Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinep

e K., Nishizawa T., Yoshimuzu M (2000), “Selection of
broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with
recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis. Aqua.
Org.41, 219–223


69. Yamashita H., Mori K., Kuroda A., Nakai T (2009),

“Neutralizing

antibody levels for protection against betanodavirus infection in sevenband
grouper, Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an
inactivated virus vaccine”, J Fish Dis. 32(9):767–75.
70. Yuasa K., Koesharyani I., Roza D., Mori K., Katata M., Nakai T (2002),
“Immune response of humpback grouper Cromileptes altivelis, injected with
the recombinant coat protein of betanodavirus”, J. Fish Dis. 25: 53–56
71. Zafran HT., Yuasa K., Hatai K (2001), “Viral nervos necrosis in
humpback grouper Chromileptes altivelis larvae and Juveniles”, Fish Pathol.
35, 95–96.
TÀI LIỆU WEBSITE
72. />73. />74. />

PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Đặc điểm các mẫu bệnh phẩm
STT

Ký hiệu mẫu

Mắt

Não

Biểu hiện lâm sàng

Gen T4

1

QN1

-

-

AB

-

2

QN2

++++

+++

ABCD

+

3

QN3

-

-

AB

-

4

QN4

++++

+++

ABCD

+

5

QN5

-

-

AB

-

6

QN6

-

-

AB

-

7

QN7

+++

++

ABCD

-

8

QN8

-

-

AB

-

9

HP1

-

-

AB

-

10

HP2

++

+

AB

+

11

HP3

-

-

AB

-

12

HP4

+++

+++

ABCD

+

13

HP5

+++

+++

ABCD

-

14

HP6

-

-

AB

+

15

HP7

-

-

AB

+

16

HP8

+++

+++

ABCD

+

17

HP9

-

-

AB

-

18

HP10

+

-

AB

+

19

HP11

-

-

AB

+


20

NĐ1

+++

+++

ABCD

+

21

NĐ2

-

-

AB

-

22

NĐ3

+

-

AB

+

23

NĐ4

+++

+++

ABCD

+

24

NĐ5

+++

+++

ABCD

+

25

NĐ6

-

-

AB

-

26

NĐ7

+

-

AB

+

27

NĐ8

+

-

AB

+

28

NĐ9

-

-

AB

-

29

NĐ10

+++

+++

ABCD

+

30

NĐ11

+++

+++

ABCD

+

31

KH1

-

-

AB

-

32

KH2

-

-

AB

-

33

KH3

-

-

AB

-

34

KH4

+++

++

ABCD

+

35

KH 5

+++

+++

ABCD

+

36

KH6

+

-

AB

-

37

KH7

-

-

AB

-

38

KH8

-

-

AB

-

39

KH9

+

-

AB

+

40

BT1

+

-

AB

-

41

BT2

+++

+++

ABCD

+


42

BT3

-

-

AB

+

43

BT4

+++

+++

ABCD

+

44

BT5

-

-

AB

-

45

BT6

-

-

AB

-

46

BT7

+

-

AB

+

47

BT8

-

-

AB

-

48

BT9

+++

+++

ABCD

+

49

BT10

-

-

AB

+

50

BT11

-

-

AB

-

51

BT12

+++

++

ABCD

+

Ghi chú:
A: Bỏ ăn
B: Bơi tách đàn, màu sắc cơ thể đen tối
C: Mắt lồi, bóng hơi căng, ruột chứa dịch
D: Bơi ngửa, bơi xoay tròn, có hiện tượng chết
(-): Không có CPE ở mô não, mô mắt; không có gen T4
(+): Có gen T4
(++): CPE > 50%
(+++): CPE > 85%
(++++): CPE > 98%, có hiện tượng tan bào

Phụ lục 2: Một số phương pháp đã sử dụng trong luận án
1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA
theo nguyên lý của PCR, bao gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi cDNA,
sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA.
Giai đoạn thứ hai: Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng
Đối với NNV, kĩ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên
mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA và giai đoạn khuếch
đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết.
Để khuếch đại trình tự T4 của RNA-2 dài 421 bp của E. fuscogutatus
và E.akaara, dựa trên trình tự của GenBank chúng tôi đã thiết kế cặp mồi
gồm:
P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và
P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’)
Thành phần phản ứng
Thành phần phản ứng

Thể tích (µl)

RT-PCR buffer

10

Q- solution

10

dNTP

2

Enzyme DNA-polymerase

2

Mồi: P1-P2

0,6

RNA temperlate

5

RNase- free water

19,8

Tổng

50

Chu trình nhiệt
RT: 50ºC/ 30phút
PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút
- 94ºC/ 30s
- 60ºC/30s
- 72ºC/ 1p
- 72º C/ 5p

30 cycle


2. Phương pháp điện di trên gel agarose
Theo phương pháp của Sambrook J, Russel DW. (2001).
+ Cân 0,2 gam agarose đun nóng chảy và bổ sung 1µl EtBr rồi đổ vào
khuôn gel đã lắp sẵn lược để tạo các giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau khi gel
đã nguội hoàn toàn thì rút lược và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X,
sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.
+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA),
trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử DNA lắng
xuống trong quá trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel.
+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V, thời gian 20-30 phút.
+ Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới
ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm.
3. Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose.
Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành
tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA
Cloning Kit của hãng Invitrogen với các bước như sau:
1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn.
2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ
10: 60 (mg/ µl) trong ống vô trùng 5ml.
3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy
hết.
4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C.
5. Hút 400µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc.
6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn đều rồi
ủ ở nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía
dưới.

7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5
phút.


8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột
tinh sạch sang eppendorf 1,5 ml.
9. Bổ sung 50 µl TE buffer (65-70°C) vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong
1 phút.
10. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu
hồi các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C.


Phụ lục 3: Kết quả so sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4
với các trình tự của GenBank