Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN TRUNG TIẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC
CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED)
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y
Mã số : 9.64.01.08

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Hµ NéI, 2018


Công trình được hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên

Phản biện 1:

PGS.TS. Đinh Duy Kháng
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 2:

PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 3:

PGS.TS. Trương Văn Dung
Viện Thú y

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp
Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

ngày

tháng

năm 2018

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bê ̣nh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)
là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ
Coronaviridae. Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1971,
sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc gia khác ở châu Á như Trung Quốc, Đài
Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan. Ở Việt Nam, bê ̣nh tiêu chảy thành dịch
ở lợn lần đầu tiên được phát hiện vào cuối năm 2008, đầu năm 2009.
Mặc dù đã lưu hành ở Việt Nam gần 10 năm, đến nay bệnh tiêu chảy
thành dịch do PEDV gây ra vẫn là chủ đề mới mẻ. Các nghiên cứu tìm hiểu

đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED và đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus
lưu hành ở Việt Nam hiện còn hạn chế. Bên cạnh đó, sự xuất hiện và lưu hành
của PEDV nhóm mới nổi (thuộc genogroup 2) từ 2010 đã làm giảm hiệu lực
của vacxin (sản xuất từ chủng PEDV thuộc genogroup 1). Do vậy, việc làm rõ
đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như dịch tễ học phân tử của virus là cơ sở quan
trọng cho đề xuất các biện pháp phòng (đặc biệt là lựa chọn đúng loại vacxin)
và chống phù hợp.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10
tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc;
- Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử
của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi
do PEDV. Các tỉnh này được chia làm 2 khu vực: đồng bằng châu thổ sông
Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình và Vĩnh Phúc)
và trung du- miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên và Lào Cai).
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam.
- Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành
phố của miền Bắc Việt Nam. Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý
của bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu
hành phổ biến của PED trong các trang trại chăn nuôi.
- Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hoàn chỉnh và 8 trình
tự gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành
tại thực địa không có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng.
- Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh
được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt nam.
1

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED
tại 10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của
bệnh, chứng minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại
thực địa.
- Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là
tư liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi-Thú y.
- Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức
tương đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và
những chủng vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện
pháp phòng chống bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG
Dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một
bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống
Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch PED thường xảy ra ở lợn
con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch
PED đã và đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi
lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Dịch PED lần đầu tiên được phát hiện ở
Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ
biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, và
ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan. Ở Việt Nam,
dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch
bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn
nuôi lợn trong cả nước.
2.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV
Để xác định mối quan hệ giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả
hệ (phylogenetic tree) và đặc điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự
gen S, M, và ORF3 đôi khi cả gen E. Nghiên cứu trên một phần của gen S và

toàn bộ gen M đã gợi ý chia PEDV thành 3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm
cũng được chia thành các nhóm nhỏ hơn (G1-1, G1-2, và G1-3). Phân tích cây
phả hệ dựa trên trình tự gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập
được ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và
khác biệt với các chủng PEDV phân lập được từ các Quốc gia Châu Âu.
Phân tích mối liên hệ gen giữa các chủng PEDV có thể được thực hiện
trên cơ sở phân tích toàn bộ hệ gen của virus. Nhiều nghiên cứu cho thấy
trình tự của gen mã hóa spike protein hoặc phân đoạn gen mã hóa vùng S1
của spike protein (amino acid 1- 735) là phù hợp để phân tích đặc điểm tiến
hóa của virus. Theo tác giả Lee (2015), mặc dù chỉ có 1 serotyp duy nhất,
2


PEDV có thể được chia làm 2 genogroup: nhóm G1 cổ điển (G1, classical)
và nhóm G2 (field epidemic/ pandemic). Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều
dưới nhóm: 1a, 1b và 2a, 2b. Nhóm G1a bao gồm chủng nguyên mẫu CV777,
chủng virus vacxin và các chủng virus thích nghi trên tế bào. Nhóm G1b bao
gồm một số biến chủng mới được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc vào
năm 2011, sau đó được phát hiện ở Mỹ vào năm 2014, ở Hàn Quốc năm
2013 và một số nước châu Âu. Nhóm G2 được chia thành dưới nhóm 2a (gây
ra các vụ dịch PED ở châu Á trước đây) và dưới nhóm 2b (gây ra các vụ dịch
ở châu Á và bắc Mỹ gần đây).
Nhóm cổ điển G1a lưu hành ở Trung Quốc có thể xuất phát từ việc sử
dụng các chủng virus vacxin hoặc do nhập lậu chủng virus vacxin nhược độc
từ Hàn Quốc. Nhóm G2a bắt nguồn từ Hàn Quốc, lây lan sang Trung Quốc
và sau đó lây sang các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Việt Nam. Nhóm
G2a ở các nước Đông Nam Á cũng có thể bắt nguồn trực tiếp từ Hàn Quốc.
Nhóm di truyền mới nổi G1b và G2b hình thành ở Trung Quốc có thể là kết
quả của quá trình tái tổ hợp giữa virus thuộc nhóm G1a và G2a lưu hành tại
nước này. Cả 2 nhóm này sau đó lây lan gần như đồng thời sang Mỹ, và sau

đó xuất hiện ở Hàn Quốc, một số nước bắc Mỹ, nam Mỹ và có thể cả Nhật
Bản và Đài Loan.
Dựa vào hiện tượng thêm – xóa (insertion- deletion) ở gen mã hóa
spike protein (S INDEL), có thể chia PEDV làm 2 nhóm: NON- S INDEL
và S INDEL. Ở Mỹ, những biến thể thuộc nhóm S INDEL gây ra các ổ dịch
có triệu chứng lâm sàng nhẹ. Các chủng PEDV phân lập được ở châu Âu
(Đức, Ý, Bỉ, Hà Lan và Pháp) vào năm 2014 và 2015 đều thuộc nhóm S
INDEL cùng với nhóm lưu hành ở Mỹ.
PHẦN 3. NỘI DUNG- NGUYÊN LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1.1. Tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam
- Điều tra tình hình PED từ năm 2013 – 2015 tại 10 tỉnh miền Bắc,
- Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và bệnh tích của lợn mắc PED
3.1.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen
- Giải trình tự gen S và ORF3 của các chủng PEDV lưu hành
- Phân tích đặc điểm trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV
lưu hành ở Việt Nam.
3.1.3. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử
- Nghiên cứu đặc điểm về sự lưu hành theo nhóm di truyền
- Nghiên cứu hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam
3


- Nghiên cứu sự phát tán theo không gian và thời gian của các chủng
PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 của hai genogroup.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Mẫu phân hoặc mẫu ruột của lợn nghi mắc tiêu chảy do PEDV.
- Bộ kít tổng hợp cDNA, bộ kít PCR.
- Trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở Việt
Nam và trên thế giới có đầy đủ thông tin về địa điểm và thời gian phân lập.

