Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGÔ ĐỨC DUY

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ
BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGÔ ĐỨC DUY

PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ
BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Thành phố Hồ Chí Minh- 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những thông tin đƣợc viết trong luận văn này là do tôi
thực hiện và sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh. Mọi kết quả
nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng, cùng với các thông tin nghiên cứu khác đƣợc
trích dẫn rõ ràng, cụ thể trong luận văn.
Nội dung trong đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ bất cứ
Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ nào và chƣa đƣợc công bố. Tôi xin
chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan trên.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019
Ngƣời cam đoan

Ngô Đức Duy

i


LỜI CẢM ƠN

Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts
Hoàng Quốc Khánh và tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy.

Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi
nhất hoàn thành khóa học, Thầy cô Giảng viên và Học Viện Khoa học và
Công nghệ.
Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii của Trƣờng GSALS
(The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo
Nhật Bản, đã hỗ trợ kỹ thuật và tài chính cho nghiên cứu này thuộc dự án
“Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến
biomass” của JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan
Science and Technology Agency) và Đại học Bách Khoa TP.HCM. Lời
cảm ơn những Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro,
Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng
Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hoàng Dũng và
các Em trong phòng Vi sinh đã hỗ trợ nhiều trong nghiên cứu. Với những
chia sẽ vui buồn từ các bạn Học viên Cao học là động lực cho tôi hoàn
thành luận văn.
Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, con
Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng rất nhiều và Anh Chị trong Gia đình đã
luôn ủng hộ tôi trong mọi điều kiện.

Ngô Đức Duy

ii


LỜI NÓI ĐẦU

Hiện nay định danh chủng vi sinh không còn nhiều khó khăn nhƣ trƣớc,
vì sự phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với những phƣơng pháp
đa dạng và độ chính xác cao. Phần lớn định loại loài trƣớc đây luôn dựa vào
quá trình phân lập thuần chủng hoặc sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục

đích nghiên cứu. Tuy nhiên có những nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ các thành
phần loài vi sinh tồn tại trong mẫu vật, quá trình thay đổi thành phần, số
lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần cơ chất, điều kiện sống và
quá trình trao đổi chất. Trong tự nhiên vi sinh vật rất đa dạng, mức độ thay
đổi theo điều kiện môi trƣờng, phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh
thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa trên các kỹ thuật sinh học phân
tử.
Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang đƣợc sử dụng trong hầu hết
các lĩnh vực nghiên cứu về gene của công nghệ sinh học, trong đó có kỹ thuật
phân tích PCR-DGGE cơ bản tách độc lập riêng biệt mỗi trình tự gene với độ
chuẩn xác khác biệt 1 nuclotide. Chính vì vậy mà có thể sử dụng kỹ thuật
DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn trong mẫu mà không cần giai đoạn phân
lập làm thuần chủng, bên cạnh đó có thể kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng trong
nghiên cứu sẽ giúp hiệu suất nghiên cứu cao hơn và tăng tính ứng dụng đa
dạng phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân tích cộng đồng vi sinh vật.
Mục tiêu nội dung của nghiên cứu là sử dụng phƣơng pháp PCRDGGE và tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn trong rơm trƣớc và sau ủ.
Nhằm phân tích đánh giá khả năng biến động đa dạng vi khuẩn có trong
nguồn rơm ủ dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử . Tạo nền tảng cho việc phân
lập, tuyển chọn những loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase và các định
hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học trong tƣơng
lai.

iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APS: Ammonium Persulfate
BA: Bis-Acrylamine
bp: base pairs

CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide
DFB: Diffusion buffer
DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DNA: Deoxylribonucleic acid
dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
PCR: Polymerase Chain Reaction
PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis
RAPD: Random amplified polymorphic DNA
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms
RNA: Ribonucleic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TAE: Tris Acetic
TEMED: Tetramethyl ethylene diamine
UF: Urea Formamide
UV: Ultra violet

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. .............................. 1
Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ. ............................................. 4
Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của rơm rạ. ............................................ 4
Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới. .................. 7
Bảng 1.5. Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số bệnh trên
lúa mì. .............................................................................................................. 17
Bảng 2.1. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. ................... 23
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR . ........................................................... 27
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR. ...................................................... 27

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3. .................................... 28
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3. ........................................... 29
Bảng 2.6. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine. ................... 30
Bảng 2.7. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh........... 31
Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR ............................................................ 35

v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1.Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam……….3
Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose. ................................... 10
Hình 2.1. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm. ......................................... 22
Hình 2.2. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu. ............................................. 25
Hình 2.3. Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu rơm. ........................... 26
Hình 2.4. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie......................... 33
Hình 2.5. Cấu trúc pGEM@-T Easy vector của hãng Omega. ........................ 34
Hình 3.1. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm............................. 38
Hình 3.2. Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R. ....... 39
Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R. ........ 40
Hình 3.4. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. ...................................... 41
Hình 3.5. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn. ...... 43
Hình 3.6. Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng. . ........................................... 44
Hình 3.7. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 . ..................................... 45
Hình 3.8. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad .............. 46
Hình 3.9. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn. .................................... 47
Hình 3.10. Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn. ............. 48

vi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ....................................................... vi
MỤC LỤC ...................................................................................................... vii
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 1
1.RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ .............. 1
1.1.

