Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi và cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo (abelmoschus sagittifolius kurz var septentrionalis gagnep)

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được dùng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin được trích dẫn trong khóa luận đều được
chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn.
Hà Nội, ngày......tháng......năm 2015
Sinh viên

Dương Thị Thanh Huyền

i


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, được sự
quan tâm, dạy dỗ chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí
nghiệm cùng sự nỗ lực cố gắng của bản thân em đã hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp của mình.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường,
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyến
đạt cho em những kiến thức, kỹ năng vô cùng quan trọng và quý báu trong suốt thời
gian học tập, rèn luyện tai Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo PGS. TS. Nguyễn Thị
Phương Thảo – Trưởng Khoa Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn em trong
suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Ninh Thị Thảo,
giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật đã dành nhiều thời gian, tâm huyết
hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình thực tập.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các giảng viên bộ môn công nghệ sinh học Thực
vật, ThS. Phạm Thị Thu Hằng, cán bộ tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học
Thực vật cùng các chị kĩ thuật viên trên phòng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho em trong suốt thời gian thực tập. Cám ơn bạn bè, tập thể lớp K56-CNSHA đã luôn
động viên và tạo động lực để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, em xin gửi lời
cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân đã nuôi nấng, yêu thương, động viên
và tạo động lực cho em suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2015
Sinh viên
Dương Thị Thanh Huyền

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi và cảm ứng tạo rễ tơ in vitro
cây sâm báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var. septentrionalis Gagnep)” được
tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến cải thiện chất lượng chồi
in vitro cây sâm báo và cảm ứng thành công rễ tơ cây sâm báo làm tiền đề cho việc
xây dựng quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp phục vụ ngành công nghệ dược
liệu ở Việt Nam
Với mục đích thứ nhất là cải thiện chất lượng chồi in vitro cây sâm báo,
nghiên cứu đã thu được những kết quả ban đầu như sau: Nồng độ đường
thích hợp nhất cho sự phát triển chồi in vitro cây sâm báo là 50 g/l, nồng độ IBA
vàGA3 tốt nhất dùng để cải thiện chất lượng chồi in vitro cây sâm báo lần lượt là 0,5
mg/l và 2,0 mg/l. Môi trường lỏng là môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển
của chồi in vitro cây sâm báo. Môi trường có bổ sung tổ hợp auxin/BA không có tác
dụng trong việc cải thiện chất lượng chồi in vitro cây sâm báo.
Mục đích thứ hai của để tài là cảm ứng tạo rễ tơ cây sâm báo nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes, nghiên cứu đã thu được một số kết quả nhất định sau:
Nồng độ dịch khẩn ở giá trị OD 600 = 0,2 là thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo rễ tơ

in vitro cây sâm báo. Vật liệu lây nhiễm cho hiệu quả cảm ứng tạo rễ tơ tốt nhất là
mô lá in vitro cây sâm báo. Phương pháp lây nhiễm mẫu được tạo vết thương bởi
dao cấy đã nhúng dịch khuẩn là phương pháp thích hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ
cây sâm báo

iii


MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Thành phần phản ứng PCR.......................Error: Reference source not found
Bảng 2: Chu kì nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen rolA của rễ tơ......Error: Reference
source not found
Bảng 3: Chu kì nhiệt trong phản ứng PCR kiểm tra gen virD của Agrobacterium
rhizogenes..............................................................Error: Reference source not found
Bảng 4: Các mồi đặc trưng cho gene rolA và virD sử dụng trong phản ứng PCR.....Error:
Reference source not found
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến chất lượng chồi in vitro cây sâm báo
sau 30 ngày nuôi cấy.............................................Error: Reference source not found
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến chất lượng chồi in vitro cây sâm báo
sau 30 ngày nuôi cấy.............................................Error: Reference source not found
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến chất lượng chồi in vitro cây sâm báo
sau 30 ngày nuôi cấy.............................................Error: Reference source not found
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường + 0,5 mg/l IBA đến chất lượng chồi
in vitro cây sâm báo sau 30 ngày nuôi cấy.............Error: Reference source not found
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tổ hợp auxin/BA đến chất lượng chồi in vitro cây sâm báo
sau 30 ngày nuôi cấy.............................................Error: Reference source not found
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đến khả
năng cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo..........Error: Reference source not found

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của loại mô lây nhiễm đến khả năng cảm ứng tạo rễ tơ in
vitro cây sâm báo sau 4 tuần nuôi cấy....................Error: Reference source not found
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến khả năng cảm ứng tạo rễ tơ
in vitro cây sâm báo sau 4 tuần nuôi cấy................Error: Reference source not found

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1: Chồi in vitro sâm báo trên các môi trường có nồng độ đường khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy.....................................Error: Reference source not found
Hình 4.2 : Chồi sâm báo trên các môi trường chứa nồng độ IBA khác nhau sau 30
ngày nuôi cấy.........................................................Error: Reference source not found
Hình 4.3: Chồi sâm báo trên các môi trường chứa nồng độ GA 3 khác nhau sau 30
ngày nuôi cấy.........................................................Error: Reference source not found
Hình 4.4: Chồi cây sâm báo trên các trạng thái môi trường khác nhau kết hợp 0,5 mg/l IBA
sau 30 ngày nuôi cấy.............................................Error: Reference source not found
Hình 4.5: Chồi sâm báo trên các môi trường chứa 0.5 mg/l các auxin khác nhau + 2
mg/l IBA sau 30 ngày nuôi cấy..............................Error: Reference source not found
Hình 4.6: Mẫu mô lá sâm báo cảm ứng tạo rễ tại các nồng độ dịch khuẩn khác nhau
sau 4 tuần nuôi cấy................................................Error: Reference source not found
Hình 4.7: Cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo trên các loại mô lây nhiễm (lá,
đoạn thân) khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy.............Error: Reference source not found
Hình 4.8: Mẫu mô lá sâm báo cảm ứng tạo rễ tơ bởi các phương pháp lây nhiễm
khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy...............................Error: Reference source not found

v


DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÍ HIỆU VIẾT TẮT

α – NAA

: Axit α – naphtyl axetic

BA

: 6 - Benzylaminopurine

CT

: Công thức

CV (%)

