thể thay hydroxylamin
bằng dung dịch SnCl2 10% được không? Giải thích
- Hydroxyamin được dùng để loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng của các chất oxi hóa mạnh
và chuyển Fe3+ về Fe2+.
- Dung dịch thuốc thử1,10-phenantrolin: dùng để tạo phức có màu với ion sắt (II).
- Đệm pH = 5 dùng để ổn định môi trường.
- Không thể thay thế Hydroxyamin bằng SnCl 2 10% vì SnCl2 +H2O  Sn(OH)Cl + HCl.
Sn(OH)Cl là chất rắn không tan do đó làm dung dịch bị vẩn đục, bên cạnh đó
SnCl2 khó pha chế.
3. Nếu thay bình định mức 25 mL bằng bình 50 mL thì tổng thể tích dãy chuẩn phải là
bao nhiêu để dãy chuẩn có nồng độ các điểm chuẩn không thay đổi?
Để dãy chuẩn có nồng độ các điểm chuẩn không đổi thì tổng thể tích của dãy
chuẩn phải tăng lên gấp đôi và như trong bài này đó là 10mL vì:
Xét bình định mức 25mL, ta lấy 5mL được tổng nồng độ dãy chuẩn là:
Cđm25.25 = Cc.Vc1  Cđm25.25 = 25.5 => Cđm25 = 5(ppm).
Xét bình định mức 50ml: Cđm50.50 = Cc.Vc2.
Để nồng độ các điểm không đổi các điểm chuẩn không đổi tổng nồng độ của dãy

Vc 2 =

50.5
= 10mL
25

chuẩn không đổi  Cđm25= Cđm50=5(ppm) 
.
4. Trình bày trình tự hợp lý, khoa học khi thực hiện bài thực hành này. Có thể dùng kỹ
thuật so sánh được không? λ = 508 nm có phải là λmax không? Nếu không thì làm cách
nào để xác định λmax trong điều kiện làm việc tại phòng thí nghiệm. Sau khi có số liệu thí
nghiệm, hãy chọn dung dịch phù hợp để thực hiện kỹ thuật so sánh một chuẩn, hai chuẩn.
Tính toán kết quả và so sánh kết quả của 3 kỹ thuật.
Tiến hành pha chuẩn, pha mẫu với bình định mức 25mL. Sau đó để yên 15 phút.
1


Dùng một bình trong dãy chuẩn quét phổ của dung dịch phức trong khoảng bước sóng
400nm đến 600nm, bình 1 làm bình so sánh. Tìm ra giá trị bước sóng ứng với độ hấp thu
cực đại. Sau đó do độ hấp thu của dãy chuẩn và mẫu tại bước cực đại vừa tìm được, bình
số 1 làm bình so sánh.
Có thể dùng kỹ thuật so sánh nhưng kết quả có độ chính xác không cao bằng kỹ
thuật dường chuẩn.
Phức của ion Fe2+ với 1,10-phenanthroline hấp thu bức xạ có bước sóng 5105nm
nên có thể là bước sóng ứng với độ hấp thu cực đại hoặc có thể là không phải. Nếu không
phải thì ta phải tiến hành quét sóng để xác định bước sóng ứng với độ hấp thu cực đại để
tiến hành đo độ hấp thu.
5. Nếu cho bề dày cuvet là 1cm; thể tích đo là 25 mL. Hãy tính hàm lượng Fe 2+ tối thiểu
(µg) trong bình đo để định lượng trên máy quang phổ có Amin = 0,001 AU
Từ phương trình y = 0,0087x – 0,0026 thực nghiệm của bài này: khi Amin = 0,001 AU

=> Hàm lượng Fe2+ tối thiểu (µg) trong bình đo = 0,418(µg).
6. Nếu mẫu có tác nhân oxy hóa thì có ảnh hưởng gì đến kết quả thí nghiệm? Giải thích
và nêu cách khắc phục.
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm là: các chất oxi hóa mạnh; xyanua,
nitrit; crom, kẽm khi nồng độ chúng gấp 10 lần nồng độ sắt; coban, đồng khi nồng độ
chúng gấp 5 lần nồng độ sắt; niken khi nồng độ của nó gấp 2 lần sắt; bimut, cadimi, thủy
ngân, molypdat và bạc tạo kết tủa với 1,10- phenantrolin. Dẫn đến quá trình hấp thụ sai
=> đi đến kết quả phân tích sai.
Cách khắc phục: Ban đầu đun sôi với axit để loại bỏ ảnh hưởng của xyanua và
nitrat. Thêm chất khử hydroxyamin dư để loại bỏ sự ảnh hưởng của các chất oxi hóa
mạnh.
7. Xác định Fe có kết quả thực nghiệm như sau:
Ký hiệu bình
Chuẩn
Mẫu
Dung dịch (mL)

