Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu của enzyme lasparaginase tái tổ hợp từ erwinia chrysanthemi tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG

BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO
UNG THƯ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ
HỢP TỪ Erwinia chrysanthemi

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9 42 01 07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


2

Hà Nội - 2019


Công trình được hoàn thành tại:
Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:TS. Đỗ Thị Tuyên
Viện Công nghệ sinh học
PGS. TS Quyền Đình Thi
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: ………………………………
Phản biện 2: ………………………………
Phản biện 3: ……………………………….

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính thức
Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Vào hồi .. giờ phút, ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia


4
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học
- Webside:


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
L-asparaginase (EC.3.5.1.1; L-asparagine amino-hydrolase) là enzyme phân
hủy L-asparagine - một chất dinh dưỡng quan trọng của tế bào ung thư. Lasparaginase thủy phân nguồn asparagine ở bên ngoài tế bào buộc các tế bào dựa
hoàn toàn vào những gì chúng có thể tự tổng hợp được. Tế bào bình thường gần
như không cần nhiều asparagine để tồn tại và có thể tự tổng hợp được asparagine
nhờ asparagine synthetase do đó bị ảnh hưởng ít hơn. Trong khi đó tế bào ung thư
nhất là ung thư máu không có asparagine synthetase để tổng hợp asparagine, hơn
nữa chúng lại cần rất nhiều asparagine cho sự phát triển khổng lồ của chúng do đó
chúng dễ dàng bị tiêu diệt khi điều trị bằng L-asparaginase. Ung thư máu là một
trong những loại ung thư phổ biến nhất ở trẻ em với ba phần tư trường hợp bệnh là
ở loại bạch cầu lympho cấp. Hiện tại L-asparaginase là thuốc không thể thiếu trong
phác đồ hóa trị liệu bạch cầu cấp dòng lympho cho trẻ em cũng như người lớn.
Tuy nhiên L- asparaginase có nguồn gốc tự nhiên từ Escherichia coli đang sử

dụng đã dẫn đến nhiều phản ứng quá mẫn trong quá trình điều trị. Vì vậy, Lasparaginase từ Erwinia chrysanthemi dùng để thay thế trong trường hợp xuất hiện
phản ứng quá mẫn do sản xuất kháng thể kháng L-asparaginse từ E. coli. Sử dụng
công nghệ tái tổ hợp trong sản xuất L-asparaginase đang ngày càng được quan tâm
bởi đã biết rõ về đặc tính sinh học, ít gây tác dụng phụ, ái lực cao với cơ chất và
độc tính thấp. Các đặc tính động học cho thấy L-asparaginase tái tổ hợp kết hợp
những lợi thế chính của L-asparaginase II từ Erw. chrysanthemi và E. coli.
Chính vì thế đề tài “Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung
thư máu của enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi” được
chúng tôi tiến hành thực hiện
2. Mục đích nghiên cứu
Biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw. chrysanthemi có hoạt tính ức chế sinh
trưởng với tế bào ung thư máu trong hệ biểu hiện E. coli với năng suất cao.
3. Nội dung nghiên cứu
 Thiết kế hệ biểu hiện gene aspg mã hóa L-asparaginase II từ Erw. chrysanthemi
trong E. coli có hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp cao;
 Tối ưu điều kiện biểu hiện và thành phần môi trường để năng suất sinh tổng hợp
L-asparaginase tái tổ hợp đạt cao nhất;
 Tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp; nhận diện enzyme tái tổ hợp
 Xác định một số tính chất lý hóa của L-asparaginase tái tổ hợp


2
 Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của L-asparaginase tái tổ hợp trên một số
dòng tế bào ung thư;
 Đánh giá ảnh hưởng của L-asparaginase tới tế bào thường.
4. Những đóng góp mới của luận án
i. Đã thiết kế, biểu hiện và thu nhận thành công trong E. coli L-asparaginase tái tổ
hợp có hoạt độ cao đạt 354 IU/mg dựa trên trình tự gene gốc có mã số X12746
trên GenBank mã hóa cho L-asparaginase II từ Erw. chrysanthemi.
ii. L-asparaginase tái tổ hợp thu được có khả năng ức chế sinh trưởng của sáu

dòng tế bào ung thư máu nghiên cứu. Trong đó dòng tế bào ung thư tủy xương
chuột SP2/0-Ag14, P3X63Ag8 và tế bào ung thư bạch huyết P388 giá trị IC 50
đạt xấp xỉ 50 µg/ml. Nhạy cảm nhất với dòng tế bào ung thư nguyên bào tủy
cấp của người HL60 với IC50 đạt 1,14 µg/ml mạnh hơn chế phẩm thương mại
ONCOGINASE. Với dòng ung thư bạch cầu lympho người Jurkat enzyme cũng
thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng tương đương với chế phẩm thương mại
ONCOGINASE
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về
nghiên cứu biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp củng cố thêm cơ sở khoa học trong
hướng lựa chọn hệ vector và điều kiện biểu hiện thích hợp nhất để enzyme tái tổ
hợp đạt hoạt tính cao.
Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được về thành phần môi trường và
điều kiện biểu hiện tối ưu giúp lên men lượng lớn sản xuất L-asparaginase tái tổ
hợp, những đặc điểm hóa sinh của L-asparaginase tái tổ hợp giúp định hướng trong
các ứng dụng sử dụng L-asparaginase.
*

Cấu trúc luận án:

Luận án gồm 147 trang (cả tài liệu tham khảo), 18 bảng và 55 hình được chia
thành các chương, phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu 32 trang;
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang); Chương 3: Kết quả
nghiên cứu (42 trang); Chương 4: Bàn luận (19 trang); Kết luận và đề nghị (2
trang); Tóm tắt tiếng Anh (9 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án
(1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang, gồm 2 tài liệu tiếng Việt và 181 tài liệu
tiếng Anh); Phụ lục (15 trang).

