Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ THANH KIM HƯỜNG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ THANH KIM HƯỜNG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG
Ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu
của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu,
kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ
hướng dẫn và nhóm nghiên cứu.

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã
trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện
nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Nguyễn Thị Hải
Yến - Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi tiến hành các thí nghiệm

trong đề tài luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh
học hiện đại & Giáo dục Sinh học; cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động
viên, chia sẻ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




TÀI TRỢ
Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này được tài trợ bởi Quỹ Phát
triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.012018.27" với tên đề tài là: “Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration
responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu
hạn ở cây chuyển gen” do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm.

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………

i

LỜI CẢM ƠN………………………………………………………

ii

TÀI TRỢ……………………………………………………………

iii

MỤC LỤC…………………………………………………………

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………

v

DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………

vi

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT……………………………

vii

MỞ ĐẦU…………………………………………………………...

1

1. Đặt vấn đề………………………………………………………

1

2. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………

2

3. Nội dung nghiên cứu……………………………………………

2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài………………………

2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………

4

1.1. Đặc tính chống chịu của thực vật………………………………

4

1.1.1. Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật…………

4

1.1.2. Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của
thực vật…………………………………………………………

5

1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2……………………………………

6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1.2.1. Cây đậu tương………………………………………………

6

1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương…………………

8

1.3. Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector
chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình………………………………

12

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….

16

2.1. Vật liệu nghiên cứu……………………………………………

16

2.1.1. Vật liệu thực vật……………………………………………

16

2.1.2. Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên
cứu…………………………………………………………………

16

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu……………………

16

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu………………………………

16

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu…………………………………………

17

2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………

17

2.3.1. Nhóm phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide
của gen GmDREB7…………………………………………………

18

2.3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và nhân bản gen GmDREB7 từ
cDNA………………………………………...……………………..

18

2.3.1.2. Tách dòng gen GmDREB7…………………………………

19

2.3.1.3. Xác định trình tự nucleotide………………………………

21

2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển
gen và tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển
gen chứa gen GmDREB7…………………………………

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

21
2.3.3. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua A. tumefaciens...

22

2.3.4. Nhóm phương pháp phân tích, xử lý số liệu…………………

24

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……...

25

3.1. Đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương
DT2008…..........................................................................................

25

3.1.1. Kết quả nhân bản, tách dòng và giải trình tự gen
GmDREB7..........................................................................................

25

3.1.2. Mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương DT2008 và các
mẫu đậu tương mang mã số BT092314, BT089389, NM001249580,
NM001248527, AY244760 trên GenBank………..

31

3.2. Thiết kế gen và vector chuyển gen thực vật mang gen
GmDREB7…………………………………………………………

33

3.2.1. Thiết kế gen GmDREB7 nhân tạo……………………………

33

3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen
GmDREB7..........................................................................................

34

3.3. Chuyển gen và phân tích sự biểu hiện của gen GmDREB7 trên
cây thuốc lá…………………………………………………………

36

3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc
lá thông qua A. tumefaciens………………………………………

36

3.3.2. Phân tích sự có mặt và sự biểu hiện ở mức phiên mã của gen
chuyển GmDREB7 trên cây thuốc lá chuyển gen..............................
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................. ...........................................

41

1. Kết luận..........................................................................................

41

2. Đề nghị...........................................................................................

41

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN.......

42

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................

43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR………............

19

Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn………...........

20

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách
dòng pBT……………………………………………………………

20

Bảng 2.4. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá……………..

24

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen
GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide
mang mã số BT092314 trên GenBank……………………………

28

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen
GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide
mang mã số BT092314 trên GenBank………………….....................

30

Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào cây
thuốc lá giống K326………………………………………….....……

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

38




DANH MỤC CÁC HÌNH

Tran
g
Hình 1.1. Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên
GenBank…………………………………………………………….

10

Hình 1.2. Đặc điểm trình tự amino acid suy diễn của trình tự mang
mã số BT092314 trên GenBank…………………………………….

