NGHIÊN CỨU TUYỂN CHON VI KHUẨN TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH DỊ DƯỠNG ĐỂ ỨNG DỤNG CHUYỂN HÓA PHẾ THẢI HỮU CƠ THÀNH SINH KHỐI CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CAO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHON VI KHUẨN TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH DỊ
DƯỠNG ĐỂ ỨNG DỤNG CHUYỂN HÓA PHẾ THẢI HỮU CƠ THÀNH SINH
KHỐI CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CAO

Khóa luận tốt nghiệp đại học chính quy
Ngành Sinh học
(Chương trình đào tạo tài năng)

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHON VI KHUẨN TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH DỊ
DƯỠNG ĐỂ ỨNG DỤNG CHUYỂN HÓA PHẾ THẢI HỮU CƠ THÀNH SINH
KHỐI CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CAO

Khóa luận tốt nghiệp đại học chính quy
Ngành Sinh học
(Chương trình đào tạo tài năng)

Cán bộ hướng dẫn: TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và
ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Phạm Thế Hải –
Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp
đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình CN. Vũ Hà Phương và
các bạn thuộc phòng thí nghiệm GREEN LAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự
sống và phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật học trong suốt thời gian làm khóa luận tốt
nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô ở bộ môn Vi sinh vật học
cũng như các thầy cô thuộc khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học tự nhiên,
ĐHQGHN đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức chuyên môn và tạo điều
kiện hết sức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và
bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về mặt thể chất và tinh thần để tôi có
thể hoàn thành khóa luận này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý
báu đó!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

Bp

Base pair

Cặp bazo-nito

dNTP

Nucleoside 5’ -triphosphates

Nucleoside 5’ -triphosphates

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

OD

Optical density

Mật độ quang học

COD

Chemical oxygen demand

Nhu câu oxy hóa học

VK

Vi khuẩn

Vi khuẩn

VKQH

Vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn quang hợp


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................... 2

1.1. Tổng quan về vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh ....................................... 2
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn quang hợp .................................................................. 2
1.1.2. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía ................................................... 2
1.1.3. Vi khuẩn tía không lưu huỳnh ........................................................................ 4
1.2. Chuyển hóa chất thải hữu cơ thành sinh khối vi khuẩn tía không lưu huỳnh giàu
dinh dưỡng .................................................................................................................... 8
1.2.1. Tình trạng xử lý chất thải chăn nuôi và chất thải chế biến thực phẩm ở Việt
Nam 9
1.2.2. Việc sử dụng vi khuẩn tía không lưu huỳnh trong xử lý chất thải ................ 10
1.3. Làm giàu vi khuẩn tía không lưu huỳnh ............................................................. 12
1.3.1. Tình hình nghiên cứu .................................................................................... 12
1.3.2. Các điều kiện cơ bản ..................................................................................... 12
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 14
2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 14
2.1.1. Mẫu nguồn VK tía không lưu huỳnh............................................................. 14
2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................... 14
2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu .................................................... 14
2.1.4. Thiết bị .......................................................................................................... 15
2.1.5. Chọn lựa nguồn Carbon ................................................................................ 15
2.1.6. Chọn lựa nguồn Nito ..................................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp làm giàu mẫu nước .................................................................. 15
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn tía không lưu huỳnh ................................... 15
2.2.3. Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tía không lưu huỳnh ............... 16
2.2.4. Phương pháp so sánh hàm lượng sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu
huỳnh 17


2.2.5. Phương pháp so sánh hàm lượng carotenoid giữa các chủng VK tía không lưu
huỳnh 17

2.2.6. Phương pháp so sánh hàm lượng protein giữa các chủng VK tía không lưu
huỳnh 18
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 19
3.1. Kết quả làm giàu và phân lập VK tía không lưu huỳnh ...................................... 19
3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện làm giàu và phân lập VK tía không lưu huỳnh ........... 19
3.1.2. Kết quả làm giàu VK tía không lưu huỳnh ................................................... 20
3.2. Kết quả định danh VK tía không lưu huỳnh ........................................................ 20
3.2.1. Kết quả xét hình thái ..................................................................................... 21
3.2.2. Kết quả kiểm tra hóa sinh .............................................................................. 24
3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn 16S rRNA ............................................................ 24
3.3. Kết quả so sánh khả năng sinh trưởng giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh
trên các nguồn Carbon khác nhau ............................................................................... 25
3.3.1. Kết quả so sánh sinh khối .............................................................................. 25
3.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng carotenoid ......................................................... 26
3.3.3. Kết quả so sánh hàm lượng protein ............................................................... 28
3.4. Kết quả so sánh khả năng sinh trưởng giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh
trên các nguồn Nito khác nhau ................................................................................... 30
3.4.1. Kết quả so sánh sinh khối .............................................................................. 30
3.4.2. Kết quả so sánh hàm lượng carotenoid ......................................................... 31
3.4.3. Kết quả so sánh hàm lượng protein ............................................................... 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 35
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 38


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Sự xuất hiện của vi khuẩn tía không lưu huỳnh ở mương nước thải chăn nuôi11
Hình 2: Kết quả làm giàu VK tía không lưu huỳnh ....................................................... 20
Hình 3: Sản phẩm PCR colony đoạn 16S rRNA kích thước 1400bp của các chủng VK
tía không lưu huỳnh........................................................................................................ 24

Hình 4: Biểu đồ so sánh sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh ................ 26
Hình 5: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Carbon là Glucose ............. 27
Hình 6: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Carbon là Maltose ............. 27
Hình 7: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Carbon là Tinh bột ............ 28
Hình 8: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Carbon là Glucose .................. 29
Hình 9: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Carbon là Maltose................... 29
Hình 10: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Carbon là Tinh bột ................ 30
Hình 11: Biểu đồ so sánh sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh .............. 30
Hình 12: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Nito là Amoni clorua ...... 31
Hình 13: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Nito là Ure....................... 31
Hình 14: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Nito là Peptone ................ 32
Hình 15: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Nito là Amoni clorua ............ 32
Hình 16: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Nito là Ure ............................ 33
Hình 17: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Nito là Peptone ..................... 33
Hình 18: Kết quả xét tính động ...................................................................................... 38
Hình 19: Kết quả xét khả năng sử dụng acetate làm nguồn Carbon .............................. 38
Hình 20: Kết quả xét khả năng sử dụng glucose làm nguồn Carbon ............................. 39
Hình 21: Đường chuẩn protein với trường hợp so sánh hàm lượng protein giữa các nguồn
Carbon ............................................................................................................................ 39
Hình 22: Đường chuẩn protein với trường hợp so sánh hàm lượng protein giữa các nguồn
Nito ................................................................................................................................. 40


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.Một số đặc điểm chung của vi khuẩn quang hợp tía [21].................................... 2
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn tía không lưu huỳnh ....................................... 5
Bảng 3: Ước tính lượng nước thải phát sinh từ hoạt động chăn nuôi trâu, bò, lợn giai
đoạn 2012 – 2016 ............................................................................................................. 9
Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR ............................................................................... 17
Bảng 5: So sánh các điều kiện làm giàu và phân lập VK tía không lưu huỳnh ............. 19

Bảng 6: Kết quả xét hình thái ......................................................................................... 21
Bảng 7: Kết quả kiểm tra hóa sinh ................................................................................. 24
Bảng 8: Kết quả phân tích các trình tự 16S rRNA của các đơn chủng .......................... 25


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019
MỞ ĐẦU

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp hiệu quả để xử lý hầu hết các chất hữu cơ
gây độc có trong chất thải chăn nuôi và chất thải chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, khác
với chất thải công nghiệp nặng, những nguồn chất thải này chứa hàm lượng chất hữu cơ
giàu protein, cacbonhydrat và chất béo vì có nguồn gốc từ thực vật, động vật. Vì thế, các
nhà khoa học đang quan tâm đến vấn đề tái sử dụng nguồn chất hữu cơ này. Một trong
những phương pháp đó là sử dụng vi khuẩn tía không lưu huỳnh – là một loại vi khuẩn
quang hợp.
Vi khuẩn tía không lưu huỳnh phát triển tốt nhất khi sinh trưởng trong điều kiện
quang dị dưỡng, do đó sử dụng hàm lượng chất hữu cơ đậm đặc để làm nguồn carbon.
Chất hữu cơ được chuyển hóa trực tiếp thành sinh khối có nhiều giá trị dinh dưỡng (giàu
protein, sắc tố, vitamin và một số chất có hoạt tính sinh học cao), hứa hẹn nhiều tiềm
năng ứng dụng trong xử lý môi trường, chăn nuôi hoặc nuôi trồng thủy sản. Cho đến thời
điểm hiện tại, tuy đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn tía không lưu huỳnh nhưng vẫn
chưa có những công bố cụ thể cho điều kiện làm giàu tối ưu hay nguồn phế thải phù hợp
để vi khuẩn này sinh trưởng đạt hiệu suất cao nhất.
Vì vậy, với tinh thần kế thừa việc nghiên cứu và phát triển thêm các biện pháp tối
ưu hóa, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn tía không lưu
huỳnh dị dưỡng để ứng dụng chuyển hoá phế thải hữu cơ thành sinh khối có giá trị
dinh dưỡng cao”

1


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn quang hợp
Vi khuẩn quang hợp có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng
lượng hóa học nhờ chứa chlorophyll hoặc bacteriochlorophyll (sắc tố quang hợp vi
khuẩn). Bacteriochlorophyll ở vi khuẩn khác với chlorophyll ở thực vật. VKQH được
chia làm hai nhóm chính là VKQH hiếu khí và VKQH kị khí.
Đối với nhóm VKQH hiếu khí có đại diện là vi khuẩn lam. VK lam sử dụng
chlorophyll là sắc tố quang hợp, sử dụng nước làm nguồn điện tử giống như cơ chế của
thực vật. Chúng tạo ra oxy nên được là VK hiếu khí.
Đối với nhóm VKQH kị khí thì không sử dụng nước làm nguồn hidro như thực
vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi, chúng sử dụng nguồn hidro là sunfit
thiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa.
VKQH kị khí bao gồm: vi khuẩn lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu
huỳnh.
1.1.2. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía
1.1.2.1. Đặc điểm chung
VKQH tía là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình que ngắn,
hình phẩy… đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Các loài vi khuẩn này có khả năng chuyển
hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quang hợp kị khí. VKQH
tía thường có màu hồng đến màu đỏ tía, sắc tố quang hợp là bacteriochlorophyll và
carotenoid. Chúng có thể phát triển dị dưỡng với CO2 là nguồn carbon [21].
Bảng 1.Một số đặc điểm chung của vi khuẩn quang hợp tía [21]

Đặc điểm
Nhóm/ loài

Ví dụ
-Vi khuẩn tía lưu huỳnh (gammproteobacteria)
-Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặc betaproteobacteria)

Một số loài chính

Allochromatium vinosum và Thiocapsa roseopersicina (vi
khuẩn tía lưu huỳnh); Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter
sphaeroides, Rhodospirillum rubrum và Rhodopseudomonas
palustris (vi khuẩn tía không lưu huỳnh

2


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Sắc tố/ màu sắc của - BChl a hoặc b; carotenoid chính: spirilloxanthin, spheroidene,
huyền phù tế bào

lycopene, rhodopsin và dẫn xuất của chúng
- Màu sắc huyền phù tế bào: tía, tía đỏ, tía tím, đỏ, cam, nâu,
nâu vàng (với những loài chứa BChl a), xanh hoặc vàng (với
những loài chứa BChl b)

Vị trí của sắc tố Nằm trong lớp màng sinh chất, được sắp xếp thành dạng ống,

trong tế bào
dạng màng, dạng túi hoặc dạng phiến lamellae
Phổ hấp thụ cực đại - Những loài chứa BChl a: gần 800nm, và những vùng có bước
của tế bào sống

song từ 815-960nm
- Những loài chứa BChl b: 835-850nm và 1010-1040nm

Chất cho electron/
giọt lưu huỳnh

- Sulfide: S0, S2O32-, H2
- Nếu S0 được hình thành từ quá trình oxy hóa sulfide thì S0
được tích lũy bên trong tế bào, và điều này chỉ xảy ra ở loài vi
khuẩn tía lưu huỳnh

Quang tự dưỡng/ - Vi khuẩn tía lưu huỳnh bị hạn chế về số lượng
hô hấp tối

- Vi khuẩn tía không lưu huỳnh đa dạng về số lượng

1.1.2.2. Phân loại của VKQH tía
Năm 1907, Molisch là người đầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc tố màu đỏ
và có khả năng quang hợp nên ông gọi chung nhóm vi khuẩn này là Rhdobacteria. Nhóm
vi khuẩn này bao gồm hai họ Thiorhodaeceae (là những vi khuẩn tía có khả năng hình
thành giọt “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả
năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) [13]
Theo khóa phân loại của Bergey (1989) VKQH được chia làm ba nhóm: vi khuẩn
tía quang hợp, vi khuẩn xanh quang hợp và nhóm vi khuẩn hiếu khí chứa
bacteriochlorophyll (nhưng không xếp vào hai nhóm trên). Riêng nhóm VKQH tía được

chia làm ba họ:
- Họ Chromatiaceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh tía có khả năng hình
thành giọt lưu huỳnh bên trong tế bào.
- Họ Ectothiorhodospiraceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh tía có khả năng
hình thành giọt lưu huỳnh bên ngoài tế bào.
3


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

- Họ Rhodospirilaceae: gồm tất cả các VKQH tía không tích lũy giọt lưu huỳnh.
Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại của Bergey (2001) dựa vào thành phần acid
béo, quinone, trình tự và kích thước của cytochrome c, VKQH tía lại được xếp vào ba
phân lớp:
- Alphaproteobacteria: gồm VKQH tía không lưu huỳnh và VKQH tía hiếu khí.
- Betaproteobacteria: cũng gôm VKQH tía không lưu huỳnh.
- Gammaproteobacteria: gồm hai họ Chromatiaceae và Ectothiorhodospriraceae
Gần đây, sự phân loại VKQH không chỉ dựa vào các phân tích về hình thái tế bào,
đặc tính sinh lý sinh hóa mà còn dựa trên các thông tin về di truyền và nguồn gốc phát
sinh. Một trong những thông tin di truyền quan trọng được dùng trong phân loại các vi
khuẩn là thông tin về trình tự gen 16S rDNA. Đây là một gen có tính bảo thủ cao trong
quá trình tiến hóa của sinh vật, có kích thước đủ lớn để xác định thông tin di truyên với
mức độ tin cậy cao [18]. Do đó, trong khóa phân loại của Bergey năm 1994 và hệ thống
phân loại của Bergey năm 2001, mối quan hệ di truyền giữa các vi khuẩn đã được thiế
lập dựa vào phân tích trình tự gen 16S rDNA.
1.1.3. Vi khuẩn tía không lưu huỳnh
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học
Hiện tại có khoảng 20 loài VK tía không lưu huỳnh được tìm thấy (bảng 2), trong

đó 2 loài Rhodobacter và Rhodopseudomonas được sử dụng nhiều nhất để nghiên cứu
về quang hợp kị khí. Bảng 2 cho thấy các VK tía không lưu huỳnh đều là VK
proteobacteria và các dạng hình thái đặc trưng của tế bào VK tía không lưu huỳnh [21]
VK tía không lưu huỳnh là nhóm vi khuẩn linh hoạt về mặt sinh lý, có thể phát
triển được ở điều kiện quang dưỡng hoặc trong tối. Ví dụ Rhodobacter capsulatus
(R.capsulatus) với điều kiện quang dưỡng thì sẽ phát triển bằng tự dưỡng hoặc quang dị
dưỡng, với điều kiện trong tối là hô hấp, lên men hoặc hóa dưỡng [20].

4


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Bảng 2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn tía không lưu huỳnh
Phân loại

Loài

Tên viết tắt

Đặc điểm hình
thái

Alphaproteobacteria

Betaproteobacteria

Rhodobaca

Rca.

Cầu hoặc
ngắn

Rhodobacter

Rba.

Que

Rhodovulum

Rdv.

Que

Rhodopseudomonas

Rps.

Que nảy chồi

Rhodoblastus

Rbl.

Que nảy chồi

Blastochloris

Blc.

Que nảy chồi

Rhodomicrobium

Rmi.

Que nảy chồi

Rhodobium

Rbi.

Que

Rhodoplanes

Rpl.

Que

Rhodocista

Rcs.

Xoắn

Rhodospirillum

Rsp.

Xoắn

Phaeospirillum

Phs.

Xoắn

Rhodopila

Rpi.

Cầu

Rhodospira

Rsa.

Xoắn

Rhodovibrio

Rhv.

Phẩy

Rhodothallasium

Rts.

Xoắn

Roseospira

Ros.

Xoắn

Roseospirillum

Rss.

Xoắn

Rhodocyclus

Rcy.

Phẩy xoắn

Rhodoferax

Rfx.

Que, phẩy

Rubrivivax

Rvi.

Que, que cong

5

que


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

1.3.1.1.1. Quang dị dưỡng
Ở điều kiện có ánh sáng, kị khí, phần lớn VK tía không lưu huỳnh có thể phát
triển quang tự dưỡng với H2 hoặc lượng thấp sulfide làm nguồn điện tử, một số loài có
thể dùng S2O32- hoặc Fe2+ [7, 9]. Tuy nhiên, phần lớn VK tía không lưu huỳnh phát triển
tốt nhất ở điều kiện quang dị dưỡng với môi trường chứa nguồn chất hữu cơ phù hợp
như malate hoặc succinate làm nguồn Carbon và ammonia làm nguồn Nito [29]. Phương
trình tổng quát của phản ứng quang hợp được viết như sau
CO2 + 2H2A + hv → [CH2O]n + 2A + H2O
Chú thích: Ở tảo và thực vật bậc cao: H2A là H2O. Ở VK tía: H2A có thể là chất
hữu cơ đơn giản, các hợp chất khử của lưu huỳnh hoặc hydro phân tử
Sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp là bacteriochlorophyll (Bchl). Hiện
nay bacteriochlorophyll được chia thành 5 nhóm a, b, c, d và e theo sự khác nhau về cấu
trúc phân tử và cực đại của phổ hấp thụ trong vùng ánh sáng đỏ. Ngoài Bchl, VK tía
không lưu huỳnh còn chứa các carotenoid. Sự phân biệt màu sắc của các chủng và các
loài trong tự nhiên là do sự khác nhau về thành phần Bchl, carotenoid và tỉ lệ hàm lượng

của chúng có trong tế bào.
1.3.1.1.2. Sinh trưởng và trao đổi chất trong điều kiện không có ánh sáng
Nhiều chất hữu cơ tương tự được dùng trong quang dưỡng có thể được dùng làm
chất cho điện tử và nguồn Carbon cho sự sinh trưởng dựa trên hô hấp trong tối. Một số
VK tía không lưu huỳnh có thể phát triển trong điều kiện tối kị khí bằng cách lên men
hoặc hô hấp yếm khí. Ví dụ, pyruvate [10, 31]và một số loại đường nhất định [19, 27]
hỗ trợ sự phát triển lên men của một số VK tía không lưu huỳnh. Ngoài ra, sinh trưởng
trong điều kiện hóa dưỡng cũng được một số loài VK tía không lưu huỳnh sử dụng với
H2 hoặc S2O32- là nguồn cho điện tử [20].
1.1.3.2. Môi trường sống
VK tía không lưu huỳnh phát triển dày đặc ở những nơi có hàm lượng sulfide thấp
hoặc không có. VK tía không lưu huỳnh phát triển ít ở môi trường sống của VK tía lưu
huỳnh do chúng nhạy cảm với sulfide.
VK tía không lưu huỳnh được tìm thấy nhiều trong nước thải [11, 28], những khu
vực chất thải có hàm lượng chất hữu cơ đậm đặc – là nguồn Carbon cho sự phát triển dị
dưỡng của chúng. Trong nghiên cứu của Sifert và cộng sự năm 1978 [28] đã chỉ ra rằng
số lượng trung bình của VK tía không lưu huỳnh trong nước thải nhà máy ở Göttingen,

6


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Đức trong giai đoạn xử lý bùn hoạt tính là cao nhất, được xác định trong khoảng 105 đến
106 tế bào trong 1ml.
1.1.3.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn tía không lưu
huỳnh
1.1.3.3.1. pH

Quang hợp của VK tía không lưu huỳnh có thể xảy ra trong môi trường pH 3 –
11 [12]. Tuy nhiên, chúng sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6 -7.
1.1.3.3.2. Cường độ ánh sáng
VK tía không lưu huỳnh sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh ở môi
trường có ánh sáng đỏ, vàng. Ngoài phát triển ngoài sáng, chúng có thể phát triển trong
bóng tối [12].
1.1.3.3.3. Nhiệt độ
Quang hợp của VK tía không lưu huỳnh có thể xảy ra ở nhiệt độ lên tới 570C và
xuống tới 00C [8]. Nhiệt độ tối cho sự sinh trưởng và phát triển là khoảng 300C.
1.1.3.3.4. Nguồn Carbon
VK tía không lưu huỳnh có khả năng sử dụng rất nhiều chất hữu cơ làm nguồn
carbon cho sinh trưởng. Chúng có sự điều chỉnh các cơ chế trao đổi chất hữu cơ rất linh
hoạt trong các điều kiện sinh trưởng khác nhau. Một số hợp chất hữu cơ hỗ trợ cho sự
phát triển quang dị dưỡng của VK tía không lưu huỳnh, điển hình như các axit hữu cơ,
axit amin, axit béo, rượu, carbonhydrate và thậm chí là hợp chất C-1, tuy nhiên, VK tía
không lưu huỳnh sinh trưởng nhanh hơn và đạt mật độ cao hơn trong môi trường có các
cơ chất 4-C với 2 nhóm carboxyl (như malate, succinate) so với khi sinh trưởng trên các
nguồn cơ chất khác [29].
1.1.3.3.5. Nguồn Nito
Tất cả các loài VK tía không lưu huỳnh đều có thể sử dụng một số nguồn nito
vô cơ hoặc hữu cơ như amoni, nitrate, glutamate, asparagin, alanine… trong đó amoni
là nguồn nito ưu thích nhất đối với loài vi khuẩn này [14].
1.1.3.3.6. Các yếu tố khác
Nhiều loài VK tía không lưu huỳnh có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide
như là chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2mN (tương đương 64mgS2-/L). Nếu trong
môi trường sống với nồng độ sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng [12].
Ngoài ra nồng độ NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của VK tía
không lưu huỳnh.
7

Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

1.1.3.4. Ứng dụng
Nhóm VK tía không lưu huỳnh có các khả năng trao đổi chất rất linh hoạt tùy
thuộc vào điều kiện môi trường sống nên chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Những
ứng dụng nổi bật của VK tía không lưu huỳnh là xử lý nước thải, cải thiện môi trường,
sản xuất hydro phân tử, sinh khối.
1.1.3.4.1. Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao
Tế bào VK tía không lưu huỳnh có khả năng tổng hợp một số chất có hoạt tính
sinh học cao như Ubiquinone, hormone sinh trưởng thực vật, các chất kháng sinh…Ví
dụ như Ubiquinone 10 (Q10) ở tế bào VK tía không lưu huỳnh có hàm lượng cao hơn
các loài vi sinh vật khác. Q10 có giá trị về dược liệu, có tác dụng kích thích cơ tim được
sử dụng trong điều trị các bệnh về phổi và còn có thể sử dụng như một chất chống oxy
hóa trong sản xuất dược phẩm [25].
1.1.3.4.2. Sản xuất phân bón sinh học
VK tía không lưu huỳnh được làm nguồn phân bón sinh học cho các đối tượng
hoa màu và các loại cây ăn quả như cam chanh, khoai tây… đã rất thành công [15, 26].
Bên cạnh đó, người ta còn áp dụng phân bón này trên ruộng lúa ở các nước thuộc
khu vực châu Á bởi đảm bảo được nhu cầu về ánh sáng, nguồn cơ chất (hữu cơ hoặc vô
cơ) và môi trường ngập nước cũng như không có oxy. Đây là điều kiện thuận lợi cho
sinh trưởng của VK tía không lưu huỳnh [26].
1.1.3.5. Giá trị dinh dưỡng và khả năng sử dụng sinh khối vi khuẩn tía không
lưu huỳnh như thành phần bổ sung vào thức ăn chăn nuôi – thủy sản
Ở tế bào VK tía không lưu huỳnh, hàm lượng protein thường chiếm khoảng 6070%; thành phần cũng như hàm lượng các amino acid không thay thế của chúng có thể
tương tự như ở đậu tương, thịt và trứng gà. Hơn nữa, chúng còn có các hàm lượng cao
các vitamin nhóm B (B1, B2, B6 và B12), vitamin E, niacin, acid folic, acid pantothenic
và carotenoid. Do đó, chúng là những đối tượng lý tưởng trong sản xuất thức ăn cho gia

súc, gia cầm và thủy hải sản. Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã tuyển chọn các chủng
VK tía không lưu huỳnh có khả năng sinh trưởng và loại bỏ hoạt tính sulfide cao nhất để
cung cấp thức ăn tại trại giống hải sản cơ sở (Giao Xuân, Giao Thủy, Nam Định và trại
giống thủy sản Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng) với quy mô 300-500 l/ngày, mật độ 1091010 TB/ml [1].
1.2. Chuyển hóa chất thải hữu cơ thành sinh khối vi khuẩn tía không lưu huỳnh
giàu dinh dưỡng
8


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

1.2.1. Tình trạng xử lý chất thải chăn nuôi và chất thải chế biến thực phẩm ở Việt
Nam
1.2.1.1. Tình hình xử lý chất thải ở Việt Nam
Những năm gần đây, ngành chăn nuôi tại Việt Nam có xu hướng chuyển dịch từ
quy mô hộ gia đình sang chăn nuôi tập trung trên quy mô lớn. Ô nhiễm môi trường chăn
nuôi tại các vùng nông thôn ngày càng trở nên nghiêm trọng. Nguyên nhân chính là do
chất thải không được kiểm soát xả thải ra môi trường. Khảo sát thực tế tại các trang trại,
mặc dù có áp dụng biện pháp xử lý môi trường, nhưng một số cơ sở vẫn gây ô nhiễm do
công tác quản lý chưa chặt chẽ và áp dụng công nghệ chưa phù hợp.
Theo thống kê, lượng nước thải chăn nuôi phát sinh được ước tính trên số lượng
gia súc, gia cầm và hệ số phát sinh nước thải. Theo một số nghiên cứu ở Việt Nam, hệ
số phát sinh nước thải trung bình từ họat động chăn nuôi như sau: trâu, bò khoảng 12.5
L/ ngày, lợn khoảng 20 L/ngày với tổng lượng nước thải phát sinh ước tính lên tới trên
681 triệu m3/ ngày [3]
Bảng 3: Ước tính lượng nước thải phát sinh từ hoạt động chăn nuôi trâu, bò, lợn
giai đoạn 2012 – 2016
Lưu lượng nước thải (m3/ ngày)

Năm

Trâu, bò

Lợn

Tổng

2012

97 775 000

525 288 000

623 063 000

2013

96 452 500

525 288 000

621 740 500

2014

96 946 250

535 228 000

632 174 250

2015

98 645 000

555 014 000

653 659 000

2016

100 200 000

581 506 000

681 706 000

Nước thải chăn nuôi thường có hàm lượng lớn chất rắn lơ lửng, các chất hữu cơ,
chất dinh dưỡng và vi sinh vật với một số thông số ô nhiễm đặc trưng bao gồm: BOD,
COD, tổng Nito và tổng Coliform được quy định rõ trong QCVN 62-MT:2016/BNTMT.
Tương tự với nước thải nuôi trồng thủy sản cũng có hàm lượng chất hữu cơ cao
(BOD 12 – 35mg/L, COD 20 – 50mg/L), các chất dinh dưỡng (photpho, nito), chất rắn
lơ lửng (12 – 70mg/L) …

9


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Bên cạnh đó, nước thải từ quá trình chế biến lương thực, thực phẩm, chăn nuôi
và giết mổ, đặc biệt là nước thải từ khâu lọc tách bã, ví dụ như tách bột đen của quá trình
sản xuất tinh bột từ sắn, dong riềng cũng gây nên ảnh hưởng ô nhiễm hữu cơ nặng nề
Đặc điểm chung của các loại chất thải này là có lưu lượng tương đối lớn và ổn
định; chứa các hợp chất hữu cơ (thường ít độc) có nguồn gốc từ động vật và thực vật
(chất thải hữu cơ có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu là cacbonhydrat, chất thải có nguồn
gốc động vật có thành phần đa phần là protein và chất béo); có các thông số ô nhiễm đặc
trưng như hàm lượng TSS, BOD5, COD khá cao (cao gấp 10 – 20 lần quy chuẩn), vi
khuẩn gây hại; chứa hàm lượng Nito, Photpho khá cao, một số nước thải có hàm lượng
muối cũng rất cao.
1.2.1.2. Các phương pháp xử lý phế thải
1.2.1.2.1. Phương pháp hóa lý
Phương pháp hóa lý dùng trong xử lý nước thải gồm có: trung hòa, oxy hóa và
khử bằng cách sử dụng các chất oxy hóa mạnh như khí oxy, Cl2, potassium ferricyanide,
quinone, manganese dioxide…[2, 4]. Phương pháp này dùng để loại bỏ các chất hòa tan,
trong hệ thống nước khép kín và hiệu quả cao. Tuy nhiên, các thiết bị sử dụng để xử lý
cần có như: thiết bị sục khí, thiết bị gia nhiệt, máy khuấy… dẫn đến giá thành cao vì nó
đòi hỏi phải bổ sung thêm hóa chất. Mặt khác, có thể còn gây ra ô nhiễm môi trường thứ
cấp do lượng hóa chất bị dư thừa.
1.2.1.2.2. Phương pháp sinh học
Phương pháp sinh học được ứng dụng để xử lý nước thải sinh hoạt và nước thải
công nghiệp khỏi nhiều chất hữu cơ hòa tan và một số chất vô cơ (H2S, các sunfua, NH3,
các nitric…). Quá trình xử lí dựa trên khả năng của vi sinh sử dụng các chất này làm chất
dinh dưỡng trong hoạt động sống. Các chất hữu cơ đối với vi sinh là nguồn carbon. Theo
Buisman và cộng sự (1990), xử lý nước thải bằng phương pháp có những ưu điểm sau:
- Không sử dụng chất xúc tác và chất oxy hóa vì vậy mang hiệu quả kinh tế cao
- Không có hóa chất tồn dư trong bùn nên không gây ô nhiễm thứ cấp cho môi
trường nuôi

- Bùn sinh học tạo ra ít
- Tiêu thụ năng lượng ở mức thấp
- Hiệu quả xử lý cao
1.2.2. Việc sử dụng vi khuẩn tía không lưu huỳnh trong xử lý chất thải

10


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Các phương pháp xử lý chất thải chăn nuôi, chất thải chế biến thực phẩm hiện nay
đều có ưu điểm là hiệu quả cao, xử lý được các chất hữu cơ hòa tan trong nước. Tuy
nhiên, đa số đều chưa tái sử dụng được nguồn carbon này. Hiện nay, nhiều nhà khoa học
đang nghiên cứu các phương pháp, đặc biệt là phương pháp sinh học để tái sử dụng được
nguồn carbon này. Thông thường, khi lựa chọn đối tượng nghiên cứu thì người ta chọn
VKQH nhiều hơn vì trong những nguồn chất thải này thường chứa nhiều chất hữu cơ và
hàm lượng oxy hòa tan thấp [16]. Đây chính là môi trường tối ưu cho VKQH phát triển,
đặc biệt VK tía không lưu huỳnh. Tác giả Okubo và cộng sự (2006) đã quan sát thấy VK
tía không lưu huỳnh tạo thành một tấm thảm màu đỏ trong kênh chứa nước thải chăn
nuôi và chủ yếu là do các chi Rhodobacter và Rhodopseudomonas tạo nên [24].

Hình 1: Sự xuất hiện của vi khuẩn tía không lưu huỳnh ở mương nước thải chăn
nuôi
Do vậy, để xử lý chất thải đồng thời tái sử dụng, chuyển hóa chất thải thành sinh
khối giàu dinh dưỡng, nhiều tác giả đã chọn VK tía không lưu huỳnh vì hiệu quả mang
lại tương đối cao: hàm lượng chất hữu cơ trong chất thải được loại bỏ nhờ quá trình sinh
trưởng dị dưỡng của nó. VK tía không lưu huỳnh có thể sử dụng đa dạng các nguồn
carbon với mức độ sinh trưởng cao, đồng thời, tỉ lệ chất hữu cơ được chuyển hóa thành

sinh khối giàu dinh dưỡng của VK tía không lưu huỳnh trong quá trình phát triển quang
dị dưỡng cũng cao cao hơn khi so sánh với các vi sinh vật dị dưỡng khác [23]. Bên cạnh

11


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

đó, VK tía không lưu huỳnh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời trong
quá trình xử lý nên giảm bớt chi phí vận hành [17].
1.3. Làm giàu vi khuẩn tía không lưu huỳnh
1.3.1. Tình hình nghiên cứu
Với khả năng ứng dụng hấp dẫn như trên, việc nghiên cứu làm giàu vi khuẩn tía
không lưu huỳnh để sử dụng trong chuyển hóa phế thải hữu cơ thành sinh khối đang
nhận được nhiều sự quan tâm. Vi khuẩn tía không lưu huỳnh sinh trưởng tốt nhất trong
điều kiện quang dị dưỡng. Môi trường làm giàu VK tía không lưu huỳnh là môi trường
cần thiết đáp ứng để chúng sinh trưởng tốt nhất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc thay
đổi từng điều kiện trong môi trường làm giàu như nguồn carbon, nồng độ NaCl, pH đều
gây ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng cũng như sắc tố sinh ra. Ví dụ, với pH khoảng 9,
nồng độ NaCl 1%, loài Rhodobacter và Rhodovulum có sắc tố vàng hoặc vàng nâu [22].
Đến nay, các nghiên cứu cho điều kiện làm giàu VK tía không lưu huỳnh đều tập trung
chú trọng vào các hướng như nguồn chất hữu cơ, nhiệt độ, khoảng pH và hạn chế sự phát
triển của các vi sinh vật khác.
1.3.2. Các điều kiện cơ bản
1.3.2.1. Nguồn chất hữu cơ
VK tía không lưu huỳnh có thể dùng đa dạng các nguồn chất hữu cơ để làm nguồn
cho điện tử như acid béo, các hợp chất rượu đơn, rượu đa, carbonhydrates hoặc hợp chất
vòng thơm. Tuy nhiên, phần lớn VK tía không lưu huỳnh dùng những chất hữu cơ dễ sử

dụng như malate, pyruvate hoặc succinate làm nguồn carbon và ammonia làm nguồn
nito cho sinh trưởng quang dị dưỡng của nó [29].
1.3.2.2. pH
VK tía không lưu huỳnh có thể sinh trưởng trong dải pH rộng nhưng để đạt hiệu
suất tối đa thì môi trường làm giàu nên ở mức pH trung tính (mức pH dưới 6 và trên 8
không có lợi cho sự sinh trưởng) [32].
1.3.2.3. Hạn chế sự sinh trưởng của tảo lục
Đôi khi, chủng cấy ban đầu chứa lượng lớn các loài tảo lục, như Euglena hoặc
Chlamydomonas, từ đó gây khó khăn cho việc làm giàu VK tía không lưu huỳnh. Thành
phần môi trường làm giàu nếu sử dụng tartrate hoặc malonate làm nguồn carbon [32] là
một trong những yếu tố ảnh hưởng đến việc sinh trưởng của VK tía không lưu huỳnh
chậm hơn so với tảo lục do khả năng tạo oxy nhanh chóng của tảo lục sẽ làm mất đi điều

12


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

kiện kị khí cho môi trường làm giàu. Ngoài ra, việc sử dụng ánh sáng hồng ngoại cũng
hạn chế sự sinh trưởng của tảo lục vì chúng không sinh trưởng được dưới bước sóng trên
750nm [5, 6].

13


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu nguồn VK tía không lưu huỳnh
Mẫu nguồn được lấy từ các nguồn nước thải sinh hoạt: Triều Khúc (Thanh Xuân),
Định Công (Hoàng Mai), nước ao hồ: hồ Thành Công (Thành Công) và nước thải từ làng
bún Phú Đô (Mỹ Đình).
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng làm giàu, phân lập VK tía không lưu huỳnh: KH2PO4,
MgSO4.H2O, NaCl, NH4Cl, CaCl2, (CH2COOH)2, cao nấm men, H3BO3, CoCl2.H2O,
MnCl2.4H2O, NiCl2.6H2O, Na2MoO4.2H2O, ZnCl2, FeSO4.7H2O, CuCl2. Các hóa chất
trên đều được mua từ các hãng đảm bảo tin cậy như Affymetric (Mỹ) hoặc Xilong (Trung
Quốc).
Hóa chất sử dụng cho các kiểm tra hóa sinh: acetate, peptone, dextrose, NaCl,
phenol red, agarose, meat extract, tinh bột. Các hóa chất trên đều được mua từ các hãng
đảm bảo tin cậy như Affymetric (Mỹ) hoặc Xilong (Trung Quốc).
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử: Bộ hóa chất sử dụng tách
DNA (Glycogen 20mg/l, Ethanol 100%, Amonium acetate); phản ứng PCR (USB Tag
PCR Master Mix 2x); điện di kiểm tra sản phẩm PCR ( HydraGreen Safe AND Stain 20
000x, Loading Dye 6x, Gene Ruler 1kb AND Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR
(ExoSAP-IT PCR Product Cleanup). Tất cả được cung cấp bới Affymetric USB, Merck
và Fermentas (Mỹ).
2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường cơ bản làm giàu VK tía không lưu huỳnh (g/l): KH2PO4-0.33,
MgSO4.H2O-0.33, NaCl-0.33, NH4Cl-0.5, CaCl2-0.0377, (CH2COOH)2-1, cao nấm
men-0.02, pH=7.
Môi trường vi lượng bổ sung vào môi trường cơ bản (g/l): H3BO3-0.02, CaCl20.152, CoCl2.H2O-0.34, MnCl2.4H2O-0.2, NiCl2.6H2O-0.52, NaCl-2, Na2MoO4.2H2O0.02, ZnCl2-0.2, FeSO4.7H2O-2.2, CuCl2-0.04, pH=3-4.
Môi trường phân lập VK tía không lưu huỳnh (g/l): KH2PO4-0.33, MgSO4.H2O0.33, NaCl-0.33, NH4Cl-0.5, CaCl2-0.0377, (CH2COOH)2-1.5, cao nấm men-1.02, agar15, pH=7.

14

Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Môi trường bán rắn (semi-solid) để kiểm tra tính động (g/l): Peptone-10, NaCl-5,
agar-4, cao thịt-3, pH=7.
Môi trường acetate differental agar (g/l): NH4H2PO4-1, CH3COONa-2, NaCl-5,
K2HPO4-1, MgSO4.7H2O-0.2, agar-20, Bromothymol blue-0.08, pH=7.
Môi trường the phenol red dextrose broth (g/l): Peptone-10, dextrose-5, NaCl-5,
đỏ phenol-0.18, agar-1, pH=7.
2.1.4. Thiết bị
Bình kị khí, máy lắc vortex IKA 3 (Đức), máy Thermo Scientific BioMate 3
UV/VIS Spectrophotometer (USA), máy ly tâm KUBOTA 5900, máy ly tâm g65471R
(Eppendord Đức), máy Elisa, kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức), thiết bị phản ứng
nhiệt HACH DRB200 (Trung Quốc).
2.1.5. Chọn lựa nguồn Carbon
Sử dụng Glucose, Maltose và Tinh bột làm 3 nguồn Carbon để so sánh khả năng
sinh sinh khối, sinh carotenoid và protein của các chủng VK tía không lưu huỳnh.
2.1.6. Chọn lựa nguồn Nito
Sử dụng Ammoni, Ure và Peptone làm 3 nguồn Nito để so sánh khả năng sinh
sinh khối, sinh carotenoid và protein của các chủng VK tía không lưu huỳnh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp làm giàu mẫu nước
Mẫu nước thu được làm giàu trong môi trường cơ bản, đặt trong bình kị khí. So
sánh khả năng sinh trưởng dưới 2 điều kiện: ánh sáng (ánh sáng có màu vàng và ánh
sáng có màu trắng) và nhiệt độ (25oC và 30-35oC).
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn tía không lưu huỳnh
Pha loãng dịch làm giàu ra các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4. Hút 100µL dịch đã

pha loãng, nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường cơ bản. Dùng que trang khửng gạt đều dịch
trên bề mặt đĩa cho đến khi mặt thạch khô. Đặt đĩa trong chuông kị khí (đốt đèn trong
chuông để loại bỏ không khí). Sau khoảng 3 ngày, quan sát trên đĩa xuất hiện khuẩn lạc
màu từ đỏ, hồng nâu hoặc tím, tiến hành đánh dấu những khuẩn lạc có hình thái khác
nhau (đường kính, hình dạng, màu sắc...).
Tinh sạch những khuẩn lạc đã chọn lọc bằng cách dung que cấy khử trùng ria 3
pha trên đĩa petri chứa môi trường cơ bản. Đặt đĩa trong điều kiện như trên.

15


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

2.2.3. Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tía không lưu huỳnh
2.2.3.1. Phương pháp định danh bằng xét hình thái
Phương pháp nhuộm gram: Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lam kính. Nhặt một
khuẩn lạc Bacillus/ Ecoli và 1 khuẩn lạc vi khuẩn tía không lưu huỳnh rồi hòa tan vào
giọt nước cất, đợi khô. Tiếp đó nhỏ tím kết tinh, để 1 phút rồi rửa bằng nước cất, đợi
khô. Sau đó nhỏ Lugol, để 1 phút rồi rửa bằng ethanol 95% trong 30 giây, đợi khô. Cuối
cùng nhỏ Safranin, để 1 phút rồi rửa bằng nước cất, đợi khô. Soi mẫu dưới kính hiển vi
ở 10X, 40X, 100X.
2.2.3.2. Phương pháp định danh bằng kiểm tra hóa sinh
Kiểm tra tính động: chuẩn bị môi trường semi-solid 0,2% agar trong ống nghiệm.
Dùng que cấy khử trùng chấm 1 khuẩn lạc, chọc thẳng xuống thạch. Đậy kín nắp, bọc
parafin, đặt trong bình kị khí, chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. Nếu các chủng mọc lan
sang hai bên đường cấy là chủng đó có tính động.
Kiểm tra khả năng sử dụng acetate làm nguồn Carbon: chuẩn bị các ống thạch
nghiêng môi trường acetate differential agar. Dùng que cấy khử trùng chấm khuẩn lạc

VK tía không lưu huỳnh rồi ria trên bề mặt thạch nghiêng. Đặt các ống trong bình kị khí,
chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. Dùng Ecoli làm đối chứng dương. Nếu sau 3 ngày, môi
trường chuyển từ màu xanh dương sang xanh lục thì chủng VK tía không lưu huỳnh có
sử dụng acetate làm nguồn carbon.
Kiểm tra khả năng sử dụng glucose làm nguồn Carbon: chuẩn bị các ống chứa
môi trường bán lỏng the phenol red dextrose broth. Dùng que cấy khử trùng chấm khuẩn
lạc VK tía không lưu huỳnh rồi hòa đều vào môi trường. Đặt các ống trong bình kị khí,
chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. Dùng Ecoli làm đối chứng dương. Nếu sau 3 ngày, môi
trường chuyển từ màu đỏ sang vàng thì chủng VK tía không lưu huỳnh có sử dụng
glucpse làm nguồn carbon.
2.2.3.3. Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử
Phương pháp PCR colony: Hòa tan 1 khuẩn lạc vào 200 µL nước PCR. Sốc nhiệt
ở 100 độ trong 5 phút. Sau đó, ly tâm, hút dịch trên, dịch đó là template cho phản ứng
PCR. Thành phần cho phản ứng PCR:

16


Đỗ Bình Minh – K60 Tài năng Sinh

2019

Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng

Thể tích

Taq PCR mix

7,5 µl

P63F (10 µM)

0.6 µl

P1378R (10 µM)

0.6 µl

ADN template

0.6 µl

Nước PCR

5.7 µl

Tổng thể tích phản ứng

15µl

Hỗn hợp trên được tiến hành phản ứng bằng máy PCR theo chu trình nhiệt: 95oC
trong 5 phút; 30 chu kì (95oC - 1 phút, 53oC - 45 giây, 72oC - 1 phút); 72oC trong 7 phút;
giữ ở 4 oC.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose 1%, nhuộm băng
bằng dung dịch HydraGreen Safe AND Strain 20000x và soi trên máy Geldoc.
2.2.4. Phương pháp so sánh hàm lượng sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu
huỳnh
Lấy 1 khuẩn lạc đem nuôi trong dịch môi trường cơ bản nhưng thay thế nguồn
Carbon succinate thành glucose, maltose, tinh bột với lượng tương ứng (500mgC/l) và

Nito là ammoni thành ure, peptone với lượng tương ứng (500mgN/l). Dịch nuôi sau đó
ly tâm 5000 vòng, 4oC trong 20 phút. Thu và lọc tủa qua giấy lọc. Sấy khô, thu được
sinh khối khô của VK tía không lưu huỳnh.
2.2.5. Phương pháp so sánh hàm lượng carotenoid giữa các chủng VK tía không
lưu huỳnh
Pha loãng 5ml dịch nuôi ở 2.2.4 với 5ml nước cất. Ly tâm 5000 vòng, 4oC trong
20 phút. Bỏ dịch nổi, thu cặn. Hòa cặn tế bào với 0.2ml nước cất, 9.8ml acetone:
methanol. Vortex hỗn hợp bọc bằng giấy bạc để tránh ánh sáng, bảo quản ở 5 độ C trong
30 phút. Ly tâm ở 5000rpm trong 20 phút ở 4 độ C, thu lấy dịch nổi, đo quang phổ ở
bước sóng 480nm. Sử dụng dung dịch acetone: methanol làm blank.

17