1

2

3

4

5

6

Chuẩn Fe2+ 10 ppm

0,0

1,0

2,5

4,0

0,0

0,0

Mẫu

0,0

0,0

0,0

0,0

5,0

5,0

0,000

0,037

0,082

0,122

0,021

0,140

Độ hấp thu A

Kết quả thực nghiệm có điều gì không hợp lý? Theo Anh Chị nên xử lí như thế nào?
Kết quả thực nghiệm của mẫu nằm ngoài khoảng tuyến tính của dãy chuẩn nên
không hợp lý. Đối với mẫu có độ hấp thu A nhỏ hơn độ hấp thu tối thiểu trong dãy chuẩn
2


thì chúng ta cần cho thêm mẫu vào bình định mức và định mức tới vạch. Đối với mẫu có
độ hấp thu A lớn hơn độ hấp thu tối đa của dãy chuẩn thì chúng ta cần lấy bớt mẫu ra và
định mức lại.
1.2. BÀI TƯỜNG TRÌNH
1. Kết quả đo
Chuẩn
VFe2+ 25 ppm

0,0
chuẩn (mL)
Vmẫu (mL)
0,0
2+

Hàm lượng Fe (µg)
0,0
Độ hấp thu A
0,0
2. Đồ thị đường chuẩn

Mẫu

0,5

1,0

1,5

2,0

0,0

0,0
12,5
0,110

0,0
25
0,202

0,0
37,5
0,327

0,0
50
0,435

5,0
13,98
0,119

3. Tính kết qua
Phương trình hồi qui biểu diễn mối quan hệ giữa A và số µg sắt:
y = 0,0087x – 0,0026; R2 =0,9983
Hàm lượng Fe2+ (µg) trong mẫu: Dựa vào phương trình đường chuẩn ta tính được giá trị
hàm lượng Fe2+= 23,18 (µg).
Nồng độ Fe2+ (ppm) trong mẫu ban đầu: từ giá trị hàm lượng Fe 2+=23,18(µg) ta tính được
Fe 2+ =

23,18
= 4, 636 ( ppm ) .
5

nồng độ của
Phương trình hồi qui biễu diễn mối quan hệ giữa A và nồng độ ppm của sắt:
y = 0,2174x – 0,0026; R² = 0,9983

3


Vc 2 =

50.5

= 10mL
25

BÀI 2: XÁC ĐỊNH NITRIT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRẮC
QUANG, KỸ THUẬT THÊM CHUẨN

2.1. CÂU HỎI CHUẨN BỊ
1. Trình bày vài trò của các hóa chất sử dụng trong qui trình xác định?
Dung dịch nitrit: làm dung dịch chuẩn
Dung dịch CH3COOH (5M): tạo môi trường acid (pH = 2 đến 2,5).
Griess A (acid sunfanilic) và Griess B (anpha-naphthylamin). Nitrit được xác định
thông qua sự hình thành thuốc nhuộm màu đỏ hồng của phản ứng ghép đôi azo giữa acid
sunfanilic và anpha-naphthylamin trong môi trường pH=2 đến 2,5.
Nước cất 2 lần: dùng để pha chuẩn và mẫu.
2. Vì sao cần phải có bình số 1 để làm dung dịch so sánh? Kỹ thuật sử dụng trong bài này
được áp dụng khi nào? Ưu điểm của nó so với kỹ thuật thêm chuẩn so sánh?
Dùng bình số 1 làm mẫu trắng để xác định đường cơ sở để so sánh với các chuẩn.
Kỹ thuật được sử dụng trong bài là kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn được áp dụng khi
nền mẫu phức tạp không loại trừ được nhưng nồng độ C x đủ lớn hơn Cmin, nếu thêm vào
một lượng Cc sao cho Cx+Cc thuộc (Cmin đến Cmax).
Phương pháp này có ưu điểm hơn phương pháp thêm chuẩn so sánh là tính được
hệ số K chính xác hơn từ đó cho kết quả đáng tin cậy hơn.
3. Giả sử nồng độ NO2- 1 ppm thì sẽ không nghiệm đúng định luật Lambert-Beer. Với dữ
kiện bài thí nghiệm, hãy tính lượng cân mẫu hay thể tích mẫu đảm bảo định luật
Lambert-Beer nghiệm đúng cho 2 trường hợp sau:
3.1. Hàm lượng NaNO2 có trong lạp xưởng ghi trên bao bì 5 mg/Kg. Hỏi cần lấy bao
nhiêu gam mẫu đem chiết NaNO2 bằng 100mL nước cất nóng sau khi xay nhuyễn mẫu.
Rút ra 5 mL mẫu đem đo trong bình 25 mL và thực hiện kỹ thuật đường chuẩn thêm
chuẩn như trong bài?
Giả sử nồng độ NO2- 1 ppm thì sẽ không nghiệm đúng định luật Lambert-Beer =>