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo 2 tài liệu tiếng Việt và 175 tài liệu tiếng Anh để tổng kết
các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Tổng quan về L-asparaginase; (2) L-


3
asparaginase trong điều trị ung thư máu; (3) Tình hình nghiên cứu trong, ngoài
nước.
L-asparaginase (ASPG) (EC.3.5.1.1; L-asparagine amino-hydrolase) là
enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân L-asparagine thành aspatic acid.
L-asparaginase hiện diện nhiều trong mô động vật, vi khuẩn, thực vật, và trong
huyết thanh của một số động vật gặm nhấm, nhưng không có trong người.
L-asparaginase được chia thành 3 họ: L-asparaginase vi khuẩn, L-asparaginase
thực vật và L-asparaginase tương tự như L-asparaginase Rhizobium etli
asparaginase. L-asparaginase từ vi khuẩn gồm hai dạng, dạng I tồn tại trong bào
tương trong khi dạng II tồn tại trong khoang chu chất của vi khuẩn và có ái lực với
asparagin cao hơn so với dạng I. Trình tự amino acid của L-asparaginase dạng I và
dạng II tương tự nhau, hầu hết những trình tự amino acid quanh trung tâm hoạt
động đều bảo thủ. Sự khác nhau ở cấu trúc 3D của L-asparaginase giải thích tại sao
dạng I có ái lực với asparagine thấp hơn so với dạng II.
Loại L-asparaginase khác nhau được dùng cho mục đích công nghiệp và dược
phẩm khác nhau. Trong thực phẩm, L-asparaginase I được sử dụng để làm giảm
sự hình thành acrylamide – một chất nghi ngờ gây ung thư. Trong dược phẩm,
L-asparaginase II dùng để điều trị ung thư bạch cầu.
L-asparaginase tách từ E. coli hoạt động như một tetramer của 4 tiểu đơn vị
giống hệt nhau, gồm 222 đối xứng và có 4 vị trí hoạt động. Mỗi đơn vị có trọng
lượng phân tử khoảng 35,6 kDa.
Mặc dù L-asparaginase có từ nhiều nguồn nhưng hiện nay chỉ có hai nguồn
asparaginase sử dụng trong y tế L-asparaginas từ E. coli và Erw. chrysanthemi

asparaginase và dẫn xuất của chúng. L-asparaginase từ Erw. chrysanthermy dùng
để thay thế trong trường hợp dị ứng với L-asparaginse từ E. coli. Việc phân lập và
sàng lọc một loại vi khuẩn có khả năng sinh trưởng nhanh và không độc với môi
trường, có tính chất miễn dịch học mới có thể ngăn cản phản ứng quá mẫn luôn là
nhu cầu cần thiết. Các chủng xạ khuẩn biển cũng là một nguồn tiềm năng cho Lasparaginase hoạt tính cao . Pradhan và cộng sự đã phân lập được một loài vi
khuẩn Bacillus subtilis hswx88 từ suối nước nóng có khả năng sinh tổng hợp Lasparaginase ngoại bào từ có hoạt tính đạt 23,8 IU/mL . Sun và cộng sự cũng tìm ra
một dạng L-aspraginase II mới từ vi Aquabacterium sp. A7-Y gồm 319 amino
acid, tương đồng 35% so với L-asparaginase II từ E. coli, có hoạt tính đặc hiệu cao
đạt 458,9 U/mg …..
L-asparaginase tái tổ hợp cũng đã được sản xuất bằng ứng dụng sinh học phân
tử và kỹ thuật di truyền từ rất sớm.. Bahreini và cộng sự đã nhân dòng Lasparaginase từ E. coli K12 biểu hiện trong E. coli BL21 pLysS (DE3) enzyme tái


4
tổ hợp đã được tinh sạch cho hoạt tính riêng đạt 116,9 U/mg . Sindhu và cộng sự đã
nghiên cứu nhân dòng một dạng L-asparaginase khác từ Pseudomonas fluorescens
MTCC 8127 và biểu hiện trong E. coli BL21(DE3. L-asparaginase tinh sạch có
hoạt tính riêng đạt 26 U/mg . L-asparaginase từ B. subtilis 11-06 cũng được biểu
hiện trong B. subtilis 168 cho hoạt tính của enzyme tái tổ hợp là 9,98 U/ml . Lasparaginase II từ chủng S. cerevisiae đã được nghiên cưú trong P. pasptoris dưới
sự điều khiển của promoter AOX1. L-asparaginase tái tổ hợp có hoạt tính ức chế
sinh trưởng của dòng tế bào ung thư máu K562 .
Cho đến nay ở Việt Nam mới chỉ có một vài công bố về L-asparaginase.
Nghiên cứu của Ngô Kế Sương và cộng sự đã sàng lọc được hai chủng E. coli tự
nhiên có hoạt tính L-asparaginase lần lượt 0,08 và 0,1 IU/mg tế bào . Và nghiên
cứu của Nguyễn Thanh Ngọc và cộng sự đã đã biểu hiện thành công gene mã hóa
L-asparaginase I của A. oryzae trong Pichia pastoris nhằm nghiên cứu quy trình
sản xuất asparaginase tái tổ hợp, ứng dụng giảm lượng acrylamide tạo thành trong
sản xuất bánh nướng .
Nghiên cứu của chúng tôi phát triển theo hướng sản xuất L-asparaginase II tái
tổ hợp từ Erw chrysanthemy trong E. coli để ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị

ung thư máu

2
2.1

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu và hóa chất nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là L-asparaginase II từ Erw. chrysanthemi. Dựa trên
trình tự gene gốc mã số X12746 trên GenBank mã hóa cho L-asparaginase II từ
Erw. chrysanthemi NCPBB1125, gene aspg được tối ưu codon cho phù hợp với hệ
biểu hiện E. coli và được tổng hợp bởi GenScripGene USA. Vector pET22b(+),
pET21a(-) được dùng cho biểu hiện L-asparaginase trong E. coli
Chủng E. coli DH10B dùng cho nhân dòng. Chủng E. coli BL21(DE3)
(Invitrogen) được sử dụng cho biểu hiện.
Dòng tế bào thường NHI/3T3, ba dòng tế bào ung thư máu: tế bào ung thư
bạch huyết của chuột P388, tế bào ung thư tủy của chuột P3X63Ag8 và SP2/0Ag14 được cung cấp từ phòng Thử nghiệm sinh học_Viện Công nghệ sinh học, tế
bào ung thư nguyên bào tủy cấp của người HL60 và tế bào ung thư bạch cầu
lympho người Jurkat được cung cấp từ phòng Công nghệ tế bào động vật-Viện
Công nghệ sinh học; tế bào ung thư tủy mãn của người K562 (ATCC, Mỹ) do
Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên cung cấp, tế bào ung thư thanh quản của
người Hep2 (ATCC, Mỹ) do Học Viên Quân Y cung cấp.
Các mồi được tổng hợp bởi Bioneer (Hàn Quốc) được liệt kê trong Bảng 2.1