- Cặp mồi đặc hiệu được thừa hưởng từ các nghiên cứu trước đây
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ
Thu thập thông tin các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED từ các
trại trên địa bàn nghiên cứu thông qua các kỹ thuật viên của trại.
3.3.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng
Dựa vào quan sát triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để bước đầu xác
định bệnh.
3.3.3. Phương pháp mổ khám
Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan,
tổ chức của lợn mắc PED, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện
triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành
lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách
các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh.
3.3.4. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu được thu thập trên thực địa từ những lợn có biểu hiện lâm sàng
tiêu chảy cấp tại các trại chăn nuôi ở một số địa phương thuộc miền Bắc Việt
Nam, bao gồm: (i) các đoạn ruột và hạch ruột, (ii) phân. Mẫu được bảo quản
lạnh sau khi lấy và trong suốt quá trình vận chuyển.
3.3.5. Phương pháp tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA
- ARN tổng số được tách bằng TRIzol.
- cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã
ngược (reverse transcriptase), sử dụng kit SuperScript (Invitrogen) và oligo dT.
3.3.6. Phương pháp RT-PCR phát hiện PEDV
- Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng chẩn đoán PED bằng
phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu của PEDV.
3.3.7. Phương pháp giải trình tự gen
Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo hai chiều (xuôi và
ngược) bằng phương pháp Sanger. Trình tự nucleotide tiếp tục được phân
tích bằng chương trình tin sinh học BioEdit v7.1.3.0 trên cơ sở đối chiếu so

sánh (i) giữa trình tự nucleotide được giải trình tự theo chiều xuôi và chiều
ngược, và (ii) với trình tự gen S hoặc ORF3 tham chiếu công bố trên ngân
hàng gen.
4


3.3.8. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền
Phần mềm MEGA7 (Kumar et al., 2016) được dùng để tính khoảng
cách di truyền (genetic distance) giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam,
dựa vào trình tự gen S (n=38) và gen ORF3 (n=12). Các mô hình mô phỏng
sự biến đổi nucleotide được dùng bao gồm: Kimura-2P (K2P), Tajama-Nei,
Tamura-3P và Tamura-Nei. Khoảng cách di truyền giữa các chủng virus sau
đó được sắp xếp biểu diễn dưới dạng đồ thị tần suất.
3.3.9. Phương pháp xây dựng cây phả hệ
Cây phả hệ (dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3) được xây dựng
như sau:
(i) Lập cơ sở dữ liệu bao gồm các chủng PEDV thu nhận từ ngân hàng
gen và các chủng đã biết genogroup (Lin et al., 2016).
(ii) Sắp xếp (alignment) trình tự nucleotide theo cột trên cơ sở bộ ba
mã hóa (codon- based alignment) bằng phần mềm MAFFT (Katoh and
Standley, 2013) và PAL2NAL (Suyama et al., 2006).
(iii) Xây dựng cây phả hệ bằng thuật toán neighbor-joining được tích
hợp trong chương trình MEGA (Kumar et al., 2016). Mức tin cậy của các
nhánh phân chia ở mỗi nút (node) được biểu thị bằng giá trị bootstrap.
(iv) Phần mềm FigTree ( />được dùng để biểu diễn và hiệu đính cây phả hệ.
3.3.10. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử
Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại
quá trình phát tán theo không gian (quốc gia- quốc gia, địa phương- địa
phương) và thời gian (năm) của PEDV dựa vào trình tự gen S hoặc gen
ORF3. Các tham số của mô hình dựa theo kết quả của nghiên cứu trước đây

(Lemey et al., 2009).
3.3.11. Phương pháp xử lý số liệu
- Kiểm định giả thuyết về trị trung bình của 2 tổng thể độc lập
(independent samples t-test) được thực hiện bằng phần mềm SPSS,
- Phân tích phương sai một yếu tố (oneway ANOVA) dùng kiểm định
giả thuyết trung bình bằng nhau của các nhóm mẫu,
- Các phép kiểm định được thực hiện với mức ý nghĩa là α = 0,05.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH DỊCH PED Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC TỪ 2013-2015
4.1.1. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015
Trong khuôn khổ của đề tài, tình hình dịch PED đã được nghiên cứu
tại các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED tại Hà Nội, Hải Dương, Hải
Phòng, Hưng Yên, Thái Bình, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Bắc Giang, Lào Cai và
5


Thái Nguyên. Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm được
trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015
Số mẫu
Tỷ lệ
Số mẫu
Tỷ lệ %
kiểm
trung
dương tính dương tính
tra
bình
Phân
5

2
40,00
1
Bắc Giang
40,00
Ruột
5
2
40,00
Phân
8
3
37,50
2
Hà Nội
47,37
Ruột
11
6
54,50
Phân
7
2
28,50
3
Hải Dương
42,86
Ruột
7
4

57,10
Phân
5
2
40,00
4
Hải Phòng
50,00
Ruột
5
3
60,00
Phân
3
1
33,30
5
Hòa Bình
55,56
Ruột
6
4
66,60
Phân
7
3
42,80
6
Hưng Yên
53,85

Ruột
19
11
57,80
Phân
3
1
33,30
7
Lào Cai
50,00
Ruột
5
3
60,00
Ruột
12
6
50,00
8
Thái Bình
34,25
Phân
61
19
31,14
Ruột
6
3
50,00

9
Thái Nguyên
37,50
Phân
26
9
34,62
Phân
4
2
50,00
10
Vĩnh Phúc
45,45
Ruột
7
3
42,80
Tổng hợp
212
89
41,98
* Trường hợp thu thập được lợn bệnh, mẫu ruột sẽ được dùng thay mẫu phân trong phát
hiện PEDV
TT

Địa điểm

Loại
mẫu*

Bảng 4.1 cho thấy sự hiện diện của PEDV ở các địa phương lấy mẫu,
với tỷ lệ dương tính dao động từ 34,25% (Thái Bình) tới 55,56% (Hòa Bình).
Phân tích phương sai một nhân tố (ANOVA) về tỷ lệ dương tính PEDV giữa
10 tỉnh cho giá trị p = 0,841 > 0,05. Do vậy, khác biệt về tỷ lệ nhiễm PEDV
giữa các địa phương là không có ý nghĩa thống kê ở mức 95%. Xét trên khía
cạnh vị trí địa lý, kết quả trên cho thấy dịch PED không chỉ xảy ra ở các tỉnh
thành tiếp giáp nhau như Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên và Thái
Bình; mà còn phát hiện được ở một số tỉnh xa như Thái Nguyên, Lào Cai.
Ngoài 10 tỉnh thuộc phạm vi nghiên cứu, PEDV cũng được phát hiện ở Bắc
Ninh, Hà Nam, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An và Quảng Trị (kết quả không
trình bày).
Đối với 2 loại mẫu xét nghiệm là phân và ruột, kết quả ở bảng 4.2 cho
biết tỷ lệ mẫu ruột dương tính với PEDV (40,00% - 66,60%, trung bình
53,90%) cao hơn so với tỷ lệ mẫu phân dương tính với virus (28,50% 6