nồng độ NO2- 1ppm.
Trong bài thí nghiệm chọn bình 4 để tính (vì có A lớn nhất trong kết quả đo của bài).
Đặt nồng độ và số µg NO2- trong bình 4 lần lượt là C4, m4
Ta có C4 1ppm m425µg (trong bình đo 25mL).
Hàm lượng NO2- trong bình đo bao gồm chuẩn và mẫu.
Mà số µg chuẩn là: 51=5µg => số µg NO2- của mẫu trong bình đo 25 - 5=20 µg.
Gọi số g mẫu cần lấy là x(g):
Hàm lượng NaNO2 có trong lạp xưởng ghi trên bao bì 5 mg/Kg =5µg/g.
pha
x(g)
100mL
Hút 5 mL định mức thành 25mL (20µg).

4


Trong 1g mẫu có 5µg NaNO2 => có = µg NO2- trong 1g mẫu. Nên trong x(g) mẫu thì
có µg NO2-.
Từ đó ta được: 20  x120g.
Vậy mẫu cần lấy phải 120g.
3.2. Hàm lượng NaNO2 trong nước thải theo số liệu quan trắc môi trường dao động
5 - 7 ppm. Thực hiện kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn như trong bài thì số mL mẫu cần
lấy là bao nhiêu?
Gọi V(mL) là thể tích mẫu cần lấy ta có:
Theo như trong bài thì hàm lượng NaNO 2 trong nước thải theo số liệu quan trắc môi
trường dao động 5 -7 ppm
=> Hàm lượng NO2- dao động từ đến = đến
=> Số µg NO2- dao động trong khoảng từ đến V.
Để trong tuân theo định luật Lambert-Beer thì nồng độ của NO2- trong bình đo 1ppm.
Chọn bình 4 để tính toán (vì có A lớn nhất trong kết quả đo của bài).

Tương tự ta cũng đặt nồng độ và số µg NO2- trong bình 4 lần lượt là C4, m4 ta có:
C41ppm m425µg.
Hàm lượng NO2- trong bình đo bao gồm chuẩn và mẫu.
Mà số µg chuẩn là: 51=5µg => số µg NO2- của mẫu trong bình đo 25-5=20 µg.
V(mL)
pha
100mL
Hút 5mL
định mức thành 25 mL (20µg).
Giả sử ta lấy mẫu nước thải có nồng độ là 5ppm từ giải thích ở trên ta suy ra số µg
NO2- của mẫu:
=400µgV120mL. (1)
Tương tự ta chọn lấy mẫu nước có nồng độ là 7ppm từ giải thích ở trên ta suy ra số
µg NO2- của mẫu:
V=400µgV85,71mL. (2).
Từ (1) và (2) ta được: V85,71mL. Vậy mẫu lấy phải nhỏ hơn 85,71mL.
4. Nếu như yêu cầu định lượng nitrit ở hai mẫu có nền mẫu giống nhau. Có nhất thiết
phải thực hiện hai đường chuẩn thêm chuẩn không?
Nếu như yêu cầu định lượng nitrit ở hai mẫu có nền mẫu giống nhau thì không
nhất thiết phải thực hiện hai đường chuẩn thêm chuẩn vì nền mẫu giống nhau thì có thể
sử dụng trong cùng một đường chuẩn thêm chuẩn.