11

Hình 1.3. Vị trí của gen GmDREB7 trên nhiễm sắc thể 12 của đậu
tương..................................................................................................
...

11

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121………………

13

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát……………………………….

18

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB7……

22

Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB7-F/DREB7-R......................

25

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen
GmDREB7 từ cDNA của giống đậu tương DT2008…………………

26

Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ 4 dòng
khuẩn lạc……………………………………………………….

27

Hình 3.4. Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI……………..

27

Hình 3.5. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn mã hóa nhân
tố phiên mã GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 so với
trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank………………………

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

29




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Hình 3.6. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 của giống
đậu tương DT2008 so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự
nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank…………………..

31

Hình 3.7. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của
đoạn mã hóa DREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và các trình
tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM
001248527, AY244760 trên GenBank………………………………

32

Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy

diễn của protein DREB từ giống đậu tương DT2008 và từ các trình tự
mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM
001248527, AY244760 trên GenBank…………............................….
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo………..………..

33
34

Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7
trong vector pUC18 và sản phẩm cắt vector pBI121 bằng cặp enzyme
SacI và XbaI………………………………………………...

35

Hình 3.11. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho
chuyển gen vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens……………………….

35

Hình 3.12. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ khuẩn
lạc A. tumefaciens chủng CV58………………………………

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

36




Hình 3.13. Hình mô tả quá trình biến nạp gen GmDREB7 và tái sinh

tạo cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật lây nhiễm A.
tumefaciens...........................................................................................

37

Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen
GmDREB7 trong các cây thuốc lá chuyển gen....................................

39

Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trong các cây
thuốc lá chuyển gen.......................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

40




DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung)

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GM

Môi trường tái sinh chồi

LB

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Lysogeny Broth)

M

Thang DNA chuẩn (Maker)

MS

Murashige – Skoog

NCBI

National Center for Biotechnology Information
(Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase Chain Reaction

RM

Môi trường ra rễ

RNA

Ribonucleic Acid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng chiếm
vị trí quan trọng trong các cây nông nghiệp và trong đời sống của con người.
Đậu tương được xem là cây trồng khá nhạy cảm với các tác động của môi
trường. Trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu và sự nóng lên của trái đất
đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đậu tương.
Stress phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt là hạn và có thể làm
giảm năng suất đậu tương khoảng 40%.
Tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của thực vật nói chung
và của đậu tương nói riêng do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen này
liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chống chịu hoặc có chức năng
điều hòa nhóm gen chống chịu. Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan
trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng với tác động của các stress phi sinh học.

Nhân tố trans - protein DREB có thể liên kết với trình tự cis để kích hoạt biểu
hiện gen khi có tín hiệu stress ở thực vật.
Protein DREB là một phân họ của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, có chức
năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn hán, nhiễm mặn
và nhiệt độ thấp, tạo ra tính chống chịu các stress của ngoại cảnh ở nhiều loài
thực vật. Thuộc tính chủ yếu của gen DREB là vùng bảo thủ AP2 liên kết với
các nhân tố phản ứng với các stress. Nhiều gen DREB đã được phân lập từ các
loài thực vật khác nhau, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea
mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) và nhiều cây trồng khác. Ở cây đậu tương,
hai gen GmDREB6, GmDREB7 đã được xác định tồn tại trong hệ gen cây đậu
tương, tuy nhiên đặc điểm về cấu trúc gen cũng như hoạt động của các gen này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