Rơm rạ ............................................................................................... 1

1.2.

Thành phần cấu tạo rơm rạ ................................................................ 3

1.3.

Giá trị kinh tế của rơm rạ .................................................................. 6

1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM 9
1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose ........................... 9
1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose ........................................................... 11
1.3.KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH ............... 12
1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật................... 12

1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh ................................ 14
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn........................................................ 16
1.3.2.2. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn ..................................................... 18
1.3.2.3. Kỹ thuật tạo dòng .................................................................................................... 20

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21
2.1.VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................... 22
Hóa chất....................................................................................................... 23
Thiết bị và dụng cụ...................................................................................... 24
2.2.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 24

vii


2.2.1.Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA ............................................ 26
2.2.2. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3 ...... 27
2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3 ....................................... 29
2.2.4. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE ........................................... 30
2.2.4.1. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE ................................... 30
2.2.4.2. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide .................................. 32
2.2.4.3. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R .................... 33

2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng ...................................................................... 34
2.2.6. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài ...................... 35
2.3. Khảo sát sinh cellulase phƣơng pháp đĩa CMC ................................... 36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 38
3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ ..................................................................... 38
3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm ......... 39
3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R .................. 40
3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R .................. 41

3.5. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn........................... 42
3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega ...... 43
3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng .......................... 44
3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE ...... 45
3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn .................... 48
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 50
4.1. Kết luận ................................................................................................ 50
4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51

viii


1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.

RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ
1.1.

Rơm rạ

Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc (FAOFood and Agriculture Organization) [1], sản xuất lúa gạo trên thế giới chạm
mức kỷ lục 759,6 triệu tấn lúa (503,9 triệu tấn gạo) trong năm 2017 và năm
2018 tiếp tục tăng sản lƣợng thêm 10,3 triệu tấn lên mức cao mới 769,9 triệu
tấn lúa (510,6 triệu tấn gạo). Dự báo sản lƣợng sẽ tăng trƣởng 1,4% trong
năm 2019, khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2
vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á với mức tăng sản lƣợng tuyệt

đối lớn nhất đƣợc dự đoán sẽ là Ấn Độ, sản xuất tăng đáng kể ở các nƣớc nhƣ
Bangladesh, Sri Lanka, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal,
Philippines và Thái Lan, Việt Nam xem bảng 1.1. Tƣơng ứng với việc tăng
trƣởng sản xuất lúa gạo hàng năm thì sản lƣợng rơm rạ đƣợc thải ra ngoài
đồng ruộng trên toàn cầu cực kỳ lớn, nhƣng tới nay chƣa có thống kê chính
xác về lƣợng rơm rạ thải ra sau thu hoạch lúa, vì tùy thuộc vào văn hóa bản
địa, loại giống lúa trồng trọt, vùng canh tác và điều kiện thổ nhƣỡng. Nhƣng
tổng thể ƣớc lƣợng trung bình sản xuất ra 1 tấn gạo thì sẽ thải ra khoảng 1,5
tấn rơm rạ.
Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới.
Khu vực/Quốc gia
Thế giới
Châu á
Trung Quốc
Ấn Độ
Indonesia
Bangladesh
Việt Nam
Thai Lan