50,00%, trung bình 38,00%). Bằng phân tích phương sai một nhân tố, sự
khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p = 0,004 < 0,05). Kết quả xét
nghiệm này phù hợp với công bố của Nguyễn Tất Toàn và cs (Nguyễn Tất
Toàn và cs., 2012, Nguyễn Tất Toàn and Đỗ Tiến Duy, 2012), trong đó nhóm
tác giả cũng phát hiện được 58,14% mẫu ruột non dương tính PEDV và cao
hơn nhiều so với các mẫu phân (16,96%).
Mặc dù tất cả mẫu bệnh phẩm nêu trên (bảng 4.1) được lấy ở lợn có
triệu chứng tiêu chảy nghi ngờ do nguyên nhân virus như: (i) nôn, phân nhiều
nước và có cục sữa không tiêu; hoặc (ii) ruột non căng phồng, có cục sữa
không tiêu ở các đoạn ruột già, v.v... nhưng chỉ có trung bình 41,98% mẫu
dương tính PEDV. Kết quả này có thể do lợn được lấy mẫu nhiễm các virus
gây tiêu chảy khác. Khả năng này là có thể bởi lẽ trong một công bố gần đây,
deltacoronavirus đã được phát hiện ở Hà Nội và Thái Bình là hai tỉnh thuộc

phạm vi thu thập mẫu của nghiên cứu này (Lê Văn Phan và cs., 2017).
4.1.2. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại
Những nghiên cứu trong vòng 5 năm trở lại đây tại Việt Nam cho thấy
PEDV là nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát dịch tiêu chảy trên lợn (Do Tien
Duy et al., 2011; Vui et al., 2015). Do không nằm trong danh mục các bệnh
bắt buộc phải khai báo dịch, nên tình hình dịch PED ở ngoài thực địa được dự
đoán xảy ra trên diện rộng. Để làm rõ hơn tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền
Bắc, kết quả xét nghiệm được tổng hợp theo trang trại và được trình bày ở
bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc
theo trang trại
TT

Địa điểm

1
Bắc Giang
2
Hà Nội
3
Hải Dương
4
Hải Phòng
5
Hòa Bình
6
Hưng Yên
7
Lào Cai
8

Thái Bình
9
Thái Nguyên
10
Vĩnh Phúc
Tổng hợp

Số trại
theo dõi
4
10
6
5
5
7
3
5
5
5
55

Số trại
dương tính
1
8
4
3
2
6
1

3
2
2
32

Tỷ lệ (%)
dương tính
25,00
80,00
66,67
60,00
40,00
85,71
33,33
60,00
40,00
50,00
58,10

Kết quả xét nghiệm PEDV tại 55 trại (có lợn mắc tiêu chảy nghi do
virus và chưa từng sử dụng vacxin phòng bệnh do PEDV) cho thấy có 32 trại
phát hiện được PEDV trong mẫu bệnh phẩm, tương ứng với tỷ lệ 58,1%.
Mặc dù tỷ lệ trang trại dương tính với PEDV khác nhau giữa các tỉnh (dao
động từ 25,00% - 85,71%), nhưng không có địa phương nào là không có
7


trang trại mắc PED. Kết quả này cho thấy PEDV xuất hiện khá phổ biến ở
các địa phương thuộc phạm vi nghiên cứu của đề tài này.
Xét về mặt địa lý, 6 tỉnh thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng đều có

tỷ lệ trang trại dương tính trên 50%. Cụ thể, tỷ lệ trang trại dương tính cao
nhất là ở Hưng Yên (85,71%) và Hà Nội (80,00%); tiếp đến là Hải Dương,
Hải Phòng, Thái Bình với tỷ lệ dương tính lần lượt là 66,67%, 60,00% và
60,00%. Ngược lại, ở 4 tỉnh trung du- miền núi phía Bắc, tỷ lệ trang trại
dương tính với PEDV đều dưới 50%, ví dụ như: Lào Cai là 33,33% và Bắc
Giang là 25,00%. Kết quả tính chung theo vùng địa lý cho thấy tỷ lệ trang
trại có PEDV lưu hành ở 6 tỉnh đồng bằng sông Hồng cao hơn rõ rệt so với
các trang trại ở 4 tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%), ở mức tin
cậy 95% (phụ lục 1). Sự khác biệt về tỷ lệ trang trại dương tính PEDV ở 2
vùng nói trên có thể do các tỉnh đồng bằng có số lượng hộ chăn nuôi lớn và
mật độ chăn nuôi lợn cao nên tỷ lệ mắc PED cao hơn so với các trại ở khu
vực vùng trung du - miền núi.
Tổng hợp các kết quả trình bày ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho phép rút
ra nhận xét: kể từ khi PEDV được công bố lần đầu tại miền Nam năm 2009
(Do Tien Duy et al., 2011), dịch tiêu chảy ở lợn do PEDV gây ra đã xuất
hiện ở miền Bắc với không gian trải rộng (10/10 tỉnh thu thập mẫu) và liên
tục theo thời gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015).
4.1.3. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED
Để làm rõ đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của lợn mắc
tiêu chảy do virus, nghiên cứu này đã tìm hiểu triệu chứng và bệnh tích của
50 lợn con theo mẹ (giai đoạn mẫn cảm nhất với PEDV) đã được khẳng định
chỉ dương tính với PEDV (bảng 4.3, bảng 4.4).
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn
mắc PED
Địa điểm
Bắc Giang
Hà Nội
Hải Dương
Hải Phòng
Hòa Bình

Hưng Yên
Thái Bình
Vĩnh Phúc
Tổng hợp

Số con có triệu chứng
Số con
theo
Mùi phân Phân lỏng, Lông xù,
Nôn mửa
dõi
tanh, gây có cục sữa bết phân
7
2
3
2
3
7
0
5
0
7
5
0
5
5
5
5
0
5

5
5
5
3
0
0
3
7
2
4
4
4
10
0
10
3
10
4
0
0
0
3
50
7 (14%) 32 (64%) 19 (38%)
40 (80%)

Mất nước
3
7
5

5
1
7
10
3
41 (82%)

Mặc dù lợn ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với PEDV và mắc bệnh thể
lâm sàng, nhưng lợn con theo mẹ là nhóm có biểu hiện bệnh rõ nhất. Vì vậy,
8


nghiên cứu này đã tập trung làm rõ đặc điểm triệu chứng và bệnh tích ở nhóm
lợn này. Kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho biết lợn con mắc tiêu chảy do
PEDV thường biểu hiện 2 triệu chứng liên quan tới hiện tượng tiêu chảy.
Phổ biến nhất là triệu chứng lợn con gầy sọp do mất nước (82%), tiếp theo
là hiện tượng lông xù, bết phân ở toàn thân (80%). Kết quả tổng hợp ở bảng
4.3 cũng cho thấy rõ tỷ lệ lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình của lợn mắc
tiêu chảy do PED: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), một số trường
hợp trong phân có cục sữa không tiêu (38%). Ngoài các triệu chứng nêu trên,
lợn bệnh còn có biểu hiện chung như run rẩy, nằm chồng đống lên nhau,
v.v... (kết quả không trình bày). Các đặc điểm về triệu chứng ở lợn con theo
mẹ nhiễm PEDV kể trên cũng được mô tả ở nhiều nghiên cứu trong và ngoài
nước (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014; Sun et al., 2012). Tuy nhiên, hiện
tượng nôn mửa chỉ chiếm 7 trong tổng số 50 ca theo dõi (14%).
Tóm tắt kết quả nghiên cứu bệnh tích của lợn con theo mẹ mắc PED
được tổng hợp và trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED
Địa điểm