như thế nào và sản phẩm protein của chúng có liên quan trực tiếp đến nhóm
chống chịu nào hay không đang là vấn đề cần tìm lời giải đáp.
Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của gen
đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của cây
đậu tương đã được giải mã chức năng. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi
đã chọn và tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen
GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương” để phục vụ chuyển gen với mục đích
đánh giá hoạt động và chức năng sinh học của gen GmDREB7 ở cây đậu tương.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương.
2.2. Thiết kế được vector biểu hiện thực vật mang gen GmDREB7 của cây đậu
tương.
3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Nghiên cứu thông tin, thiết kế cặp mồi PCR, nhân gen, tách dòng và xác định
trình tự gen GmDREB7 từ cây đậu tương.
3.2. Nghiên cứu thiết kế gen và vector biểu hiện mang gen GmDREB7.
3.3. Chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc lá.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Về mặt khoa học
Nghiên cứu góp phần làm rõ đặc điểm cấu trúc của gen GmDREB7 phân
lập từ cây đậu tương (giống DT2008). Những kết quả về tạo cây chuyển gen
thêm một lần nữa khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển
gen trong cải thiện tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của cây
trồng.
4.2. Về mặt thực tiễn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Trình tự gen GmDREB7 phân lập được và các cây thuốc lá chuyển gen
được tạo ra có khả năng chống chịu tốt hơn so với cây đối chứng. Qua đó, góp
phần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả
năng chống chịu của cây trồng nói chung cũng như trong thực tiễn chọn giống
cây trồng ở Việt Nam nói riêng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc tính chống chịu của thực vật
1.1.1. Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật
Trong những thập kỷ gần đây, stress phi sinh học đã trở thành mối quan
tâm chính trong sản xuất nông nghiệp. Sự tăng trưởng và phát triển của thực
vật trong các điều kiện stress có thể ảnh hưởng đến vụ mùa. Thực vật có đặc
điểm trạng thái sống đặc thù – bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển
trong suốt quá trình phát triển cá thể. Vì vậy, chúng thường xuyên đối mặt với
điều kiện ngoại cảnh ngày càng nhiều tác động bất lợi lên quá trình sinh trưởng
phát triển, gây ra những biến đổi và đặc biệt ảnh hưởng đến năng suất cây trồng
[2]. Ngày nay, do có sự biến đổi khí hậu toàn cầu nên môi trường ngày càng bị
tác động nặng nề hơn.
Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặc trưng
của thực vật. Do đó, việc tìm hiểu cơ chế tác động của các tác nhân gây stress
cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọng trong
trồng trọt. Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có
nhiều stress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật. Ví dụ stress
thiếu nước thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ
cao ở lá. Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác
nhân stress chỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ), có những yếu tố môi trường phải
mất nhiều ngày hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất,
chất khoáng...) [2].
Đối với cây trồng, nhiệt độ tối ưu để phát triển bình thường là 23 - 28°C.
Nếu nhiệt độ trên 30°C thậm chí đến 35°C sẽ ảnh hưởng lớn đến cây. Trường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