Số lƣợng gạo
(triệu tấn)
758.9
686.4
210.1
165.3
74.2
53.1
44
33.3

Khu vực/Quốc gia
Châu Phi
Ai Cặp
Nigeria
Madagascar
Tanzania
Mali
Guinea
Nam Mỹ

Số lƣợng gạo
(triệu tấn)
30.7
6.2
5.3
3.5
3.1
2.8
2.2
24.9


2

Myanmar
Philippines
Nhật Bản
Pakistan
Camphuchia

Triều Tiên
Nepal
Lào
Malaysia
Sri Lanka

28.3
18.6
10.7
10.3
9.7
5.5
5.4
4
3.1
3

Brazil
Colombia
Peru
Bắc Mỹ
Mỹ
Trung Mỹ
Châu Âu
Nga
Úc

11.9
2.6
3.1

9.1
9.1
2.9
4.1
1.1
0.9

Việt Nam đã trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo đứng đầu
trên thế giới hiện nay, tốc dộ tăng trƣởng sản xuất lúa gạo từ những năm 2012
đạt sản lƣợng 43,7 triệu tấn lúa. Đến năm 2018, sản lƣơng tăng lên khoảng 55
triệu tấn, xuất khẩu gạo đạt 6,1 triệu tấn, nâng giá trị 3,06 tỷ USD. Theo dữ
liệu thống kê những năm gần đây của Bộ Nông nghiệp Phát Triển Nông thôn
Việt Nam, vụ mùa 2015/16 đạt 44,13 triệu tấn lúa, vụ mùa 2016/17 đạt 44,52
triệu tấn và vụ mùa 2017/18 đạt đƣợc 44,96 triệu tấn. Dự kiến năm 2019 diện
tích trồng lúa trên cả nƣớc là 7,53 triệu ha, sản lƣợng gạo dự kiến tƣơng
đƣơng năm 2018. Bên cạnh đó thống kê của tổ chức GAIN (Global
Agriculture Information Network) của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ về diện tích
gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Viêt Nam từ năm 1993 đến 2017 tăng
trƣởng liên tục cả về diện tích và năng suất xem hình 1.1.
Những nỗ lực đem lại lợi ích từ sản xuất lúa gạo ngày càng gia tăng và
tăng thu nhập cho nông dân, nhƣng song song với đó là lƣợng rơm rạ thải ra
hàng năm ở nƣớc ta trung bình khoảng 55 triệu tấn. Đây cũng là một thách
thức cho việc xử lý giảm thiểu ô nhiễm rơm, bên cạnh đó tận dụng nguồn tài
nguyên phế phụ phẩm nông nghiệp ở nƣớc ta. Trong 55 triệu tấn Rơm thải ra
hàng năm có khoảng 20% đƣợc sử dụng cho gia sức gia cầm, trồng nấm rơm,
phân ủ, còn lại là đốt hoặc bỏ lại trên đồng ruộng gây ô nhiễm môi trƣờng
đồng ruộng và lãng phí nguồn tài nguyên tái sinh dồi dào.


3

Hình 1.1. Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam
Vấn đề đặt ra làm nhƣ thế nào và làm sao để tận dụng nguồn tài nguyên
tái tạo và dồi dào nhƣ rơm rạ. Để đạt hiệu quả cao thì trƣớc tiên sẽ phân tích
phân tích về thành phần cấu tạo và dinh dƣỡng trong rơm.
1.2.

Thành phần cấu tạo Rơm

Thành phần cellulose, lignocellulose và lignin là nguồn sinh khối
chính của tế bào thực vật nói chung và rơm rạ nói riêng. Rơm là nguồn
nguyên liệu đƣợc tái sinh trong tự nhiên, các thành phần cấu tạo rơm có sự
thay đổi dựa vào sự phát triển trong các chủng loại lúa, điều kiện thổ nhƣỡng
canh tác khác nhau, các yếu tố môi trƣờng khắc nghiệt, côn trùng và mầm
bệnh. Thành phần hóa học của rơm tính theo khối lƣợng khô gồm cellulose
60%, lignin 14%, đạm hữu cơ (protein) 3%, chất béo (lipid) 2%. Nếu tính
theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%,
nitơ (N) khoảng 0,92%, một lƣợng rất nhỏ photpho (P), lƣu huỳnh (S) và kali
(K). Theo kết quả phân tích thành phần đƣờng cơ bản chính trong rơm bao


4

gồm hexose (glucose, galactose, mannose), pentose (xyloza, arabinose), lignin
(cả axit hòa tan và không hòa tan), tro, silica. Ngoài ra còn có các thành phần
phi cấu trúc chủ yếu bao gồm protein (khoảng 3%) và pectin (khoảng 2,8%)
cùng với một lƣợng nhỏ đƣờng tự do, diệp lục, chất béo, dầu và sáp đƣợc nêu
trong bảng Bảng 1.2 và 1.3 [2, 3, 4, 5] .
Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ.
Thành phần

Glucose
Xylose
Arabinose
Mannose
Galactose
Acid soluble lignin
Acid insoluble lignin
Ash and silica
Extractive (i.e., protein, pectin,)
other nonstructural components)

Hàm lƣợng (w/w%)
34.0 - 43.7
19.0 - 22.0
2.0 - 3.6
1.8 -2.0
0.4
2.2 - 6.0
13.0 - 22.7
7.8 - 20.3
16.1- 19.3

Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của Rơm.
Thành phần

Đơn vị tính

Hàm lƣợng

Carbon

Hydrogen
Nitrogen
Sulphur
Oxygen
Tổng
Thành phần hóa học
Nguyên tố halogen
Chlorine (Cl)
Bromine (Br)
Fluorine (F)
Nguyên tố chính
Aluminium (Al)
Potassium (K)
Sodium (Na)
Calcium (Ca)

wt%
wt%
wt%
wt%
wt%
wt%

47.92
6.54
0.53
0.09
44.80
100.00

mg/kg
mg/kg
mg/kg

1,109.4
0.0
0.0

mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)

143.0
8,668.0
162.0
3,899.0


5

Silicon (Si)
Magnesium (Mg)
Iron (Fe)
Phosphorus (P)
Titanium (Ti)
Nguyên tố phụ
Cadmium (Cd)
Cobalt (Co)
Chromium (Cr)

Copper (Cu)
Manganese (Mn)
Nickel (Ni)
Lead (Pb)
Vanadium (V)
Zinc (Zn)
Barium (Ba)
Nguyên tố khác
Strontium (Sr)
Boron (B)
Tungsten (W)

mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)

6,734.0
571.0
100.0
558.0
3.6

mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)

mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)

0.0
15.0
1.7
3.0
17.0
1.5
1.0
0.3
6.6
22.5

mg/kg (dry)
mg/kg (dry)
mg/kg (dry)

26.0
2.7
13.0

Những kết quả đã phân tích cho thấy rằng thành phần chất xơ trong
rơm rạ chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin. Cellulose gồm nhiều
chuỗi thẳng ghép nhau thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo cấu tạo dạng
sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một
disaccharide gọi là cellobiose, có cấu tạo từ hai phân tử D-glucose.
Các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 và đƣợc giữ

chặt bởi liên kết hydro liên chuỗi và liên chuỗi mạnh để tạo thành các vi sợi.
Chúng cung cấp độ bền cơ học cho thành tế bào thực vật và có thể dài vài µm
trong rơm và đƣờng kính khoảng 12-35nm [6, 7]. Các công bố cho thấy mức
độ trùng hợp D-glucose của rơm rạ cao hơn một chút so với dƣ lƣợng nông
nghiệp khác nhƣ rơm lúa mì và bã mía nhƣng nó thấp hơn đáng kể so với gỗ
cứng và gỗ mềm [8].
Hemicellulose là những heteropolysaccharide cùng với cellulose có ở
màng tế bào thực vật, không hòa tan đƣợc trong nƣớc nhƣng hòa tan đƣợc
trong dung dịch kiềm và bị thủy phân bởi acid dễ dàng hơn so với cellulose.


6

Hemicellulose liên kết một phần với lignin bởi các liên kết cộng hóa trị, trong
khi đó mối liên kết giữa hemicelluloses và cellulose là thông qua liên kết
hydro. Trong dạ cỏ loài động vật nhai lại có những vi khuẩn đặc biệt chứa
enzyme cellulase phân giải đƣợc cellulose. Cellulose và hemicellulose là
những hợp chất có thể tiêu hóa đƣợc.Nhƣng cấu tạo cellulose trong của vách
tế bào rơm rạ qua nhiều liên kết và cấu trúc không gian phức tạp, nên enzyme
của hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động đƣợc. Lớp ngoài thành tế bào đƣợc
tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi sinh
dạ cỏ phân giải chậm làm cản trở những lớp cellulose bị tác động của hệ
enzyme vi sinh vật. Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa của rơm rạ và các chất xơ khác,
các nhà nghiên cứu đã tiến hành xử lý rơm bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ: lý
học, hóa học, vi sinh vật [9, 10].
Thành phần thứ ba đáng chú ý trong xơ là lignin, lignin luôn đi kèm với
cellulose và hemicellulose trong thành phần tế bào, không hòa tan trong nƣớc,
trong các dung môi hữu cơ bình thƣờng và rất bền vững bởi enzyme của hệ
sinh vật dạ cỏ. Nhƣng dƣới tác dụng của kiềm thì lignin một phần bị phân giải
và chuyển vào dung dịch. Lignin là polymer có nhiều thứ hai trên trái đất sau

cellulose, lignin chủ yếu bao gồm ba loại cấu trúc chủ yếu là monolignols,
hydroxycinnamyl (p- coumaryl, coniferyl và rƣợu sinapyl) liên kết với nhau
bằng các loại liên kết ether và carbon-carbon khác nhau nhƣ β-O-4, 4-O- 5, -,
β- 1 và β- 5 để tạo ra các đơn vị phenylpropanoid nhƣ p - hydroxyphenyl (H),
guaiacyl (G) và syringyl (S). Trong số này, liên kết β-O-4 là liên kết ether
chiếm ƣu thế nhất (khoảng 40 - 60%) trong rơm rạ. Lignin đƣợc gắn vào
carbohydrate bởi este benzyl, ete benzen và phenyl glycoside. Do các mối liên
kết hóa học và liên kết vật lý chặt chẽ này, rất khó để loại bỏ lignin ở dạng
nguyên sinh của nó [11].
1.3.

Giá trị kinh tế của rơm rạ

Thành phần đã phân tích ở trên cho thấy nguồn giá trị từ rơm chƣa
đƣợc quan tâm đúng mức trong thời gian dài, phần lớn rơm rạ thƣờng để mục,
tự phân hủy ở ngoài đồng ruộng hay đốt tại chỗ để trả lại khoáng chất cho
ruộng, phần còn lại đƣợc đem về làm thức ăn cho gia súc, phục vụ đun nấu


7

trong gia đình hay trồng nấm rơm. Hơn 20% rơm đƣợc sử dụng trong khi
khoảng 50% rơm bị đốt cháy hoặc để lại trên đồng ruộng, họ sẵn sàng cho vụ
mùa tiếp theo. Đốt rơm không những ảnh hƣởng khí nhà kính mà còn ô nhiễm
độc hại đã đƣợc báo cáo mà còn góp phần đến hen suyễn và các rối loạn hô
hấp khác ở trẻ nhỏ và ngƣời già [12, 13]. Do đó, cần phải phát triển các giải
pháp nghiên cứu mới nhằm tận dụng rơm để nông dân nhận đƣợc lợi nhuận
cao hơn cho việc thu gom từ ruộng và kềm chế đốt rơm gây thêm ô nhiễm
môi trƣờng.
Năm 2009, dữ liệu báo cáo của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp

Quốc lúa đƣợc trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, tuy
nhiên một số ít sản xuất lúa ở vùng khí hậu Địa Trung Hải. Khu vực sản xuất
lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á
và Đông Nam Á. Đối với lúa mì, các nhà sản xuất chính đƣợc đặt tại Nam Á,
Đông Âu, Bắc Mỹ và Đông và Trung Á. Đối với Liên minh châu Âu, lúa mì
là loại cây trồng chiếm ƣu thế hơn so với trồng lúa gạo.Thống kê sản lƣợng
lúa gạo và sản lƣợng rơm đƣợc tạo ta trên toàn thế giới nêu trong bảng 1.4.
Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới (FAO).
Diện tích(ha)

Gạo (tấn)

Rơm rạ (tấn)

Thế giới

158,511

684,595

727,400

Nam Á

59,449

202,889

215,600

Đông Nam Á

48,203

197,777

210,100

Tây Á

32,999

216,630

230,200

Đông Á

5,114

10,392

11,000

Nam Mỹ

5,253

25,568

27,200

Đông Phi

3,147

6,701

7,100

Trung Phi

691

663

700

Bắc Phi

590

5,593

6,000

462

3,152

3,350

Liên Minh Châu


8

Âu
Caribbean

456

1,246

1,300

Nam Âu

418

2,906

3,100

Trung Mỹ

326

1,228

1,300

Đông Âu

225

1,183

1,250

Trung Á

193

696

740

Tây Á

153

927

990

Tây Âu

24

138

150

Châu Đại Dƣơng

14

82

90

1

3

3

Nam Phi

Lƣợng lớn rơm hàng năm trên toàn cầu xem nhƣ là nguồn nhiên liệu vô
cùng lớn. Nhiều khía cạnh phân tích đã công bố về thành phần rơm đã cho
thấy những giá trị kinh tế nguồn phụ phẩm nông nghiệp đem lại rất lớn và đa
dạng để sản xuất dầu sinh học, than sinh học và khí sinh học từ rơm rạ. Dầu
sinh học rơm rạ đã đƣợc báo cáo bao gồm một số thành phần phụ nhƣ ketone,
aldehyd, axit carboxylic, phenol, furfural và levoglucosan, ngoài ra than sinh
học đƣợc sản xuất từ rơm tạo độ phì của đất, tăng lƣu trữ carbon và giảm phát
thải khí nhà kính. Năng suất, chất dinh dƣỡng, hàm lƣợng chất dễ bay hơi,
khả năng trao đổi ion dƣơng, kali và phốtpho có sẵn hàm lƣợng than sinh học
giảm khi tăng nhiệt độ nhiệt phân, độ kềm và hàm lƣợng chất thơm. Than

sinh học có nguồn gốc từ rơm cho thấy khả năng hấp thụ ion Cu (II) và
cyromazine, một loại thuốc trừ sâu hữu cơ [14, 15, 16]. Quá trình khí hóa rơm
rạ để xử lý chất thải gần đây đã thu hút đƣợc sự quan tâm để sản xuất khí
Hydro và Metan. Rơm cũng đƣợc sử dụng làm nhiên liệu cho nồi hơi để sản
xuất điện và phân tích kinh tế kỹ thuật cho thấy rằng đó là một lựa chọn khả
thi để tạo ra điện nông thôn dựa trên lƣới điện nhỏ ở vùng sâu vùng xa và các
Quốc gia đang phát triển.
Khi mà vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu trở nên nóng bỏng thì việc sử
dụng khối lƣợng lớn rơm cho hợp lí là điều mà các nhà khoa học đang quan


9

tâm đến, trong đó các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tận dụng nguồn
nhiên liệu cellulose trong rơm để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học
(biofuels) cho tƣơng lai nhằm thay thế nguồn tài nguyên dầu mỏ ngày cạng
kiệt.
Trong thành phần chính của rơm chủ yếu vẫn là cellulose và sản phẩm
phân giải cuối cùng có giá trị là D-glucose, cho nên việc phân giải và thu
nhân sản phẩm glucose làm nguồn nguyên liệu khác đã đƣợc quan trong nhiều
nghiên cứu. Trong đó có phƣơng pháp hóa học là phân hủy và thu nhận
cellulose mà còn phƣơng pháp sinh học là sử dụng sự phân giải tự nhiên của
hệ enzyme đƣợc sinh ra từ hệ vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều hơn.
1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM RẠ
1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật trong
điều kiện yếm khí và hiếu khí trong thời gian dài và sản phẩm phân giải cuối
cùng là glucose. Quá trình này diễn ra do nhiều nhóm vi sinh vật sinh tổng
hợp các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase phân giải cellulose.
Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thƣờng rất chậm

và không triệt để. Sự tham gia enzyme phân hủy cellulose đƣợc các nhà khoa
học chia ra làm ba nhóm chủ yếu nhƣ sau [17, 18].
1,4 β-D-Glucan cellobiohydrolase: enzyme cắt đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt tên khác
nhƣ: cellobiosehydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và
avicellase. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh
mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme
endocellulase phân giải chúng.
1,4β-D-glucan 4 glucanohydrolase: enzyme này tham gia phân giải liên
kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-Dglucan. Sản phẩm của
quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.Chúng tham gia tác
động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.


10

Enzyme này còn có tên khác nhƣ: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase và Ccellulase.
β-D-glucoside glucohydrolase: enzyme này tham gia phân hủy
cellobiose, tạo thành glucose. Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là
cellobiase và β-glucosidase.
Sự thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme
exoglucanase, endoglucanase, β-glucosidase. Trong những nghiên cứu riêng
rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme
cellulase, nhiều tác giả đều đƣa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase
sẽ thay nhau thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose
xem hình 1.2.

Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose.
Phân giải cellulose cơ bản là quá trình sinh học đƣợc tạo ra và kiểm
soát bởi các enzyme cellulase. Cellulase là enzyme đa dạng với chức năng

xúc tác cho một phản ứng đơn, nó đóng vai trò trong phản ứng thủy phân cầu


11

nối β-1, 4 giữa hai phân tử glucose cấu tạo nên cellulose. Hệ thống enzyme
cellulase bao gồm ba lớp enzyme ngoại bào có thể hòa tan là: 1, 4-βendoglucanase, 1, 4-β-exoglucanase, và β-glucosidase (β-D-glucoside,
glucohydrolase hoặc cellobiase). Endoglucanase chịu trách nhiệm trong sự
phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1, 4-glycosidic dọc theo chuỗi cellulose.
Exoglucanase thì cần thiết cho sự phân cắt đoạn cuối chuỗi không biến đổi và
phân tách các sợi cơ bản của tinh thể cellulose, và β-1, 4-glucosidase thủy
phân cellubiose và cellodextrin hòa tan thành glucose. Trên thực tế, mặc dù
đều sử dụng cơ chất cellulose nhƣng cơ chế phân giải cellulose của các loài vi
sinh vật rất khác nhau [19, 20, 21].
1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose
Nhiều nghiên cứu phân lập dòng vi sinh sản sinh enzyme cellulase và
khả năng phân giải cellulose từ các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm là chủ
yếu. Đa số các nghiên cứu tập trung vào nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ nhƣ bò, trâu, cừu, dê và
côn trùng nhƣ bọ cánh cứng, mối, trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải
[22, 23, 24].
Nhóm Vi khuẩn phân giải cellulose tập trung ở các loài vi khuẩn yếm
khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng
nguồn thức ăn chính là cỏ, cây, rơm rạ các nhóm chính sau; Clostridium,
Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus,
Methanobrevibacter
ruminatium,
Siphonobacter
aquaeclarae,
Cellulosimicrobium funkei, Pseudomonas nitroreducens. Ngoài ra còn một số

nhóm đƣợc phân lập từ đất nhƣ; Brevibacillus, Paenibacillus, Bacillus, và
Geobacillus [25, 26].
Nhóm Xạ khuẩn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc
hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ streptomycin, gentamicin, rifamycin và
erythomycin. Bên cạnh đó xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công
nghiệp dƣợc phẩm cũng nhƣ trong nông nghiệp. Trong đó số loài đáng chú ý
thuộc giống này nhƣ Streptomyces lividans, Streptomyces reticuli,
Streptomyces drozdowiczii. Còn nhóm thu nhận từ trầm tích nhƣ


12

Thermoactimnomyces, Streptosporangium cũng là những loài có khà năng
phân hủy cellulose [27, 28, 29, 30, 31].
Nhóm Nấm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy
cellulose do các cellulase từ nấm thƣờng có hoạt lực cao hơn và ít có các dạng
vật lý phức tạp nhƣ enzyme này từ vi khuẩn nhƣ; Acremonium sp.,
Chaetomium sp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicillium
pinophilum, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii,
Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus và Rhizopus
oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose ở nhiều điều
kiện môi trƣờng khác nhau. Trong đó nhóm đáng chú ý nhất là nhóm
Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Mucor hầu nhƣ các loài này sống hoại
sinh trong xác thực vật nhƣ trên tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá
hủy các vật liệu trên. Mỗi nhóm tiết ra mỗi loại enzyme trong hệ enzyme
cellulase, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ
sinh [32].
1.3.

KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH

1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc
thu nhận một lƣợng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic
acid là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị
phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay
hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi
trƣờng khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết trong điều
kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào
(Desoxyribonuclease - DNase và Ribonuclease- RNase) [33, 34].
Nhiều phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA bộ gene của vi sinh vật,
nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu ở cấp độ gene. Tuy nhiên đa số
các mẫu ly trích thu nhận DNA bộ gene của mỗi chủng loài dựa trên dòng
thuần chủng nhằm trách sự tạp nhiễm gene của các loài với nhau. Do đó, giai


13

đoạn tách chiết và thu nhận DNA vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu và ứng
dụng là rất cần thiết. Quá trình này cần phải đảm bảo về độ tinh khiết, nguyên
vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện đƣợc các khâu nghiên cứu tiếp theo. Tùy
thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phƣơng pháp ly trích thu nhận
DNA cho phù hợp.
Phƣơng pháp Benzyl Chloride: Đây là phƣơng pháp ly trích DNA
tƣơng đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia
nhiệt đến 650C. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, nhanh chóng và
mang lại kết quả khá cao. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để ly trích DNA
của cả thực vật, nấm và vi khuẩn [35].
Phƣơng pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): đƣợc xem là phƣơng

pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật
với hiệu quả cao, ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl
trimethyl ammonium bromide, proteinase K.
Bên cạnh đó phƣơng pháp sốc nhiệt: Phƣơng pháp này sử dụng kỹ
thuật đóng băng và tan băng ở - 650C trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ
vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận
lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trƣờng tự nhiên [36].
Phƣơng pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là
phƣơng pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là
dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic với nồng độ muối cao (1,5 M
NaCl). vì vậy mà CTAB đƣợc dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết
acid nucleic và độ phá hủy vách tế bào rất cao, tuy nhiên CTAB mang tính
chất độc với môi trƣờng và sức khỏe. [37].
So sánh các phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn trong đất, vùng rễ,
phƣơng pháp SDS cho kết quả tốt nhất cả về khối lƣợng lẫn độ tinh sạch.
Phƣơng pháp SDS cho kết quả tốt là do sử dụng proteinase K phá vỡ hiệu quả
thành tế bào của vi sinh vật để giải phóng DNA dễ dàng. Phƣơng pháp CTAB
mặc dù không làm giảm khối lƣợng DNA chiết xuất từ đất vùng rễ nhƣng độ
tinh sạch chƣa cao và DNA bị ảnh hƣởng bởi nồng độ muối cao. Phƣơng pháp


14

đóng băng và tan băng it gây đứt gãy DNA nhƣng hiệu quả ly trích lại thấp.
báo cáo rằng sự kết hợp giữa việc nghiền, phƣơng pháp đóng băng và tan
băng, và phƣơng pháp SDS có thể thu đƣợc khối lƣợng DNA cao hơn nhiều
mà không ảnh cũng loại hƣởng đến độ nguyên vẹn về cấu trúc DNA [38].
Nhiều nghiên cứu phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA bộ gene vi
khuẩn trực tiếp từ mẫu rơm nhằm để giữ nguyên cộng đồng vi sinh hiện diện
trong mẫu, trong các điều kiện hiều khí và yếm khí đang đƣợc các nhà khoa