: Sai số thí nghiệm

đ/c

: Đối chứng

GA3

: Gibberellic acid

IAA

: Indole acetic acid

IBA

: Indole butyric acid

LSD0,05

: Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

MS

: Môi trường Murashige and Skoog

TB

: Trung bình

vi


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Cây sâm báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var. septentrionalis Gagnep) là
một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền. Sâm báo có vị ngọt nhạt, có chất
nhầy, tính bình, có tác dụng bổ mát, nhuận phế, dưỡng tâm, sinh tân dịch, sao với
gạo thì tính ấm bổ tỳ vị, giúp tiêu hoá, tăng thêm sức dẻo dai. Sâm báo được sử
dụng kết hợp với một số vị thuốc đông y khác để chữa một số bệnh của cơ thể như
bệnh về đường tiêu hóa (trẻ em gầy còm xanh xao, lỵ kéo dài, phân lỏng), bệnh phụ
nữ (rối loạn kinh nguyệt), bệnh nam giới (bổ thận, tráng dương)… Một số chất có
trong củ sâm báo như flavonoid có tác dụng chống viêm loét dạ dày, chống co thắt
túi mật, ống dẫn mật, có tác dụng chống độc giúp làm giảm tổn thương gan, bảo vệ
chức năng gan, chất coumarin trong rễ củ sâm báo cũng có nhiều tác dụng như
chống co thắt, làm giản nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, chống

đông máu, chống viêm,…
Tại Việt Nam, cây sâm báo chỉ được phát hiện mọc hoang nhiều ở vùng núi
thấp, vùng đồi núi trung du Thanh Hoá. Hiện nay, nguồn sâm báo cung cấp cho thị
trường chủ yếu được thu hái từ tự nhiên dẫn đến số lượng cây sâm báo tự nhiên
ngày càng giảm sút, số lượng cây giống quá ít. Trên nền tảng công nghệ nuôi cấy
mô tế bào thực vật và những nghiên cứu trên cây dược liệu như cây đan sâm, sâm
ngọc linh, sâm dây… Một số nghiên cứu trên cây sâm báo đã được tiến hành như
nghiên cứu của Nguyễn Thị Hạnh – năm 2013 và Nguyễn Thị Yến – năm 2014
thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học đã cho ra
một số kết quả tốt. Tuy nhiên còn một số vấn đề cần khắc phục như chất lượng chồi
kém, thường xuất hiện hiện tượng úa vàng lá, cây còi cọc.
Bên cạnh đó thì số lượng sâm báo cung cấp cho thị trường là rất hạn chế
trong khi đó giá trị và nhu cầu về sâm báo ngày càng tăng cao. Việc áp dụng công
nghệ sinh học vào sản xuất nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu sinh khối là rất cần
thiết. Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt trội như rễ phát triển
nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào các chất điều hóa tăng trưởng ngoại

1


sinh, bền vững về mặt di truyền và tổng hợp các hợp chất thứ cấp hàm lượng cao,
tạo sinh khối lớn, giúp hạ giá thành sản phẩm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của
con người là một giải pháp đầy hứa hẹn để khắc phục những khó khăn trước mắt.
Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết trên chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu cải thiện chất lượng chồi và cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo
(Abelmoschus sagittifolius Kurz var. septentrionalis Gagnep)”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
• Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến chất lượng chồi in
vitro cây sâm báo làm cơ sở hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây sâm báo
cho chất lượng cây giống tốt.

• Cảm ứng rễ tơ cây sâm báo bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes làm
tiền đề cho việc xây dựng quy trình sản xuất một số hợp chất thứ cấp phục vụ công
nghiệp dược liệu ở Việt Nam.
1.3. Yêu cầu
• Xác định môi trường thích hợp cho sự phát triển chồi in vitro cây Sâm Báo
• Cảm ứng tạo rễ tơ cây sâm báo
• Kiểm tra dòng rễ tơ sau chuyển gen bằng phương pháp PCR.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cây sâm báo
2.1.1. Vị trí phân loại, phân bố cây sâm báo:
Cây sâm báo có tên khoa học là Abelmoschus sagittifolius Kurz var.
septentrionalis Gagnep thuộc:
Họ: Malvaceae (Bông)
Chi : Hibiscus (Dâm Bụt)
Phân bố: Cây Sâm Báo (Abelmoschus sagittifolius Kurz var. septentrionalis
Gagnep) được phát hiện mọc hoang nhiều ở vùng núi thấp, vùng đồi núi trung du
Thanh Hoá, ở xã Cẩm Bình huyện Cẩm Thủy, trên núi Báo xã Vĩnh Hùng huyện
Vĩnh Lộc hay ở vườn quốc gia Bến En huyện Như Thanh, tỉnh Thanh Hóa (Viện
dược liệu trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội).
2.1.2. Đặc điểm thực vật học
Sâm báo là cây thân thảo, cao 30 - 50cm. Rễ củ hình trụ, đôi khi phân nhánh,
màu trắng đục. Thân hình trụ, có lông nhám. Lá mọc so le hình tam giác, dạng 3
thuỳ hoặc hình tim, dài 5 - 7cm, rộng 3 - 5cm, hai mặt có lông đơn và lông hình sao;
mép lá xẻ răng tù nông hoặc hơi lượn sóng; gân chính 3, gân phụ hình mạng lưới.
Cuống lá dài 2.5 - 4,0cm, có lông. Lá kèm hình chỉ, có lông. Hoa màu đỏ hoặc
vàng, mọc đơn độc ở ngọn hoặc kẽ lá, có nhiều lông. Đài hình mo có 5 rãnh nhỏ ở