hợp tương tự xảy ra nếu nhiệt độ xuống dưới 15°C, năng suất cây trồng sẽ giảm

đáng kể. Một yếu tố khác đóng vai trò vô cùng quan trọng, đó là nước. Nước là
nguyên liệu khởi đầu, sản phẩm trung gian và cũng là sản phẩm cuối cùng trong
mọi quá trình trao đổi chất của tế bào. Mọi quá trình phản ứng trong cơ thể đều
được thực hiện trong môi trường nước. Do đó, thiếu hay thừa nước đều ảnh
hưởng xấu đến cây trồng. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thống kê được thiệt
hại hàng năm do hạn hán gây ra là rất lớn, có thể làm mất mùa, giảm đến trên
60% sản lượng [2].
1.1.2. Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật
Stress hạn, mặn và sốc nhiệt tác động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển
và năng suất của nhóm cây trồng cạn. Trong các điều kiện stress, thực vật vẫn
có những cơ chế để thích nghi đối với sự thay đổi cường độ khác nhau của
stress, tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa đủ để giúp thực vật chống chịu.
Thực vật có nhiều cơ chế phản ứng khác nhau với các stress thông qua các
con đường truyền tin và phản ứng tế bào, từ việc thay đổi biểu hiện gen, trao
đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức độ sinh
trưởng và năng suất cây trồng. Khi gặp các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, những
biến đổi trong quá trình phát triển và trao đổi chất sẽ làm thay đổi sự biểu hiện
của gen. Điều này bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào, lan truyền
tín hiệu trong tế bào, sau đó lan truyền khắp cơ thể.
Để chống chịu với stress, các phản ứng sinh hóa được kích hoạt trong cây
trồng để tích lũy nhiều các loại chất dễ hòa tan như: đường, amino acid, glycine
betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với stress [15] và giúp cây
phục hồi sau một thời gian nhất định chịu tác động từ điều kiện môi trường
[14].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với stress có liên quan chặt chẽ với quá
trình phiên mã. Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng của cả môi
trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa. Các nhân tố phiên mã
(Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển những thay đổi trong biểu
hiện gen và phản ứng với các stress từ môi trường ngoại cảnh. Hiện nay, các
protein DREB là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất, bởi nó kích hoạt
sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan
trong điều kiện phi sinh học [40].
1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2
Họ AP2 là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn
phân họ lớn: AP2, RAV, ERF và DREB [32]. Phân họ protein DREB đặc trưng
bởi miền bảo thủ AP2 chứa các vị trí liên kết với mạch DNA ở vùng promoter.
Nhiều gen trong phân họ DREB đã được phân lập từ các loài thực vật, như cây
Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum
aestivum)... Tuy nhiên các công bố về chức năng của một số gen DREB chủ
yếu ở cây Arabidopsis.
Gen mã hóa nhân tố phiên mã chứa miền AP2 liên quan đến nhiều quá
trình sinh học của thực vật bao gồm sự tăng trưởng, truyền tín hiệu, phản ứng
với mầm bệnh và ứng phó với các stress phi sinh học như hạn hán, muối,...
Miền AP2 có khoảng 58 hoặc 59 amino acid, trong đó có một số amino acid
liên kết với nhân tố đáp ứng sự mất nước (DRE) hoặc hộp GCC [25], [35].
1.2.1. Cây đậu tương
Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill thuộc họ Đậu
(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae), có bộ NST 2n = 40. Đậu tương
là một loại cây trồng cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Đông Nam Á.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Đậu tương là loại lương thực chính ở các nước châu Á đã từ lâu và đã
được sử dụng làm loài thực vật mẫu cho các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa
sinh và sinh học phân tử. Các phân tích sinh hóa cho thấy hạt đậu tương chứa
từ 38 - 40% protein, 12-25% lipid, các muối khoáng, các vitamin A, B1, B2,...
và nhiều axit amin thiết yếu (cystein, tryptophan, methionine, lysine,...) [39].
Bên cạnh giá trị về kinh tế và dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn giữ vai trò
quan trọng trong việc cải thiện đồ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh
tác [32].
Đậu tương thuộc loại cây Hai lá mầm, thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt,
bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm
rễ cái và các rễ bên, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium
japonicum có khả năng cố định đạm từ nito của không khí [1]. Nhiều nghiên
cứu cho thấy, những giống đậu tương có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần
thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác
dụng cải tạo đất. Trên thân có nhiều lông nhỏ, ít phân cành, có từ 8 - 14 đốt,
các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân. Đậu tương có 3 loại lá chính: Lá
mầm, cặp lá đơn, lá kép có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét. Đậu tương thuộc loại
cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, mọc thành chùm, mỗi chùm thường có 3 - 5
hoa có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, có
nhiều lông bao phủ, khi chín vỏ quả có màu vàng hoặc xám đen. Hạt có dạng
hình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt... không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ
bao quanh một phôi lớn. Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm,
xanh, nâu, đen... đa số là hạt màu vàng. Đặc biệt, màu sắc rốn hạt ở các giống
là không giống nhau, đây là biểu hiện đặc trưng của giống.
Trong các gian đoạn sinh trưởng, đặc biệt là thời kì ra hoa, tạo quả nếu
thiếu nước thì hoa và quả non sẽ rụng nhiều. Giai đoạn phát triển của quả và
hạt cần nhiều nước nhất, thiếu nước trong giai đoạn này sẽ dẫn đến giảm kích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