học quan tâm nghiên cứu. Việc ủ rơm và phân tích trong các giai đoạn khác
nhau sẽ cho ra các kết quả về cộng đồng vi sinh khác nhau. Ngoài ra, pH của
mẫu cũng làm thay đổi cộng đồng vi sinh đã đƣợc kiểm tra bằng cách sử dụng
phƣơng pháp in vitro [39, 40]. DNA vi khuẩn có trong rơm trƣớc khi ủ và
trong các giai đoạn ủ dài ngày, sử dụng kết hợp các phƣơng pháp nghiền mẫu
trong nitơ lỏng, dùng đệm ly trích CTAB, đóng băng và tan băng, sau đó bổ
sung proteinase K và SDS [41]. DNA tổng số thu đƣợc đem tinh sạch bằng
phƣơng pháp của sử dụng Sephadex G-200. Một nghiên cứu khác về ly trích
DNA của vi sinh vật phân giải cellulose bằng phƣơng pháp Benzyl Chloride,
sau đó để loại bỏ thành phần tạp có trong mẫu chiết xuất bằng cách sử dụng
Genclean spin kit (BIO101, Carlsbad, Calif.) ở giai đoạn tinh sạch [42].
1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử và vùng gene trong định danh
Để xác định tất cả các loài đã sống hoặc tồn tại trên hành tinh trái đất
này, một số tiêu chí ban đầu nhƣ đặc điểm hình thái hình thành nên cơ sở của
nhận dạng nhƣng sau đó các tính năng khác nhƣ sinh hóa, sinh lý và sinh học
phân tử đƣợc ghi nhận phải có. Cho đến nay, hơn 1,5 triệu loài động vật, thực
vật và vi sinh vật đã đƣợc định danh và ƣớc tính số lƣợng các loài sống chƣa
đƣợc mô tả có thể là hơn 3 triệu, đa số là nhóm vi sinh vật. Các nhà phân loại
học cho rằng ít nhất 50 triệu loài sinh vật khác nhau đã bị tuyệt chủng trong
quá trình tiến hóa. Mỗi loài sinh vật có thể tồn tại ở nhiều dạng khác nhau,
chúng có thể đƣợc tìm thấy ở hai giới tính khác nhau, nhóm tuổi, hình thức
theo mùa và các biến thể kiểu hình khác.
Trong phân loại phân tử, có thể nghiên cứu cả DNA và RNA, các kỹ
thuật chính đã đƣợc sử dụng trong hệ thống bao gồm xây dựng bản đồ giới


15

hạn và phân tích RAPD, RFLP, lai DNA-DNA, lai DNA-RNA và giải trình
tự bộ gene. Kỹ thuật RFLP đƣợc coi là phƣơng pháp nhạy cảm nhất để xác

định chủng và một số sinh vật đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử dụng
kỹ thuật này. RFLP là một kỹ thuật khai thác các biến thể trong chuỗi DNA
tƣơng đồng. Phƣơng pháp PFGE và PCR đƣợc sử dụng để mô tả các loài sinh
vật, trong đó PFGE sử dụng các enzyme cắt giới hạn phân tử DNA để tạo ra
một kiểu đặc trƣng nhằm so sánh hai loài khác nhau dựa trên tính tƣơng đồng
hoặc không giống nhau giữa chúng. Phƣơng pháp PCR, một đoạn DNA duy
nhất đƣợc khuếch đại có thể là một gen mã hóa protein hoặc gen rRNA cụ thể
hoặc một phần của nó trong vùng gene bảo tồn phân loại. Lai phép DNA với
DNA dựa trên mức độ tái tổ hợp hai mạch với nhau với các thành viên của
cùng một loài cho thấy sự lai tạo cao nhất và xa loài cho tỷ lệ lai ít hơn. Trình
tự RNA cũng cung cấp cơ sở cho việc xác định hai loài riêng biệt, 16S rRNA
và 18 SrRNA là một phần của tiểu đơn vị ribosome của tế bào nhân sơ và tế
bào nhân chuẩn đƣợc phân lập và giải trình tự [43, 44].
Phân loại gene RNA ribosome là tiêu chuẩn vàng cho nghiên cứu phân
loại phân tử trong nhiều thập kỷ. Đặc biệt, gene tiểu đơn vị ribosome 16S
(16S rRNA), đã đƣợc sử dụng rộng rãi để nghiên cứu và mô tả các thành phần
cộng đồng vi khuẩn trong nhiều loại hệ sinh thái bao gồm các cộng đồng liên
kết với vật chủ, nhƣ hệ vi sinh vật nội sinh của con ngƣời, vật chủ các cộng
đồng tự do, nhƣ môi trƣờng đất và đại dƣơng. Đầu tiên, nó có mặt khắp nơi
trong cuộc sống thuộc nhóm Prokaryotic. Thứ hai, kích thƣớc và mức độ bảo
tồn chức năng cao của nó dẫn đến tỷ lệ đột biến trong suốt quá trình tiến hóa
của sinh vật nhân sơ. Thứ ba, và quan trọng nhất, gen 16S rRNA bao gồm cả
các khu vực đƣợc bảo tồn, có thể đƣợc sử dụng để thiết kế các đoạn mồi
khuếch đại trên khắp các đơn vị phân loại, cũng nhƣ 9 khu vực (V1 - V9), có
thể đƣợc sử dụng một cách hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại.
Hiện nay các nghiên cứu hiện đại thƣờng dựa vào phân tích các chuỗi
RNA ribosome 16S để xác định phân loại các chủng vi khuẩn, loại phân tích
này đã trở thành một tiêu chuẩn thực tế cho phân loại sinh vật nhân sơ. Trong
đó gene rRNA 16S dài khoảng 1600bp và bao gồm 9 vùng có khả năng bảo