5
Hóa chất trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết được mua từ các hãng hóa
chất có uy tín như Sigma, Invitrogen, Thermo (Mỹ), Qiagen, Bio basic (Canada),
Merck (Đức). Các dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng

dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn.
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều có độ chính xác cao thuộc
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Bảng 2.1. Các mồi dùng trong thiết kế plasmid
Tên mồi
L-ASP F
L-ASP R
21 mASP -F
LASP-nonhis
R

2.2

Trình tự nucleotide 5’→3’
ATT GGA TCC GAT GGA ACG CTG
AAG CTC GAG GTA GGT ATG GAA G
GCC ATA TGG CCG ATA AAC TGC
CGA
5’- AAG CTC GAG TCA GTA GGT
ATG GAA G -3

Sản phẩm
Gene aspg đầy đủ
Gene maspg không
có signal peptide
Gene maspg có
chứa mã kết thúc

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh
Dòng E. coli tái tổ hợp mang gen aspg được nuôi cấy biểu hiện trong LB có bổ
sung ampicillin và cảm ứng bằng IPTG.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp: nồng độ
chất cảm ứng IPTG; nồng độ ampicillin trước cảm ứng; nồng độ giống; pH ban đầu
của môi trường biểu hiện; nguồn carbon bổ sung; nguồn khoáng bổ sung. Qua đó
chọn ra 3 thông số nồng độ chất cảm ứng IPTG, tỉ lệ giống và tỉ lệ KH2PO4 để tiếp
tục tối ưu hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp bằng phương pháp đáp ứng bề mặt.
2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp PCR; Điện di agarose;Tách chiết, tinh sạch plasmid; Biến nạp
plasmid hóa học, biến nạp xung điện; Các kỹ thuật cắt, nối DNA;... được tham
khảo theo Sambrook và Ruessell (2001). Giải trình tự và phân tích gen theo Sanger
(1975).
2.2.3 Phương pháp hóa sinh
Tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực qua cột ProBond resin
(Invitrogen), cột sắc ký lọc gel Sephacryl S-200, cột sắc ký trao đổi ion Sepharose
DEAE; Chạy điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phương pháp của
Lemmli (1970); Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (1975);
Xác định hoạt tính L-asparaginase được xác định theo phương pháp của Mashburn


6
và Wriston 1964 . Xác định một số tính chất lý hóa của enzyme (Động học phản
ứng của enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme; Ảnh
hưởng của nhiệt độ và pH đến độ bền của enzyme; Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
đến độ bền enzyme;); Định dạng protein bằng phương pháp MALDI-TOF.
2.2.4 Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với các dòng tế bào
Nuôi cấy tế bào sử dụng phép thử sinh học theo phương pháp của Monks
(1991) và phương pháp MTS xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng của tế bào.
2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu

Phần mềm Microsoft Excel được sử dụng để xử lý số liệu thu được trong quá
trình thực nghiệm, tính giá trị tham số thống kê. Phần mềm Dolphin 1D được dùng
để phân tích và đánh giá mức độ biểu hiện và tinh sạch của protein/enzyme.
Chương trình DNA star được dùng để kiểm tra trình tự nucleotide của các plasmid
mang gene L-asparaginase. C hương trình Design-Expert 7: xử lý số liệu tối ưu
đáp ứng ma trận. Phần mềm Table Cuvet được sử dụng để tính IC50

3
3.1

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ

Nghiên cứu biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia
chrysanthemi

3.1.1 Tối ưu trình tự gene
Với mục tiêu sản xuất L-asparaginase II từ Erw. chrysanthemi chúng tôi sử
dụng trình tự đoạn gene có mã số X12746 trên Genebank mã hóa cho Lasparaginase II từ Erw. chrysanthemi NCPBB1125 để nhân dòng, thiết kế vector và
biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp trong E. coli.
Để mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli đạt cao nhất có thể, trình
tự X12476 được tối ưu codon bằng thuật toán OptimumGene TM Kết quả phân tích
trình tự sau khi tối ưu cho thấy về xu hướng sử dụng codon (codon usage) có chỉ số
thích nghi codon (CAI: Codon Adaptation index) trong E. coli trung bình đạt 0,87.
Đặc biệt tần suất sử dụng các bộ ba ở mức 91-100 đạt 66%.Hàm lượng GC trung
bình của gene sau tối ưu đạt 54,63 % nằm trong khoảng tối ưu và phân bố đồng
đều trên toàn gene. Các cấu trúc Stem-Loop tác động lên sự ổn định của mRNA bị
phá vỡ. Gene sau tối ưu không chứa các trình tự cắt của enzyme giới hạn hay sử
dụng trong nhân dòng và biểu hiện, đồng thời không có các yếu tố CIS như RBS
(AGGAGG); Poly T (TTTTTT); PolyA (AAAAAAA); Chi (GCTGGTGG); T7-Cis
(ATCTGTT); SD (GGRGGT).

Trình tự gene được tối ưu codon cho phù hợp với hệ biểu hiện E. coli và đã
được tổng hợp bởi Genscrip. Đoạn gene đầy đủ dài 1044 nucleotide. Trình tự


7
amino acid suy diễn dài 348 animo acid, trong đó 21 anino acid đầu N là peptide
tín hiệu (phân tích bằng DNAStar và signal peptide SignalIP-4.1)
( (Hình 3.1).

Hình 3.1. Trình tự amino acid suy diễn của L-asparaginase
(chữ màu xanh là vị trí O-glycosyl hóa, chữ màu đỏ là vị trí N-glycosyl hóa)

3.1.2 Thiết kế plasmid pE22aspg và biểu hiện trong E. coli
1

M kb

2

3

4

5

6

ĐC

7

M

kb

←6
←1

←1

Hình 3.2. Thiết kế plasmid pE22aspg
1: Sản phẩm PCR của gene aspg; 2-6: Các dòng plasmid tái tổ hợp pE22aspg; ĐC:
Vectơ pET22b(+) 7: Plasmid pE22aspg được cắt bằng hai enzyme BamHI và Xhol, M:
Marker DNA;

Hệ plasmid biểu hiện đầu tiên được thiết kế cho gene aspg nguyên vẹn. Đoạn
DNA mã hóa protein ASPG đầy đủ được nhân lên bằng phản ứng PCR với cặp mồi
L-ASP F/L-ASP R từ khuôn plasmid pUaspg được chèn vector pET22b tạo
plasmid tái tổ hợp pE22aspg chọn dòng trong E. coli DH10B (Hình 3.2).
Plasmid pET22aspg sau khi giải trình tự để kiểm tra khung đọc mở được biến
nạp vào E. coli BL21(DE3) và được nuôi biểu hiện. Kết quả điện di protein tổng số
của mẫu tế bào sau khi được cảm ứng bằng IPTG không thấy xuất hiện băng
protein lạ (Hình 3.3). Kết quả kiểm tra hoạt tính L-asparaginase cũng không phát
hiện thấy sự biểu hiện của enzyme tái tổ hợp.


8
1 2 3 4 5 M kDa
←112
←66

←45
←35
←25
←18
←14

Hình 3.3. Biểu hiện pE22aspg trong E. coli BL21(DE3)
1:-5 E. coli /pE22aspg sau 6 giờ cảm ứng IPTG với nồng độ lần lượt là 0-,5-1-1,5-2; M:
Marker protein

3.1.3 Thiết kế plasmid pE21maspg và biểu hiện trong E. coli
Để kiểm tra ảnh hưởng của đoạn signal peptide tới sự biểu hiện enzyme, đoạn
gene aspg cắt signal peptide (21 amino acid đầu N) câu từ plasmid pUaspg với cặp
mồi 21mASP F/L-ASP R và được chèn vào vector pET21a(+) hình thành plasmid
tái tổ hợp pE21maspg và biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3.
Hình 3.4. SDS-PAGE protein tổng số của E. coli tái tổ hợp mang plasmid pE21maspg
1: E.coli /pE21maspg không cảm ứng IPTG, 2-5: Các dòng E.coli /pE21maspg sau 6h
cảm ứng IPTG; M: Marker protein

Plasmid pE21maspg được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3) thấy xuất hiện
một băng protein mới có khối lượng tương ứng khoảng 37 kDa (làn 2) so với mẫu
tế bào không được cảm ứng IPTG (làn 1) (Hình 3.4). Đây có khả năng là băng
ASPG tái tổ hợp được biểu hiện. Mức độ biểu hiện của rASPG đạt 75 % protein
tổng số (tính toán bằng phần mềm Dolphin 1D) .Tuy nhiên kết quả kiểm tra hoạt
tính rASPG trong dịch chiết tế bào thu được rất thấp, chỉ đạt 2,44 IU/mg protein
tổng số.
Tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp từ E.coli /pE21maspg
L-asparaginase tái tổ hợp được thiết kế mang đuôi 6xHis của vector nên
enzyme được tinh sạch dễ dàng bằng một bước qua cột sắc ký ái lực với Niken.
(Hình 3.5).

Hình 3.5. Tinh sạch rASPG từ E. coli/pE21maspg bằng cột ProBond Nikel
M: Marker, 1-5: Các phân đoạn tinh sạch qua cột thu được

Hiệu suất tinh sạch đạt 32%, với độ sạch 3 lần và hoạt độ riêng 7,48 U/mg
(Bảng 3. 1).


9
Bảng 3.1. Tinh sạch rASPG qua cột ProBond Nikel-Chelating Resin
Hoạt độ
E.
coli
BL21
Hàm lượng
riêng
Tổng
(DE3)/pE21maspg
protein (mg)
(IU/mg)
Unit
Dịch thô
Dịch rASPG tinh
sach

22,4

2,44 ± 0,06

54,72

2,36

7,48 ± 0,1

17,7

Độ
sạch

Hiệu
suất
(%)

3

32,34

3.1.4 Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis và biểu hiện trong E. coli
Plasmid biểu hiện mới được thiếu kế nhằm kiểm tra ảnh hưởng của 6xHis tới
hoạt tính enzyme, cấu trúc tương tự như pE21maspg nhưng loại bỏ đuôi 6xHis của
vector biểu hiện bằng cách đặt mã kết thúc ngay sau đoạn gene maspg với cặp mồi
21mASP F/L-ASP-nonhis R hình thành plasmid tái tổ hợp pE21maspg-nonhis.
Plasmid pE21maspg được giải trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện sau đó
được biến nạp vật chủ biểu hiện E. coli BL21(DE3). Kết quả điện di protein tổng
số của các mẫu tế bào sau khi được cảm ứng bằng IPTG ở Hình 3.6 thấy xuất hiện
một băng protein ASPG có khối lượng tương ứng khoảng 37 kDa (làn 2) so với
mẫu tế bào không được cảm ứng IPTG (làn 1). Đồng thời rASPG có hoạt tính
tương đối tốt đạt khoảng 30 IU/mg protein tổng số. Như vậy, ASPG tái tổ hợp đã
được biểu hiện có hoạt tính.
1

2

M kDa
←112
←66
←45
←35
←25
←18
←14

Hình 3.6. Biểu hiện pE21maspg-nonhis trong E. coli BL21(DE3)
1: pE21maspg-nonhis/E. coli chưa cảm ứng; 2: pE21maspg-nonhis/E. coli sau 6 giờ
cảm ứng IPTG, M: Marker protein

Như vậy, trong ba hệ biểu hiện được nghiên cứu: E. coli/pE22aspg,
E.coli/pE21maspg, E.coli/pE21maspg-nonhis, hệ biểu hiện E. coli/pE21maspgnonhis mang gene maspg mã hóa cho ASPG hoàn chỉnh cắt signalpeptide và không
chứa đuôi 6xHis cho hoạt tính L-asparaginase biểu hiện trong E. coli BL21(DE3)
cao nhất được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.


10
3.2

Lựa chọn điều kiện biểu hiện

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG
Nồng độ IPTG được từ khảo sát từ dải 0,2 đến 1,4 mM để kiểm tra sự khác
nhau về hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp. Kết quả hình 3.7 cho thấy không có sự

khác biệt lớn về hoạt tính L-asparaginase giữa các nồng độ IPTG.

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sự tổng hợp rASPG

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tiếp giống
Chủng giống E. coli/pE21maspg-nonhis được nuôi qua đêm, sau đó được tiếp
giống sang bình biểu hiện với nồng độ tiếp giống được khảo sát 0,5%; 1%; 2% và
5%. Kết quả hình 3.8 cho thấy với nồng độ tiếp giống 0,5% (OD 600 tại thời điểm
tiếp giống là 0,5) hoạt tính enzyme tái tổ hợp đạt cao nhất.

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ tiếp giống đến sự tổng hợp rASPG


11
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ampicillin trước khi cảm ứng

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ ampicillin đến sự tổng hợp rASPG

Kết quả ở hình 3.9 cho thấy sự tăng nồng độ ampicillin trong môi trường nuôi
cấy chủng tái tổ hợp E. coli/ pE21maspg-nonhis trước khi cảm ứng không ảnh
hưởng đến hoạt tính của L-asparaginase. Nồng độ ampicillin 25 µg/ml mặc dù cho
hoạt tính enzyme cao tuy nhiên nồng độ này quá thấp có thể dẫn đến sự thoái hóa
chủng. Do đó chúng tôi lựa chọn nồng độ ampicillin 100 µg/ml cho nghiên cứu
tiếp theo.
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường biểu hiện
Kết quả khảo sát pH ban đầu trong khoảng từ 5-9, rất rõ ràng là chủng tái tổ
hợp thích hợp với pH kiềm 7, 8, 9, ở pH acid enzyme không có hoạt tính do sự sinh
trưởng của E. coli rất kém (Hình 3.10).

Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự tổng hợp enzyme

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung


12
Hình 3.11. Ảnh hưởng của một số nguồn carbon đến sự tổng hợp rASPG

Kết quả khảo sát nguồn carbon cho thấy với cùng một điều kiện biểu hiện, các
nguồn carbon được bổ sung thêm không làm tăng hoạt tính enzyme tái tổ hợp so
với không bổ sung (Hình 3.11).
3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của ion khoáng bổ sung
Trong các nguồn khoáng được khảo sát K và P có ảnh hưởng tích cực tới sự
sinh tổng hợp enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cao nhất khi có mặt KH 2PO4.(Hình
3.12).

Hình 3.12. Ảnh hưởng của một số nguồn ion tới sự tổng hợp rASPG

Tổng hợp lại các yếu tố được khảo sát, chúng tôi chọn môi trường LB, pH 7
bổ sung 100 µg/ml ampicillin là điều kiện biểu hiện cố định. Yếu tố bổ sung
KH2PO4, nồng độ IPTG và nồng độ tiếp giống có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt
tính enzyme sẽ được tiếp tục tối ưu bằng pháp đáp ứng bề mặt.
3.2.7 Tối ưu điều kiện biểu hiện ASPG tái tổ hợp bằng phương pháp đáp ứng
bề mặt
Bài toán tối ưu sử dụng phần mềm Design–Expert đã xây dựng phương trình
hồi quy mô tả mối quan hệ giữa hoạt tính L-asparaginase với các biến mã hóa như
sau.
Y = 95,61 +7,99*A +7,9 *B -21,65*C + 5,56 *A*B + 6,04*B*C - 10,14*A2
Trong đó: Y là hoạt tính L-asparaginase (IU/ml); A, B, C lần lượt là các biến
mã hóa cho nồng độ chất cảm ứng IPTG, tỉ lệ giống và tỉ lệ KH2PO4
Trong thí nghiệm, hệ số hồi quy (R2) tính được là 0,9208, giá trị P < 0,05 (độ

tin cậy trên 95% ) được xem là ảnh hưởng có ý nghĩa đến hoạt động của Lasparaginase. Giá trị mô hình F = 25,19 với P < 0,0001 ngụ ý rằng mô hình này có
ý nghĩa. Yếu tố thiếu phù hợp không có ý nghĩa, tức là phản ứng thử nghiệm phù
hợp với mô hình.
Trong vùng khảo sát, phương trình hồi quy cho thấy hoạt tính enzyme tái tổ
hợp chịu ảnh hưởng bậc 1 của cả ba nhân tố nghiên cứu A, B, C, và chịu ảnh


13
hưởng đồng thời của các cặp nhân tố nồng độ chất cảm ứng – tỉ lệ giống (A*B), tỉ
lệ giống – tỉ lệ khoáng KH2PO4 bổ sung (B*C).
Mô hình đã dự đoán hoạt độ L-asparaginase tái tổ hợp tối đa đạt được là
123,74 IU/ml ở các giá trị yếu tố nồng độ chất cảm ứng IPTG (1,03 mM), tỷ lệ
giống (3%), và hàm lượng KH2PO4 bổ sung (0,5% w/v). Để kiểm tra kết quả của
mô hình, tiến hành thí nghiệm với các giá trị dự đoán để thu được hoạt tính Lasparaginase cực đại. Hoạt độ L-asparaginase nhận được từ kết quả thực nghiệm là
120 IU/ml, mức độ biểu hiện rASPG tính toán dựa trên phần mền Dolphin1D đạt
46 % protein tổng số (Hình 3.13- làn 1). Sự tương quan chặt chẽ giữa hai kết quả
tính toán giúp khẳng định tính chính xác của mô hình và sự tồn tại của điểm tối ưu.
1 2 M kDa
112
66
45
35
25

Hình 3.13. SDS-PAGE mẫu biểu hiện tại điểm tối ưu
1: E. coli/pE21maspg-nonhis biểu hiện ở điều kiện tối ưu , 2: E. coli/pE21maspg-nonhis
biểu hiện ở điều kiện chưa tối ưu, M: Marker protein

3.3

Đánh giá tính chất lý hóa của rASPG không có 6xHis

3.3.1 Tinh sạch rASPG từ E. coli/pE21maspg-nonhis
Dịch siêu âm phá tế bào biểu hiện E. coli/pE21maspg-nonhis sau khi ly tâm
loại cặn được cho qua cột Sephacryl S-200. Các phân đoạn trong vùng có hàm
lượng protein cao được xác định hoạt tính enzyme, trong đó thu được ba phân đoạn
S9-S10-S11 có hoạt tính cao nhất (Hình 3.14A ) tiếp tục được tinh sạch qua cột
DEAE-Sepharose. Kết quả cho thấy enzyme chỉ tập trung phân đoạn SD16 và
SD17 cho hoạt tính đặc hiệu enzyme đạt cao nhất đồng thời kết quả điện di SDSPAGE cũng cho thấy hai phân đoạn này có độ sạch cao, chỉ có một băng kích
thước 37 kDa (Hình 3.14B).


14
1 2 3 4 M kDa

5 6 M kDa

← 45
← 35

← 45
← 35

A

B

Hình 3.14. SDS_PAGE các phân đoạn rASPG qua cột Sephacryl S-200 (A) và DEAESepharose (B) 1- 4: phân đoạn S9-S12 ; 5-6 : phân đoạn SD16-SD17

Như vậy, rASPG được tinh sạch qua 2 cột độ sạch tăng lên 7,82 lần, hiệu suất

thu hồi 28,96%, hoạt độ riêng đạt 354,23 IU/mg (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 .Tinh sạch rASPG qua cột Sephacryl S-200 và DEAE-Sepharose
HĐR
Tổng hoạt
Hiệu
Độ
Bước tinh sạch
HLPR (mg/ml)
(IU/mg)
tính (IU)
suất (%)
sạch
Dịch chiết tế bào
2 ± 0,026
45
360
100
1
Sephacryl S-200
DEAE-Sepharose

0,52 ± 0,005
0,098 ±0,0015

95,34 ± 1
354,23±7,75

222,12
104,29

61,7
28,96

2,12
7,82

HLPr: Hàm lượng protein; HĐR: Hoạt độ riêng.

3.3.2 Nhận diện enzyme tái tổ hợp
Để xác định chính xác enzyme tái tổ hợp có phải là L-asparaginase II, băng
kích thước 37 kDa được phân tích bằng Quang phổ khối MALDI-TOF
Kết quả phân tích MANDI-TOF của các đoạn peptide sau khi thủy phân
protein bằng trysin cũng chỉ ra ba đoạn peptide tương đồng với L-asparaginase trên
cơ sở dữ liệu NCBI với vị trí tương ứng là GVMVVLNDR (vị trí 169-179),
GRGVMVVLNDR (vị trí 171-179), TNATSLDTFR (vị trí 189-198) (Hình
3.15);.độ bao phủ chuỗi đạt 6% (relative RMS error =90 ppm), mascot PMF là 147.
Kết quả tổng hợp peptide nhận được L-asparaginase II có khối lượng: 36777
Da, điểm protein: 117. Với điểm số protein rất cao, đây là một kết quả tốt có độ
chính xác cao.


15

Hình 3.15. So sánh độ tương đồng giữa trình tự của ba đoạn peptide thu được (peptide)
với L-asparaginase từ GenBank (WP-039108651)

3.3.3 Động học enzyme
Mối quan hệ giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất thể hiện ở Hình 3.16A
được sử dụng để xây dựng phương trình tuyến tính. Với kết qủa phương trình
tuyến tính xây dựng được ở Hình 3.16B Thông số động học được xác định từ đồ thị

Lineweaver-Burke. Dựa trên phương trình, Km, Vmax, Kcat và Kcat/Km của rASPG
Erw. chrysanthemi biểu hiện trong E. coli với cơ chất L-asparagine lần lượt là 0,5
mM, 500 U/mg, 14,9  103 s-1, 29,9  103 mM-1s-1.

A

B

Hình 3.16. Đồ thị biến thiên vận tốc phản ứng của rASPG theo nồng độ cơ chất
L-asparagine

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH phản ứng tới hoạt độ rASPG
Hoạt tính L-asparaginase tăng khi nhiệt độ tăng từ 25-45°C và đạt tối ưu ở
45°, hoạt tính enzyme bắt đầu giảm khi nhiệt độ tăng tiếp lên 55-65°C (Hình
3.17A).


16

A

B

Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) tới hoạt tính enzyme

Khi nghiên cứu ba dải pH: acid (pH 4-6), trung tính (pH 6,5-8), bazơ (pH 810) nhận thấy L-aspsaraginase tái tổ hợp hoạt động tốt ở pH trung tính và kiềm, đạt
tối ưu ở pH 7,5 (Hình 3.17B).
3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới độ bền của rASPG
B

A
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) tới độ bền enzyme

Kết quả kiểm tra độ bền cho thấy rASPG là enzyme kém bền nhiệt. Sau 100
phút ủ ở 37°C và hoạt độ enzyme còn 77%, khi nhiệt độ tăng lên đến 45 và 55°C
enzyme kém bền hơn, sau 100 phút hoạt độ enzyme chỉ còn 38,7 và 39,5% (Hình
3.18A). Với dải pH trung tính 6-7-8, hoạt tính enzyme tương đối bền sau 100 phút
ủ ở pH 6, 7, 8 enzyme duy trì được 80% hoạt độ (Hình 3.18B)
3.3.6 Ảnh hưởng của EDTA và một số ion kim loại lên hoạt tính của rASPG
Mẫu rASPG tinh sạch được ủ 30 phút ở 30°C với EDTA và các ion kim loại ở
nồng độ 10 mM. Kết quả cho thấy các ion kim loại, Pb 2+, Mg2+, Ba2+, Fe2+, làm hoạt
độ enzyme tăng nhẹ, ion Mn2+ làm hoạt độ enzyme tăng mạnh nhất 23% hoạt độ.
Các ion kim loại Na+, K+, Fe3+, Ca2+, Ni+, Al3+, Cu2+, Hg2+ ức chế hoạt tính enzyme
trong đó ion Hg+ ức chế mạnh nhất làm giảm 27% hoạt độ. EDTA làm giảm 28%
hoạt độ enzyme (Hình 3.19).


17

Hình 3.19. Ảnh hưởng của ion kim loại tới hoạt độ enzyme

3.3.7 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính rASPG
Với rASPG các chất hoạt động bề mặt nghiên cứu đều làm giảm hoạt tính
enzyme, ở nồng độ cao mức độ ức chế cao hơn ở nồng độ thấp (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt độ enzyme
Chất hoạt động bề
mặt

Hoạt độ còn lại (%) ở các nồng độ chất hoạt động bề
mặt (%)

1%

5%

Tween 20

87,65 ± 8

0

Tween 80

54,35 ± 2

0

Triton X-100

47,91 ± 5

31 ± 12

Triton X-114

45,76 ± 2

0

3.3.8 Ảnh hưởng của Dithiothreitol tới hoạt tính rASPG
Ở nồng độ thấp 0,1-0,5 mM DTT không ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme, ở

nồng độ 1 mM, DTT làm hoạt độ enzyme tăng 46%, tuy nhiên khi tăng nồng độ
DTT lên đến 5 mM hoạt độ enzyme chỉ tăng 11% (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của DTT tới hoạt độ rASPG
Nồng độ DTT
(mM)

Hoạt độ L- asparaginase còn lại (%)

0,1

98,10 ± 1,39

0,5

109,89 ± 4,17

1

146,57 ± 11,58

5

119,06 ± 9,73


18
3.4

Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng của rASPG với các dòng tế bào

Chúng tôi kiểm tra ảnh hưởng của rASPG trên các dòng tế bào ung thư trong
Bảng 3. 5.
Bảng 3.5. Các dòng tế bào ung thư được tiến hành thử nghiệm hoạt tính rASPG
STT
1
2
3
4
5
6
7

Loại tế bào ung thư
Ung thư tủy mãn của người (chronic myelogenous
leukemia)
Ung thư nguyên bào tủy cấp của người (acute
promyelocytic leukemia)
Ung thư bạch cầu lympho của người
Ung thư bạch huyết của chuột (lymphoma cell line)
Ung thư tủy xương của chuột (myeloma cell line)
Ung thư tủy xương của chuột (myeloma cell line)
Ung thư thanh quản của người

Dòng
K562
HL60
Jurkat
P388
P3X63Ag8
SP2/0-Ag14

Hep2

3.4.1 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388
rASPG được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư máu chuột P388 với các
nồng độ: 0,4; 2; 10; 50 µg/ml. Kết quả thử nghiệm với dòng tế bào ung thư bạch
cầu lympho của chuột P388 cho thấy với nồng độ 0,4 µg/ml rASPG cũng không
gây ảnh hưởng tới tế bào ung thư P388, ở nồng độ 2 µg/ml rASPG làm ức chế
8,23% tế bào P388,và nồng độ 10 µg/ml rASPG mật độ tế bào giảm rõ ràng hơn
tương ứng 19,45% tế bào bị ức chế. Ở nồng độ cao hơn 50 µg/ml rASPG tế bào bị
ức chế 48,22%.
3.4.2 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8
Kết quả thử nghiệm với tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 cho thấy rASPG
đã ức chế sự sinh trưởng của các tế bào ung thư P3X63Ag8 với các mức độ khác
nhau, số tế bào bị chết tăng dần khi được bổ sung rASPG với nồng độ tăng dần.; ở
nồng độ 50 µg/ml rASPG mật độ tế bào giảm rõ rệt 53,68 % tế bào bị ức chế. Từ
các nồng độ rASPG đã thử trên dòng tế bào P3X63Ag8, giá trị IC 50 của rASPG với
dòng tế bào P3X63Ag8 đã được xác định là 41,67 µg/ml.
3.4.3 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14
Với nồng độ 0,4 µg/ml rASPG gây ảnh hưởng không đáng kể tới tế bào ung
thư tủy SP2/0-Ag14. Tại nồng độ 2 µg/ml rASPG ức chế 8,23% tế bào. Khi nồng
độ tăng lên đến 10 µg/ml rASPG mật độ tế bào đã bắt đầu giảm tương ứng với
19,45 % tế bào bị ức chế, ở nồng độ 50 µg/ml rASPG mật độ tế bào cũng giảm rõ


19
rệt 51,22 % tế bào bị ức chế. Giá trị IC 50 của rASPG với dòng tế bào SP2/0-Ag14
đã được xác định là 48,09 µg/ml.
3.4.4 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy mãn người K562
L-asparaginase tái tổ hợp đã được tiến hành thử nghiệm trên dòng tế bào ung
thư máu K562 với dải nồng độ 2,656 đến 85 µg/ml để so sánh hiệu quả tác động.Ở

nồng độ thấp 2-21 µg/ml rASPG ức chế được 7-15% tế bào, ở nồng độ cao hơn bắt
đầu quan sát thấy số lượng tế bào giảm rõ rệt, tuy nhiên mức ức chế rất thấp ở nồng
độ 85 µg/ml rASPG hiệu quả ức chế chỉ đạt 25% so với đối chứng.