thước hạt và năng suất giảm đi đáng kể. Do vậy, thời kì này được chứng minh
là thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nước [36].
Đậu tương là cây nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh, đặc biệt là hạn. Khi
nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về mặt sinh lý và di truyền
đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của
chất nguyên sinh, quá trình trao đổi chất. Tính chịu hạn của cây đậu tương là
tính trạng đa gen và chúng thể hiện ở nhiều mặt như: sự phát triển nhanh của
bộ rễ, tính chín sớm tương đối,...
Các cây họ Đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng là loài cây trồng có
nhu cầu về nước cao hơn các loài cây khác và không đồng đều qua các giai
đoạn, chúng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Do hàm lượng protein và lipid trong
hạt cây đậu tương rất cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500 – 530 kg nước và
trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũng khá cao
50%, trong khi ngô chỉ là 30% và lúa là 20% [3].
1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương
Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nghiên cứu về DREB đã được các
nhà khoa học trên thế giới quan tâm, tiến hành giải trình tự gen DREB và so
sánh trình tự gen này ở các loài thực vật khác nhau như: họ Cúc (Asteraceae),
hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.)…
Nhiều thành viên trong phân họ DREB đã được phân lập, mô tả và các
nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến
sự phản ứng với các nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách quy định biểu
hiện gen thông qua các trình tự DRE/CRT [38]. Một số thành viên của phân họ
gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa,
GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5,
GmDREB6, GmDREB7 [28]. Với trình tự và độ dài khác nhau nhưng mỗi gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

trong phân họ DREB đều có những biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các điều
kiện stress hạn, mặn, sốc nhiệt. Trong khi nhóm DREB1 điều khiển tính chịu
hạn, mặn và lạnh thì nhóm DREB2 lại có vai trò chủ yếu trong điều khiển tính
chịu hạn, chịu nóng,…
Đặc điểm của gen DREB ở cây đậu tương đã được tiếp cận nghiên cứu từ
những năm đầu của thế kỉ XXI. Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ
mRNA của cây đậu tương có kích thước 705 bp [13]. Gen DREB1 được phân
lập từ DNA của cây đậu tương bởi Charlson và cs (2009) cũng có kích thước
705 bp [8]. Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 và gen GmDREB3
(2009) từ mRNA ở đậu tương với kích thước lần lượt là 927 bp [10] và 597 bp
[11]. Liu và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương
với kích thước là 693 bp [21]... Tuy nhiên, việc nghiên cứu các gen DREB ở
cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng ở Việt Nam còn khá mới, chỉ
có một vài công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các
nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở
cây đậu tương của nhóm tác giả Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [4].
Đặc điểm của gen ứng cử viên GmDREB7
Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank phân lập từ mRNA
đậu tương là gen ứng cử viên được gán nhãn GmDREB7. Trình tự mang mã số
BT092314 do nhóm tác giả Cheung và cs (2009) nghiên cứu đã được đăng kí
mã số trên GenBank vào tháng 8/2009. Trình tự này có kích thước 793 bp, được
phân lập từ mRNA của cây đậu tương (Glycine max) và chưa rõ chức năng sinh
học. Trình tự đoạn mã hóa của gen mang mã số BT092314 trên GenBank có
kích thước 561 bp, từ vị trí nucleotide số 144 đến 704, với mã mở đầu là ATG
và mã kết thúc là TGA (Hình 1.1).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Hình 1.1. Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank.
Đặc điểm của trình tự amino acid suy diễn, vùng AP2 và các điểm DNA
binding của trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank
Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank là ứng cử viên gen
GmDREB7 mã hóa 186 amino acid. Trình tự amino acid thuộc miền AP2 (Hình
1.2A) có 59 amino acid, từ vị trí amino acid số 64 đến 122, trong đó có 11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN