Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

======

NGUYỄN TRÂM ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

======

NGUYỄN TRÂM ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS. PHẠM THỊ KIM DUNG

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với
đề tài “ Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của màng
Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già” , em đã nhận được
sự hướng dẫn và giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại
Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc
tới:
Th.s Phạm Thị Kim Dung – Người đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô làm việc tại Viện nghiên cứu
Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô và các
bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại bộ môn Sinh lý người và động vật,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên,
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Trâm Anh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là
kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu
của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Trâm Anh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU..................................................... 5
1.1. Tình hình nghiên cứu màng CVK trên thế giới và tại Việt Nam .............. 5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................ 7
1.2. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ........................................... 8

1.2.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum ........................................ 8
1.2.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum............................................................. 8
A. xylinum .......................................................................................................... 8
1.2.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum............................................. 8
1.2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A. xylinum .................................... 9
1.2.2. Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum ....... 9
1.2.2.1. Cấu trúc ................................................................................................ 9
1.2.2.2. Đặc tính của màng CVK ...................................................................... 9
1.2.2.3. Chức năng sinh lý của màng CVK..................................................... 10
1.2.2.4. Môi trường nuôi cấy A.xylinum ......................................................... 10
1.2.3. Giới thiệu tổng quan về thuốc Diclofenac ............................................ 10


1.2.3.1. Công thức .......................................................................................... 10
1.2.3.2. Nguồn gốc và tính chất ...................................................................... 10
1.2.3.3. Động học giải phóng và tác dụng....................................................... 11
1.2.3.4. Công dụng của thuốc.......................................................................... 11
1.2.3.5. Tác dụng không mong muốn của thuốc ............................................. 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 14
2.1.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................... 14
2.1.2. Nguyên liệu – hóa chất.......................................................................... 14
2.2. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 14
2.2.1. Thiết bị .................................................................................................. 14
2.2.2. Dụng cụ ................................................................................................ 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK ................................................................ 15
2.3.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn.................................................... 17
Nồng độ dung dịch Diclofenac (mg/ml) ......................................................... 18
2.3.3. Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK ............... 21

2.3.4. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK............. 23
2.3.5. Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của thuốc Diclofenac
......................................................................................................................... 23
2.3.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ................................................ 24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 25
3.1. Màng CVK được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già .......................... 25
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường........................................................... 25
3.3. Tinh chế màng CVK ................................................................................ 26


3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng khỏi màng CVK ............... 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 37
1. Kết luận ....................................................................................................... 37
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 37
TÀI LỆU THAM KHẢO ................................................................................ 38


DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Hình 2.1: Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men .................................................. 16
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276 nm .. 18
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278 nm .. 19
Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281 nm .. 20
Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già............ 25
Hình 3.2. Màng CVK thu ở ngày thứ 7 độ dày màng 0.5cm .......................... 26
Hình 3.3. CVK ngâm trong HCl

Hình 3.4. Màng CVK sau khi được tinh

chế ................................................................................................................... 27
Hình 3.5. Màng CVK dày 0,5cm

Hình 3.6. Màng CVK dày 1cm ..... 27

Hình 3.7. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm không ép trong các môi trường pH khác nhau (n=3) .............. 30
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
0,5cm và 1cm ép 50% trong các môi trường pH khác nhau (n = 3) ............... 31
Hình 3.9. Biểu đồ biếu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng
chưa ép ở các pH và thời gian khác nhau ....................................................... 34
Hình 3.10. Biểu đồ biếu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng
đã ép 50% ở các pH và thời gian khác nhau. .................................................. 35


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần môi trường tạo màng Cenllulose vi khuẩn ................. 15
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 276 nm ..................................................................... 18
Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 278nm ...................................................................... 19
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 281nm ...................................................................... 20
Bảng 3.1. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng chưa ép ................... 28
Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng ép 50% ................... 29
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH
khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ............................... 32
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng đã ép 50% ở các môi trường
pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ......................... 33

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Diclofenac - dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không
steroid. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh.
Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm
giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là
những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con
đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu.
Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại
đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin
(chất có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tưới
máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin
nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư
đặc biệt ở những người bị bệnh thận hoặc suy tim mạn tính. Với những người
bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp
và suy tim cấp.
Diclofenac lần đầu tiên có mặt tại thị trường Anh năm 1976, sau 12 năm
được nghiên cứu bởi tập đoàn dược phẩm Smith, Kline và French ( SK&F nay
là GlaxoSmithKline). Các nhà khoa học của SK&F đã nhận thấy vai trò kích
thích tiết acid dạ dày của histamin trong cơ thể từ năm 1964, nhưng ở thời điểm
đó các kháng histamin cổ điển không có tác dụng để ức chế hoạt động này. Và
kể từ khi họ chứng minh được sự hiện diện của receptor histamin H2 ở tế bào
thành dạ dày, mục đích duy nhất của nhóm nghiên cứu là tìm ra một chất có
khả năng ức chế cạnh tranh với histamin , gắn vào receptor histamin H2- nhưng
lại ức chế tiết acid. Chất đó chính là các chất kháng histamin H2..
Vào tháng 11 năm 1976, diclofenac sau khi trải qua hàng loạt các thử
nghiệm với kết quả thành công mỹ mãn, đã được ra mắt trên thị trường với tên

1

Tagamet. Vào ngày 01 tháng 01 năm 1979, diclofenac chính thức được Cục
quản lí dược và mỹ phẩm Hoa Kỳ kê đơn. Kể từ đó đến nay, diclofenac trở
thành một trong những thuốc được kê đơn phổ biến nhất.
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những triệu
chứng bất thường do thuốc gây nên như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà,
lú lẫn, trầm cảm, kích động... hay chứng to vú ở đàn ông, bất lực ở đàn ông,
tăng men gan. Viêm gan mạn tính, vàng da, rối loạn chức năng gan, viêm tụy
có thể xảy ra. Các phản ứng này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc... Đây là những
tác dụng phụ của thuốc, những triệu chứng này có thể gặp ngay cả ở liều điều
trị. Ngoài ra, thuốc này còn gây tương tác với rất nhiều thuốc khác.
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng sinh học (CVK) có cấu trúc và
đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose
thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề
chắc, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và độ tinh khiết cao[3,7,9].
Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng
làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi
trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt
trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế
da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các
bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người[7,9].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.

2


Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn để khắc phục được những tác dụng phụ của thuốc
Diclofenac trong điều trị giảm đau và chống viêm, chúng tôi đã chọn nghiên
cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”
2. Mục đích nghiên cứu
- Chế tạo được màng CVK từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi
trường nước dừa già.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Diclofenac từ màng CVK đã
nạp thuốc trong môi trường nước dừa già có các pH khác nhau.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc Diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK,
định hướng việc khắc phục nhược điểm của thuốc.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum
+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng để nghiên cứu khả năng giải
phóng của thuốc Diclofenac
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

3


5. Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị màng CVK.
- Phương pháp dựng đường chuẩn.
- Chuẩn bị bộ đệm.
- Chế tạo màng CVK nạp Diclofenac.
- Xác định lượng Diclofenac nạp vào màng CVK.
- Xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK đã nạp thuốc
Diclofenac.
- Phương pháp xử lý thống kê.

4


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu màng CVK trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới màng Bacterial cellulose hay màng Cellulose vi khuẩn
(CVK) đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau.
Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá
trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho
tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad (1998) dùng màng như là một chất để
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [14]. Đặc biệt trong
lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da
trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các
bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người [14]. Tính đến cuối năm

2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng CVK trong vận tải và phân
phối thuốc đã được báo cáo [12], trong đó có 9 nghiên cứu với màng CVK
tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng CVK và 7 với các vật liệu
Nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành
nghiên cứu. Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm
hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho
thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông
thường [14]. Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô
CVK thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân
kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc
trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác
dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của Staphylococcus
aureus (S.aureus) và Bacillus subtilis (B.subtilis).

5


Sợi CVK với các hạt Nano bạc đã sản xuất thành công lên đến 99,99% hoạt
tính kháng khuẩn chống lại E.coli và S.aureus. Nghiên cứu khác cho thấy việc
sử dụng Nanocomposites bạc với CVK đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao .
Các S-enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao huyết áp, có
được giải phóng từ một lớp composite của CVK với methacrylate, và đã thử
nghiệm invivo cho kết quả tốt [13,16]. Một miếng dán có thể giải phóng thuốc
enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một bể chứa gel và
polyme in dấu phân tử (MIP) màng. Nghiên cứu về gel miếng dán gồm của
chitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8 giờ, Cmax của S-propranolol
đã đạt được (8,0 ± 1,0 ng/ml) từ một hồ chứa 1,5 mg propranolol racemic
[16]. Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng CVK qua da đã được
nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và
không được chiếu xạ. CVK không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh

hơn so với ảnh hưởng của CVK chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy
màng CVK không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho
giải phóng thuốc qua màng [12].
Việc sử dụng màng CVK cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể
là lidocaine; ibuprophen; caffeine; diclofenac và sulfadiazine bạc cho kết quả
tích cực. Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng
CVK giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da. Tất cả
5 loại thuốc trên đã được thử nghiệm invitro cho thẩm thấu qua da [16] và so
sánh với cách thức thông thường. Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ưu mỡ
thấm qua màng CVK cao hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các
giải pháp PEG400; lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn
ibuprofen, do màng CVK có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã
làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng

6


thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc
điều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn.
Luan J. et al. (2012) [14], đã nghiên cứu màng CVK cho băng vết
thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều
trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Nó đã được chứng minh rằng sau khi sử
dụng màng CVK ngâm tẩm bạc sulfadiazine, hoạt động kháng khuẩn đối với
P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi thông
thường.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết
quả ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật-Vi sinh

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng
A.xylinum có khả năng tạo màng CVK và những nghiên cứu bước đầu cho
thấy màng CVK từ chủng A. xylinum có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho
thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người [6]. Tại Đại học Y dược Thành
phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm nghiên cứu đã thành công
với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter
xylinum”.
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [6] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và
thu màng CVK từ A. xylinum đạt hiệu quả cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu
trên cũng đã tiến hành thử nghiệm invivo trong ứng dụng màng CVK điều trị
bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất
kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh
mô tốt hơn hẳn. Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc

7


Diclofenac trong việc liên quan đến sức khỏe con người, nâng cao tối đa hiệu
quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí.
Màng CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ
kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo
hệ thống vận tải và phân phối thuốc Diclofenac
1.2. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.2.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
1.2.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae.
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:[5]
+ Lớp: Schizomycetes

+ Bộ: Pseudomonadales
+ Bộ phụ: Pseudomonadieae
+ Họ: Pseudomonadaceae
1.2.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6-0,8µm, dài khoảng 2-3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già
hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài
hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ
thu được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5mm, tròn, nhày,
rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục,
có màu cafe sữa rồi khô dần.

8


1.2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát
triển từ 25 – 300C. Ở nhiệt độ 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ
thích hợp nhất là 250C . Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3- 8, pH tối
ưu để sản xuất cellulose là 5,5 .
A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và
cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.
Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ
sung acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48h

lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.2.2. Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum
1.2.2.1. Cấu trúc
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer β-1,4 glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng
khác nhau về cấu trúc đại thể.
Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3-8nm.
1.2.2.2. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 – 0,5nm. Sản phẩm này có những

9


tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt
là khả năng cản khuẩn. Với các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học.
1.2.2.3. Chức năng sinh lý của màng CVK
Quá trình lên men:[5]
- Pha sinh trưởng
- Pha tích tụ sản phẩm
- Quá trình tổng hợp cellulose của A.xylinum
1.2.2.4. Môi trường nuôi cấy A.xylinum
Môi trường nuôi cấy A.xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng[9].
Nhu cầu sử dụng đường của A.xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp CV nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử
dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường,
nước dừa già, nước mía...để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.xylinum. Trong
đó nước dừa già được xem là môi trường điển hình trong nuôi cấy A.
xylinum[9].
1.2.3. Giới thiệu tổng quan về thuốc Diclofenac
1.2.3.1. Công thức [2]
- Tên IUPAC: - 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
- -Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
- Phân tử khối: 296,148 g / mol.
1.2.3.2. Nguồn gốc và tính chất
- Nguồn gốc: thảo dược.

10


1.2.3.3. Động học giải phóng và tác dụng
- Động học giải phóng;
Diclofenac được hấp thụ dễ dàng qua đường tiêu hóa sau khi uống.
Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với
protein huyết tương, chủ yếu với albumin. Khoảng 50% liều uống được chuyển
hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh
khả dung trong mũi tiêm tĩnh mạch. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương
xuất hiện 2 giờ sau khi uống, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch xuất hiện mức
tối đa khoảng 4-6 giờ sau khi uống. Tác dụng của thuốc xuất hiện sau khi tiêm
bắp từ 20-30 phút, 30-60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng và 60-120 phút
sau khi uống[2].

Nửa đời trong huyết tương khoảng 1-2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao
hoạt dịch là 3-6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các
chất chuyển hóa còn một phần dưới dạng hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc
nguyên vẹn, phần còn lại thải qua mật và phân. Hấp thụ, chuyển hóa và đào
thải hình như không phụ thuộc vào tuổi. Nếu liều lượng và khoảng cách giữa
các lần dung thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy ngay
cả khi chức năng thận và gan bị giảm.
- Cơ chế tác dụng của thuốc Diclofenac
Do công thức gần giống histamin nên các thuốc kháng H2-histamin tranh
chấp với histamin tại receptor H2 ở tế bào thành dạ dày, làm ngăn cản tiết dịch
vị bởi các nguyên nhân gây tăng tiết histamin ở dạ dày. Thuốc làm giảm tiết cả
số lượng và nồng độ HCl của dịch vị.
1.2.3.4. Công dụng của thuốc
Diclofenac được dùng để giảm đau, sưng (viêm), và cứng khớp do viêm
khớp. Diclofenac là một thuốc kháng viêm không steroid (NSAID).
Nếu bạn đang điều trị các căn bệnh mãn tính như viêm khớp, hãy hỏi bác sĩ

11


về phương pháp điều trị không dùng thuốc hoặc sử dụng các loại thuốc khác.
Công dụng khác: Diclofenac cũng có thể được sử dụng để điều trị các tình
trạng đau khác (chẳng hạn như đau răng, đau nhức cơ bắp, đau sau phẫu thuật
hoặc sau khi sinh.
1.2.3.5. Tác dụng không mong muốn của thuốc
(5 - 15% người bệnh dùng diclofenac có tác dụng phụ ở bộ máy tiêu
hóa).
Chú ý: Trong số các thuốc chống viêm không steroid, diclofenac độc
hơn ibuprofen và ibuprofen là thuốc ít độc nhất nhưng vẫn hiệu quả.
Thường gặp, ADR > 1/100

Toàn thân: Nhức đầu, bồn chồn.
Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng,
chán ăn, khó tiêu.
Gan: Tăng các transaminase.
Tai: Ù tai.
Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100
Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở người bệnh hen),
choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay.
Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển, nôn
máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ (khi đặt thuốc vào trực tràng).
Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu, dễ
bị kích thích.
Da: Mề đay.
Hô hấp: Co thắt phế quản.
Mắt: Nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt, nhìn đôi.
Hiếm gặp, ADR <1/1000
Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc.

12


Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn.
Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng bạch
cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu.
Gan: Rối loạn co bóp túi mật, test chức năng gan bất thường, nhiễm độc
gan (vàng da, viêm gan).
Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội
chứng thận hư.

13

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu – hóa chất
Nguyên liệu: Nước dừa già.
Hóa chất: Diclofenac dạng tinh khiết (98%).
Pepton, đường glucose. (NH4)2SO4, KH2 PO4.
Acid boric, NaOH, HCl.
Nước cất, cồn 96◦.
CH3COOH, H3PO4.
2.2. Thiết bị, dụng cụ
2.2.1. Thiết bị
Cân phân tích CP 224S.
Cân kĩ thuật TE 412.
Máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAM.
Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
Tủ ấm (Biner - Đức).
Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
Bể rung siêu âm S60/H Bể ổn nhiệt 1013.
Tủ sấy, máy ép màng.
2.2.2. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, cốc đong 500ml, 1000ml, pipet,
bình định mức, bình tam giác, bình xịt cồn, kéo, giấy bạc, giấy thấm, giấy

14


quỳ tím và một số dụng cụ khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK
A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường cải biến từ môi trường chuẩn
Hestrin - Schramm và được trình bày ở bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 2.1. Thành phần môi trường tạo màng Cenllulose vi khuẩn
Glucose 30g

Nước dừa già 1000ml

KH2PO4 0,3g

Acid axetic 2%

(NH4)2SO4 0,5g

Dịch giống A.xylinum 10%

Pepton 4g
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1 chưa có acid acetic và dịch
giống.
- Bước 2: Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trường cho đến khi bão
hòa.
- Bước 3: Hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút để diệt khuẩn và nấm
mốc.
- Bước 4: Lấy môi trường ra đặt vào buồng cấy vô trùng dưới đèn tím
trong 30 phút và để nguội.

- Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid axetic lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 6: Cuối cùng, dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ và ủ tĩnh trong
khoảng 6 - 14 ngày ở 26°C.
● Quá trình nuôi cấy tĩnh
Để các lọ chứa môi trường trong phòng sạch, thoáng khí có nhiệt độ, độ
ẩm ổn định và không di chuyển dung dịch trong vòng 6 – 14 ngày để dung
dịch lên màng.

15


● Thu màng Cellulose vi khuẩn
Sau 6 – 14 ngày nuôi cấy tĩnh tiến hành thu màng Cellulose vi khuẩn,
màng thu được là màng thô chưa qua tinh chế.
● Xử lý màng
Sau khi ủ tĩnh 6 - 14 ngày ở nhiệt độ 26℃ màng Cellulose vi khuẩn
được thu tinh chế bằng cách rửa sạch nhiều lần ngâm trong NaOH 3%, HCl
3% và nước cất.
Màng Cellulose vi khuẩn thô được xử lý theo sơ đồ hình 2.1
Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước

48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh chế

Hình 2.1: Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men

16