đỉnh, sớm rụng; đài phụ gồm 10 cái dạng sợi, có lông, tồn tại cùng với quả. Cánh
hoa 5. dạng thìa hay trứng thuôn dài. Nhị nhiều dính với nhau thành cột, mang bao
phấn phú kín chỉ nhị. Bầu hình trứng hay hình thoi. Vòi nhuy có đầu xẻ thành 5 đầu
nhỏ, tròn, có chất dính. Quả nang, hình trứng nhọn có 5 gờ dọc, vỏ ngoài có nhiều
lông nhám khi chín tách thành 5 mành. Hạt nhiều, hình thận, màu nâu (Đào Thị Vui,
2006)
2.1.3. Đặc điểm vi học rễ củ cây sâm báo
• Đặc điểm vi phẫu rễ củ sâm báo:
Ngoài cùng là 2 – 3 lớp tế bào bần. Dưới lớp bần là lớp tế bào tầng phát
sinh bần lục bì và 3 – 4 lớp tế bào lục bì. Tiếp đến là mô mềm vỏ. Rải rác trong mô

3


mềm có các tinh thể calci oxalate hình cầu gai và các túi tiết chất nhầy. Các bó libegỗ cấp 2 là những bó chồng, gồm 6 – 7 bó chiếm toàn bộ phần trung trực của rễ.
Giữa các bó libe-gỗ là tia ruột. Bó gỗ cấp 1 không rõ (Đào Thị Vui, 2006)
• Đặc điểm bột rễ củ sâm báo:
Bột màu trắng ngà, mùi thơm nhẹ, vị nhạt. Soi dưới kính hiển vi thấy có rất
nhiều hạt tinh bột, hạt đơn, kép đôi, kép ba hoặc kép tư và có hình dạng khác nhau,
có rốn nhìn rõ nhưng không nhìn rõ vân. Sợi có thành mỏng, riêng lẻ hay xếp thành
bó. Mảnh mô mềm cấu tạo từ những thành mỏng có chứa hạt tinh bột, đôi khi có
các túi chứa chất nhầy. Rải rác có tế bào mô cứng. Mảnh mạch thường là mạch
điểm. Các tinh thể calci oxalate hình cầu gai. (Đào Thị Vui, 2006)
2.1.4. Giá trị dược liệu
Bộ phận dùng: Rễ, thu hái vào mùa thu, đông, cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy khô
Thành phần hóa học có trong rễ:
Rễ cây sâm báo được trồng ở Bạc Liêu đã được xác định có chứa các chất
phytosterol, coumarin, acid béo, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic. Hàm
lượng lipid có trong rễ là 3,96%. Lipid gồm acid myrisric, acid palmitic, acid
stearic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic. Hàm lượng protein toàn phần là

0,23g %, hàm lượng protide là 1,26g %. Các acid amin gồm 11 chất, trong đó có
histidin, arginin, threonin, alanin,prolin, tyrosin, valin, phenylalanin và leucin. Hàm
lượng tinh bột là 15,14% và chất nhầy là 26,7%. Chất nhầy là D-glucose và Lrhamnose. Ngoài ra, còn có 13 nguyên tố : Na, Ca, Mg, Al, So Fe, V, Mn, Ti, Mo,
Cu, Zr và P.
Tác dụng dược lý:
Bằng đường uống và tiêm phúc mạc, cao cồn Sâm Báo có tác dụng gây giảm
hoạt động tự nhiên của chuột nhắt trắng, đối kháng với tác dụng tăng hoạt động của
amphetamin, kéo dài thời gian gây ngủ bởi thuốc ngủ barbituric, và chống co giật
gây bởi pentetrazol. Điều đó chứng tỏ Sâm Báo có tác dụng ức chế thần kinh trung
ương, an thần.

4


Tính vị, công năng:
Rễ sâm báo có vị ngọt, hơi nhớt, tính bình, vào 2 kinh: tỳ, phế, có tác dụng
bổ khí, ích huyết, chỉ khát, sinh tân dịch; sao với gạo thì tính ấm, bổ tỳ vị, giúp tiêu
hoá, thêm sức mạnh.
Rễ sâm báo chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, mất ngủ, đau lưng, đau mình,
các chứng ho sốt nóng, trong người khô, táo bón, khát nước, gầy còm. Có khi được
dùng làm thuốc thông tiểu tiện, điều kinh, chữa bệnh phổi và bạch đới.
Liều dùng: ngày 16 – 20 g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột.
Kiêng kỵ: thể trạng hư hàn phải tẩm nước gừng, sao kỹ.
2.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ
Cây sâm báo có khả năng cho năng suất dược liệu cao. Giá 1kg sâm báo tươi
khoảng 40.000 đồng. Năng suất sâm báo thu được khoảng 1 – 2 tấn/ha. Tương
đương 40 – 80 triệu đồng cho 1ha. Hiện nay, sâm báo chỉ được tiêu thụ nhỏ lẻ trong
tỉnh Thanh Hóa
Năm 2006, Viện Dược liệu Tôkai – Nhật Bản đã chính thức đặt hàng mua
của Viện Dược liệu Việt Nam mỗi năm 20 – 30 tấn sâm báo và số lượng này có thể

tăng qua các năm. (Tô Hà, năm 2014, Cổng thông tin văn hóa huyện Vĩnh Lộc).
2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân nhanh chồi và chất lượng chồi in vitro
2.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng chồi in vitro và một số nghiên cứu
cải thiện chất lượng chồi in vitro.
Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến chất lượng chồi in vitro
Theo nguyên lý chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi sử dụng phối hợp
cytokinin và auxin với nồng độ và tỷ lệ thích hợp không những nâng cao hệ số nhân
chồi mà còn có tác dụng tốt đến chất lượng của chồi in vitro. Nhiều kết quả nghiên cứu
cũng đã khẳng định hiệu quả phối hợp của auxin và cytokinin đến hệ số nhân nhanh
chồi và chất lượng chồi trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau. Trên cây địa liền
(Kaempferia galanga), Parida và cộng sự (2010) đã chỉ ra rằng môi trường MS có bổ
sung 1 mg/l BA và 0,5 mg/l IAA cho hệ số nhân nhanh chồi và chất lượng chồi cao
nhất. Nghiên cứu nhân của giống in vitro Larraburu và cộng sự (2012) trên cây

5


Handroanthus impetiginosus cũng cho thấy môi trường có bổ sung BA và IBA với
nồng độ lần lượt là 20 μM và 1 μM có hệ số nhân, chiều cao chồi lớn nhất.
Trong nghiên cứu nhân giống in vitro cây ba kích của Hoàng Thị Thế và
cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng khi bổ sung IBA ở nồng độ thấp (0,2 mg/l) kết hợp
với 3,0 mg/l BA, hệ số nhân chồi cao hơn so với môi trường chỉ chứa 3,0 mg/l BA,
chiều cao trung bình và chất lượng chồi cũng cao hơn. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ
IBA (0,4-1,0 mg/l), hệ số nhân chồi giảm, các chồi có xu hướng tạo rễ. Khi bổ sung
IBA ở nồng độ cao (1,0 mg/l), hệ số nhân chồi giảm mạnh, chất lượng chồi kém,
chồi mảnh, ngắn, lá vàng. Hệ số nhân chồi ba kích đạt cao nhất sau 45 ngày nuôi
cấy trên môi trường chứa 3,0 mg/l BA và0,2 mg/l IBA, các chồi sinh trưởng phát
triển tốt. Ngoài ra nhằm nâng cao chất lượng chồi ba kích, 2 loại vitamin, acid
ascorbic và riboflavin, đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Kết quả cho thấy,
chiều cao và chất lượng chồi ba kích được cải thiện rõ rệt, đặc biệt là khi bổ sung 10

mg/l riboflavin.
Nghiên cứu của Trần Thị Lệ và Trần Thị Triệu Hà thuộc Trường Đại học
Nông Lâm, Đại học Huế về nhân giống in vitro một số giống khoai sọ đã chỉ ra rằng
vai trò của chất kích thích sinh trưởng rất quan trọng, đặc biệt là tỷ lệ giữa hai nhóm
chất kích thích sinh trưởng auxin và cytokinin. Sự kết hợp giữa hai nhóm chất này ở
nồng độ thích hợp có tác dụng tốt trong việc nhân nhanh chồi và tăng chất lượng
chồi. Kết quả là sau 8 tuần nuôi cấy môi trường có bổ sung 3 mg/l BA và 0,7 mg/l
NAA cho số chồi và chất lượng chồi tốt nhất đối với khoai sọ Hà Tĩnh, còn môi
trường có bổ sung 3 mg/l BA và 0,5 mg/l α-NAA cho số chồi và chất lượng chồi tốt
nhất đối với khoai sọ Tây Nguyên
Ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ đến chất lượng chồi in vitro
Sự bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc
đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt là những cây sinh trưởng
chậm và khó nhân giống đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và cho kết quả
rất khả quan. Các nghiên cứu của Pierik và cộng sự. (1988), Li và cộng sự (2001),
Chyuam và cộng sự (2010), Songjun và cộng sự (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ
sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy hệ số nhân chồi, chất lượng chồi

6


của một số loài lan hài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này. Các
hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước dừa, dịch
chiết chuối, cà rốt, khoai tây, peptone và triptone, đây là những nhân tố đóng vai trò
không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Ngày càng nhiều
các hợp chất hữu cơ khác nhau được phát hiện và bổ sung vào môi trường nuôi cấy
in vitro như mầm ngô, mầm đậu, dịch chiết cà chua, để nâng cao hiệu quả nhân
giống cũng như chất lượng chồi
Cũng trong nghiên cứu về nhân giống in vitro một số giống khoai sọ của
Trần Thị Lệ và Trần Thị Triệu Hà đã cho thấy ảnh hưởng của nước dừa đến khả

năng nhân nhanh của cụm chồi cũng như chất lượng chồi. Kết quả cho thấy, các môi
trường có bổ sung nước dừa đều tăng số chồi và tăng chất lượng của chồi. Chồi sinh
trưởng tốt, to, xanh, và khỏe. Ở tất cả các công thức có bổ sung nước dừa, số chồi
đều tăng cao và đạt giá trị cao nhất ở 10% nước dừa. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng
nước dừa lên 15 - 20% thì số chồi và chất lượng chồi giảm.
Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển
Một trong những ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào là có thể cung cấp một
lượng lớn cây giống đồng đều. Do đó, phải cấy chuyển nhiều lần để tạo ra một số
lượng lớn cây giống. Tuy nhiên, số lần cấy chuyển có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
của mô nuôi cấy. Nếu số lần cấy chuyển quá lớn thì sẽ dẫn đến hiện tượng cây bị
thoái hóa và sinh trưởng kém, có thể mất đi những đặc tính ban đầu của cây mẹ. Vì
vậy, ngoài mục đích là xác định phương thức nhân nhanh bằng môi trường dinh
dưỡng, chúng ta cần phải xác định số lần cấy chuyển hợp lý. Nghiên cứu về nhân
giống in vitro một số giống khoai sọ do Trần Thị Lệ và Trần Thị Triệu Hà tiến hành
đã cho thấy ảnh hưởng của số lần cấy chuyển đến khả năng nhân nhanh và chất
lượng chồi trên hai giống khoai sọ Hà Tĩnh và Tây Nguyên. Kết quả nhận thấy khi
số lần cấy chuyển từ 6 đến 11 lần thì số chồi giảm mạnh và khi số lần cấy chuyển
cao, đặc biệt khi lớn hơn 5 lần, thì chất lượng chồi giảm. Chồi nhỏ, lá nhỏ, không có
màu xanh đậm và xoăn lại. Một số chồi không chắc và có hiện tượng xốp.

7


2.2.2. Một số nghiên cứu trên cây sâm báo
Năm 2013, Nguyễn Thị Hạnh và cộng sự đã tiến hành nhân nhanh in vitro
cây Sâm Báo. Với vật liệu ban đầu là hạt và đoạn thân chứa mắt ngủ. Hạt của cây
được khử trùng cồn 70º, thời gian khử trùng là 10 phút với tỷ lệ mẫu sạch là 94,02%
và tỷ lệ nảy mầm là 8,33%. Đoạn thân chứa mắt ngủ của cây Sâm Báo dược khử
trùng bằng HgCl2 0,1% mang lại hiệu quả khử trùng tốt ở thời gian khử trùng 10
phút với tỷ lệ mẫu sạch là 73,33% và tỷ lệ mẫu sống là 83,33%. Hệ số nhân tính

theo chồi /mẫu đạt cao nhất (3,5 lần) sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/l BA và 10% nước dừa. Hệ số nhân cao nhất tính theo cắt đoạn đạt cao
nhất (4,8 lần) sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l kinetin và
15% nước dừa. Thử nghiệm tạo rễ in vitro cho chồi Sâm Báo trên môi trường MS
bổ sung 0,5 mg/l IBA đạt tỷ lệ ra rễ 100%, số rễ trung bình đạt 2,9 rễ/chồi
Năm 2014, Nguyễn Thị Yến và cộng sự đã tiến hành đề tài “Hoàn thiện quy
trình nhân nhanh in vitro cây Sâm Báo” với vật liệu ban đầu là cây Sâm Báo hoa đỏ
được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ đã cho ra một số
kết quả: trong nghiên cứu khắc phục hiện tượng vàng úa của chồi cây Sâm Báo thu
được công thức tốt nhất là công thức MS có bổ sung 0,5 mg/l BA, 10% nước dừa và
0,2 mg/l AgNO3 hiện tượng vàng úa xảy ra sau 35 ngày. Đồng thời ở công thức này
hệ số nhân nhanh theo chồi cao nhất là 4,31 lần. Hệ số nhân nhanh theo đoạn thân
và chiều cao tốt nhất thu được ở cùng công thức MS có bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5
mg/l α-NAA với hệ số nhân nhanh theo cắt đoạn là 5,58 lần và chiều cao 5,74 cm.
Nghiên cứu ra rễ cho công thức ra rễ tối ưu là môi trường MS có bổ sung 0,75 mg/l
IBA với 4,0 rễ/chồi. Tuy nhiên đây không phải là công thức cho chất lượng rễ tốt
nhất, việc bổ sung α-NAA nhận thấy rễ lớn hơn và nhiều lông hút hơn
2.3.Cảm ứng tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.3.1. Rễ tơ và cơ sở hình thành rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Ở đa số các họ thực vật, rễ là nơi tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa
thứ cấp chính bao gồm các alkaloid, polyacetylen, sesquiterpen và napthoquinon.
Những hợp chất này có thể được tổng hợp theo cách tương tự trong rễ tơ. Rễ tơ là

8


một bệnh ở thực vật gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes, một loại vi khuẩn đất gram âm, với tế bào vật chủ.
Giống như vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid Ti, A. rhizogenes mang
plasmid Ri (root-inducing) được xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào

thực vật bị xâm nhiễm. Khi bị tổn thương, tế bào thực vật tiết ra các polyphenol hấp
dẫn các vi khuẩn, tại đây chúng chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) từ
plasmid Ri vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung, cơ chế quá trình xâm nhiễm
và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai vi
khuẩn này được chứng minh là tương tự nhau.
Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A. tumefaciens do gen mã hóa
sinh tổng hợp auxin qui định, trong khi đó, các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi
khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật.
Plasmid Ri là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ 200800 kb gồm 2 vùng chính là T-DNA và vir (virulence). T-DNA ở plasmid Ri của
nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng biên trái TL-DNA và biên phải TRDNA. Hai vùng này đều có kích thước khoảng 15-20 kb và được xen kẽ bởi 1 đoạn
DNA, đoạn này không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. TR-DNA chỉ
được tìm thấy ở plasmid Ri của các chủng thuộc nhóm agropine, vùng này mang
các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin và opine (aux1, aux2, rolB TR, mas1, mas2 và
ags). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được các gen aux không giữ vai trò quan
trọng trong quá trình cảm ứng sản sinh rễ tơ mà chỉ đóng vai trò bổ trợ cho quá trình
này. Nghiên cứu của Vilaine và cộng sự (1987) cho thấy, sự biểu hiện của các gen
nằm trên T-DNA vùng biên phải có khả năng cảm ứng hình thành kiểu hình rễ tơ ở
một số thực vật, tuy nhiên hình thái rễ tơ là không điển hình và tốc độ sinh trưởng
của rễ không mạnh như khi biểu hiện cả vùng biên trái và vùng biên phải. Điều này
cho thấy, T-DNA vùng biên trái là cần thiết để mở rộng đối tượng vật chủ ở các
chủng A. rhizogenes nhóm agropine .
Vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs), trong đó các gen được
nghiên cứu có khả năng gây bệnh bao gồm 4 locus 10, 11, 12 và 15 tương ứng với
các gen rolA, B, C và D (root locus) và các ORFs 8, 13 và 14. Plasmid Ri của các

9


chủng A. rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa
vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm

agropine nhưng khuyết gen rolD. Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan
trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba
gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm.
Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so
với rễ bình thường. Có rất nhiều nghiên cứu về vai trò ảnh hưởng của các gen rol
lên quá trình cảm ứng hình thành rễ tơ ở thực vật thông qua việc chuyển từng gen
rol hay tổ hợp các gen rol vào các đối tượng thực vật khác nhau.
Những nghiên cứu này đã cho thấy các gen rol tương tác hỗ trợ lẫn nhau, tuy nhiên,
rolB đóng vai trò trung tâm và quan trọng hơn cả, trong khi rolA và rolC hoạt động bổ trợ
thúc đẩy sự hình thành và phát triển của rễ tơ. Khi rolB bị bất hoạt, hoạt động của các gen
còn lại không tạo được kiểu hình rễ tơ. Trái lại, ở rất nhiều loài thực vật, chỉ riêng sự biểu
hiện của rolB đã đủ cảm ứng sản sinh ra rễ. Loại rễ tơ này cũng có khả năng phát triển
nhanh, phân nhánh nhiều và không hướng đất. Mặc dù vậy, một số phân tích cho thấy có sự
khác nhau về vai trò của các gen rol giữa một số loài thực vật, phần lớn phụ thuộc vào sự
cân bằng hormon cần thiết cho quá trình tái sinh.
Chuyển gen thông qua A. rhizogenes từ lâu đã được coi là phương thức biến đổi hệ
gen thực vật. Sự có mặt và hoạt động của các gen vi khuẩn trong mô thực vật chuyển gen
có khả năng cảm ứng hình thành rễ tơ ở nhiều loài thực vật khác nhau. Phần lớn các
nghiên cứu chuyển gen nhờ A. rhizogenes chỉ áp dụng trên cây cảnh và chuyển gen tạo rễ
tơ vào một số loài thực vật với mục đích sản xuất hợp chất thứ cấp, trong đó có một số cây
dược liệu quan trọng. Gần đây, xu hướng sử dụng hệ thống nuôi cấy rễ tơ để sản xuất các
dược phẩm sinh học tái tổ hợp bắt đầu được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng.
2.3.2. Các nghiên cứu về chuyển gen tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes
Các loài dược liệu quý hiếm thường có thời gian sinh trưởng kéo dài ,

khả

năng tích lũy sinh khối chậm. Vì vậy việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ các loài
thực vật được nuôi trồng bằng các phương pháp nông nghiệp truyền thống là rất tốn

thời gian và nguyên liệu. Ngoài ra việc sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng phương

10


pháp này còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác như thời tiết, sâu bệnh…Ngày
nay nhu cầu của con người đối với việc sử dụng dược liệu ngày càng cao vì vậy
việc nâng cao các hoạt tính sinh học cũng như chất lượng của các loại thảo dược
đang là vấn đề được quan tâm. Vậy làm sao để khắc phục những vấn đề trên để có
thể tạo ra một lượng lớn các loài dược liệu có chất lượng? Đây chính là một trong
nhiều hướng nghiên cứu của nền công nghệ sinh học hiện đại: Tạo và nhân nuôi
sinh khối rễ tơ làm tiền đề cho việc xây dựng các quy trình sản xuất các hợp chất
thứ cấp phục vụ nghành công nghiệp dược liệu đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của
con người.
Đã có rất nhiều nghiên cứu về chuyển gen tạo rễ tơ trên thực vật nhờ vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Hu và Alfermann (1993) đã tiến hành tạo rễ tơ
cây đan sâm bằng cách lây nhiễm các bộ phận của cây được nuôi cấy trong điều
kiên vô trùng với các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes khác nhau. Nghiên
cứu này đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn khác nhau có ảnh hưởng đến khả năng
cảm ứng tạo rễ tơ từ lá cây đan sâm, chủng vi khuẩn LBA 9402 có mang plasmid
pRi 1855 cảm ứng tạo rễ tơ tốt nhất. Nghiên cứu cũng cho thấy acetosyringone
(20µM) giúp làm tăng hiệu quả chuyển gen, môi trường không có hormone sinh
trưởng, ammonium nitrat và bổ sung 3% sucrose vào ngày nuôi cấy thứ 12 có ảnh
gưởng tích cực đến sự sinh trưởng và tích lũy diterpenes của rễ tơ.
Gupta và cộng sự (2011) sử dụng mô lá cây đan sâm làm vật liệu để tiến
hành chuyển gen, lá được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,25 cm² sau đó
dược nuôi cấy trên môi trường MS 1 ngày trước khi tiến hành lây nhiễm với vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng BCRC15010 sau đó được nuôi trên môi
trường BEP (beef extract and peptone) ở 28ºC trong tối. Quá trình nuôi cấy được
tiến hành trong vòng 8-10h. Vi khuẩn được sử dụng tại nồng độ OD 580 = 0,4. Nuôi

cấy trước với dịch khuẩn trong vòng 30 phút bằng cách lắc. Sauk hi thấm dịch
khuẩn, đĩa được chuyển sang môi trường MS và đồng nuôi cấy trong 2 ngày. Sau đó
được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, cefotaxime (200mg/l) và
8% agar. Rễ tơ phát triển từ các vùng lây nhiễm vào cuối tuần thứ 2, được tách ra
sau 3 tuần và chuyển sang môi trường B5 chứa 200mg/l cefotaxime. Rễ tơ thu được

11


từ các dòng đơn được nuôi cấy trên môi trường B5 lỏng và giử tại 100 rpm. Các
dòng được lựa chọn trên sự tăng trưởng của chúng, sau đo được nuôi cấy trong 3
tuần trước khi đem phân tích.
Mặt khác mật độ vi khuẩn khác nhau có ảnh hưởng tới khả năng cảm ứng rễ
tơ. Theo nghiên cứu của Ashwani Sharma và cộng sự năm 2005 trên cây Coffea
canephora thì vi khuẩn có khả năng lây nhiễm cao ở OD 600 = 0,6 với thời gian 30
phút đạt kết quả tốt nhất và cho tần số lây nhiễm là 89,64%. Các mẫu đã tiến hành
chuyển gen sau đó được sẽ được nuôi cấy trong môi trường đồng nuôi cấy với nhiệt
độ là 22ºC, pH 5,9. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường MS + 3% sucrose
mẫu chuyển gen sẽ được chuyển vào môi trường chọn lọc có bổ sung 500 mg/l
cefotaxime. Mẫu sẽ được nuôi giữ trong điều kiện tối ở 280C.
Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến cảm ứng rễ tơ là phương pháp lây
nhiễm. Để xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu, 3 phương pháp đã được sử dụng: tiêm
trực tiếp vi khuẩn vào mô, mẫu được ngâm trong dịch vi khuẩn 20 phút, mẫu được
tạo vết thương bằng dao cấy đã nhúng trong dung dịch vi khuẩn (Ebil và cộng sự,
2009). Trong đó mẫu được cắt, tạo vết thương và tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mẫu
nhằm tạo ra hợp chất phenolic thu hút vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes gắn lên
vị trí bị thương của mẫu. Ngâm mẫu đã tạo vết thương vào dung dịch vi khuẩn tạo
điều kiện để mẫu tiếp xúc với vi khuẩn và những tín hiệu từ tế bào thực vật kích
thích sự hoạt động của gen vir, dẫn tới vi khuẩn bám lên vị trí bị thương của mẫu.
Từ đó, dẫn đến những biến đổi trong tế bào vi khuẩn,sự hình thành cầu nối để

chuyển phức hợp T-DNA vào tế bào thực vật và sự sáp nhập T-DNA của Ri-plasmid
vào bộ gen tế bào chủ.
Thời gian đồng nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến nạp của
vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ. Sự chuyển và gắn T-DNA vào bộ gen tế bào
thực vật xảy ra trong giai đoạn đồng nuôi cấy. Nếu thời gian đồng nuôi cấy quá ngắn
thì quá trình biến nạp có thể xảy ra không hoàn toàn, trong khi đó thời gian nuôi cấy
quá dài có khả năng ảnh hưởng không tốt đến quá trình biến nạp do ái lực của vi khuẩn
với tế bào thực vật sẽ giảm hoặc ức chế cạnh tranh (Tao và cộng sự, 2006).

12


Năm 2008, Barbara và cộng sự đã tạo ra được các dòng rễ tơ chuyển gen với
chủng Agrobacterium rhizogenes 15834 của hai loài bông Gossypium hirsutum và
Gossypiumbarbadense dựa trên 3 loại vật liệu là mẫu lá, đoạn thân và cuống lá in
vitro.Một phương pháp cảm ứng để tạo nguồn rễ tơ của bốn loài Hyoscyamus

(H.

arachnoideus Pojark, H. kurdicus Bornm, H. reticulates L. và H. squarrosus Griff.)
là sử dụng 5 chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes (1724, 2659, 15834, A4 và
LBA 9402) lây nhiễm trên lá và sau đó được nuôi cấy trên hai nền môi trường là:
MS và B5 (Akramian và cộng sự, 2008). Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes LBA 9402 và môi trường B5 cho hiệu quả chuyển gen
tốt nhất. Do đó, sự dụng nhiều loại vật liệu phục vụ chuyển gen khác nhau thì thành
công của thí nghiệm chuyển gen càng cao.
Theo nghiên cứu của Yachya và Manuhara (2009) trên rễ tơ của cây Panax
ginseng được tạo ra theo phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. Sau đó, để
tăng khối lượng rễ tơ tạo ra thì các rễ tơ chuyển gen đã được nuôi trên môi trường

MS lỏng lắc không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng, kết quả là sau 2 tuần thì khối
lượng rễ đã tăng lên gấp 4 lần. Rễ tơ chuyển gen nuôi cấy trên môi trường MS đặc
có hiện tượng rễ phát triển thẳng lên và không phân nhánh. Nhưng ngược lại, rễ tơ
nuôi cấy trên môi trường lỏng lại có hiện tượng phân nhánh.
Hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes còn chịu ảnh
hưởng của kích thước và tuổi mẫu. Được biết đến như quá trình chuyển gen ở
Brassicas nhờ Agrobacterium rhizogenes, các mẫu lá sử dụng cho chuyển gen
thường là lá non in vitro điều này tạo điều kiện cho quá trình xâm nhiễm của vi
khuẩn qua vết thương cơ giới. Mỗi yếu tố đơn lẻ đều đóng vai trò rất quan trọng
trong quá trình chuyển gen để tạo rễ tơ bao gồm nguồn mẫu và tuổi mẫu, thời gian
chuyển gen, bước đưa mẫu vào để chọn lọc, nuôi cấy mẫu trước (Christey và cộng
sự, 2004).

13


PHẦN II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
• Cây sâm báo in vitro Abelmoschus sagittifolius Kurz var. septentrionalis
Gagnep
• Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 do Trung tâm
Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh cung cấp.
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiện Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ
sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
2.2.2.Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2015.
2.3 Nội dung nghiên cứu.
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chất

lượng chồi in vitro cây sâm báo
Vật liệu ban đầu là chồi ngọn cây sâm báo có kích thước 2 – 3 cm nuôi trong
điều kiện in vitro.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến chất lượng chồi in
vitro cấy sâm báo
Công thức
CT1

Nồng độ đường sucrose (g/l)
10

CT2

30

CT3

50

CT4

70

CT5

90

Nền môi trường: MS

14

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến chất lượng chồi in vitro cây sâm báo
Công thức
CT đ/c

Nồng độ IBA (mg/l)
0,00

CT1

0,25

CT2

0,50

CT3

1,00

CT4
Nền môi trường: MS + 70 g/l sucrose

2,00

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến chất lượng chồi in vitro cây sâm báo
Công thức
CT đ/c

Nồng độ GA3 (mg/l)
0

CT1

1

CT2

2

CT3

3

CT4
Nền môi trường: MS + 70 g/l sucrose

5

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến chất lượng chồi in vitro
cây sâm báo
Công thức
CT1

Trạng thái môi trường
Rắn (8 g/l agar)

CT2

Bán lỏng (4 g/l agar)

CT3
Lỏng (0 g/l agar)
Nền môi trường: MS + 70 g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tổ hợp auxin/BA đến chất lượng chồi in vitro cây
sâm báo
Công thức
CT1

Nồng độ auxin/BA
0,5 mg/l IBA + 2 mg/l BA

CT2

0,5 mg/l αNAA + 2 mg/l BA

CT3
Nền môi trường: MS + 70 g/l sucrose

0,5 mg/l IAA + 2 mg/l BA

2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu khảo sát sự cảm ứng hình thành rễ tơ in vitro
cây sâm báo bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

15


Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
đến khả năng cảm ứng tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo

Mẫu lá cây sâm báo được lây nhiễm bằng phương pháp tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào mẫu cấy với các nồng độ dịch khuẩn khác nhau thể hiện ở mật độ quang
ở bước sóng 600nm
Công thức
CT đ/c

OD600
0,0

CT1

0,2

CT2

0,3

CT3

0,4

Chỉ tiêu theo dõi:
+Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại mô lây nhiễm đến khả năng cảm ứng tạo rễ
tơ in vitro cây sâm báo
Các loại mô khác nhau được tách ra từ cây sâm báo in vitro, sau đó được lây
nhiễm với dịch vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes có nồng độ cho hiệu quả cảm
ứng tạo rễ tốt nhất trong thí nghiệm 1.
Công thức
CT1

Mô lây nhiễm
Lá bánh tẻ

CT2

Đoạn thân

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến khả năng cảm ứng
tạo rễ tơ in vitro cây sâm báo
Vật liệu sử dụng là mẫu lá in vitro cây sâm báo 40 ngày tuổi nuôi cấy trên
môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l α-NAA, câc mẫu được lây nhiễm ở nồng
độ cho hiệu quả cảm ứng rễ tốt nhất ở thí nghiệm 1.

Công thức Phương thức lây nhiễm
CT đ/c
Đối chứng không lây nhiễm
CT1

Tiêm trực tiếp dung dịch vi khuẩn vào mẫu cấy

16


CT2

Mẫu được tạo vết thương bởi dao cấy đã nhúng dung dịch

CT3

khuẩn
Mẫu được ngâm vào dịch khuẩn trong thời gian 20 phút

2.3.3. Nội dung 3: Đánh giá dòng rễ tơ đã chuyển gen bằng phương pháp PCR
Tách chiết DNA tổng số của mẫu rễ theo protocol Purification of DNA from
Plant Tisue – Mini Protocol, Qiagen.
Tiến hành xác định các dòng rễ chuyển gen bằng phương pháp PCR với các
mồi đắc trưng cho gen rolA và virD của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
• Thành phần phản ứng PCR:
Bảng 1: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần

Thể tích 1 phản ứng (µl)
14.5

Nước
Green Go Taq flexi buffer

2

dNTPs 2mM

2

Mg²

2

25mM

Primer Forward

0,2

Primer Reverse

0,2

Go Taq flexi

0,1

DNA

1

Tổng thể tích (µl)

20

17


• Phản ứng PCR kiểm tra gen rolA của rễ tơ
Bảng 2: Chu kì nhiệt phản ứng PCR kiểm tra gen rolA của rễ tơ
Bước
1

Nhiệt độ
95ºC

Thời gian
5’

Số chu kì
1

2

95ºC

45”

35

3

56 ºC

30”

35

4

72 ºC

30”

35

5

72 ºC

7’

1

6

4 ºC

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách điện di trên gel agarose 1%, bổ sung
ethidiumbromide (3µl/100ml đệm TAE, hiệu điện thế 60V, thời gian 60 phút.
• Phản ứng PCR kiểm tra gen virD của Agrobacterium rhizogenes
Bảng 3: Chu kì nhiệt trong phản ứng PCR kiểm tra gen virD của
Agrobacterium rhizogenes
Bước
1

Nhiệt độ
95 ºC

Thời gian
2’

Số chu kì
1

2

94 ºC

30”

35

3

50ºC

30”

35

4

72ºC

1’

35

5

72ºC

5’

1

6

4ºC

Bảng 4: Các mồi đặc trưng cho gene rolA và virD sử dụng trong phản ứng PCR
Gen

Trình tự mồi

Tm (ºC)

Kích thước sp

RolA

F-CAGAATGGAATTAGCCGGACTA-

56

307bp

50

560bp

R-TTAATCCCGTAGGTTTGTTTCGVirD

F-GAAGAAAGCCGAAATAAAGAG-

R-TTGAACGTATAGTCGCCGATA2.4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:

18


• Môi trường nuôi cấy: MS + 70 g/l sucrose + 7,5 g/l agar + chất điều tiết
sinh trưởng, pH = 5,7 được hấp khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.
• Điều kiện nuôi cấy:
Cường độ ánh sáng: 2000 lux
Nhiệt độ: 24 ± 2ºC
Chu kỳ chiếu sáng: 16h sáng/ 8h tối
Chỉ tiêu theo dõi với nội dung 1:
Chiều cao TB chồi (cm) = [∑ chiều cao chồi / ∑ mẫu nuôi cấy]
•

Số lá TB chồi (cm) = [∑ Số lá chồi / ∑ mẫu nuôi cấy]
Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên CRD
Phương pháp chuyển gen in vitro nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
• Các loại môi trường sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen:
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: môi trường LB lỏng và LB đặc, pH=7
Môi trường pha loãng vi khuẩn: môi trường YM lỏng bổ sung
acetosyringone 200µM, pH=7
Môi trường đồng nuôi cấy: MS + 3%succrose, pH=5,7
Môi trường diệt khuẩn: MS + 500mg/l cefotaxime + 3% sucrose, pH=5,
+ Bước 1: Hoạt hóa vi khuẩn:
- Nuôi vi khuẩn trên môi trường LB đặc trong điều kiện 28ºC, trong 48 – 72h
- Thu khuẩn lạc đơn nuôi trong LB lỏng, lắc 200rpm, 28ºC trong 16 – 24h

- Dịch khuẩn thu được đem li tâm ở 24ºC, 3000rpm trong 15 phút
- Loại bỏ phần dịch phía trên, thu sinh khối, pha loãng bằng môi trường
MS lỏng
- Xác định nồng độ nằng máy đo quang phổ hấp thụ bước sóng 600nm
- Pha loãng tới nồng độ thích hợp lây nhiễm bằng môi trường MS lỏng
+ Bước 2: Chuẩn bị mẫu lây nhiễm
-

Mẫu được tiến hành lây nhiễm là lá bánh tẻ, đoạn thân được tách ra từ

cây sâm báo in vitro
+ Bước 3: Lây nhiễm vi khuẩn

19