Bắc Giang
Hà Nội
Hải Dương
Hải Phòng
Hòa Bình
Hưng Yên
Thái Bình
Vĩnh Phúc
Tổng hợp

Sữa chưa tiêu

Số con có bệnh tích
Ruột non

Số con
theo
dõi

Dạ dày

Ruột

Mỏng,
trong

Xung
huyết

7

7
5
5
5
7
10
4
50

7
7
5
5
5
7
10
4
50 (100%)

1
0
3
2
0
4
0
0
10 (20%)

5

2
5
5
0
3
10
0
30 (60%)

0
0
0
0
1
2
1
0
4 (8%)

Hạch
ruột
xung
huyết
0
0
0
0
0
0
0

0
0 (0%)

Đối với lợn con được khẳng định mắc tiêu chảy do PEDV, nghiên cứu
này không ghi nhận được biến đổi bệnh lý đại thể ở các hệ cơ quan ngoài
đường tiêu hóa như: hô hấp, tuần hoàn. Các nhóm bệnh tích quan sát được ở
hệ tiêu hóa chủ yếu tập trung vào các đặc điểm giảm tiêu hóa/ giảm hấp thu.
100% số lợn mổ khám đều quan sát được sữa đông vón trong dạ dày. Khác
với nhiều nghiên cứu khác, cục sữa đông vón trong dạ dày thường được nhấn
mạnh như một bệnh tích điển hình của lợn mắc PED (Nguyễn Văn Điệp và
cs., 2014). Tuy nhiên, trong quá trình mổ khám, đặc điểm này còn thấy cả ở
nhóm lợn con theo mẹ không mắc PED (kết quả không trình bày). Do đó,
cục sữa đông trong dạ dày là do lợn con theo mẹ chết mà không kịp tiêu hóa
hết, không phải là bệnh tích điển hình của bệnh. Hiện tượng ruột non có
màu trong, chứa nhiều dịch xuất hiện với tỷ lệ cao nhất (60%). Cục sữa
9


không tiêu ở các đoạn ruột non và kết tràng xuất hiện với tỷ lệ không cao
(khoảng 20%).
4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM VỀ TRÌNH TỰ GEN
Để làm cơ sở cho so sánh đa chiều về đặc điểm sinh học phân tử cũng
như đặc điểm dịch tễ học phân tử, chúng tôi tiến hành thu thập toàn bộ trình
tự gen S và ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam. Do vậy, cơ sở dữ liệu
về trình tự gen S bao gồm 38 trình tự hoàn chỉnh của gen mã hóa spike
protein (gen S), thu thập trong khoảng 2013- 2016, ở 11 tỉnh/ thành phố
thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam. Cơ sở dữ liệu trình tự gen ORF3
bao gồm 12 trình tự gen ORF3 hoàn chỉnh, thu thập trong khoảng 20132014 tại 6 tỉnh thành thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam.
4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam
4.2.1.1. Đặc điểm về tính đa dạng di truyền của gen S

Đặc điểm đầu tiên phản ánh tính đa dạng của PEDV lưu hành ở Việt
Nam là sự biến động chiều dài gen S. Cụ thể, gen S của 38 chủng PEDV
được phân tích trong nghiên cứu này có kích thước: 4140 nt (1 chủng), 4146
nt (6 chủng), 4149 nt (5 chủng), 4155 nt (16 chủng), 4158 nt (9 chủng) và
4179 nt (1 chủng).
SimPlot - Query: Spike_AF353511_CV777
FileName: D:\ATien\Simplot-Vietnam\S-vietnam-ref-nu-al.fasta.txt

100
98
96
94
92
90
88

KJ960178,
Đồng Nai, 2013

86
84

KX708903,
Hải Phòng, 2015

82

Similarity (%)

80

78
76
74
72
70
68

A

66
64

B

C

D

62
60
58
56
54
52
50
0

200

400

600

800

1,000

1,200

1,400

1,600

1,800

2,000
2,200
Position

2,400

2,600

2,800

3,000

3,200

3,400

3,600

3,800

4,000

Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy)

Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0

Hình 4.1. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV
Dễ nhận thấy ở 4/5 chiều dài gen S (nucleotide 800 - 4188), 38 chủng
PEDV có sự tương đồng > 90% về trình tự nucleotide (ngoại trừ chủng
KJ960178 (vùng C) và chủng KX708903 (vùng D)). Ở hai vùng A và B (từ
nucleotide 1 - 800), mức tương đồng về trình tự gen giữa các chủng PEDV
trong nghiên cứu này là thấp nhất, dao động từ 63,7% - 87,9%. Sự biến động
về mức tương đồng trên dọc chiều dài gen S giữa các chủng PEDV lưu hành
ở Việt Nam cũng đã được biết đối với một số chủng virus lưu hành trên thế
giới, trong đó có Trung Quốc.
10

KX982561_HaNoi_2013
KX982564_HoaBinh_20
KX982553_HungYen_20
KX982554_HungYen_20
KX982557_HungYen_20
KJ960180_HungYen_20
KP455313_ThaiBinh_20
KP455314_ThaiBinh_20

KJ960178_DongNai_201
KJ960179_VungTau_20
KP455320_HaiPhong_20
KX982568_HaNoi_2014
KX982570_HaNoi_2014
KX982569_HoaBinh_20
KT941120_HungYen_20
KX982572_ThaiBinh_20
KX982571_VinhPhuc_2
KP455315_QuangTri_20
KP455316_QuangTri_20
KP455317_QuangTri_20
KP455318_QuangTri_20
KP455319_QuangTri_20
KX708903_HaiPhong_20
KX708901_HaiPhong_20
KX708902_HaiPhong_20
KX708896_HaNoi_2015
KX982573_HungYen_20
KX982576_HungYen_20
KX708906_HungYen_20
KX708907_HungYen_20
KX708904_LaoCai_2015
KX708905_LaoCai_2015
KX708897_ThaiNguyen_
KX708898_ThaiNguyen_
KX708895_ThaiNguyen_
KX708899_VinhPhuc_2
KX708900_VinhPhuc_2
KX708894_HungYen_20

4.2.1.2. Đặc điểm đột biến ở vùng quyết định kháng nguyên COE
Vùng quyết định kháng nguyên COE (aa 499 – 638, hình 4.2) được
xác định bao gồm một vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh
kháng thể trung hoà từ aa 499-600 (tương đương aa 496-597 của chủng
CV777). So với chủng tham chiếu CV777, 38 chủng PEDV của Việt Nam
sai khác ở 31 vị trí, tập trung tại 8 vị trí là amino acid 517, 521, 527, 549,
594, 605, 612 và 635. Vùng quyết định kháng nguyên COE còn đóng vai trò
là receptor gắn thụ thể pAPN (porcine aminopeptidase-N). Trong 4 vị trí gắn
với pAPN (đóng khung từ 1-4), có tới 3 vị trí trong đó xảy ra đột biến. Trình
tự amino acid ở vùng gắn pAPN số 3 nhìn chung là bảo thủ (trừ 3 chủng là
KJ960178, KJ960179, KJ960180 có đột biến). Đột biến ở vùng bám pAPN
cũng đã được xác định đối với PEDV lưu hành ở nhiều nước trên thế giới.
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
.|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|...

Spike_AF353511_CV777
KX982561_HaNoi_2013
KX982564_HoaBinh_2013
KX982553_HungYen_2013
KX982554_HungYen_2013
KX982557_HungYen_2013
KJ960180_HungYen_2013
KP455313_ThaiBinh_2013
KP455314_ThaiBinh_2013
KJ960178_DongNai_2013
KJ960179_VungTau_2013
KP455320_HaiPhong_2014
KX982568_HaNoi_2014
KX982570_HaNoi_2014
KX982569_HoaBinh_2014
KT941120_HungYen_2014
KX982572_ThaiBinh_2014
KX982571_VinhPhuc_2014
KP455315_QuangTri_2014
KP455316_QuangTri_2014
KP455317_QuangTri_2014
KP455318_QuangTri_2014
KP455319_QuangTri_2014
KX708903_HaiPhong_2015
KX708901_HaiPhong_2015
KX708902_HaiPhong_2015
KX708896_HaNoi_2015
KX982573_HungYen_2015
KX982576_HungYen_2015
KX708906_HungYen_2015

KX708907_HungYen_2015
KX708904_LaoCai_2015
KX708905_LaoCai_2015
KX708897_ThaiNguyen_2015
KX708898_ThaiNguyen_2015
KX708895_ThaiNguyen_2015
KX708899_VinhPhuc_2015
KX708900_VinhPhuc_2015
KX708894_HungYen_2016

VTLPSFNDHSFVNITVSAAFGGLSSANLVASDTTINGFSSFCVDTRQFTITLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLAGACTIDLFGYPAFGSGVKLTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGITDV
..................S...H.G...I.....................S.................T..........................S..........D......F..........D...........V...
......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S............F...............................S..........E......F......................V...
......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S............F...............................S..........E......F......................V...
......................H.G...I............W......S.S.....PT.....................................S..........E......F......................V...
.....................DH.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
.....................DH.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
............K.........HRG...I............R........SR....PT....G....G...........................S..........E......F......................V...
......................H.G...I............W......S.S.....PT.....................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S...................................L........S..........E......F......................V...
......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S.................T..........................S..........D......F..........D...........V...
......................P.G...I.....................S............................................S..........D......VA.....................V...
......................P.G...I.....................S.....................................A......S..........D......VA.....................V...
..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S................G...........................S..........E......F......................V...

..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S....................................WC......N..........E......F......................V...
..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
..................V...H.G...I..................................................................S..........E......F......................V...
.....................DH.G...I.....................S............................................S........C.E......F......................V...
.....................DH.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V...
......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V...
......................H.G...I.....................S.......................................................D......F....................V.V...
......................H.G...I.....................S.............N..............................S..........E......F......................V...
......................P.G...I.....................S.................................N..........S..........D......VA.....................V...
......................P.G...I.....................S.....................................A......S..........D......VA.....................V...
......................H.G...I.....................S............................................S........H.D......F......................V...
......................H.G...I.....................S............................................S........H.D......F......................V...
......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V...
......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V...
..................V...H.G...I..................................................................S..........E......F......S...............V...
......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V...
......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V...
..................V...H.G...I..................................................................S..........E......F.....HS...............V...

1

2

3

4

aa 496- 597

Các vùng gắn với thụ thể porcine aminopeptidase-N (pAPN) được đóng khung. Vùng
kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 496-597) được xác định bởi Okda và cs.,
2017. Vị trí đột biến dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa được đánh dấu bởi
mũi tên. Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777

Hình 4.2. Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV

Mặc dù có bằng chứng trái ngược nhau nhưng pAPN (đặc biệt là tiểu
phần VII) được chứng minh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình
bám và xâm nhập của PEDV vào tế bào. Đối với coronavirus, vùng kháng
nguyên làm nhiệm vụ gắn kết với tế bào vật chủ thường là đích tác động của
11


kháng thể trung hòa. Do đó, đột biến ở 4 vị trí bám pAPN của 38 chủng
PEDV lưu hành ở Việt Nam được dự đoán có ảnh hưởng đến quá trình xâm
nhập của virus vào tế bào vật chủ. Ở khía cạnh khác, PEDV có thể không bị
trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu (neutralization resistance) chỉ với một điểm
đột biến ở vùng bám với pAPN: từ valine (V) sang glycine (G) ở vị trí 638
(tương đương với vị trí 635 của chủng CV777). Không có chủng virus nào
trong 38 chủng ở nghiên cứu này được dự đoán là có khả năng lẩn tránh
kháng thể trung hòa do đều mã hóa valine ở vị trí 635 (mũi tên, hình 4.2).
4.2.1.3. Đặc điểm đột biến ở vùng quyết định kháng nguyên S1D
Trình tự amino acid của vùng S1D được trình bày ở hình 4.3. Trong 21
vị trí có thay đổi amino acid (so với chủng CV777), có 6 vị trí đột biến nằm trong
vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 741768). Trong vùng này, epitop trung hòa SS2 và SS6 của 38 chủng PEDV của
Việt Nam có tính bảo thủ rất cao. Epitop SS2 giống với trình tự của chủng
CV777 ở 37/38 chủng, trong khi đó epitop SS6 sai khác 1 aa so với chủng
CV777 (vùng đóng khung, hình 4.3).
SS2

SS6

640
650
660
670
680
690
700
710
720
730
740
750
760
770
780
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....

Spike_AF353511_CV777
KX982561_HaNoi_2013
KX982564_HoaBinh_2013
KX982553_HungYen_2013
KX982554_HungYen_2013
KX982557_HungYen_2013
KJ960180_HungYen_2013
KP455313_ThaiBinh_2013
KP455314_ThaiBinh_2013
KJ960178_DongNai_2013

KJ960179_VungTau_2013
KP455320_HaiPhong_2014
KX982568_HaNoi_2014
KX982570_HaNoi_2014
KX982569_HoaBinh_2014
KT941120_HungYen_2014
KX982572_ThaiBinh_2014
KX982571_VinhPhuc_2014
KP455315_QuangTri_2014
KP455316_QuangTri_2014
KP455317_QuangTri_2014
KP455318_QuangTri_2014
KP455319_QuangTri_2014
KX708903_HaiPhong_2015
KX708901_HaiPhong_2015
KX708902_HaiPhong_2015
KX708896_HaNoi_2015
KX982573_HungYen_2015
KX982576_HungYen_2015
KX708906_HungYen_2015
KX708907_HungYen_2015
KX708904_LaoCai_2015
KX708905_LaoCai_2015
KX708897_ThaiNguyen_2015
KX708898_ThaiNguyen_2015
KX708895_ThaiNguyen_2015
KX708899_VinhPhuc_2015
KX708900_VinhPhuc_2015
KX708894_HungYen_2016

TDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSILAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVNDDIVGVISSLSNSTFNNTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQYGQVKIAPTVTGNISIPTNFSMSI
.......................V.......L.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D................S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
....S...G...................Y..F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
........G......................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S...............I.........................S.......................
...............................F....H..................................D...........S....S.........................................S.......................
.......................V.......L.......................................D................S......................................L..S.......................
...............................F.....................................F.D................S.K...............S.......................S.......................
...............................F.......................................D................S.K...............S.......................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F....H..................................D................S.........................................S.....T.................
...............................F..D....................................D...........S....S......................A..................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.R.....................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
........G......................F.......................................DG..........S....S......................................L..S.......................
........G......................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F....H..................................D................S.........................................S.......................
...............................F....H..................................D................S......................................S..S.......................
...............................F.......................................D................S.K...............S.......................S.......................