5


5. Định lượng nitrit trên 3 mẫu có nền giống nhau. Thực hiện như sau:
Ký hiệu bình

1
2

3
4
Dung dịch
Chuẩn NO-2 5ppm (mL)
0,0
0,0
0,5
1,0
Mẫu 1(mL)
0,0
5,0
5,0
5,0
Thêm thuốc thử thích hợp và định mức tới vạch
Độ hấp thu
0,0000
0,089
0,123
0,160

5
2,0
5,0
0,228

Đối với mẫu số 2 và 3 thực hiện như sau:
Ký hiệu bình
Dung dịch

6

(Mẫu 2)

7
(Mẫu 3)

Chuẩn NO-2 5ppm (mL)
0,0
Mẫu 1(mL)
5,0
Thêm thuốc thử thích hợp và định mức tới vạch
Độ hấp thu
0,092

0,0
5,0
0,087

Hãy tính lượng nitrit có trong mẫu 1. Đối với mẫu 2 và 3 có thể tính được kết quả không?
Từ dữ kiện của bảng số liệu ta thiết lập lại được phương trình hồi qui biễu diễn số
µg NO-2 và A có trong bình đo của mẫu 1:
y=0,089+ 0,0139x; R2=9998
0, 087
0, 089
= 6, 259 (mg ) x =
= 6,383 ( mg )
0, 0139
0, 0139

 Số µg NO-2:
Từ phương trình trên ta có thể tính ra

Lượng µg NO-2 có trong mẫu 2 là:
Lượng µg NO-2 có trong mẫu 3 là:

.

0, 092
= 6, 618 ( mg )
0, 0139
0, 087
= 6, 259 ( mg )
0, 0139

.

6


2.2. BÀI TƯỜNG TRÌNH
1. Kết quả đo
Số thứ tự

Chuẩn
1

2

3

NO−2

4

Mẫu
5

0,0
0,0
0,5
1,0
V
chuẩn 5ppm (mL)
Vmẫu (mL)
0,0
5,0
5,0
5,0
Độ hấp thu A
0
0,137
0,232
0,318
2. Tính kết quả
Phương trình hồi qui theo hàm lượng: y = 0,1385 + 0,0362x; R2 =0,9996
Phương trình hồi qui theo nồng độ: y = 0,1385 + 0,905x; R2 =0,9996
Hàm lượng NO2- (µg) trong dung dịch đo: 0,1385/0,0362 = 3,836 (µg)
Nồng độ NO2- (ppm) trong mẫu ban đầu: từ phương trình y = 0,1385 + 0,905x ta tính
được nồng độ NO2- trong bình đo 25mL là 0,1385/0,905 = 0,153 (ppm)
0,153.

=> Nồng độ trong mẫu ban đầu là

25
= 0, 765 ( ppm )
5

7

.


BÀI 3: XÁC ĐỊNH HỖN HỢP ĐỒNG VÀ COBAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
CHIẾT TRẮC QUANG
3.1. CÂU HỎI CHUẨN BỊ
1. Trình bày cách tìm ε của phức Na-DDTC với Cu 2+ và Co2+, cách tính toán kết quả qui
về ppm (mg/L).
Sau khi thực hiện các quá trình pha chuẩn và chiết chuẩn. Ta tiến hành đo các dung
dịch chuẩn. Sau khi đo ta tiến hành tính ε ở bước sóng 367 nm và 436 nm như sau:
Ta có độ hấp thu A bước sóng 367 nm, áp dụng định luật Lambert-Beer: A=ε.C.b. Cụ
thể như sau:
= ..b và = ..b
Mà , ta đo được
Còn b và , ta đã biết
Từ công thức Lambert-Beer ta có thể tính được và .
Tương tự ta có độ hấp thu A bước sóng 436 nm, áp dụng định luật Lambert-Beer:
= ..b và = ..b
Mà , ta đo được
Còn b và , ta đã biết
Từ công thức Lambert-Beer ta có thể tính được và .
2. Trình bày vai trò và lượng hoá chất cần sử dụng.
• Dung dịch chuẩn Cu2+ 100ppm (1,5 mL), dung dịch chuẩn Co 2+ 100ppm (1) dùng