Đối chứng âm
rASPG ở nồng độ 85 µg/ml
Hình 3.20. Hình ảnh tế bào K562 thử nghiệm rASPG sau 72 giờ
Độ phóng đại 560x

Hình ảnh tế bào cho thấy hình dạng tế bào không bị thay đổi nhưng mật độ tế
bào ở mẫu có bổ sung rASPG giảm rõ so với mẫu đối chứng không bổ sung rASPG
(Hình 3.20)
3.4.5 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người
HL60
Tế bào ung nguyên bào tủy cấp của người HL60 đã được thử nghiệm với
rASPG, đồng thời thử nghiệm đối chứng dương là sản phẩm thuốc L-asparaginase
từ E. coli -ONCOGINASE theo nồng độ tăng dần từ 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200
µg/ml. Hình ảnh tế bào cho thấy mật độ tế bào mẫu bổ sung rASPG giảm rõ rệt so
với mẫu nuôi cấy không bổ sung enzyme (Đối chứng âm) Kết quả xác định tỉ lệ ức
chế sinh trưởng sau 72h cho thấy ở dải nồng độ từ 0-50 µg/ml rASPG ức chế tế
bào HL60 với hiệu quả tương đương sản phẩm thuốc ONCOGINASE (Hình 3.21).
Từ các nồng độ ức chế chúng tôi xác định được giá trị IC 50 của rASPG với dòng
HL60 là 1,14 µg/ml, của ONCOGINASE là 32,82 µg/ml.


20

A

B

C

Hình 3.21: Tác động của rASPG tới dòng tế bào HL60
A: Tế bào HL60 đối chứng âm; B: Tế bào HL60 sau 72h ủ với 50 µg/ml rASPG (độ phóng đại 100x);
C: mối tương quan giữa nồng độ rASPG và ONCOGINASE thử nghiệm và % tế bào ung thư máu
HL60 còn sống sót sau 72 giờ.

3.4.6 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho người
Jurkat
rASPG đã được tiến hành thử nghiệm đồng thời với ONCOGINASE trên dòng
tế bào ung thư máu Jurkat với các nồng độ 6,26; 12,5; 25; 50 và 100 µg/ml. Tại
nồng độ 6,25 µg/ml rASPG ức chế 34% tế bào, ONCOGINASE ức chế 25% tế bào
so với mẫu không bổ sung. Khi nồng độ rASPG và ONCOGINASE tăng lên đến
mức 100 µg/ml cho tỉ lệ tế bào bị ức chế lần lượt là 38,59 và 39,58 % (Hình 3.22
C) Trên các hình ảnh tế bào được thử nghiệm quan sát rõ mật độ tế bào của mẫu bổ
sung rASPG giảm hơn hẳn so với mẫu tế bào nuôi cấy bình thường không bổ sung
enzyme (Đối chứng âm) (Hình 3.22 A_B)

C
A

B
Hình 3.22: Tác động của rASPG tới dòng tế bào Jurkat

A: Tế bào Jurkat đối chứng âm; B: Tế bào Jurkat sau 72h ủ với 50 µg/ml rASPG (độ phóng đại
100x) ; C: mối tương quan giữa nồng độ rASPG và ONCOGINASE thử nghiệm và % tế bào ung thư


21

máu Jurkat còn sống sót sau 72 giờ.

3.4.7 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư thanh quản của người Hep2
Tế bào ung thư thanh quản Hep2 đã được thử nghiệm bằng cách bổ sung
rASPG ở các nồng độ 40, 50, 60, 70, 80 µg/ml trong 72 giờ. Kết quả cho thấy sau
72 giờ mật độ tế bào Hep2 ở các mẫu thí nghiệm không khác nhau và không khác
so với đối chứng.
Như vậy qua 6 dòng tế bào ung thư bạch cầu đã được thử nghiệm ở trên đều
chứng tỏ rASPG có hoạt tính ức chế sự phát triển các dòng tế bào này. Kết quả sử
dụng phần mềm Table cuvet để xác định giá trị IC 50 cho thấy rASPG thể hiện hoạt
tính trên hai dòng tế bào ung thư máu SP2/0-Ag14 và P3X63Ag8 với các giá trị
IC50 là 48,09 và 41,67 µg/ml tương ứng 17 IU/ml và 14,75 IU/ml. Với dòng P388,
HL60, và K562 IC50 > 50 µg/ml. Với dòng tế bào ung thư thanh quản Hep2 cũng
không xác định được IC50.
3.4.8 Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào thường
Kết quả trên cho thấy rASPG không gây độc cho tế bào NIH/3T3, ở nồng độ
nghiên cứu cao nhất 50 µg/ml rASPG chỉ ức chế 18,2% tế bào, tức là có ảnh hưởng
rất nhẹ tới tế bào thường.
Kết quả kiểm tra hình ảnh tế bào cũng cho thấy rASPG ảnh hưởng không đáng
kể tới tế bào thường, hình ảnh tế bào không thay đổi nhiều so với đối chứng âm.

4

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thiết kế ba hệ thống plasmid (1)
pE22aspg: vector biểu hiện pET22b(+) mang gene aspg nguyên vẹn; (2)
pE21maspg: vector biểu hiện pET21a(+) mang gene maspg mã hóa cho ASPG
trưởng thành không mang đoạn signal peptide; (3): pE21maspg-nonhis: vector biểu
hiện pET21a(+) mang gene maspg và protein tái tổ hợp không chứa đuôi 6xhis của

vector. Kết quả không tìm thấy sự biểu hiện của L-asparaginase trong chủng tái tổ
hợp tức là đoạn gene aspg đầy đủ không biểu hiện được trong E. coli BL21(DE3).
Sau khi cắt signal peptide, đoạn gene maspg được chèn vào vector pET21a(+) và
biểu hiện thành công trong E. coli BL21(DE3) với mức độ biểu hiện rASPG cao
đạt 75% protein tổng số. Như vậy việc loại bỏ signal peptide là cần thiết để ASPG
được biểu hiện. Tuy nhiên hoạt tính enzyme rất thấp chỉ đạt 1 IU/mg protein tổng
số do đó chúng tôi thiết kế hệ biểu hiện pE21maspg-nonhis có điểm kết thúc trước
đuôi Histag, enzyme tái tổ hợp thu được đã có hoạt tính tăng vượt mức 30 lần đạt