...............................F.......................................D................S.K...............S.......................S.......................
.....K..E......................F....H..................................D................S.............................R...........S.......................
...............................F....H..................................D................S.........................................S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................
...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S.......................

aa: 741-756, 744-771, 753-768

Epitop trung hòa SS2 và SS6 được đóng khung. Các phân đoạn aa 741-756, 744-771 và
753-768 kích thích sản sinh kháng thể trung hòa được xác định bởi Okda và cs., 2017.
Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng CV777

Hình 4.3. Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV
12


Ngoài vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể
trung hòa nằm trên tiểu phần S2 kể trên, đột biến R895G (tương đương với
vị trí 891 của chủng tham chiếu CV777) được chứng minh có vai trò cực kỳ
quan trọng trong quá trình thích nghi của virus in vitro (đột biến R-> G dẫn
tới tăng hiệu giá virus và kích thước của plaque nhỏ hơn). Kết quả đối chiếu,
so sánh cho biết 38 chủng PEDV trong nghiên cứu này đều mã hóa arginine
(R) tại vị trí 891.
4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam
Gen ORF3 của PEDV gồm 672 nucleotide (không bao gồm codon kết
thúc phiên mã). Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh được vai trò của

ORF3 có liên quan đến quá trình thích nghi của virus trên môi trường tế bào
và độc lực của virus. Khi so sánh mức độ tương đồng nucleotide gen ORF3
giữa 12 chủng PEDV với chủng tham chiếu DR13 (hình 4.4), tùy thuộc vào
vị trí nucleotide được so sánh, các chủng của Việt Nam tương đồng từ 93%
- 99%. Từ nucleotide 1- 406, chủng virus KT941120 (Hưng Yên, 2014)
giống > 97% so với DR13. Cũng trong khoảng này 11 chủng virus còn lại có
mức tương đồng < 97%.

Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy) Vị trí nucleotide
được đánh dấu theo chủng tham chiếu DR13 (EU054929).

Hình 4.4. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV
Hình 4.5 trình bày kết quả phân tích trình tự amino acid của 12 chủng
PEDV lưu hành ở Việt Nam được thu thập trong năm 2013 và 2014.
13


10
20
30
40
50
60
70
80
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

KT941120_HungYen_2014
KJ960178_DongNai_2013
KJ960179_VungTau_2013

KJ960180_HungYen_2013
KP455967_ThaiBinh_2013
KP455968_ThaiBinh_2013
KP455969_QuangTri_2014
KP455970_QuangTri_2014
KP455971_QuangTri_2014
KP455972_QuangTri_2014
KP455973_QuangTri_2014
KP455974_QuangTri_2014

MFLGLFQYTIDTVVKDVSKSANLSLDAVQELELNVVPIRQASNVTGFLFTSVFIYFFALFKASSLRRNYIMLAARFAVIV
........................S............................................V.........F
........................S............................................V.........F
........................S...............................L............V.........F
........................S............................................V.........F
........................S............................................V.........F
....................V...S............................................V.........F
........................S............................................V.........F
........................S......................F.....................V.........F
....................V...S............................................V.........F
....................V...S............................................V.........F
........................S......................................F.....V.........F
90
100
110
120
130
140
150
160

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

KT941120_HungYen_2014
KJ960178_DongNai_2013
KJ960179_VungTau_2013
KJ960180_HungYen_2013
KP455967_ThaiBinh_2013
KP455968_ThaiBinh_2013
KP455969_QuangTri_2014
KP455970_QuangTri_2014
KP455971_QuangTri_2014
KP455972_QuangTri_2014
KP455973_QuangTri_2014
KP455974_QuangTri_2014

LYCPLLYYCGAFLDATIICCTLIGRLCLVCFYSWRYKNALFVIFNTTTLSFLNGKADYYDGKSIVILEGGDHYITFGNSF
..........................F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
...................R......F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
................T.........F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................
..........................F..............I..............A.......................





170
180
190
200
210
220
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....

KT941120_HungYen_2014
KJ960178_DongNai_2013
KJ960179_VungTau_2013
KJ960180_HungYen_2013
KP455967_ThaiBinh_2013
KP455968_ThaiBinh_2013
KP455969_QuangTri_2014
KP455970_QuangTri_2014
KP455971_QuangTri_2014
KP455972_QuangTri_2014
KP455973_QuangTri_2014
KP455974_QuangTri_2014

VAFVSSIDLYLAIRGRQEADLQLLRTVELLDGKKLYVFSQHQIVGITNAAFDSIQLDEYATISE
.......N.............H....................V.....................
.......N.............H....................V.....................
.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................

.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................
.......N.............H..........................................


Các vị trí liên quan đến ức chế sự nhân lên của virus in vitro được đánh dấu bởi mũi tên.
Trong đó, aa 81 và 167 có ảnh hưởng rõ rệt nhất được đánh dấu màu xám. Vùng aa 8298 liên quan đến hiện tượng ức chế sự nhân lên của virus được gạch chân. Vị trí xuất
hiện đột biến tại (aa 98) trong quá trình nhược độc hóa chủng virus nhược độc PC22A
được đóng khung nét liền. Vùng aa (1) và (2) ảnh hưởng tới kênh ion K+, trong đó aa
170 có ảnh hưởng rõ rệt được đóng khung bằng nét đứt

Hình 4.5. Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV
Protein ORF3 ngoài đóng vai trò là kênh ion trên vỏ bọc của virus với
Tyrosin ở vị trí 170 (170Y) đóng vai trò quan trọng trong duy trì hoạt động
của kênh ion K+. Vị trí này ở protein ORF3 của 12 chủng PEDV của Việt
Nam đều không có đột biến. Đối chiếu với 2 vị trí amino acid (F81L và
M167S) đóng vai trò then chốt trong quá trình ức chế sự nhân lên của virus
trên môi trường tế bào in vitro, chúng tôi không quan sát được các đột biến
đã được chứng minh ức chế sự nhân lên của PEDV.
14


4.3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV
4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành PEDV theo nhóm di truyền
4.3.1.1. Cây phả hệ của PEDV dựa vào gen S
Để làm rõ mối liên hệ về trình tự gen giữa các chủng PEDV lưu hành
ở Việt Nam với thế giới, chúng tôi đã thu thập và phân tích cơ sở dữ liệu bao
gồm 911 trình tự gen S hoàn chỉnh, có đủ thông tin về địa điểm và thời gian

thu thập mẫu. Các kết quả phân tích được trình bày ở hình 4.6.

Nhóm Bắc Mỹ

Nhóm châu Á

Nhánh của cây phát sinh chủng loại được đánh dấumàu đen (genogroup 1) và màu xanh
(genogroup 2). Nhánh dẫn tới các chủng lưu hành ở Việt Nam được đánh dấu màu đỏ
và được chỉ bằng mũi tên

Hình 4.6. Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S
Kết quả cho thấy 38 chủng PEDV của Việt Nam (mũi tên) thuộc về 2
nhóm riêng rẽ là genogroup 1 và genogroup 2. Trong khi các chủng virus
thuộc genogroup 1 chỉ bao gồm 1 nhánh, PEDV thuộc genogroup 2 phân bố
rải rác ở các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại. Cùng với các
chủng PEDV lưu hành ở các nước khác, 31 chủng virus của Việt Nam thuộc
genogroup 2 được phân bố vào 2 dưới nhóm là nhóm châu Á và nhóm Bắc
Mỹ. Kết quả phân loại PEDV lưu hành ở Việt Nam kể trên là phù hợp nghiên
cứu được công bố năm 2015 trong đó nhóm tác giả cho biết: dựa vào trình
tự toàn bộ gen S, PEDV lưu hành ở một số tỉnh thuộc miền Bắc và miền
Trung thuộc về genogroup 1 và genogroup 2. Ở góc độ khác, kết quả phân
tích của nghiên cứu này cho biết một số công bố chỉ phát hiện được
genogroup 2 của PEDV ở nước ta là chưa chính xác.
15


4.3.1.2. Cây phả hệ của PEDV dựa vào gen ORF3
Mối liên hệ giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam trong tương
quan với các chủng lưu hành trên thế giới tiếp tục được phân tích dựa vào
gen ORF3.

MF577027
KU836638

Genogroup 1
Genogroup 2
Variant

Nhánh của cây thuộc về genogroup 1 và genogroup 2 lần lượt được đánh dấu màu đen
và màu xanh. Nhánh có chủng PEDV của Việt Nam được đánh dấu màu đỏ. Nhóm biến
thể chưa được xác định genogroup được đánh dấu màu tím.

Hình 4.7. Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3
Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen ORF3 phân chia các
chủng PEDV thành 2 genogroup rõ ràng là genogroup 1 và genogroup 2. Tuy
nhiên, khác với các công bố trước đây, kết quả trình bày trong nghiên cứu
này cho thấy, ngoài 2 genogroup kể trên, còn quan sát được 1 nhánh phát
sinh nằm ở gốc của cây phả hệ. Nhánh này hiện bao gồm 2 chủng virus (với
đặc điểm gen khác biệt lớn so với các chủng PEDV hiện lưu hành) được tìm
thấy ở các mẫu bệnh phẩm lưu trữ từ năm 2000 ở Anh và năm 2008 ở Nga.
Phân tích cơ sở dữ liệu gồm 886 trình tự gen ORF3 có trong ngân
hàng gen (gồm trình tự gen cập nhật của Việt Nam), nghiên cứu này đã xác
định PEDV lưu hành ở nước ta gồm genogroup 1 (11 chủng, phân lập năm
2013-2014) và genogroup 2 (1 chủng, phân lập năm 2014). Đây được xem
như kết quả bổ sung về đặc điểm dịch tễ học virus lưu hành ở nước ta, bởi lẽ
dựa vào gen ORF3 nghiên cứu trước đây đã nhận định PEDV lưu hành ở
Việt Nam chỉ bao gồm một nhóm di truyền có quan hệ chặt chẽ với nhau.
16

4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam
Kết quả phân tích cây phả hệ dựa vào trình tự một phần hoặc toàn bộ
gen S, cho thấy một số chủng có sự thay đổi về genogroup được phân loại.
Nghiên cứu này đã làm rõ hiện tượng tái tổ hợp của các chủng PEDV lưu
hành ở Việt Nam trên cơ sở so sánh cây phả hệ được xây dựng bởi các đoạn
khác nhau của gen S: một phần (nt 1534- 2049) gen S và toàn bộ gen S.
A

B

genogroup 2

genogroup 1

(A) Cây phả hệ dựa trên trình tự gen S từ nt 1534- 2049 theo Nguyễn Trung Tiến và cs
(2015). (B) cây phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ gen S được xây dựng trong nghiên cứu
này. Các chủng PEDV giống nhau ở mỗi cây phả hệ được nối với nhau bởi một
đường thẳng

Hình 4.8. Đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ/ một
phần gen S
Hình 4.8 A cho biết 11/11 chủng PEDV được xếp vào genogroup 1
dựa vào trình tự phân đoạn gen S gồm 650 nt. Đáng chú ý có 5/11 chủng
(đánh dấu màu vàng, hình 4.8) được xếp vào genogroup 2 ở cây phả hệ
được xây dựng dựa vào trình tự toàn bộ gen S. Đối với các chủng còn lại,
mặc dù không thấy có sự thay đổi genogroup, vẫn quan sát được sự thay
đổi vị trí (được nhóm với các chủng khác nhau) giữa 2 cây phả hệ. Tái tổ
hợp là một cơ chế tiến hóa của virus nói chung và của PEDV nói riêng.
Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV diễn ra khá đa dạng: (i) giữa PEDV và
TGEV, (ii) giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2 và xảy

ra tại nhiều vị trí của gen S, (iii) giữa các gen khác nhau của bộ gen, v.v...
17


Như vậy, có thể thấy đặc điểm tái tổ hợp của một số chủng PEDV ở Việt
Nam không phải là cá biệt.
4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian
4.3.3.1. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc genogroup 1
Hình 4.9 trình bày kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử
của PEDV thuộc genogroup 1 lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3.

~2012
~2009

~2012

~2013

Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự
đoán và chiều dài được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. Kích
thước của chấm ⚫ ở mỗi nút tương ứng với mức tin cậy của dự đoán 40%- 100%

Hình 4.9. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1
dựa vào gen ORF3
18


Hình 4.9 cho biết các chủng PEDV thuộc genogroup 1 lưu hành ở một
số tỉnh có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc (nhánh màu đỏ). Các chủng
PEDV của Việt Nam được xếp vào genogroup 1 có thể được chia thành 3

nhánh: (i) nhánh được tìm thấy ở miền Trung (Quảng Trị), (ii) miền Bắc
(Thái Bình) và (iii) nhánh được tìm thấy ở miền Bắc và miền Nam (Hưng
Yên, Vũng Tàu, Đồng Nai). Hình 4.10 là đặc điểm dịch tễ học phân tử của
PEDV thuộc genogroup 1 dựa vào trình tự gen S.

~ 2005

~ 2003

~ 2008

A

B

Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự
đoán và chiều dài được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán (A).
Nhánh dẫn đến các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam (B). Nguồn gốc được dự đoán
của virus phát sinh ở các nhánh được biểu thị ở mỗi nút (node) của cây. Kích thước của
chấm ⚫ ở mỗi nút tương ứng với mức tin cậy của dự đoán 70%- 98%.