để xác định các giá trị ε của Cu2+ Co2+ ở bước sóng 367 nm và 436 nm.
• Nước cất (1L) dùng để pha chuẩn và mẫu.
• NH3 2% với chỉ thị PP nhằm điều chỉnh pH.
• Amoni citrat 10% (15mL) nhằm cố định pH cho dung dịch chuẩn và mẫu.
• Na-DDTC 0,5% (6mL) nhằm tạo phức với Cu2+ và Co2+.
• CHCl3 (30mL) nhằm hòa tan phức để tiến hành đo quang, vì phức giữa Cu 2+, Co2+
với Na-DDTC không tan trong nước nên chúng ta phải chiết qua dung môi CHCl 3.
3. Lấy 5mL dung dịch Cu2+ 5ppm, 4mL dung dịch chuẩn Co2+ 5ppm, sau khi chiết, định
mức trong bình 25mL. Tính nồng độ mol của mỗi dung dịch.
Ta có CM (mol/L) và C(ppm) = = = CMM103
Mặt khác ta áp dụng công thức C 1V1 = C2V2 => = = 1(ppm) = 1,5625(M) và = =
0,8(ppm) = 1,35610-5(M).
4. Có thể thay đệm citrat bằng đệm amoni được không? Vì sao?
Không thể thay đệm citrat bằng đệm amoni được vì ngoài tác dụng đệm thì đệm citrat
còn là chất tạo phức phụ trợ nhằm cho kết quả đo được chính xác hơn. Trong khi đệm
amoni có pKa = 9,25 không thích hợp cho điều kiện pH trong bài.
5. Nêu cuvette phù hợp cho thí nghiệm này. Giải thích.
Trong bài này chúng ta nên dùng cuvette thạch anh vì khi đo ở bước sóng vùng tử
ngoại nếu dung cuvette thủy tinh thì nó sẽ hấp thu bức xạ ở vùng này gây ảnh hưởng đến
8


độ hấp thu cần tính.
3.2. BÀI TƯỜNG TRÌNH
1. Kết qua đo
Bình 1
1,5
0
0
0,313

0,132

2+

Thể tích dd chuẩn Cu 100ppm (mL)
Thể tích dd chuẩn Co2+ 100ppm (mL)
Thể tích mẫu (mL)
Độ hấp thu A ở 436nm
Độ hấp thu A ở 367nm
2. Tính kết qua
Chuẩn Cu2+:
=>
2+

Chuẩn Co :
=>
Mẫu: Gọi nồng độ ppm của Cu2+, Co2+ là x và y:
=>
Vậy số µg Cu2+, Co2+ :

9

Bình 2
0
1
0
0,013
0,118

Bình 3

0
0
50
0,498
0,501


BÀI 4: XÁC ĐỊNH HỖN HỢP CAFFEIN VÀ PHENANCETIN TRONG
MẪU DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC – UV
4.1. CÂU HỎI CHUẨN BỊ
1. Cấu tạo một hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao
Bình chứa pha động chứa pha động
Bộ khử khí online: Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại
trong dung môi pha động ngay trong quá trình chạy máy sắc ký.
Hệ thống bơm: Bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký.
Bộ phận tiêm mẫu (van tiêm 6 cổng): Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào
pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm 6 cổng có
vòng chứa mẫu (sample loop).
Mẫu chuẩn bị sẵn và chứa trong bình chứa vial, bằng phần mêm cài đặt sẵn, hệ thống
sẽ tự tiêm mẫu và chạy sắc ký.
Cột bảo vệ: dài khoảng 4cm, là nơi giữ lại các cặn, tạp chất.
Cột: là nơi thực hiện quá trình tách sắc ký, dài khoảng 25cm.
Đầu dò: chất phân tích sau khi qua cột sẽ đến đầu dò, tại đây đầu dò nhận tín hiệu và
chuyển thành tín hiệu điện.
2. Cơ chế hoạt động của van tiêm mẫu trong sắc kí lỏng
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi. Mẫu lỏng
hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng
dòng bằng một van tiêm 6 cổng có vòng chứa mẫu (sample loop). Vòng chứa mẫu có
dung tích khác nhau.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