Hình 4.10. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1
dựa vào gen S
Giống như kết quả dự đoán nguồn gốc của các chủng virus lưu hành
ở Việt Nam dựa vào gen ORF3, kết quả phân tích dựa trên trình tự của gen
S cũng chỉ rõ toàn bộ các chủng PEDV lưu hành tại các địa phương lấy mẫu
có nguồn gốc trực tiếp từ các chủng lưu hành ở Trung Quốc. Mặc dù vậy,
kết quả ở hình 4.9 và hình 4.10 đều chỉ ra rằng PEDV lưu hành ở các tỉnh
của Việt Nam nằm ở các nhánh khác nhau của cây phả hệ (bắt nguồn từ các
nhánh lưu hành ở Trung Quốc). Quan trọng hơn, kết quả phân tích cho biết

19


sau khi xâm nhập vào Việt Nam, các chủng virus này đã có sự lây lan. Ví dụ:
dựa vào gen S (hình 4.10), con đường phát tán được dự đoán là: Quảng TrịQuảng Trị, Quảng Trị- Hải Phòng và Quảng Trị- Trung Quốc.
Về mặt thời gian, hình 4.9 cho thấy, mặc dù 11 mẫu PEDV thuộc
genogroup 1 của Việt Nam đều được lấy vào năm 2013- 2014, nhưng kết
quả dự đoán thời điểm sớm nhất mà virus xuất hiện tại các địa phương là
không giống nhau, dao động từ khoảng năm 2009 – 2013 (1- 4 năm trước
thời điểm mẫu được lấy). Ngược lại, dựa vào gen S (hình 4.10) thời điểm
sớm nhất mà PEDV được dự đoán xuất hiện tại các địa phương kể trên là
vào khoảng năm 2005 và khoảng năm 2008 (6- 9 năm trước thời điểm
mẫu được lấy). Nhìn chung, kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học theo
thời gian cho biết PEDV thuộc genogroup 1 đã lưu hành ở đàn lợn tại các
tỉnh như Hòa Bình, Quảng Trị và Hải Phòng trong một khoảng thời gian
trước khi ca bệnh do PED được phát hiện.
4.3.3.2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc genogroup 2
Phân loại genogroup PEDV dựa vào gen ORF3 (hình 4.7) cho biết chỉ
có 1 chủng PEDV của Việt Nam nằm trong nhóm này. Phân tích đặc điểm
dịch tễ học phân tử dựa vào gen ORF3 được trình bày ở hình 4.11.






Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự
đoán. Chủng PEDV của Việt Nam được đánh dấu bởi mũi tên

Hình 4.11. Sự phát tán theo không gian của genogroup 2 dựa vào

gen ORF3
20


Cơ sở dữ liệu dùng cho phân tích gồm trình tự gen ORF3 thu thập ở
13 quốc gia. Kết quả cho biết các chủng PEDV lưu hành ở Hàn Quốc được
dự đoán là nguồn gốc tổ tiên xa nhất của các chủng virus lưu hành trên thế
giới (hình 4.11). Chủng PEDV của Việt Nam (mũi tên) được dự đoán có
nguồn gốc từ các chủng lưu hành ở Trung Quốc.
Dựa vào gen trình tự gen S, kết quả phân loại tại hình 4.8 cho thấy
genogroup 2 của PEDV lưu hành ở Việt Nam thuộc về 2 nhóm: nhóm châu
Á và nhóm Bắc Mỹ theo phân loại của. Do đó, nghiên cứu sự phát tán theo
không gian và thời gian của PEDV genogroup 2 ở nước ta được thực hiện
đối với từng nhóm.
4.3.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc nhóm châu Á
PEDV thuộc nhóm châu Á bao gồm các chủng lưu hành ở 5 nước
(Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Philipin và Thái Lan). Kết quả phân tích
được trình bày ở hình 4.12.

13

13,
15, 16
Trung Quốc
~2004

14, 15

13, 15
14, 15

Hàn Quốc
~1993

Hình 4.12. Sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV
nhóm châu Á
21


Vùng giới hạn bởi các nhánh của cây phả hệ được đánh dấu bởi màu
tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán. Chiều dài của các
nhánh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. Để dễ quan sát, ký hiệu
tên chủng được lược bỏ. Các chủng PEDV của Việt Nam được hiển thị kèm
là năm phân lập (2 số cuối của năm)
Hình 4.12 cho biết, PEDV thuộc nhóm châu Á lưu hành ở Trung
Quốc, Philippine, Thái Lan và Việt Nam được dự đoán có nguồn gốc từ các
chủng PEDV từ Hàn Quốc. Chủng virus tổ tiên này được dự đoán xuất hiện
vào khoảng năm 1993. Về tình hình của Việt Nam, PEDV lưu hành ở nước
ta (giới hạn bởi vùng màu tím) được xác định có nguồn gốc trực tiếp từ các
chủng lưu hành ở Trung Quốc (vùng màu đỏ). Kết quả phân tích cụ thể được
trình bày ở hình 4.13.
A

1

2

B

E

3

C

D

F

G

H

Cây phát sinh chủng loại với các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc
gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán (A). Nhánh dẫn đến các chủng PEDV lưu hành ở Việt
Nam (B-D) với chiều dài được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán.
Nguồn gốc được dự đoán của virus phát sinh ở các nhánh được biểu thị ở mỗi nút
(node) của cây phát sinh chủng loại (E-H)

Hình 4.13. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian
của PEDV genogroup 2 nhánh châu Á
22


Các chủng PEDV thuộc genogroup 2 lưu hành ở nước ta xuất phát từ
các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại. Kết quả này cho thấy
PEDV sự xâm nhập vào nước ta qua nhiều đợt. Thậm chí, virus lưu hành ở
một tỉnh, tại các thời điểm khác nhau cũng được dự đoán có nguồn gốc khác
nhau: ví dụ như các chủng lưu hành ở Hưng Yên được mô tả ở hình 4.13 C
và 4.13 D. Đối với nhóm châu Á này, chúng tôi cũng nhận thấy một đặc điểm

tương tự như với genogroup 1: sau khi xâm nhập vào một số tỉnh, các chủng
virus này đã có sự lây lan ra các tỉnh khác (hình 4.13 E-H).
4.3.3.4. Đặc điểm lưu hành của PEDV thuộc nhóm Bắc Mỹ
Khác với nhóm châu Á, PEDV genogroup 2 thuộc nhóm Bắc Mỹ là
các chủng có nguồn gốc từ PEDV lưu hành ở Mỹ từ năm 2013, nhóm này
không chỉ bao gồm các chủng virus ở lục địa châu Mỹ mà còn có các chủng
ở lục địa châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan và Việt Nam)
và ở lục địa châu Âu.
A

B
~ 2011

~ 2011

Cây phát sinh chủng loại với các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc
gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán. Nhánh dẫn đến các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam
được đánh dấu bởi mũi tên và đi kèm là dự đoán về nguồn gốc phát sinh

Hình 4.14. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian
của PEDV genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ
Kết quả phân tích ở hình 4.14 cho biết PEDV của Việt Nam thuộc
nhóm Bắc Mỹ có nguồn gốc từ các chủng virus lưu hành ở Mỹ. Dựa vào đặc
điểm phân nhánh, các chủng này nằm ở các nhánh khác nhau. Kết quả này
dự đoán rằng có nhiều đợt xâm nhập của PEDV thuộc nhóm này vào nước
ta. Các kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV lưu hành
23