(autosamper).
- Tiêm mẫu bằng tay: Cắm xilanh vào cổng tiêm ở vị trí inject
- Tiêm mẫu tự động: Vặn van về vị trí load. Lúc này pha động vẫn đang được bơm
vào cột. Tiêm mẫu ở vị trí load, thể tích mẫu cần thiết sẽ giữ trong loop, phần dư sẽ thải.
Điều này giúp thể tích mẫu tiêm luôn.
3. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò UV
Máy dò này đo sự tập trung của mẫu dưới một bước sóng trong giới hạn nhật định
khi chúng rời khỏi cột và đi xuyên qua detector của dòng pin. Khi không có bước sóng đi
xuyên qua detector tín hiệu là một giá trị không đổi. Khi mẫu có bước sóng đi qua
detector, detector lại phản ứng tín hiệu được hiển thị trên màn hình.
Nguyên tắc hoạt động: Khi không có mẫu qua detector ánh sáng đi qua dòng pin
và phát ra tín hiệu lớn nhất tại dòng cảm biến nếu một mẫu có bước sóng đi qua detector,
mẫu này làm giản lượng ánh sáng ở dòng cảm biến và là nguyên nhân làm thay đổi tín
hiệu ở detector. Tín hiệu hiển thị tăng lên tập trung tại mẫu của dòng pin. Ngày nay có 2
loại đầu dò UV được sử dụng phổ biến.
- Đầu dò có bước sóng thay đổi được.
- Photodiode Array.
10


4. Cách xác định LOD, LOQ trong bài
Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.
Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị một mẫu trắng
làm nền, pha loãng liên tiếp 2 đến 5 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp Caffein và Paracetemol.
Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC. Đến khi nào chiều cao peak bằng 3 lần chiều cao đường
nền thì lấy đó là LOD.
Từ đó suy ra: LOQ = 10/3 LOD.
5. Cách xác định phương trình hồi quy tuyến tính trong bài
Dựa vào sắc ký đồ của chuẩn đơn để định danh Caffein và Paracetamol thông qua

thời gian lưu.
Dựa vào sắc ký đồ của chuẩn ta có bảng số liệu:
Bước sóng
272,4 nm
245,16nm
S(paracetamol)
6,65949
32,63324
Chuẩn 1
S(caffein)
60,37917
20,62025
Chuẩn 3
Chuẩn 5

S(paracetamol)

28,44403

101,04182

S(caffein)

276,78543

90,28912

S(paracetamol)

119,33650

411,75290

S(caffein)
1112,46094
377,52856
Từ bảng số ta suy ra ở bước sóng 272,4 nm để xác định Caffein và 245,16 nm để xác
định Paracetamol.
Nồng độ dung dịch chuẩn: (số liệu lớp cô Xuân).
Bình

1

2

3

Nồng độ Caffeine (ppm)

1

4,8

20

Nồng độ paracetamol (ppm)

0,4

1,24

4,8

Từ đó ta thiết lập được phương trình hồi quy tuyến tính.
Ở 272,4 nm ta có: y = 55.26x + 7.9714; R2 = 1;
Ở 245,16 nm ta có: y = 86.493x - 3.8629; R² = 0.9999.
6. Tại sao trong sắc ký khí thì thường sử dụng phương pháp nội chuẩn còn trong sắc ký
lỏng dùng phương pháp ngọai chuẩn
Trong sắc khí để có độ chính xác khi sử dụng kỹ thuật đường chuẩn, cần phải tiêm
vào máy sắc ký các thể tích mẫu như nhau. Điều này rất khó đáp ứng khi sử dụng kim
tiêm. Để giải quyết các hạn chế này kỹ thuật nội chuẩn được sử dụng.
Sử dụng phương pháp nội chuẩn trong phương pháp sắc ký khí đây là phương pháp
cho phép xác định chính xác nồng độ của chất quan tâm mà không bị ảnh hưởng đáng kể
bởi thể tích tiêm mẫu giữa các lần tiêm.
11


-

-

.......Còn trong sắc ký lỏng (HPLC) có van tiêm 6 cổng nên khi lấy mẫu thì được thể tích
lập lại do đó chỉ sử dụng kỹ thuật ngoại chuẩn mà không sử dụng kỹ thuật nội chuẩn.
7. Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên dựa trên các thông số nào của sắc ký đồ? giải
thích?
Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số sắc ký đồ:
Thời gian lưu: trong một phép phân tích nếu tR nhỏ => sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì
peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo
theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xác của phép phân tích.
Độ phân giải càng gần 1.5 càng tốt: Nếu độ phân giải nhỏ thì các peak chưa tách hẳn,

việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác; nếu độ phân giải lớn quá thì thời gian
phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém.
- Chiều cao peak => ảnh hưởng đến độ nhạy.
- Hệ số tailing tf
10.2. KẾT QUẢ
10.2.1. Khao sát dung môi
Ta khảo sát pha động ở 3 tỉ lệ MeOH:H2O là 50:50, 30:70, 20:80.
Ở tỉ lệ MeOH:H2O=50:50 ta được sắc ký đồ:

Ở tỉ lệ MeOH:H2O= 30:70 ta được sắc ký đồ:

12


Ở tỉ lệ MeOH:H2O = 20:80 ta được sắc ký đồ:

.....Từ đó ta chọn tỉ lệ pha động tối ưu là MeOH:H2O=50:50 vì thời gian lưu ngắn hơn 2 tỉ lệ
pha động còn lại, peak tách tốt và đẹp.
10.2.2. Định danh peak
.....So sánh thời gian lưu giữa chuẩn đơn paracetamol, chuẩn đơn caffeine với chuẩn hỗn
hợp để định danh peak.
Chuẩn đơn paracetamol với thời gian lưu là 3,337 phút.

13


Chuẩn đơn caffeine với thời gian lưu là 4,411 phút.

Chuẩn hỗn hợp caffein và paracetamol

Từ đó ta định danh được peak của caffeine và paracetamol.
14


10.2.3. Dãy chuẩn
Tiến hành do dãy chuẩn ở hai bước sóng 245,16 nm và 272,4 nm ta có kết quả như sau:
Bước sóng
272,4 nm
245,16nm
S(paracetamol)
6,65949
32,63324
Chuẩn 1
S(caffein)
60,37917
20,62025
Chuẩn 3
Chuẩn 5

S(paracetamol)

28,44403

101,04182

S(caffein)

276,78543

90,28912

S(paracetamol)

119,33650

411,75290

S(caffein)
1112,46094
377,52856
Ta chọn bước sóng 245,16 nm để tính hàm lượng paracetamol
Đồ thị phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa Spara và Cpara:

Ta chọn bước sóng 272,4 nm để tính hàm lượng caffeine:
Đồ thị phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa SCaffeine và CCaffein:
10.2.4. LOD, LOQ
LOD của paracetamol ở bước sóng 245,16nm:
Chuẩn
Nồng độ (ppm)
Chiều cao
Mẫu trắng
2,710-2
Chuẩn 1
0,4
4,32705
Chuẩn 3
1,24
12,48034
Chuẩn 5
4,8

49,37508
Lấy chuẩn có nồng độ thấp nhất để tính, dựa vào quy tắc tam suất ta được:
LOD=3=2,510-3(ppm)
LOQ=LOD=2,510-3=8,3310-3 (ppm).
LOD của caffeine ở bước sóng 272,4 nm:
Chuẩn
Nồng độ (ppm)
Chiều cao
Mẫu trắng
4,910-2
Chuẩn 1
1
5,89879
Chuẩn 3
4,8
9,03674
Chuẩn 5
20
112,39490
Lấy chuẩn có nồng độ thấp nhất để tính, dựa vào quy tắc tam suất ta được:
LOD=3=24,9210-3(ppm)
LOQ=LOD=10-3=83,06810-3 (ppm).
10.2.5. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu
Lấy bước sóng 245,16nm; mẫu 3 dùng để tính hàm lượng paracetamol với diện
tích S=194,73473.
Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa Spara và Cpara
y = 86,493x – 3,8629; R² = 0,9999
Nồng độ của paracetamol có trong mẫu đo:
15

Cm==2,2961(ppm)
số mg trong mẫu ban đầu là
mpara = CmVdd110-3f = 2,296110010-3468,5918(mg)
(số liệu của lớp cô Xuân)
Lấy bước sóng 272,4nm; mẫu 2 dùng để tính hàm lượng caffein với diện tích S =
483,88196.
Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa SCaffeine và CCaffein
y = 55,26x + 7,9714; R² = 1
Nồng độ của caffeine có trong mẫu đo:
Cm = = 8,6122(ppm)
 Số mg trong mẫu ban đầu là
mcaffeine = Cm Vdd110-3f = 8,61210010-3 = 61,5157(mg).
Vậy mcaffeine=61,5157(mg) và mpara=468,5918(mg).

16